CN106574224B - 用于检测生物粒子的存在或缺失的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于在化学物质(3)的存在下检测培养基(2)上生物粒子(1)的培养物中所包含的至少一个第一抑制区(Z1)存在或缺失的方法。所述检测方法100包括用所述生物粒子(1)接种所述培养基(2)的第一步骤，所述培养基(2)接收所述化学物质(3)的第二步骤，所述培养基温育的第三步骤，和对所述培养基(2)的第一抑制区(Z1)进行测量的第四步骤，其包括通过阴影照相摄取第一抑制区(Z1)的图像的第一阶段。

Description

用于检测生物粒子的存在或缺失的方法
本发明涉及用于在化学物质的存在下检测培养基上生物粒子的培养物中所包含的至少一个第一抑制区存在或缺失的方法，所述检测方法包括用生物粒子接种所述培养基的第一个步骤，所述培养基接收所述化学物质的第二步骤，和温育所述培养基的第三步骤。
文献WO 2011/125033描述了用于在表面上检测生物粒子的团簇的方法。所述生物粒子选自微生物，如细菌、酵母或真菌、或来自植物或动物细胞。所述生物粒子具有通常小于或等于100μm的直径或者主要尺寸。所述表面选自培养基和周围介质(如空气)之间的界面、功能化的支持物表面、或微孔膜的表面。
所述方法包括多个步骤，包括由确定表面的地形表现组成的第一步骤，以及由在所述地形表现上检测划分出可能对应于生物粒子团簇(值得注意的是细菌菌落)的区域的轮廓所组成的第二步骤，其中使用电子数据处理单元来进行这些步骤。
第一步骤是在无接触且无样品制备的光学方法的基础上进行的。根据第一种变体，通过光谱共焦微地形来进行第一步骤。根据第二种变体，通过纹影法(strioscopie)或通过阴影照相(ombroscopie)来进行第一步骤。更具体地，第一步骤包括通过光源照射需要三维表现的表面的阶段、其中通过光传感器来检测对应于由此表面所反射或发射的光的信号的阶段、以及从所检测的信号确定所述表面的三维地形表现的阶段。
对表面的照射可以从周围指引朝向该表面。当照射未经瞄准时，其可聚焦于待测区域。所述光源可以是在空间上和/或时间上连贯的，或者其可以是不连贯的。其可以是多色的或单色的。检测可以用一维图像传感器(如线性阵列)来进行，或者用二维图像传感器来进行，如CMOS型、CCD、光电倍增器、光电二极管等的矩阵。此传感器可具有光谱仪功能，使得能够分析所检测的光的光谱。其还可以偶合至光圈、或针孔，以便构成用于共焦检测的设备。
所述细菌菌落是可通过使用阴影照相技术的设定来进行观测的。平行光束穿过含有所述培养基的皮氏培养皿，并继而通过第一透镜聚焦于检测器上。当细菌菌落在所述培养基上发展时，其由于高度的变化(以及因此表面上形成的局部斜率的变化)而使光线偏转。测器未捕获通过所观测的表面上高度的改变、和/或指标的改变而偏转的射线。此设备使得可以检测待分析平表面上的局部斜率，导致检测器形成的图像上出现暗区。因而，根据此方法，所述细菌菌落表现为光亮背景上的暗点，所述光亮背景对应于所述培养基的表面。介质表面地形的表现是二维的表现，也即图像中两个相邻像素之间强度的变化反映了所照射表面高度的改变。
在对生物粒子对化学物质(如抗生素等)的应答进行诊断的领域，需要用于对生物粒子的存在或缺失进行检测的快速、有效且可靠的方法。有许多成像技术，其用于检测存在化学物质时生物粒子生长抑制区的存在或缺失。然而，所述化学物质在培养基的表面以及琼脂内的扩散现象，再加上培养基表面上生物粒子(特别是微生物)的生长，意味着很难检测抑制区(其测量值随着时间推移保持稳定并且对所使用的培养基和化学物质的类型不敏感)。一方面，化学物质的浓度在扩散的最初几个小时产生变化直至达到平台值；另一方面，在存在培养基时生物粒子进行发展(以取决于化学物质浓度的方式)。不同类型的化学物质(特别是抗生素)，也会具有不同的扩散行为，并且它们具有其自己的折射率。确定生长区(粒子生长)和抑制区(所述化学物质太高以至于粒子不能生长)之间的稳定边界，因而会是特别的复杂。为了克服此缺点，监管机构如NCCLS(临床实验室标准国家委员会)或EUCAST(抗菌药物敏感测试欧洲委员会)的推荐是在18小时、或在20小时、任选在24小时进行单次读取，以便确保琼脂之中和之上化学物质的扩散现象已经稳定并且所抑制区的测量值是可靠的且可重复的(与参考测量的值相比较)。更具体地，因此期望有这样的方法，其具有改善的诊断时间(特别是少于8小时)、具有最优化的可靠性和可重复性。
因此本发明的一个目的是提出用于检测第一抑制区存在或缺失的可靠方法，并且该方法的可重复性经最优化，无论所使用培养基以及化学物质的类型。另外，本发明的另一目的是提出用于测量第一抑制区的方法，其快速且随着时间推移保持稳定、特别是贯穿所述化学物质在所述培养基中的扩散。本发明的另一目的是提出用于检测生物粒子的存在或缺失的可靠方法，该方法的可重复性经最优化并且其提供了对化学物质存在的短的应答时间，特别是等于8小时，且尤其是比现有技术已知的方法(基于肉眼对生物粒子的观测)更快。本发明的另一目的是提出用于进行所述检测方法的检测设备。
本发明一种方法是，用于在化学物质的存在下检测培养基上生物粒子的培养物中所包含的至少一个第一抑制区存在或缺失的方法。所述检测方法包括用生物粒子接种所述培养基的第一个步骤，所述培养基接收经所述化学物质浸渍的支持物的第二步骤，和所述培养基温育的第三步骤。
根据本发明，所述检测方法包括对所述培养基的第一抑制区进行测量的第四步骤，其包括通过阴影照相摄取第一抑制区的图像的第一阶段。
根据本发明的第一实施方案，所述测量的第四步骤包括测量所述经浸渍的支持物与第一抑制区的边缘之间的距离。
根据本发明的第二实施方案，所述测量的第四步骤包括测量第一抑制区的直径。在此实施方案中，有利的是此第四步骤的随后可以是评估最低抑制浓度的至少一个操作，以用于确定生物粒子对所述化学物质的敏感性。
有利的是检测方法包括第五处理步骤，其包括摄取所述培养基的对照图片的第二阶段。
所述对照图片例如是安置在所述培养基上的标尺的图片。
有利的是检测方法包括将所述图像与所述对照图片重叠已形成标准化的表示的第三阶段。
有利的是第五处理步骤包括将所述标尺的参考定位的第四阶段。
有利的是第五处理步骤包括处理所述标准化的表示的第五阶段。
有利的是第五阶段包括用于使所述标准化的表示均化的至少一个平滑操作。
有利的是第五阶段包括将所述标准化的表示的像素强度的动态进行拉伸的至少一个操作，以形成标准化的表示的反差直方图。
有利的是第五阶段包括所述标准化的表示的至少一个阈值操作，其包括阈值的检测和所述标准化的表示轮廓的确定。
有利的是检测方法包括至少一个评估最低抑制浓度的操作，以用于确定生物粒子对所述化学物质的敏感性。
摄取图像的第一阶段和摄取对照图片的第二阶段例如是联系进行的阶段。
摄取图像的第一阶段和摄取对照图片的第二阶段例如是以给定的时滞进行的阶段。
本发明的计算单元是配置用于进行所述检测方法的计算单元，优选用于进行所述测量步骤104和/或所述处理步骤105。
有利的是本发明的处理器包含所述计算单元。
本发明的检测设备主要在包含此种处理器的检测设备中可识别。
有利的是检测设备包含传感单元、能够产生经瞄准的光线的光源和光学焦点。
有利的是所述传感单元包含传感轴，其被安置为与所述培养基在其上延伸的第一平面正交。
有利的是所述光源位所述传感轴上，所述培养基介入至所述传感单元和所述光源之间。
有利的是所述检测设备包含至少一个半反射镜，用于使光源所发射的光线返回至所述培养基。
本发明的其它特征和优势将通过阅读实施方案实例所给出的说明而变得清晰，也即附图当中的图片，其中：
图1是用于进行本发明的检测方法的皮氏培养皿的截面图。
图2是本发明的检测方法的示意图。
图3是本发明的检测方法次序的图示。
图4、5和6是图1所示皮氏培养皿根据本发明的第一个实施方案在三个分别各自的时间的俯视示意图。
图4a、5a和6a是图1所示皮氏培养皿根据本发明的第二个实施方案在三个分别各自的时间的俯视示意图。
图4b、5b和6b是图1所示皮氏培养皿根据本发明的第三个实施方案在三个分别各自的时间的俯视示意图。
图7是用于进行图2所示的检测方法的检测设备第一变体的第一实施方案的示意图。
图8是从图7所示检测设备获得的图像的演示。
图9是用于进行图2所示的检测方法的检测设备第一变体的第二实施方案的示意图。
图10是用于进行图2所示的检测方法的检测设备第二变体的示意图。
图11a、11b和11c是由图10所示检测设备所摄取的大肠杆菌(Escherichia coli)(ATCC 35218)图像(在分别存在氨苄西林、氨苄西林-舒巴坦和哌拉西林-他唑巴坦时，于2小时的测量时间T1)。
图12a、12b和12c是由图10所示检测设备所摄取的图像(大肠杆菌(ATCC 35218)在分别存在氨苄西林、氨苄西林-舒巴坦和哌拉西林-他唑巴坦时，于4小时的测量时间T1)。
图13a和13b是由图10所示检测设备所摄取大肠杆菌(ATCC 25922)的图像(在存在氨苄西林时，分别于2小时和4小时的测量时间T1)。
图14a、14b、14c、14d、14e和14f是由图9所示的检测设备所摄取的大肠杆菌(ATCC35218)的图像(在存在氨苄西林时，分别于0小时、2小时、4小时、6小时、8小时、和24小时的测量时间T1)。
图15a、15b、15c、15d、15e和15f是由图9所示的检测设备所摄取的大肠杆菌(ATCC35218)的图像(在存在氨苄西林时，分别于0小时、2小时、4小时、6小时、8小时、和24小时的测量时间T1)。
图16a、16b、16c、16d、16e和16f是由图9所示的检测设备所摄取的大肠杆菌(ATCC35218)的图像(在存在哌拉西林-他唑巴坦时，分别于0小时、2小时、4小时、6小时、8小时、和24小时的测量时间T1)。
图17是在存在氨苄西林时，通过进行本发明的检测方法所观测的大肠杆菌(ATCC25922)的、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(ATCC 25923)的、和大肠杆菌(ATCC35218)的抑制区直径随着时间的演变的示意图。
图18是在存在氨苄西林-舒巴坦时，通过进行本发明的检测方法所观测的大肠杆菌(ATCC 35218)的抑制区直径随着时间的演变的示意图。
图19和20图2所示的检测方法各个步骤的示意图。
图21至25是图2所示的检测方法第五阶段的连续操作的示意图。
图26至30是通过进行图2所示的检测方法所获得的标准化的表示的示意图。
图31a、31b、31c是由图9所示的检测设备所摄取的显色培养基ChromoIDTM MRSASmart不透明(bioMérieux，Ref.413050)上的金黄色葡萄球菌悬液的图像(在存在头孢西丁时，于4小时、5小时、和20小时的各个测量时间T1)。
图32a、32b、32c是由图9所示的检测设备所摄取的显色培养基ChromoIDTM MRSA透明(bioMérieux，Ref.43451)上的金黄色葡萄球菌悬液图像(存在头孢西丁时，于4小时、5小时、和20小时的各个测量时间T1)。
图33a、33b、33c是由图9所示的检测设备所摄取的显色培养基
Figure BDA0001226577120000061
ID 3(CPS3)(bioMérieux，Ref.43541)上的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)悬液的图像(在存在庆大霉素时，于4小时、5小时、和6小时的各个测量时间T1)。
图34a、34b、34c是由图9所示的检测设备所摄取的显色培养基
Figure BDA0001226577120000062
ID 3(CPS3)(bioMérieux，Ref.43541)上的金黄色葡萄球菌悬液的图像(在存在庆大霉素时，于4小时、5小时、和6小时的各个测量时间T1)。
图35a、35b、35c是分别由不同的检测设备"SIU"、"ADVENCIS"、和图9随时设备所摄取的Mueller Hinton E培养基(bioMérieux MHE，Ref.413822)上大肠杆菌培养物的图像(存在庆大霉素时，6小时的测量时间T1)。
图36是由三种检测设备所摄取的图35a、35b和35c中的图像上所观测到的三个灰度图的示意图。
图37a、37b、37c是由检测设备"SIU"摄取的Mueller Hinton E培养基(bioMérieuxMHE，Ref.413822)上的大肠杆菌(ATCC"美国典型培养物保藏中心"25922)悬液的图像(在存在庆大霉素时，分别于4小时、6小时、和24小时的测量时间T1温育之后)。
图38a、38b、38c是由检测设备通过图9的阴影照相摄取的Mueller Hinton E培养基(bioMérieux MHE，Ref.413822)上的大肠杆菌(ATCC 25922)悬液的图像(在存在庆大霉素时，分别于3小时30分钟、6小时、和24小时的测量时间T1温育之后)。
图39a和39b是在每个测量时间从用于获得图37a、37b和37c以及38a、38b、38c的两种设备所观测到的三个灰度图的示意图。
参见图1或2，在医学和/或药学领域，经常需要使用生物粒子1在培养基2(接触化学物质3)上存在或缺失的检测方法100。所述培养基2接连接收生物粒子1、以及继而能够抑制某些生物粒子1的发展的化学物质3。所述生物粒子1没差别地选自微生物(如细菌、酵母或真菌)，或者选自植物或动物细胞。所述培养基2优选是琼脂、琼脂层等。所述化学物质3特别是抗生素、抗真菌剂、抗分枝杆菌剂或类似的化合物。
更具体地，期望能够可靠且快速地鉴定出生物粒子1对化学物质3的存在的应答，所述应答通常根据以下三种表述之一分类：敏感的、中性的、或抗性的。"敏感的"意味着在存在所述化学物质3时生物粒子1的生长、或甚至是存活是不可能的(从化学物质3的某种浓度开始)。"中等的"意味着在存在所述化学物质3时生物粒子1的生长受损(从化学物质3的某种浓度开始)。"抗性的"意味着在存在所述化学物质3时生物粒子1的生长是可能的。
此种的检测方法100特别是可经常用于医学和/或药学诊断(用于在患者中检测病理学)领域。因此，期望所述检测方法100在以下的意义上是可靠的：上述的生物粒子1对化学物质3的应答的性质是期望的、确定的、没有疑虑和不确定性的。还有期望此检测方法100(其接连顺序在图3中示出)是快速的，期望起始时间T0(生物粒子1接触化学物质3时)与检测时间TX(获得所述可靠应答时)之间所消耗的应答时间越短越好，特别是少于8小时。还有期望此检测方法100应当具有适当的可重复性。这些目的通过进行本发明的检测方法100而有利地得以实现。
总的来说，参见图2，本发明的检测方法100包括用生物粒子1的提取物接种培养基2的第一步骤101。所述生物粒子1的提取物例如是直接得自患者的生物粒子1的原样品。在此情形中，原样品经过预培养阶段，以用于分离存在的生物粒子1的菌株(在包含多样的生物粒子1的样品的情形)，以及用于增加所选择的和分离的生物粒子1。生物粒子1的提取物例如是以类似的方式制备的，特别是过滤的、离心的和/或纯化的样品。生物粒子1的样品具有足以进行有效分析的生物粒子1的生物量，如浓度0.5McFarland的标准。生物粒子1的提取物例如来自尿液、血液、脑脊液或类似的生物液体。
培养基2例如被生物粒子1的提取物所淹没，或者通过擦抹而用生物粒子1接种培养基2，或者培养基2用通过耙涂抹而接收生物粒子。继而，将皮氏培养皿4横向搅动以使得生物粒子1的提取物尽可能均匀地分布在培养基2上，继而将任何上清从皮氏培养皿4去除。接种的第一步骤101可以具有不同于以上所述的特征而并不偏离本发明的规则。
检测方法100继而包括在起始时间点接收至少一个剂量的化学物质3的第二步骤102，例如从将至少一个用化学物质3接种的经浸渍的支持物5放置在培养基2上所述经浸渍的支持物5的接收区2上开始。
所述经浸渍的支持物5例如是用化学物质3浸渍的圆盘，所述圆盘具有圆柱体薄片的整体形态。所述圆盘包含在其体积中整体均质的一定量的化学物质3。
所述经浸渍的支持物5例如还可以是整体矩形形态的细长条带。所述条带例如包含从该条带的一个短边至另一个短边遵循渐增浓度梯度的一定浓度的化学物质3。
所述经浸渍的支持物5例如还可以缩减为含有化学物质3的水滴。
根据图4、5和6中所示的一个实施方案，所述培养基2接收单一的经浸渍的支持物5。接收区R优选由皮氏培养皿4的中心点形成。
根据图4a、5a和6a所示的另一实施方案，所述培养基2接收多个经浸渍的支持物5’,5”,5”’,5””，每个经浸渍的支持物5’,5”,5”’,5””例如包含其自己浓度(与其它经浸渍的支持物5’,5”,5”’,5””不同)的化学物质3。例如，第一经浸渍的支持物5'包含第一浓度的化学物质3，其少于第二经浸渍的支持物5”所包含的第二浓度的化学物质3，第二浓度少于第三经浸渍的支持物5”’所包含的第三浓度的化学物质3，第三浓度少于第四经浸渍的支持物5”’所包含的第四浓度的化学物质3。用多个接收区R，其例如由来自培养基2的等距的点所形成。根据另一实施方案，每个经浸渍的支持物5’,5”,5”’,5””包含与其它经浸渍的支持物5’,5”,5”’,5””不同的化学物质3。
根据图4b、5b和6b所示的另一实施方案，所述培养基2接收多个经浸渍的支持物5’,5”,5”’,5””，其每个形成条带并用各自的化学物质3浸渍。由多个接收区R并且它们例如根据皮氏培养皿4的各个半径而形成。
根据情形，这些变体目的在于使分析生物粒子1对各种化合物3(以及不同浓度)的应答的效率和速度最优化，其具有最优化的分析率。根据这些变体，第二接收步骤102导致化学物质3瞬时递送至培养基2内部，其从经浸渍的支持物5,5’,5”,5”’,5””传播至培养基2的内部。
检测方法100继而包括温育的第三步骤103，期间生物粒子1在给定的时滞(对应于温育时间)与所述化学物质3相互作用。优选地，所述温育步骤103在在受控的环境中以恒定的温度进行，例如37℃。温育时间优选为几小时的级别，且特别是2小时、或4小时、或6小时、或8小时、或18小时、或20小时、或者甚至是24小时。通常，温育时间等于下文所述的观测时间T1、T2。
分别一方面参见图5、5a、5b以及另一方面参见图6、6a、6b，作为这些安排的结果，在第一观测时间T1的观测期间，以及继而在第二观测时间T2，有生物粒子1的至少一个第一抑制区Z1的形成，其中生物粒子1被抑制(在生物粒子1对所述化学物质3敏感的有利情形)。在此情形中，生物粒子1被破坏，或者其生长停止。否则，培养基2以一定浓度的生物粒子1(其在所有所述培养基2内整体均质)保持均质。在此情形中，我们观测到抑制区Z1的缺失，换句话说我们观测到在存在化学物质3时生物粒子1的生长。
在图5、5a和图6、6a中，抑制区Z1整体是圆形的并且以接收区R为中心。生物粒子1的每个抑制区Z1趋向于从接收区R放射状增加(在图5、5a中所示的在第一观测时间T1，与图6、6a所示的第二观测时间T2之间)。
在图5b和图6b中，抑制区Z1整体是椭圆的并且对称分布于接收区R两侧。生物粒子1的每个抑制区Z1趋向于从接收区R离心增加(在图5b中所示的在第一观测时间T1，与图6b所示的第二观测时间T2之间)。
检测方法100继而包括通过阴影照相对第一抑制区Z1进行测量的第四步骤。所述测量的第四步骤104包括测量接收区R与抑制区Z1的边缘之间的距离F的阶段。
在图6和6a中，距离F等于抑制区Z1的直径D。
在图6b中，距离F等于沿着所述经浸渍的支持物5所取的抑制区Z1的长度。
参见图7、9和10，第四测量步骤104利用图像7的传感单元6和光源8。总的来说，所述光源8照射皮氏培养皿4，通过所述传感单元6以常规时间间隔、或者对每个皮氏培养皿4在给定的时滞之后、或者持续在同一个皮氏培养皿4上，摄取其图像7。所述传感单元6包含传感轴A，其优选被安置为与培养基2在其上延伸的第一平面P1正交。有利的是所述传感单元6位于皮氏培养皿4之上，以便取得培养基2的俯视图。所述传感单元6例如是CCD相机，特别是Basler piA2400-17gm类型的，其装配有远心物镜11。所述光源8优选是经瞄准的照明器，其能够产生正交到达培养基2的平行光线9。所述光源8包含多个二极管，所述二极管无差别地包含红、率、蓝和白的发射范围。
根据图7中所示的第一变体的第一实施方案，所述光源8横向安置在皮氏培养皿4上方。根据图9中所示第一变体的第二实施方案，所述光源8横向安置在皮氏培养皿4下方。所述光源8与允许直接照射皮氏培养皿4的光学焦点8'相关联。根据第一个实施方案，所述光源8与倾斜45°的半反射镜10关联，其用于使光源8所发射的光线9返回至皮氏培养皿4。所述光源8例如是Opto Engineering–LTCL 048–W的类型。光学焦点8'例如是OptoEngineering–LTCL 24的类型。在两种情形中，远心物镜11都特别是Opto Engineering–TC23 048的类型，包含46x38.5mm的焦场和134.6mm的工作距离。
根据图10中所示的第二实施方案，光源8以皮氏培养皿4之下为中心，以用于使所述光源发射的光线9直接照至皮氏培养皿4上。更具体地，光源8相对于传感轴A而轴向安置，从而将背光照射递送至皮氏培养皿4。在此情形中，光源8例如是Opto Engineering–LTCL024–G的类型，其发射波长为520nm，而远心物镜11例如是Edmund Optics–63733的类型，包含8.44x 7.07mm的焦场和65mm的工作距离。
传感单元6、光源8以及任选地半反射镜10和光学焦点8'一起形成能够进行本发明的检测方法100的检测设备12。
参见图5、6、5a、6a、5b、6b和8，当光线9穿过培养基2无生物粒子1的第一抑制区Z1时，所述光线9未经偏转而以如下的方式穿过所述培养基2：由传感单元6所摄取的图像7反映出所述图像7的第一部分，其光亮(特别是发白)，并且其与第一抑制区Z1具有相同的形态。当光线9穿过包含生物粒子1的第二增殖区Z2时，所述生物粒子1以如下的方式使光线9偏转：由传感单元6所摄取的图像7反映出所述图像7的第二部分，其发暗(特别是发黑)，并且其与第二增殖区Z2具有相同的形态。由此在给定的观测时间，第一抑制区Z1和第二增殖区Z2之间的反差大于以现有技术的常规方法所观测到的同一反差。在说明的此阶段需要注意的是，图8中所示的图像7是使用图7所示的检测设备12而获得的，生物粒子为金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)，化学物质3为环丙沙星以及检测时间TX为18h。
参见图11a、11b和11c，其分别是在氨苄西林、氨苄西林-舒巴坦、和哌拉西林-他唑巴坦的存在下于2小时的测量时间T1时的大肠杆菌(ATCC 35218)的图像7，和图12a、12b和12c，其分别是在氨苄西林、氨苄西林-舒巴坦、和哌拉西林-他唑巴坦的存在下于4小时的测量时间T1时的大肠杆菌(ATCC 35218)的图像7；以及图13a和13b，其分别是在氨苄西林的存在下于2小时和4小时的测量时间T1时的大肠杆菌(ATCC 25922)的图像7，所述图像7是皮氏培养皿4的部分图像(由从皮氏培养皿4径向的条带13构成)，条带13在接收区R皮氏培养皿4的外周末端E之间延伸。在此情形中，检测方法100是通过微观阴影照相的检测方法100，其提供了以下优势：给出第一抑制区Z1较好的解析度以及较快的检测。因而，在图12b、12c和13b中，第一抑制区Z1在4小时的检测时间TX可鉴别，或者在图11b、11c和13a中为2小时的检测时间TX。鉴于大肠杆菌(ATCC 35218)对氨苄西林-舒巴坦混合物以及对哌拉西林-他唑巴坦混合物的敏感性、鉴于大肠杆菌(ATCC 35218)对氨苄西林的抗性，该结果是可靠的且明确的应答(以4小时的检测时间TX)。鉴于大肠杆菌(ATCC 25922)对氨苄西林的敏感性，该结果是可靠的且明确的应答(以2小时的检测时间TX)，所述应答与现有技术参考方法(如裸眼观测的方法)相当，但却有短得多的检测时间。
参见图14a、14b、14c、14d、14e和14f，其分别是在氨苄西林的存在下于0小时、2小时、4小时、6小时、8小时、和24小时的测量时间T1时的大肠杆菌(ATCC 35218)的图像7，值得注意的是从4小时起即可以鉴别出大肠杆菌(ATCC 35218)对氨苄西林的抗性的可靠的且明确的应答。实际上，从4小时起，未检测到抑制区，并且这随着时间的推移可靠且可重复。
参见图15a、15b、15c、15d、15e和15f，其分别是在氨苄西林-舒巴坦的存在下于0小时、2小时、4小时、6小时、8小时、和24小时的测量时间T1时的大肠杆菌(ATCC 35218)的图像7，值得注意的是从4小时起可鉴别大肠杆菌(ATCC 35218)对氨苄西林-舒巴坦混合物的敏感性可靠且明确的应答。实际上，从4小时起检测的抑制区具有随着时间推移可复进行测量的稳定直径。
参见图16a、16b、16c、16d、16e和16f，其分别是在哌拉西林-他唑巴坦的存在下于0小时、2小时、4小时、6小时、8小时、和24小时的测量时间T1时的大肠杆菌(ATCC 35218)的图像7，值得注意的是从4小时起可鉴别大肠杆菌(ATCC 35218)对氨苄西林-舒巴坦混合物的敏感性可靠且明确的应答。实际上，从4小时起检测的抑制区具有随着时间推移可复进行测量的稳定直径。图14至16中的实例显示出使用阴影照相来检测抑制区的益处，其证明了在此方法中使用阴影照相(更特别是使用远心物镜(优选偶合至经瞄准的照明器))的优势。
再次参见图2，前述各种生物粒子1对混合物3的应答得自本发明的检测方法100，有利的是其包括处理通过本发明的检测设备12获得的图像7的第五步骤105。通过利用计算单元14来进行第五处理步骤105，所述计算单元14配置为用于执行此步骤并且包括例如用于图像分析和处理的单元，该计算单元14形成了检测设备12所包含的处理器的一部分。
根据第五处理步骤105的第一方式，其包括例如对图像7的高斯滤波、获取图像的各个特征以及所述特征的变化。
根据第五处理步骤105的第二方式，其包括例如对接收区R的定位、设定图像的高动态范围、对图像进行中值滤波、通过使图像绕接收区R旋转来获取特征、所述特征的改变、以及特征的均值以确定每个图像7中第一抑制区Z1的存在或缺失。
根据一个或另一个前述方式，检测方法100使得可以确定抑制的反应动力学，将第一抑制区Z1的直径表示为时间t的函数，所述动力学在图17和18中示出。在图17中，曲线C'1、C'2、C'3分别示出了图14a至14f、图15a至15f以及图16a至16f中抑制的反应动力学。在图18，曲线C2示出了大肠杆菌(ATCC 35218)在存在抗生素氨苄西林-舒巴坦时抑制的动力学(相对于肠杆菌对于此抗生素的参考阈值BP)。6小时后，所测量的直径D大于指定的参考阈值BP。因此，认为此菌株对此抗生素是敏感的。
第五处理步骤105的第三方式图19至30中示出。
在图19中，第五处理步骤105包括摄取皮氏培养皿4中含有的培养基2上安置的标尺15的对照图片7'的第二阶段X2，第二阶段X2也是通过检测设备12进行的。第五处理步骤105继而包括将所述图像7与所述对照图片7'重叠的第三阶段X3，更具体地是将它们各自的接收区R重叠以形成述培养基2的标准化的表示7”。
在图20中，第五处理步骤105包括对标尺15的参考标志16进行定位的第四阶段X4。在显示出的实例中，参考标志16是标尺15上的指示"256"，并且参考标志16可以由其它以及相对地由任何指示构成。参考标志16包括笛卡儿坐标X256和Y256。
在图21至25中，第五处理步骤105包括处理标准化的表示7”的第五阶段。
在图21中，第五阶段X5包括用于使所述标准化的表示7”均化的至少一个平滑操作。所述平滑操作例如从标准化的表示7”的高斯滤波起开始进行。优选地，所述平滑操作进行若干次，特别是7次。
在图22中，第五阶段X5包括将标准化的表示7”的像素强度的动态进行拉伸的至少一个操作，以形成标准化的表示7”的反差的直方图17，在所述标准化的表示7”的暗像素和光亮像素之间考虑所述反差。这导致确定了所述标准化的表示7”的有用动态18。
在图23中，第五阶段X5包括标准化的表示7”的至少一个阈值操作，其包括例如阈值19的检测和从所述标准化的表示7”的数字化确定轮廓20。
在图24中，第五阶段X5包括评估最低抑制浓度(通常已知为首字母缩写MIC)的至少一个操作(基于对参考最低抑制浓度的横坐标XMIC的确定)。
在图25中，第五阶段X5包括从以下关系式[1]中计算最低抑制浓度MIC的至少一个操作：
Figure BDA0001226577120000131
其中常数"div"对应于标尺15被因子2所分开的两个刻度线之间一定数目的像素。常数"div"例如等于169像素。
这些安排在一起，从而准确、可靠、可重复地确定最低抑制浓度MIC(其是从第一抑制区Z1出现起的化学物质3的浓度)，并且有可靠的应答时间(时间短，特别是少于或等于8小时)。
图26和27显示了大肠杆菌(ATCC 25922)培养物在氨苄西林的存在下的标准化的表示7”，其中值得注意的是从6小时起，所计算的最低浓度MIC使得可以鉴定大肠杆菌(ATCC25922)对氨苄西林的应答为敏感的。
图28显示了金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)培养物在氨苄西林的存在下的标准化的表示，其中值得注意的是从6小时起，所计算的最低浓度MIC使得可以鉴定金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)对氨苄西林的应答为敏感的。
图29显示了大肠杆菌(ATCC 35218)培养物在氨苄西林的存在下的标准化的表示7”，其中值得注意的是基于第一抑制区Z1的缺失，大肠杆菌(ATCC 35218)对氨苄西林是抗性的。
图30从左至右的栏接连显示了大肠杆菌(ATCC 35218)培养物分别在氨苄西林、哌拉西林和他唑巴坦的混合物、以及氨苄西林和舒巴坦的混合物的存在下的标准化的表示7”，其中值得注意的是大肠杆菌(ATCC 35218)都对氨苄西林是抗性的、对哌拉西林和他唑巴坦的混合物是敏感的、以及对氨苄西林和舒巴坦的混合物是中性的(根据EUCAST(抗菌药物敏感测试欧洲委员会))。
这些安排在一起，从而通过利用本发明的检测方法100，在使生物粒子1与化学物质3(前者对后者敏感的情形)在一起之后4小时可以可靠地检测第一抑制区Z1。
图31a、31b、31c是由图9所示检测设备所摄取的显色培养基ChromoIDTM MRSASmart不透明(bioMérieux，Ref.413050)上金黄色葡萄球菌悬液的图像。通过用校准为0.5McFarland的溶液淹没来进行接种；继而将含有头孢西丁浓度梯度的
Figure BDA0001226577120000146
条带(bioMérieux)安置在培养基表面。在37℃温育培养基并在4小时，31a，5小时，31b和最终的20小时，31c的各个测量时间T1拍摄图像。
图32a、32b、32c是由图9所示检测设备所摄取的显色培养基ChromoIDTM MRSA透明(bioMérieux，Ref.43451)上金黄色葡萄球菌悬液的图像。通过用校准为0.5McFarland的溶液淹没来进行接种；继而将含有头孢西丁浓度梯度的
Figure BDA0001226577120000141
条带(bioMérieux)安置在培养基表面。在37℃温育培养基并在4小时，32a，5小时，32b和20小时，32c的各个测量时间T1拍摄图像。
图33a、33b、33c是由图9所示检测设备所摄取的显色培养基
Figure BDA0001226577120000142
ID3(CPS3)(bioMérieux，Ref.43541)上表皮葡萄球菌悬液的图像。通过用校准为0.5McFarland的溶液淹没来进行接种；继而将含有庆大霉素浓度梯度的
Figure BDA0001226577120000143
条带(bioMérieux)安置在培养基表面。在37℃温育培养基并在4小时，33a，5小时，33b、和6小时，33c的各个测量时间T1拍摄图像。
图34a、34b、34c是由图9所示检测设备所摄取的显色培养基
Figure BDA0001226577120000144
ID3(CPS3)(bioMérieux，Ref.43541)上金黄色葡萄球菌悬液的图像。通过用校准为0.5McFarland的溶液淹没来进行接种；继而将含有庆大霉素浓度梯度的
Figure BDA0001226577120000145
条带(bioMérieux)安置在培养基表面。在35℃温育培养基并在4小时，34a，5小时，34b、和6小时，34c的各个测量时间T1拍摄图像。
从4小时起由图31至34获得的最低抑制浓度的值符合EUCAST对相应微生物的推荐(对于20小时的温育后的常规读取)。还值得注意的是从4小时其可由图31a、32a、33a和34a读取的最低抑制浓度的值也类似于从5小时起可由图31b、32b、33b和34b读取的值。此外，可观测的抑制区足够稳定且可重复，从而在6小时，33c，34c和20小时31c，32c的值也是类似的。因此，使用阴影照相(更特别是使用远心物镜(优选偶合至经瞄准的照明器))的优势，以少于8小时(或者甚至是少于6小时、优选4小时)对最低抑制浓度值的读取(可靠且可重复)而得以证明(对于所有类型的培养基、特别是显色培养基)。此技术的优势也在不透明培养基上成像而得以证明，图31a、31b、31c，这些培养基已知难以分析。因而，培养基的不透明增加了穿过琼脂的任何照射的扩散，并因而降低了所拍摄图像的反差。因而，可以看到图31至34中拍摄的所有图像在微生物生长区和抑制区之间具有足够高的反差，从而所述图像易于使用计算单元来进行分析，所述计算机单元例如包括用于图像分析和处理的单元，该计算单元形成检测设备12所包含的处理器的一部分。
最后，对两种不同类型抗生素(也即杀菌剂(头孢西丁)和抑菌剂(庆大霉素))进行的这些测定，也可显示出本发明方法用于快速获得(从4小时起且少于8小时)抑制值的能力。通过使用阴影照相(更特别是使用远心物镜(优选偶合至经瞄准的照明器))也限制了化学物质的折射率对所拍摄图像的影响。以鉴别培养基如显色培养基来使用的阴影照相的另一优势也在于基于单一培养基以及单一的图像获取步骤，而能够同时执行鉴别生物粒子(通常是存在的微生物的类型)的步骤以及评估最低抑制浓度的步骤的能力。
图35a、35b、35c是由不同的检测设备所拍摄的图像。图35a是通过国际专利申请WO2012/152768中所描述的系统(参考SIU)而获得的。用于图像获取的照明是低环形照明，由垂直于培养基安置并以45°的角度朝向培养基表面的的10个RGB LED的4个线性阵列所构成。该4个线性阵列有规律地以90°分布在培养基周围。用于图像获取的传感器是5百万像素的CMOS传感器，每个像素代表3.45μm乘以3.45μm的面积。在培养基下安排黑色背景以用于图像获取。仅显示了所拍摄图像的通道R(红色)。图35b是使用ADVENCIS公司出售的并在国际专利申请WO 2013/110734中描述的"Bio-System Incubator"装置(参考Advencis)获得的，该装置由具有通过反射线性照明的扫描仪和线性相机构成。图35c是使用图9中所示设备(参考OMBRO)获得的。对于这些图像的每一个，通过用校准为0.5McFarland的大肠杆菌悬液淹没来接种Mueller Hinton E培养基(bioMérieux MHE)。将具有庆大霉素梯度的
Figure BDA0001226577120000161
条带(bioMérieux)置于每个培养基的表面。在6小时的测量和37℃温育时间T1获得每个图像。为了将获得的反差差异定量，定义了A区(图35c中可见)，其宽度通过每个条带沿着Y轴的刻度"192"和"256"来限定并且在X轴上具有50mm的长度。此区垂直于条带，其继而平行于Y轴延伸。继而通过对X中的每个位置找到A区中沿Y的像素的灰度值的平均，而获得了沿着X的特征。如此获得的特征在图36中显示(对每种图像获取装备，各自参考为SIU。ADVENCIS和OMBRO)。
因而，图36是在三种检测设备："SIU"(图35a)、"Advencis"(图35b)和"OMBRO"(图35c)所拍摄的图像上观测到的三种灰度特征(GL，8-比特编码的)的示意图。菌苔、生长区、和抑制区之间的转变，以及抑制区和
Figure BDA0001226577120000162
条带之间的转变，可以在图36中的每个特征中看到。为了评估用每种设备所获得的反差，lmax表示在菌苔区中所观测的最大灰度值，而lmin表示在抑制区中观测到的足校灰度值。因而，从以下方程计算反差：
反差＝(lmax–lmin)/(lmax+lmin)
下表1给出了三种特征的反差结果：
Ombro SIU Advencis
lmin 85 118 47
lmax 190 139 54
反差 38.18％ 8.17％ 6.93％
表1
三种特征的反差结果证明了OMBRO阴影照相设备(更特别是使用远心物镜(优选偶合至经瞄准的照明器))，给出了38.18％的反差值，远高于其它技术，并且从温育的6小时开始。此外，所观测到的最低抑制浓度的值当然符合监管机构对此抗生素/微生物配对的推荐。
图37a、37b、37c是通过检测设备("SIU")拍摄的Mueller Hinton E培养基(bioMérieux MHE)上大肠杆菌(ATCC"美国典型培养物保藏中心"25922)悬液的图像(在存在庆大霉素时，分别于4小时、6小时、和20小时的测量时间T1温育后)。仅显示了所拍摄图片的通道R(红色)。
图38a、38b、38c是通过检测设备(图9的阴影照相)拍摄的Mueller Hinton E培养基(bioMérieux MHE)上大肠杆菌(ATCC 25922)悬液的图像(在存在庆大霉素时，分别于3小时30分钟、6小时、和24小时的测量时间T1温育后)。
图39a和39b是对用于获得图37a、37b和37c以及38a、38b、38c的每种设备的每个测量时间所拍摄的图像上，观测到的三种灰度特征(GL，8-比特编码的)的示意图。
下表2给出了三种特征在每个温育时间的反差结果：
Figure BDA0001226577120000171
表2
因而，可以看到阴影照相产生了比SIU成像设备更大的反差。实际上，从3小时30分钟开始，所观测的反差水平就超过40％，而即使在4小时的温育之后SIU设备还未给出任何反差，因而未能可靠且可重复地确定抑制区。此外，即使在24小时的温育之后，反差的水平仅为11.68％，这可导致对最低抑制浓度的错误确定并且在涉及患者健康的临床决策过程中是不可接收的。通过阴影照相(更特别是使用远心物镜(优选偶合至经瞄准的照明器))获得的灰度特征，因而展现出大得多的反差，其也允许通过计算单元来进行分析，特别是更加可靠且可重复的自动化的测量步骤104和处理步骤105。
本发明所描述的方法和设备可以通过一或多种计算机程序来实施，所述计算机程序可以各种形式存在，激活的或未激活的、在单一计算机上或分布于计算机系统。例如，它们可以通过包含能够实施本发明方法的指示的软件来实施，并以源代码、结果代码、可执行代码或遵循本发明方法某些步骤(特别是所述测量步骤104和/或所述处理步骤105)的任何格式的形式来描述。所有这些计算机程序都可以存储在包含存储介质和相应的信号的计算机可读存储介质上(以压缩的或未压缩的形式)。
术语计算机是指包含处理器(中央处理器(CPU))、专用处理器、或微控制器的任何电子设备。计算机能够接收数据(一或多个输入)、在所述数据上进行一连串的预定的步骤、并产生数据或者信号形式的结果(一或多个输出)。取决于前后文，术语计算机可以具体表示处理器，或者更普遍地是与单一箱中所含的相互连接的元件相关联的处理器。
术语存储介质或计算机可读存储介质是指任何用于容纳、储存、通讯、分配、或转移计算机程序的单元，以使其被计算机或任何用于实施所述程序的单元所使用、或与其相关联。计算机可读存储介质可以是(非穷举地)电子、磁、光学、电磁、红外、或半导体系统以及装置、设备或单元(用于传播所述程序)。更具体地，存储介质的非限制性实例有软盘、CD-ROM、随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、可擦除可编程只读存储器(EPROM或FLASH存储)、光纤、或者包含一或多个电缆的任何电连接。

Claims (22)

1.用于在化学物质的存在下检测培养基上生物粒子的培养物中所包含的至少一个第一抑制区存在或缺失的方法，所述检测方法包括：用所述生物粒子接种所述培养基的第一步骤，所述培养基接收经所述化学物质浸渍的支持物的第二步骤，和温育所述培养基的第三步骤，特征在于所述检测方法包括进行测量的第四步骤，其包括：
-通过阴影照相以及使用偶合至经瞄准的照明器的远心物镜对所述培养基摄取图像，以产生所述培养基的二维强度图像的第一阶段，其中在所述图像中，所述第一抑制区比所述生物粒子的增殖区更加发黑；
-分析所述二维强度图像，以检测所述第一抑制区的存在或缺失。
2.前述权利要求的检测方法，特征在于所述第四步骤的测量包括测量所述经浸渍的支持物与第一抑制区的边缘之间的距离。
3.权利要求1的检测方法，特征在于所述第四步骤的测量包括测量第一抑制区的直径。
4.权利要求2或3的检测方法，特征在于所述检测方法包括第五处理步骤，其包括摄取所述培养基的对照图片的第二阶段。
5.权利要求4的检测方法，特征在于所述对照图片是安置在所述培养基上的标尺的图片。
6.权利要求4或5的检测方法，特征在于所述检测方法包括将所述图像和所述对照图片重叠以形成标准化的表示的第三阶段。
7.权利要求4-6任一项的检测方法，特征在于第五处理步骤包括将所述标尺的参考定位的第四阶段。
8.权利要求4-7任一项的检测方法，特征在于第五处理步骤包括处理所述标准化的表示的第五阶段。
9.权利要求8的检测方法，特征在于第五阶段包括用于使所述标准化的表示均化的至少一个平滑操作。
10.权利要求8或9的检测方法，特征在于第五阶段包括将所述标准化的表示动态拉伸的至少一个操作，其包括扩展所述标准化的表示以形成所述标准化的表示的反差的直方图。
11.权利要求8-10任一项的检测方法，特征在于第五阶段包括所述的标准化的表示的至少一个阈值操作，其包括阈值的检测和所述标准化的表示的轮廓的确定。
12.权利要求3或8-11任一项的检测方法，特征在于其包括至少一个评估最低抑制浓度的操作，以确定生物粒子对所述化学物质的敏感性。
13.权利要求4-12任一项的检测方法，特征在于摄取图像的第一阶段和摄取对照图片的第二阶段是连续进行的阶段。
14.权利要求4-12任一项的检测方法，特征在于摄取图像的第一阶段和摄取对照图片的第二阶段是以给定的时滞进行的阶段。
15.计算单元，其配置为用于实施前述任一项权利要求的检测方法。
16.处理器，其包含权利要求15的计算单元。
17.用于检测第一抑制区的设备，特征在于检测设备包含权利要求16的处理器。
18.权利要求17的检测设备，特征在于检测设备包含传感单元，能够产生经瞄准的光线的光源和光学焦点。
19.权利要求18的检测设备，特征在于所述传感单元包含传感轴，被安置为与所述培养基在其上延伸的第一平面正交。
20.权利要求18的检测设备，特征在于所述光源位于传感轴上，所述培养基介入至所述传感单元和所述光源之间。
21.权利要求18的检测设备，特征在于检测设备包含至少一个用于使光线返回至所述培养基的半反射镜。
22.权利要求17或18的检测设备，特征在于所述传感单元包含远心物镜。
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