JP2021093951A - 微生物の判別システム - Google Patents

Abstract

【課題】真正細菌だけではなく、真菌の判別を高精度で実施可能な微生物の判別システムを提供すること。【解決手段】微生物を含む疑いのある試料を培養する培養容器の培養領域を撮像モジュールによって撮像し、取得された撮像画像において設定された解析領域に含まれる培地領域および培地に存在する存在物領域のうちの少なくとも一方の画像データを学習情報として記憶するとともに、当該画像データを予め既知微生物について取得されたデータベースと照合・比較することで前記存在物が微生物に由来するコロニーであるか否かを判別し、微生物に由来するコロニーの数をサイズごとにカウントするとともに前記画像データから抽出された特徴に基づいて判別用パラメータを算出し、当該判別用パラメータを予め既知微生物について取得された当該判別用パラメータのデータベースと照合・比較して微生物の種類を判別・同定する。【選択図】図１

Description

本発明は、光センシングによる微生物の判別システムに関する。

微生物の検出・同定試験は、食品や医薬品、化粧品の製造工程の管理や、医療分野における臨床診断を目的として広く行われている。微生物による健康被害を最小化し、さらに微生物によってもたらされる疾病の蔓延を防ぐため、簡便かつ迅速な微生物検出・同定法の開発が求められ、例えば、医薬品または化粧品の製造現場において、特定微生物試験が行われている。これは、製品中に検出可能な特定の５菌種（Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）が存在しないことを判定する試験である。

従来、微生物等の細胞のコロニー形成評価は、目視確認や顕微鏡観察に基づいて実施されている。例えば寒天培地希釈法は、２倍系列希釈の薬剤液添加寒天培地に前培養した試験菌液を塗沫し、細菌なら１８〜２０時間、真菌なら４８時間培養した際のコロニー形成の有無を目視確認する方法で、試験菌の発育が完全に阻止された最小濃度の評価に用いられる。本手法は、微生物の検出能が優れていることから、長きにわたり微生物検査の公定法として用いられているが、正確な種同定を可能とする一方で、多くの専門知識と熟練が要求される。また培養に基づいている手法であるため同定の結果を得るまでに２〜３日を要するといった問題点があり、その実施効率は著しく制限されている。

また、コロニー形成評価には、目視確認可能な大きさのコロニー形成を待たずに、光学顕微鏡を用いて微小段階のコロニーを観察するマイクロコロニー法がある。斯かる方法では計測の迅速化が達成されているが、顕微鏡観察は対物レンズによる拡大像を利用するため、一度の観察視野は制限されることになる。そのため、広域を計測するためには、自動制御ステージなどの外部装置及び専用ソフトウェアを付設して、スキャニングを行う必要がある。しかしながら、この方法では、時間分解能や測定面積に制限があることから、計測スループット性は著しく制限され、同時に多数の菌体増殖能を評価することは困難である。特に薬剤感受性評価においては、変異によって薬剤耐性を獲得した菌体の有無の確認が重要となるため、同時に多数の菌体増殖能を評価できないことは問題である。

一方、ＣＣＤ等の撮像素子上の容器で培養した細胞を撮像する技術（特許文献１）、撮像素子表面に固定化した抗体に対象を捕捉し直接検出する技術（特許文献２）等が報告されている。
また、ＤＮＡシークエンサーや質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳなど）を用いて微生物の菌種を同定する方法が知られている。

特開平６−３１１８７９号公報 特開２０１０−３８５９３号公報

而して、特許文献１および特許文献２に技術は、光検出素子を用いて、細胞の形態変化情報を撮像することが行われているが、微小なコロニーの形成や成長を同時多並列にモニタリングするものではなく、コロニー形成の判定やサイズ計測を実施可能とするプログラムについても何ら報告はない。
また、真菌類の場合にはカビコロニーでは菌糸が複雑に絡まって生育するために自動識別は困難であるといった問題がある。
また、ＤＮＡシークエンサーや質量分析計による微生物同定方法では、検査に必要な微生物試料を調製するために、数日間の培養を要する。

本発明者らが鋭意研究を重ねた結果、対物レンズを介さない光センシングによって培養容器の画像を経時的に取得し、微生物由来のコロニー像の特徴から算出される特定のパラメータを組み合わせて用いることにより、微生物の判別が高精度で可能であることを見出した。
特に、直径２００ピクセル円内の菌糸本数、直径２００ピクセル円内の分岐点数、直径３００ピクセル円内の分岐点数と平均輝度値、直径３００ピクセルの円に直交する菌糸輝度値の差の平均値を含む５種のパラメータのうちから選ばれる、少なくとも３種以上のパラメータを用いることで、真菌類の判別・同定を高い信頼性で実施可能であることを見出した。

本発明は、以上のような事情に基づいてなされたものであって、真正細菌だけではなく、真菌の判別を高精度で実施可能な微生物の判別システムを提供することを目的とする。

本発明の微生物の判別システムは、培養容器を透過照明する照明装置と、前記培養容器における培養領域を経時的に撮像する撮像モジュールと、前記撮像モジュールによって取得された撮像画像において設定された解析領域に含まれる培地領域および当該培地に形成された微生物に由来するコロニー領域のうちの少なくとも一方の画像データを学習情報として記憶するとともに当該画像データを解析する解析装置とを備え、前記解析装置は、微生物を含む疑いのある試料を培養する培養容器について取得された撮像画像の前記解析領域に含まれる培地領域および培地に存在する存在物領域のうちの少なくとも一方に係る画像データを、予め既知微生物について取得されたデータベースと照合・比較して前記存在物が微生物に由来するコロニーであるか否かを判別し、微生物に由来するコロニーの数をサイズごとにカウントするとともに前記画像データから抽出された特徴に基づいて判別用パラメータを算出し、当該判別用パラメータを予め既知微生物について取得された当該判別用パラメータのデータベースと照合・比較して微生物の種類を同定する機能を有することを特徴とする。

本発明の微生物の判別システムにおいては、前記微生物が真菌類である場合には、前記判別用パラメータとして、直径２００ピクセル円内の菌糸本数、直径２００ピクセル円内の分岐点数、直径３００ピクセル円内の分岐点数と平均輝度値、直径３００ピクセルの円に直交する菌糸輝度値の差の平均値を含む５種のパラメータのうちから選ばれた少なくとも３種以上のパラメータが算出されることが好ましい。

さらにまた、本発明の微生物の判別システムにおいては、前記微生物が真正細菌である場合には、前記判別用パラメータとして、コロニー最大増殖速度、コロニー可視化時間、相対平均輝度、ヒストグラムの偏差、ドーナツ性、画像エントロピー、画像エネルギー密度、画像エネルギー、重み付け中心の差異、及び中心領域の平均輝度の１０種のパラメータのうちから選ばれた、少なくともコロニー最大増殖速度及び相対平均輝度を含む３種以上のパラメータ、もしくは、少なくともヒストグラムの偏差及びドーナツ性、又はドーナツ性及び画像エントロピーを含む２種以上のパラメータが算出されることが好ましい。

さらにまた、本発明の微生物の判別システムにおいては、前記撮像モジュールは、一方向に延びるライン状の領域を撮像するセンサアレイを備えたラインセンサカメラにより構成され、前記ラインセンサカメラのセンサアレイが対物レンズを介さずに前記培養容器に近接して配置された構成とされることが好ましい。

本発明の微生物の判別システムによれば、検査のための操作を大幅に簡便化できるとともに検査時間を短縮化できるため、微生物の判別・同定処理を飛躍的に迅速化させることができる。しかも、撮像画像において設定された解析領域に含まれる培地領域および存在物領域のうち少なくとも一方の画像データを学習情報として学習させデータベースに蓄積させることで、微生物を高精度に判別・同定することが可能となる。
また、微生物の判別に際して、微生物の種類に応じて設定されたパラメータが用いられることで、微生物の判別・同定処理をより高精度で行うことができる。
さらにまた、ラインセンサカメラを用いたいわゆるレンズレスイメージングシステムによって画像を取得することにより、判別システム自体を小型なものとして構成することができ、しかも、微生物の判別・同定処理を高精度にかつ迅速に行うことが可能であることから、例えば、化粧品、食品、医薬品等の製造分野や、臨床診断における微生物検査に導入することにより、微生物同定試験を大幅に簡便、迅速化できる。また、一回の撮像で例えばシャーレなどの培養容器の培養領域の全域の撮像が可能であるため、計測の時間短縮を図ることができるとともに映像のつなぎ作業などが不要であるので、より便利性、安価のシステムを提供することが可能となる。

本発明の微生物の判別システムの一例における要部構成を概略的に示す説明図である。 培養容器と撮像モジュールとの位置関係を概略的に示す図である。

本発明の微生物の判別システムは、微生物を含む疑いのある試料（培養液）を培養する培養容器の培地領域を透過照明下で撮像モジュールによって撮像し、取得された撮像画像を解析して微生物を判別・同定するものである。

本発明において、試料は、臨床試料、非臨床試料の何れでもよい。
臨床試料としては、例えば血液、血清、血漿、血液分画、関節液、尿、精液、唾液、糞便、脳脊髄液、胃内容物、膣分泌物、組織ホモジェネート、骨髄穿刺液、骨ホモジェネート、痰、吸引液、ぬぐい液（ｓｗａｂ）およびぬぐい液残滓（ｓｗａｂ ｒｉｎｓａｔｅ）、他の体液等が挙げられる。
また、非臨床試料としては、食品、飲料、医薬品、化粧品、水、海水バラスト、空気、土壌、汚水、植物材料、血液製剤、ドナー臓器または組織試料等を含めた物質が挙げられる。

また、本発明における菌種の判別・同定対象となる微生物は、コロニーを形成するものであれば特に限定されず、真正細菌、真菌等の何れでもよい。
例えば、シュードモナス属、エシェリキア属、サルモネラ属、赤痢菌属、エンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、プロテウス属、カンピロバクター属、ヘモフィルス属、モルガネラ属、ビブリオ属、エルシニア属、アシネトバクター属、ステノトロフォモナス属、ブレブンディモナス属、ラルストニア属、アクロモバクター属、フゾバクテリウム属、プレボテラ属、ブランハメラ亜属、ナイセリア属、バークホルデリア属、シトロバクター属、ハフニア属、エドワードシエラ属、アエロモナス属、モラクセラ属、ブルセラ属、パスツレラ属、プロビデンシア属およびレジオネラ属等のグラム陰性細菌；腸球菌、連鎖球菌、ブドウ球菌、バチルス属、パエニバチルス属、乳酸桿菌属、リステリア属、ペプトストレプトコッカス属、プロピオン酸菌属、クロストリジウム属、バクテロイデス属、ガードネレラ属、コクリア属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、ミクロコッカス、マイコバクテリウム属およびコリネバクテリウム属等のグラム陽性細菌；カンジダ属、クリプトコックス属、ノカルジア属、アオカビ属、アルタナリア属、ロドトルラ属、アスペルギルス属、フザリウム属、サッカロミセス属およびトリコスポロン属等の真菌が挙げられる。

図１は、本発明の微生物の判別システムの一例における要部構成を概略的に示す説明図である。
この判別システムは、培養容器１０を透過照明する照明装置２０と、培養容器１０における培養領域を経時的に撮像する撮像モジュール３０と、解析装置４０とを備えている。
培養容器１０としては、例えばシャーレ（ペトリ皿）などの開放系容器が用いられ、蓋１１が下方に位置される姿勢（皿１２内に作製された培地１３が上方側に位置される姿勢）でステージ１５に保持される。なお、培養容器１０は、特に限定されるものではなく、閉鎖系容器であってもよい。

照明装置２０は、平行光による照明光を培養容器１０に照射する透過照明光学系２１を備える。
透過照明光学系２１が平行光を培養容器１０に照射するよう構成されていることにより、培養容器１０に対する均一な照明を行うことができるため、培養対象とバックグラウンドとのコントラストが高く培養対象をより精度良く強調した画像を得ることができる。

透過照明光学系２１は、光軸が水平方向に延びるように配置された照明用光源２２と、照明用光源２２の光軸上に位置され点光源を形成するピンホール２３と、照明用光源２２の光軸上に位置されピンホール２３を透過した光を平行光もしくは平行光に近い状態で出射するコリメート光学系２５とを備えている。
コリメート光学系２５は、光軸が照明用光源２２の光軸と一致する状態で配置された一対の平凸レンズ２６ａ，２６ｂと、光軸が照明用光源２２の光軸に対して直交方向（鉛直方向）に延びるように配置された平凸レンズ２７と、平凸レンズ２６ｂからの光を平凸レンズ２７に向かって反射する反射部材２８とにより構成されている。

照明用光源２２としては、ＬＥＤ、有機ＥＬ、蛍光灯、白熱球等のいずれのものも用いることができるが、波長４００ｎｍ以上５００ｎｍ以下の範囲の光を放射するものであることが好ましく、波長４００ｎｍ以上５００ｎｍ以下の範囲の光を放射するＬＥＤを用いることがより好ましい。
このような照明用光源２２によれば、培養対象とバックグラウンドとのコントラストが高く培養対象をより精度良く強調した撮像画像を得ることができ、しかも熱線成分（近赤外光以上の波長成分）による熱的悪影響を軽減することができる。

撮像モジュール３０は、前記一方向に直交する方向に延びるライン状の領域を撮像するラインセンサカメラにより構成される。
撮像モジュール３０としてラインセンサカメラが用いられることにより、広域のイメージングを行うことができるため、微小なコロニーの形成や成長を同時多並列にモニタリングすることができる。しかも、培養対象の培養経過を高い時間分解能で経時的に記録することが可能であり、時間経過に伴う変化を生じないバックグラウンドに対して、動的変化を示すコロニー像をシグナルとして判別することにより、コロニー形成の迅速な判定が可能となる。

撮像モジュール３０は、図２にも示すように、複数の撮像素子３２が一方向（図２において上下方向）に線状に並ぶよう配置されたセンサアレイ３１を備えている。センサアレイ３１は、複数の撮像素子３２が線状に一列に配置されたものであっても、複数列に配置されたものであってもいずれであってもよい。図２においては、センサアレイ３１として複数の撮像素子３２が線状に一列に配置されたものが例示してある。

撮像モジュール３０は、センサアレイ３１が培養容器１０に対物レンズを介さずに近接して配置される。
センサアレイ３１における各々の撮像素子３２の受光面と培養容器１０における皿１２の底面との離間距離ｄは、５ｍｍ以下であることが好ましく、より好ましくは１〜３ｍｍである。

撮像素子３２は、培養対象に対して透過照明光を照射した場合に、当該培養対象由来の光シグナルを撮像できるものであればよい。このような撮像素子３２としては、例えばＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｅｖｉｃｅ）、ＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍｅｔａｌ Ｏｘｉｄｅ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）、ダブルゲート構造のＴＦＴ（Ｔｈｉｎ Ｆｉｌｍ Ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ）、ＣＩＳ（Ｃｏｎｔａｃｔ Ｉｍａｇｅ Ｓｅｎｓｏｒ）等を用いることができる。撮像素子３２は、例えば１０μｍ／ｐｉｘｅｌ以下の解像度を有するものであるが好ましい。

本実施形態においては、培養容器１０を保持するステージ１５が前記一方向（撮像素子３２の並ぶ方向）に直交する方向（図１において左右方向）に駆動可能に構成され、撮像モジュール３０が培養容器１０に対して走査されることで、高輝度部と低輝度部を有する散乱光パターンからなる撮像画像がピクセルデータとして取得される。
撮像は一定時間間隔で行われれば、時間間隔は特に限定されるものではないが、例えば１〜６０分間とすることができる。

解析装置４０は、撮像モジュール３０によって取得された撮像画像において設定された解析領域に含まれる培地領域（培地に対応するピクセル）および培地に形成された微生物に由来するコロニー領域（コロニー像に対応するピクセル）のうちの少なくとも一方の画像データを学習情報として記憶するとともに、画像データを解析して微生物の種類を判別・同定するためのプログラムの他、照明光の強度やレンズの焦点位置、ステージの動作等を制御するためのプログラムを含むものとして構成される。解析領域は、培地領域の全域であっても、一部であっても何れであってもよい。

解析装置４０は、微生物を含む疑いのある試料を培養する培養容器１０における培地に存在する存在物が微生物に由来するコロニーであるか否かを判別し、微生物の種類ごとに設定された定量的な判別用パラメータを算出し、当該判別用パラメータに基づいて微生物の種類を判別・同定する機能を有する。

解析装置４０においては、先ず、微生物を含む疑いのある試料を培養する培養容器１０について取得された撮像画像の解析領域に含まれる培地領域および培地に存在する存在物領域のうちの少なくとも一方に係る画像データを、予め学習させておいた既知微生物についてのコロニー領域に係る画像データのデータベース、または、培地領域に係る画像データのデータベースと照合・比較して存在物が微生物に由来するコロニーであるか否かを判別する判別処理が行われる。

次いで、培地領域および存在物領域のうちの少なくとも一方に係る画像データから抽出された特徴に基づいて判別用パラメータが算出される。画像データから抽出される特徴は、例えば形状、輝度、面積などである。

真菌類を判別するための判別用パラメータは、真菌類菌糸の動態および干渉パターンに関するものであって、直径２００ピクセル円内の菌糸本数、直径２００ピクセル円内の分岐点数、直径３００ピクセル円内の分岐点数、平均輝度値、直径３００ピクセルの円に直交する菌糸輝度値の差、菌糸の長さ、菌糸の太さ、菌糸の色の８種類のパラメータを含み、これらのうちから選ばれる少なくとも３種以上のパラメータが真菌類の判別ために算出されることが好ましい。特に、直径２００ピクセル円内の菌糸本数、直径２００ピクセル円内の分岐点数、直径３００ピクセル円内の分岐点数、平均輝度値、および、直径３００ピクセルの円に直交する菌糸輝度値の差の５種のパラメータを用いることが好ましい。

真正細菌を判別するための判別用パラメータは、コロニー最大増殖速度μｍａｘ、コロニー可視化時間ｔａ（Ｃｏｌｏｎｙ ａｐｐｅａｒａｎｃｅ ｔｉｍｅ）、相対平均輝度Ｉ、ヒストグラムの偏差Ｇ、ドーナツ性Ｄ、画像エントロピーＨ、及び画像エネルギー密度Ｅd、画像エネルギーＥ、重み付け中心の差異Ｗ、中心領域の平均輝度Ｃの計１０種のパラメータであって、これらのうちから選ばれる、少なくともコロニー最大増殖速度μｍａｘ及び相対平均輝度Ｉを含む３種以上のパラメータ、もしくは少なくともヒストグラムの偏差Ｇ及びドーナツ性Ｄ、又はドーナツ性Ｄ及び画像エントロピーＨを含む２種以上のパラメータが真正細菌の判別ために算出される。

コロニー最大増殖速度μｍａｘは、下記式（１）で表されるコロニー増殖速度μ（ｈ^-1 ）のｔ＝１０ｈまでにおける最大値で定義される。下記式（１）においてＡｒｅａ_ｔは、時刻ｔにおけるコロニーの面積である。

コロニー可視化時間ｔａは、コロニー非存在領域の直線（１００ｐｘ）上の輝度値の最大値と最小値の差をＮとし、コロニー由来散乱光パターンの中心を通る直線（１００ｐｘ）上の最大値と最小値の差をＳとしたとき、Ｓ／Ｎ≧２となった最小の時刻ｔと定義される。

相対平均輝度Ｉは、光源やフォトセンサの個体差による輝度の標準化を行うために、コロニー由来散乱光パターン領域内の平均輝度値から各画像のコロニー非存在領域の中から選んだ１００ｐｘ×１００ｐｘの領域の平均輝度値を引いた値と定義される。

ヒストグラムの偏差Ｇは、コロニーの散乱光パターン画像から輝度値を２０分割することで得たヒストグラムの各ピクセル数の標準偏差と定義される。

ドーナツ性Ｄは、コロニー全体の平均相対輝度値Ｄｗと、コロニー中心領域（直径１／２）の平均相対輝度値Ｃの比率を示すパラメータであり、Ｄｗ／Ｃと定義される。

画像エントロピーＨは、一般的に画像の情報量を表す指標として用いられており、輝度勾配の共起行列と定義される。

画像エネルギー密度Ｅｄは、２次元離散フーリエ変換により求めた振幅スペクトルの平均として定義される。

画像エネルギーＥは、２次元離散フーリエ変換により求めた振幅スペクトルの総和として定義される。

重み付け中心の差異Ｗは、輝度値を考慮せずに求めたコロニーの中心と、輝度値を考慮して求めたコロニーの中心との距離と定義する。

中心領域の平均輝度Ｃは、コロニー中心領域（直径１／２）の平均相対輝度値である。

次いで、菌種不明の微生物由来のコロニー領域の特徴から算出された判別用パラメータの値を予め構築された既知微生物ごとの当該判別用パラメータのデータベースと照合・比較することにより、微生物の判別・同定処理が行われる。

構築したデータベースから判別情報を得る方法としては、データベースの各判別用パラメータを説明変数として多変量解析する方法が挙げられる。本発明で用いる多変量解析としては、特に制限はないが、ｋ平均法、線形判別分析（ＬＤＡ）、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、ランダムフォレスト、ｋ近傍法、単純ベイズ分類、ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）などを採用できる。これらのうちでも、高い精度（正答率）で判別分析を行うことができることから、サポートベクトルマシン、ランダムフォレストが好ましい。

微生物の判別・同定のために算出されるパラメータは、適宜増減可能であり、組み合わせにより判別精度が異なる。そのため、パラメータは分析方法や判別対象となる菌種を考慮して適宜決定すればよい。

また、解析装置は、微生物に由来するコロニーの数をサイズごとにカウントする機能を有するものであることが好ましい。
コロニー領域（コロニー像）は画像データにおける高輝度部と低輝度部から構成される光学パターンによって特定される。コロニー領域のサイズと実際のコロニーのサイズとは相関することから、コロニーのサイズ（ピクセル数）は、例えば、微生物に由来するコロニー領域の辺縁に外接する円の直径を計測することにより算出される。

上記の判別システムにおいては、撮像モジュール３０が培養容器１０に対して走査されることで培養領域において点在する全コロニーについて同時多並列的にモニタリングすることが可能である。すなわち、広域を対象とした培養対象の培養経過をモニタリングすることにより、動的変化を示すコロニー像をシグナルとして検出することが可能であり、コロニー形成の迅速な判定が可能である。ここで、モニタリングとは、コロニーの形成の有無、又はコロニーのサイズ若しくは立体形状を測定することにより、コロニーを追跡又は解析することを意味する。
また、コロニー像においては、菌体の単層ないし軽度の積層部分は高輝度部として、多層集積した中心部分は低輝度部として、さらに異なる積層状態の境界部では帯状の低輝度部として、それぞれ可視化される。したがって、得られた画像中のコロニー像の光学パターンから、コロニーの立体形状の推定が可能となる。

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

［撮像系の構築］
図１に示す構成を参照してレンズレスラインスキャンによる撮像系を構築した。ラインセンサカメラは、ＣＭＯＳイメージセンサ（解像度：３．２μｍ／ｐｉｘｅｌ）を備えたものであって、撮像エリアのサイズは、直径９０ｍｍの円型のシャーレにおける培養領域の全面をカバーする大きさ（６．５５×４．９２ｍｍ² ）である。ラインセンサカメラとシャーレとの離間距離は３ｍｍとした。また、照明用光源としては、ピーク波長が４６５ｎｍのＬＥＤを用いた。
そして、下記の２１種の真菌をそれぞれ培養したシャーレの各々について、シャーレの培養領域をＬＥＤ光照射下で撮像し、取得された撮像画像において設定された解析領域に含まれるコロニー領域（コロニー像に対応するピクセル）の画像データを学習情報として記憶させるとともに上述の判別用パラメータ（画像特徴量）をデータベースとして蓄積させた。撮像は１０分間隔で行った。
［データベース構築用の真菌］
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｏｍｉｕｓ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉの６種のアスペルギルス属菌；
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ，Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄｉｇｉｔａｔｕｍ，Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉおよびＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｇｌａｂｒｕｍの４種のペニシリウム属菌；
Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉおよびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍの２種のフザリウム属菌；
Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ａｍｓｔｅｌｏｄａｍｉ，Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ｈｅｒｂａｒｉｏｒｕｍおよびＥｕｒｏｔｉｕｍ ｃｈｅｖａｌｉｅｒｉの３種のユーロチウム属菌；
Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ ｂｏｙｄｉｉ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ、Ｗａｌｌｅｍｉａ ｓｅｂｉ、Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ

〔実施例１〕
試験菌として、Ａ．ｏｒｙｚａｅ（アスペルギルス・オリザエ），Ａ．ｎｉｇｅｒ（アスペルギルス・ニガー），Ａ．ｎｏｍｉｕｓ（アスペルギルス・ノミウス）,Ａ．ｆｌａｖｕｓ（アスペルギルス・フラブス），Ａ．ａｗａｍｏｒｉ（アスペルギルス・アワモリ），およびＡ．ｖｅｒｃｉｃｏｌｏｒ（アスペルギルス・バージカラー）の６種の真菌をそれぞれ培養したシャーレの各々について、上記の撮像系によってシャーレの培養領域をＬＥＤ光照射下で撮像した。
播種後４８時間以内の撮像画像から、（ａ）直径２００ピクセル円内の菌糸本数、（ｂ）直径２００ピクセル円内の分岐点数、（ｃ）直径３００ピクセル円内の分岐点数、（ｄ）平均輝度値および（ｅ）直径３００ピクセルの円に直交する菌糸輝度値の差の５種類の判別用パラメータ（画像特徴量）を取得し、得られた判別用パラメータに基づき、サポートベクトルマシンを用いた判別分析を行ったところ、上述の６種の試験菌を９７．５％の精度で判別することが可能であることが確認された。

〔実施例２〕
上記実施例１において、撮像画像から得られた７種類の判別用パラメータ（画像特徴量）に基づき、ランダムフォレストを用いた判別分析を行ったことの他は実施例１と同様にして判別試験を行ったところ、上述の６種の試験菌を１００％の精度で判別することが可能であることが確認された。

〔実施例３〕
上記実施例１において、試験菌として、Ａ．ｏｒｙｚａｅ（アスペルギルス・オリザエ）、Ｐ．ｃｉｔｒｉｎｕｍ（ペニシリウム・シトリナム）、Ｆ．ｓｏｌａｎｉ（フザリウム・ソラニー）、Ｅ．ａｍｓｔｅｌｏｄａｍｉ（ユーロチウム・アムステロダミ）およびＡｌ．ａｌｔｅｒｎａｔａ（アルタナリア・アルタナタ）を用いたことの他は、実施例１と同様にして判別試験を行ったところ、上述の菌属の異なる５種の試験菌を１００％の精度で判別することが可能であることが確認された。

〔実施例４〕
上記実施例１において、同一シャーレ内で共培養した病原性を持つＡ．ｆｌａｖｕｓ（アスペルギルス・フラブス）および病原性を持たないＡ．ｏｒｙｚａｅ（アスペルギルス・オリザエ）を試験菌として用いたことの他は、実施例２と同様にして判別試験を行ったところ、病原性を持つＡ．ｆｌａｖｕｓが正しく判別されることが確認された。

〔実施例５〕
上記実施例１において、試験菌としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａの４種の真正細菌をそれぞれ培養したシャーレを試験対象とし、判別用パラメータ（画像特徴量）として、コロニー最大増殖速度μｍａｘ、可視化時間ｔａ、平均相対輝度Ｉ、ヒストグラムの偏差Ｇ、ドーナツ性Ｄ、画像エントロピーＨ、および画像エネルギー密度Ｅdの７種類のものを用いたことの他は実施例１と同様にして判別試験を行ったところ、上述の４種の試験菌を１００％以上の精度で判別することが可能であることが確認された。
なお、これら４種の真性細菌に係るコロニー領域（コロニー像に対応するピクセル）の画像データを学習情報として予め解析装置に記憶させておくとともに上述の判別用パラメータ（画像特徴量）をデータベースとして蓄積させておいた。

以上の結果より、真性細菌だけでなく、真菌類の迅速な菌種判別が実施可能であることが確認された。

而して、本発明の微生物の判別システムによれば、従来においては数日〜１週間程度必要であった検査時間を例えば１日以内にまで短縮することができるため、微生物検査を飛躍的に迅速化させることができ、しかも、遺伝子解析による微生物の判別・同定法においては必要とされる、微生物細胞からのＤＮＡやペプチドの抽出といった煩雑な前処理が不要であるため、検査のための操作が大幅に簡便化できる。
従って、化粧品や食品、医薬品等の製造分野や、臨床診断における微生物検査に導入することにより、微生物混入の早期検出による製品保管コストの削減やリスク低減に貢献できることが期待される。

１０ 培養容器
１１ 蓋
１２ 皿
１３ 培地
１５ ステージ
２０ 照明装置
２１ 透過照明光学系
２２ 照明用光源
２３ ピンホール
２５ コリメート光学系
２６ａ 平凸レンズ
２６ｂ 平凸レンズ
２７ 平凸レンズ
２８ 反射部材
３０ 撮像モジュール
３１ センサアレイ
３２ 撮像素子
４０ 解析装置

Claims (4)

1. 培養容器を透過照明する照明装置と、前記培養容器における培養領域を経時的に撮像する撮像モジュールと、前記撮像モジュールによって取得された撮像画像において設定された解析領域に含まれる培地領域および当該培地に形成された微生物に由来するコロニー領域のうちの少なくとも一方の画像データを学習情報として記憶するとともに当該画像データを解析する解析装置とを備え、
   前記解析装置は、微生物を含む疑いのある試料を培養する培養容器について取得された撮像画像の前記解析領域に含まれる培地領域および培地に存在する存在物領域のうちの少なくとも一方に係る画像データを、予め既知微生物について取得されたデータベースと照合・比較して前記存在物が微生物に由来するコロニーであるか否かを判別し、微生物に由来するコロニーの数をサイズごとにカウントするとともに前記画像データから抽出された特徴に基づいて判別用パラメータを算出し、当該判別用パラメータを予め既知微生物について取得された当該判別用パラメータのデータベースと照合・比較して微生物の種類を同定する機能を有することを特徴とする微生物の判別システム。
2. 前記微生物が真菌類である場合に、前記判別用パラメータとして、直径２００ピクセル円内の菌糸本数、直径２００ピクセル円内の分岐点数、直径３００ピクセル円内の分岐点数と平均輝度値、直径３００ピクセルの円に直交する菌糸輝度値の差の平均値を含む５種のパラメータのうちから選ばれる、少なくとも３種以上のパラメータが算出されることを特徴とする請求項１に記載の微生物の判別システム。
3. 前記微生物が真正細菌である場合に、前記判別用パラメータとして、コロニー最大増殖速度、コロニー可視化時間、相対平均輝度、ヒストグラムの偏差、ドーナツ性、画像エントロピー、画像エネルギー密度、画像エネルギー、重み付け中心の差異、及び中心領域の平均輝度の１０種のパラメータのうちから選ばれる、少なくともコロニー最大増殖速度及び相対平均輝度を含む３種以上のパラメータ、もしくは、少なくともヒストグラムの偏差及びドーナツ性、またはドーナツ性及び画像エントロピーを含む２種以上のパラメータが算出されることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の微生物の判別システム。
4. 前記撮像モジュールは、一方向に延びるライン状の領域を撮像するセンサアレイを備えたラインセンサカメラにより構成され、前記ラインセンサカメラのセンサアレイが対物レンズを介さずに前記培養容器に近接して配置されることを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれかに記載の微生物の判別システム。

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