BR112016017321B1 - sistema e método para imagiologia de amostras biológicas dispostas em meio de cultura - Google Patents
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Abstract
SISTEMA E MÉTODO PARA AQUISIÇÃO DE IMAGEM USANDO SÍNTESE DE IMAGENS DE ALTA QUALIDADE SUPERVISIONADA. Trata-se de um sistema e método de captura para síntese de imagem de amostras biológicas dispostas em meio de cultura suportado por uma placa. O sistema tem um módulo de calibração, um módulo de aquisição de imagem e um módulo de apresentação de imagem. Quando o sistema recebe uma placa de cultura para síntese de imagem, valores padrão para a placa e o meio de cultura são usados para começar a aquisição de imagem em um dado tempo. A imagem capturada é então usada para criar um mapa pixel por pixel da imagem. O sistema inspeciona o mapa pixel por pixel em busca de pixels saturados e da relação sinal- ruído, e obtém uma nova imagem se o número de pixels saturados estiver no ou acima de um limiar predeterminado ou a relação sina l-ruído para o pixel estiver abaixo de um limiar predeterminado. A partir desta inspeção, um novo valor de fluxo de fótons e/ou tempo de exposição é determinado e uma nova imagem é capturada usando o novo valor, e as etapas são repetidas. Quando de uma determinação de que (...).
Description
[001]O presente pedido reivindica o benefício da data de depósito do pedido U.S. Provisório No 61/933,426, depositado em 30 de janeiro de 2014, cuja revelação é por meio deste incorporada a título de referência.
[002]A imagiologia por Alta Amplitude Dinâmica (HDR) é uma técnica de imagiologia digital que captura uma amplitude dinâmica maior entre as áreas mais claras e mais escuras de uma imagem. Um processo para otimizar automaticamente uma amplitude dinâmica de intensidade de pixel adquirida a partir de uma imagem digital é descrito na Patente US No 7,978,258 para Christiansen et al. A HDR pega várias imagens em diferentes níveis de exposição e usa um algoritmo para costurá- las umas às outras para criar uma imagem que tem tanto pontos escuros quanto claros, sem comprometer a qualidade de qualquer uma delas. No entanto, a HDR pode apresentar uma distorção da realidade, pois ela distorce a intensidade da imagem em geral. Por conseguinte, continua a busca por técnicas HDR que aprimorem o contraste sem distorcer a intensidade da imagem.
[003]Técnicas para aprimorar uma imagem de uma amostra biológica são descritas na WO 2012/152769 para Allano et al. Dentre os problemas relacionados à imagiologia de tais amostras identificados em Allano et al. estão: i) o tamanho das colônias sendo visualizadas; ii) a proximidade de uma colônia para outra; iii) a mistura de cores das colônias; iv) a natureza da placa de Petri; e v) a natureza do meio de cultura; bem como outros fatores.
[004]A solução proposta de Allano et al. para o problema de gerar uma imagem de uma amostra biológica consiste em preparar uma imagem de origem criada a partir das imagens adquiridas em cada cor, remover efeitos de absorção predeterminados para o meio de cultura e o recipiente de cultura e determinar um valor para o fluxo de fótons e o tempo de exposição usando uma exposição predeterminada para adquirir uma imagem que é então dissecada em zonas de luminosidade. A partir disso, a luminosidade da imagem é adquirida e usada para determinar se o valor para o fluxo de fótons e o tempo de exposição utilizado estava correto ou se um novo valor para o fluxo de fótons e o tempo de exposição deve ser usado para a captura de imagem.
[005] O problema das técnicas anteriores é que elas não oferecem um sistema com a capacidade de proporcionar condições de imagiologia que possam detectar alterações muito sutis no contraste que são necessárias para a detecção/identificação de micróbios baseada em imagens em meio de crescimento. Uma vez que a evidência baseada em imagens dos micróbios e/ou seu crescimento no meio é (ou pelo menos pode ser) difícil de detectar, buscam-se técnicas mais robustas para a imagiologia de tais amostras.
[006]Descreve-se aqui um sistema e um método que aprimoram a captura de imagem para imagens com baixo contraste ou contraste variável. Um exemplo de tal ambiente de imagiologia desafiador é o de colônias bacterianas crescendo em placas de crescimento em ágar. As colônias bacterianas refletem a luz de maneira diferente do ágar. Além disso, as colônias bacterianas podem variar de cores claras a cores escuras e refletem a luz de maneira diferente do ágar. O tempo para capturar uma imagem de uma colônia é curto (aproximadamente um segundo). Tipicamente, uma imagem da placa de crescimento é adquirida a cada 3 a 6 horas.
[007]Uma imagem é adquirida em uma série de N aquisições de imagem em cada intervalo de tempo “x” (isto é, t0, t1 . . . tx). A primeira aquisição (N=1) usa valores padrão para a intensidade de luz e o tempo de exposição, chamados aqui de "fluxo de fótons e tempo de exposição”. O valor de fluxo de fótons define o número de fótons chegando à cena por unidade de tempo e unidade de área ((quantidade de fótons) • (tempo-1) • (área-1)). O tempo sendo o tempo de integração no sensor da câmera. O tempo de exposição determina o número de fótons capturado pelo sensor para a aquisição de um quadro. Dito de outra forma, o fluxo de fótons é a taxa de fluxo dos fótons a partir da fonte de luz e o tempo de exposição influencia a quantidade de fótons recebidos pelo sensor para a aquisição de imagem. Para um dado fluxo de fótons, o tempo de exposição controle a intensidade da imagem.
[008]Um indivíduo perito na técnica está ciente das muitas formas diferentes de se controlar o fluxo de fótons para influenciar a intensidade da imagem. Como observado acima, uma técnica controle o tempo de exposição da imagem. Existem outras técnicas que podem ser usadas para controlar a intensidade da luz transmitida para o sensor. Por exemplo, filtros, aberturas, etc. são usados para controlar o fluxo de fótons, que, por sua vez, controla a intensidade. Tais técnicas são bem conhecidas pelos versados na técnica e não são descritas em detalhes aqui. Para os fins das concretizações da invenção descrita aqui, a intensidade de luz é definida como constante e o tempo de exposição é a variável usada para controlar a integração do fluxo de fótons.
[009]Nas concretizações em que o fluxo de fótons é controlado por meio do controle do tempo de exposição, os valores de tempo de exposição iniciais são adquiridos a partir da calibração do sistema. O sistema é calibrado usando uma biblioteca de placas de calibração. A calibração de linha de base é adquirida em função do tipo de placa e do tipo de meio. Quando o sistema é usado para interrogar novas placas de crescimento, os dados de calibração para um tipo de placa e um tipo de mídia em particular são selecionados. A esse respeito, as placas de crescimento podem ser: monoplacas (isto é, para um meio); biplacas (dois meios); triplacas (três meios), etc. Cada tipo de placa de crescimento apresenta desafios de imagiologia únicos. A calibração proporciona um tempo de exposição padrão para capturar a primeira imagem (imagem N=1) da placa de crescimento. A calibração também torna possível para o sistema (ou operador do sistema) determinar quais partes da imagem são placas (isto é, não o fundo) e, das partes de placa da imagem, quais partes são o meio (os nutrientes usados para cultivar as colônias), e quais partes são, pelo menos potencialmente, colônias.
[010]A imagem N=1 de uma placa de crescimento é capturada usando os valores padrão adquiridos a partir da calibração. Se uma técnica de cálculo de média for usada para capturar as imagens digitais da placa de crescimento, os pixels claros terão uma relação sinal-ruído (SNR) melhor do que a dos pixels escuros. No método descrito aqui, os sinais são isolados para os pixels individuais, independente de se os pixels são claros ou escuros. Para um número predeterminado de pixels, a intensidade, o tempo de exposição e a SNR são determinados. Um “mapa” desses valores no contexto da imagem é preparado. A partir desse mapa, um novo de tempo de exposição que preferivelmente não irá saturar mais do que uma fração predeterminada de pixels é selecionado para a aquisição de imagem N+1. De preferência, um tempo de exposição em que somente uma fração muito pequena de pixels (ou menos) são saturados é determinado e usado para capturar a imagem final.
[011]A partir disso, um mapa da SNR para cada pixel onde a SNR é atualizada (isto é, o valor de cinza é refinado e a SNR aprimorada para os pixels não-saturados) para cada pixel não-saturado é gerado. Uma imagem é simulada com base neste mapa.
[012]Um algoritmo de função de otimização é usado para mapear cada intensidade de valor de cinza para cada pixel para o tempo de exposição necessário correspondente para a SNR ideal para o pixel. O algoritmo de otimização começa olhando para a imagem inicial (N=1), que foi capturada usando o tempo de exposição padrão predeterminado. Um mapa de intensidade, exposição e SNR é gerado para toda a imagem. O tempo de exposição para cada pixel é ajustado com base na imagem N e outra imagem (N+1) é capturada. Como declarado acima, o novo tempo de exposição é escolhido, o qual irá saturar os sinais das partes escuras, resultando na superexposição das partes claras. O mapa de intensidade, o mapa de exposição e o mapa SNR são atualizados para cada pixel. Este é um processo iterativo, e as imagens são adquiridas até que a SNR máxima para cada pixel para a imagem seja alcançada, ou o número máximo de imagens seja alcançado, ou o tempo máximo alocado tenha sido alcançado.
[013]Essencialmente, os pontos escuros permanecem escuros, os pontos claros permanecem claros e a SNR é aprimorada. O meio de crescimento em ágar atua como o fundo para as imagens digitais. Um pixel na imagem que é diferente de alguma forma (isto é, uma intensidade diferente) das imagens anteriores indica ou que a colônia está crescendo ou que há contaminação (por exemplo, poeira) na placa. Esta técnica pode ser usada para olhar para múltiplas placas de uma só vez.
[014]Uma vez que a SNR é aprimorada significativamente, é possível revelar detalhes (com confiança) que não poderiam ser vistos/confiados, permitindo a detecção de colônias pequenas muito precocemente na imagiologia de placa temporizada. Os sistemas e métodos também proporcionam imagens correspondendo a um tempo de exposição ideal que corresponde à saturação específica e controlada sobre a cena ou objeto de interesse.
[015]Uma vez que a aquisição de imagem no tempo t0 esteja completa, o processo de aquisição de imagens iterativa é interrompido para esse intervalo de tempo. Quando o intervalo de tempo predeterminado de t0 a t1 tiver decorrido, o processo de aquisição de imagem iterativa é repetido até que a confiança desejada na integridade da imagem assim adquirida tenha sido adquirida. A relação sinal- ruído é inversamente proporcional ao desvio padrão (isto é, SNR = gv’/desvio padrão). Portanto, uma aquisição de imagem que produz uma SNR máxima por pixel (isto é, um desvio padrão mínimo por pixel) irá fornecer uma imagem com uma alta confiança associada a um tempo "Tx”. Por exemplo, uma imagem de alta SNR é adquirida para uma placa que foi incubada por quatro horas (T1=4 horas). Outra imagem de alta SNR da mesma placa é adquirida após a placa ter sido incubada por quatro horas adicionais (Tx=8 horas).
[016]Uma vez que uma imagem associada a um tempo subsequente (Tx+1) seja adquirida, essa imagem (ou pelo menos os pixels selecionados da imagem associados a um objeto de interesse) pode ser comparada com a imagem associada ao tempo anterior (Tx) para determinar se a imagem subsequente fornece evidência de crescimento microbiano e para determinar o processamento adicional da placa.
[017]A FIG. 1 é uma descrição esquemática de um sistema de três módulos para aquisição de imagem e apresentação de acordo com uma modalidade da presente invenção;
[018]A FIG. 2 é um fluxograma de operação do sistema para o sistema de três módulos ilustrado na FIG. 1;
[019]A FIG. 3 é uma descrição das funções do módulo de calibração ilustrado na FIG. 1 para calibração da iluminação, calibração óptica e calibração da câmera de acordo com uma modalidade da presente invenção;
[020]A FIG. 4 é uma ilustração dos dados determinados a partir das placas de calibração para calibrar o sistema da FIG. 1 de acordo com uma modalidade;
[021]A FIG. 5 é uma descrição das funções do módulo de aquisição de imagem ilustrado na FIG. 1 de acordo com uma modalidade da presente invenção;
[022]A FIG. 6 é um diagrama esquemático do método de aquisição de imagem usando o sistema da FIG. 1 de acordo com uma modalidade;
[023]A FIG. 7 é uma descrição mais detalhada das funções realizadas pelo módulo de aquisição de imagem ilustrado na FIG. 5.
[024]A FIG. 8 ilustra o método para escolher o próximo tempo de aquisição de imagem de acordo com uma modalidade;
[025]A FIG. 9 é uma descrição das etapas realizadas para finalizar a aquisição de imagem; e
[026]A FIG. 10 é um diagrama esquemático de fluxo de processo de como determinar a integridade do sistema.
[027]O sistema descrito aqui é capaz de ser implementado em sistemas ópticos para a imagiologia de amostras microbiológicas para a identificação de micróbios e a detecção do crescimento microbiano de tais micróbios. Existem muitos sistemas comercialmente disponíveis desse tipo, os quais não são descritos em detalhes aqui. Um exemplo é o sistema de imagiologia e incubação inteligente BD Kiestra® ReadA Compact (incubadora BD Kiestra® de 2a geração). Tais plataformas de imagiologia ópticas estão disponíveis comercialmente há muitos anos (originalmente a CamerA PrimerA da Kiestra® Lab Automation), e são, portanto, bem conhecidas pelos versados na técnica e não são descritas em detalhes aqui. Em uma modalidade, o sistema é um meio legível por computador não-temporário (por exemplo, um programa de software) que coopera com um dispositivo de aquisição de imagem (por exemplo, uma câmera), que oferece alta qualidade de imagiologia de uma imagem por meio de interação para fornecer uma Relação Sinal-Ruído (SNR) máxima para cada pixel na imagem. Para cada pixel e cada cor (por exemplo, canal), a intensidade e o tempo de exposição são gravados e o sistema então prevê o próximo melhor tempo de exposição para aprimorar a SNR de toda a cena ou os objetos de interesse na cena. Um indivíduo perito na técnica irá apreciar que os múltiplos valores adquiridos por pixel irão depender dos pixels e do sistema de imagiologia. Por exemplo, em um sistema de imagiologia RBG, os valores são adquiridos para cada canal (isto é, vermelho, verde ou azul). Em outros sistemas, os valores são adquiridos para diferentes bandas espectrais ou comprimentos de ondas.
[028] Inicialmente, o sistema é calibrado. A calibração dos sistemas de imagiologia, tal como o descrito aqui, são bem-conhecidos pelos indivíduos especialistas na técnica. Uma variedade de abordagens de calibração são conhecidas. Descrevem-se aqui exemplos de calibração de sistema que oferecem uma linha de base a partir da qual as imagens capturadas são avaliadas. Durante a calibração, placas de calibração (por exemplo, placas com meio, mas sem colônias) são usadas e a aquisição de imagem do sistema é calibrada tomando como base a entrada conhecida. Uma biblioteca de valores de calibração para cada tipo de meio de placa é criada, e os dados de calibração usados para uma placa em particular são selecionados com base no meio na placa de teste. Tanto o sistema quanto os dados são calibrados. Para a calibração de dados, determina-se a SNR, a Linearidade, o Nível de Preto, etc. para cada pixel da imagem capturada da placa de calibração. O sistema de calibração inclui, mas não se limita a distorção de lente, aberrações cromáticas, resolução espacial, etc.
[029]Após a calibração, imagens das novas placas são adquiridas. Os pixels na imagem são analisados em tempo real de modo a estimar o tempo de exposição que irá aprimorar a SNR dos pixels com uma SNR que está abaixo de um limiar predeterminado ou para esses pixels com a menor SNR. Os sistemas de imagiologia típicos somente retêm valores de intensidade para os pixels na imagem. Nas concretizações aqui descritas, a intensidade e o tempo de exposição são gravados para cada pixel. O mesmo pixel é sintetizado em diferentes tempos de exposição e a informação de intensidade é combinada para gerar dados de alta SNR. A partir dessa informação, uma imagem pode ser gerada para qualquer tempo de exposição especificada, ou o melhor tempo de exposição pode ser extraído para controlar a saturação de pixel.
[030]A partir de um aspecto quantitativo, graças à alta SNR, a confiança nas variações sutis de intensidade, nas cores e na textura é aprimorada em grande medida, permitindo um melhor desempenho do reconhecimento de objeto subsequente ou da comparação da base de dados. A análise é feita em uma escala de cinza com comparação com o valor de cinza do pixel em uma imagem anterior (isto é, para a imagem N, o valor do pixel na imagem N-1). Além da comparação do mesmo valor de cinza de pixel na imagem anterior, o valor de cinza de pixel dos pixels adjacentes também é comparado com o valor de cinza de pixel para determinar as diferenças (por exemplo, a interface colônia/meio).
[031]A SNR dos objetos escuros ou coloridos é irregular nos canais diferentes ou muito fraca quando comparada à dos objetos claros. De modo a melhorar isso, o sistema e método aqui descritos implementam um módulo de detecção de imagem no qual a detecção de objeto se baseia no contraste, na SNR, e no tamanho / resolução. A SNR é aperfeiçoada tanto nas regiões escuras quanto claras. O desvio padrão é diminuído, e, portanto, o contraste local se torna tão significativo nas regiões claras quanto escuras. O objetivo aqui é oferecer um sistema que detecte até mesmo diferenças sutis entre as imagens do intervalo de tempo x e x+1 de uma placa suspeita de conter uma cultura em crescimento. Essas diferenças deverão ser distinguíveis do "ruído” que resulta das variações de sinal, mas não das alterações na amostra que podem ser atribuídas a uma cultura em crescimento. Os sistemas e métodos aqui descritos são especialmente valiosos quando os objetos de interesse na cena podem apresentar cores e intensidades muito diferentes (refletância ou absorvência).
[032]Especificamente, o sistema e método proporcionam a adaptação automática da amplitude dinâmica (amplitude dinâmica estendida) para acomodar a cena. O sistema e método proporcionam tanto o tempo de exposição mínimo para saturar o pixel mais claro quanto o tempo de exposição máximo para saturar o pixel mais escuro (dentro das restrições físicas e eletrônicas do equipamento de aquisição de imagem (por exemplo, a câmera)). O sistema e método proporcionam convergência mais rápida para uma SNR mínima por pixel se comparado com o cálculo de média de imagem. O sistema e método proporcionam confiança aprimorada nas cores. Especificamente, a SNR para os valores de vermelho, verde e azul é homogeneizada, independente das disparidades de intensidade nas cores vermelho, verde e azul.
[033]Os intervalos de confiança de intensidade são conhecidos por pixel, o que é muito valioso para qualquer esforço de classificação subsequente. A otimização da SNR oferecida pelo sistema e método pode ser supervisionada (ponderação dos objetos de interesse detectados para calcular os tempos de exposição da próxima aquisição de imagem).
[034]A intensidade, o tempo de exposição e a SNR estimada são determinadas a partir da calibração e da teoria física para cada pixel. Para melhorar ainda mais a qualidade da imagem, a aberração cromática e a distorção da lente também são calibradas e corrigidas para tornar uma imagem livre de tais defeitos.
[035]O sistema e método podem controlar a SNR de pixel para a imagem tanto em um modo automático quanto em um modo supervisionado, em que certas partes da imagem são de interesse em particular. No modo automático, toda a imagem da cena é otimizada, e todos os pixels são tratados igualmente. No modo supervisionado, a cena é adicionalmente analisada quando adquirida para detectar os objetos de interesse. A maximização da SNR favorece os objetos das regiões de interesse.
[036]No modo automático, a aquisição de imagem irá parar após a primeira das três condições seguintes ocorrer: (1) um nível mínimo de SNR é alcançado para todo e qualquer pixel; (2) um número predeterminado de aquisições foi realizado nesta cena; ou (3) o tempo de aquisição máximo permitido foi alcançado.
[037]Referindo-se à FIG. 1, uma vista esquemática do sistema de uma modalidade é ilustrada. O sistema 100 possui três módulos. O primeiro é um módulo de calibração do sistema 110. O módulo de calibração calibra a iluminação da imagem, a óptica utilizada para coletar a imagem, e os dados de linha de base para a nova placa sob avaliação pelo sistema.
[038]O módulo de aquisição de imagem 120 está em comunicação com o módulo de calibração do sistema 110. O módulo de aquisição de imagem captura uma imagem do objeto sob análise. A imagem é capturada usando o tempo de exposição e outros critérios determinados de uma maneira descrita em detalhes aqui posteriormente no contexto dos exemplos específicos. Como discutido acima, a aquisição de imagem prossegue de maneira iterativa até que um limiar de SNR predeterminado seja atingido para cada pixel ou até que um número predeterminado de imagens tenha sido capturado. O módulo de apresentação de imagem fornece a imagem com a melhor amplitude dinâmica (isto é, os pixels não-saturados mais claros que estão logo abaixo da saturação), seja globalmente (isto é, no modo automático) ou restrito aos objetos de interesse (isto é, no modo supervisionado).
[039]Referindo-se à FIG. 2, tanto os dados externos quanto as placas de calibração (isto é, a variedade de combinações de placas de teste e meios de cultura) são usados para calibrar o sistema). A partir da calibração, tanto a calibração do sistema quanto a calibração dos dados são determinadas. Os valores de calibração do sistema e dos dados são usados na aquisição de imagem para uma nova placa. A calibração é usada para validar a nova imagem em termos do mapa de imagem (isto é, quais pixels são regiões fora da placa, que estão dentro da placa, mas meios sem colônias e quais regiões revelam colônias).
[040]A FIG. 3 adicionalmente ilustra os aspectos específicos do equipamento do sistema que são calibrados. Para o(s) componente(s) de iluminação 111, o tempo de aquecimento, a intensidade (À) = f (potência de entrada) e homogeneidade de campo são determinados. Novamente, para as placas de teste, o meio deverá ser homogêneo para a região aplicável (isto é, a placa inteira para uma monoplaca, metade da placa para uma biplaca e uma terceira de uma placa para uma triplaca). Para a calibração óptica 112, determinam-se o alinhamento, as aberrações cromáticas e as distorções geométricas. Para a calibração da câmera 113, os níveis de linha de base são determinados. Tais dados de linha de base são: tempo de aquecimento; linearidade (relação fixa dos valores de cinza e número de fotos que chegam ao sensor) e nível de preto em função do tempo de exposição, SNR em função da intensidade de pixel; homogeneidade de campo; aberrações cromáticas; e distorções geométricas, todos sendo determinados como uma linha de base junto à qual a imagem adquirida é avaliada. Tais dados de linha de base são bem- conhecidos pelos versados na técnica e não são descritos em detalhes adicionais.
[041]A FIG. 4 mostra detalhes adicionais sobre as entradas nos sistemas de calibração (isto é, informações do sistema, a biblioteca de placas de calibração e outras entradas). Para cada placa de calibração, uma imagem é adquirida e cada pixel é designado para valores para nível de preto, SNR, linearidade e iluminação. Para o sistema (isto é, não pixel por pixel), os valores de modelo que refletem fatores do sistema, tal como distorção, aberrações cromáticas, resoluções espaciais e balanço de branco são determinados. Todos esses valores são coletados para proporcionar um sistema calibrado e dados calibrados para uso na avaliação das placas. Como observado abaixo, esses valores são usados para finalizar a aquisição de imagem.
[042]Mais detalhes sobre o módulo de aquisição de imagem são descritos na FIG. 5. Na primeira etapa, uma imagem é adquirida usando valores padrão. A partir dessa primeira imagem, a intensidade, o tempo de exposição e a SNR para cada pixel são determinadas. A intensidade é determinada subtraindo-se o “nível de preto” para o pixel a partir de um valor de intensidade medido. O nível de preto e a SNR são adquiridos a partir da calibração descrita anteriormente.
[043]A aquisição de imagem ocorre nos tempos to, ti, ... tx. Em cada tempo, uma imagem é adquirida através de uma série de N aquisições de imagem. A série de N aquisições de imagem realiza uma iteração para uma SNR para a imagem adquirida que se correlaciona com alta confiança na integridade de imagem.
[044]A aquisição de imagem em um dado tempo (por exemplo, to) e a atualização é ilustrada na FIG. 6. A imagem de uma nova placa 6io é adquirida na etapa 62o. A aquisição de imagem é informada pela calibração do sistema 63o e dos dados 64o. As condições de tráfego de placa (isto é, número de placas por unidade de tempo) também são usadas para calibrar e controlar o sistema. Em um ponto posterior no tempo durante o processo de aquisição de imagem, uma imagem subsequente é adquirida 65o e comparada com a imagem anterior (tanto automaticamente quanto de forma supervisionada). Tipicamente, haverá aproximadamente quatro a aproximadamente dez aquisições de imagem em cada intervalo de tempo para adquirir uma imagem com uma confiança aceitável. Uma vez que a SNR desejada para o objeto selecionado seja adquirida, o tempo de exposição é determinado para a aquisição da imagem final 66o.
[045]De acordo com uma modalidade, os pixels são atualizados como se segue. O valor de cinza, o tempo de exposição de referência e a relação sinal-ruído representam a informação armazenada para cada configuração de iluminação (superior, lateral, inferior, ou uma mistura das mesmas) por placa (objeto de imagem). Esta informação é atualizada após cada nova aquisição. Para começar, esta informação é atualizada usando a primeira aquisição de imagem (N=i).
[046]O valor de cinza, o tempo de exposição de referência e a relação sinal- ruído representam a informação armazenada para cada configuração de iluminação (superior, lateral, inferior, ou uma mistura das mesmas) por placa. Esta informação é atualizada após cada nova aquisição. Para começar, esta informação é inicializada de acordo com a primeira aquisição de imagem (N=1). Em uma modalidade, i é um valor de cinza (gv) na posição de imagem (x,y) correspondendo à 1a captura de imagem (N=1) da placa usando o tempo de exposição e a respectiva Relação Sinal-Ruído (-■'“:;-•). Nesta modalidade: • 5. é o ponto de valor de referência de preto em (x,y) correspondendo ao tempo de exposição ; • ^ * é o ponto de tempo de referência atualizado em (x,y) após 1 aquisição; • ^ .. é o valor de cinza atualizado em x,y após 1 aquisição no tempo de exposição equivalente ~ . i; • >-'- .. - .1 é a SNR atualizada em x,y após 1 aquisição;
[047]O nível de preto é ruidoso e o processo de aquisição de imagem iterativa obtém uma imagem que é "menos ruidoso" (isto é, uma imagem com um nível de confiança maior). O valor de preto é um valor padrão que não é recalculado durante a aquisição de imagem. O valor de preto é em função do tempo de exposição.
[048]SNR = 0 quando um pixel está saturando para um dado tempo de exposição (portanto, nenhum aprimoramento na SNR) e intensidade de fonte de luz. Somente os valores dos pixels não-saturados são atualizados.
[049]N=1: O tempo de exposição inicial é o melhor tempo de exposição padrão conhecido (a priori), ou um valor arbitrário (por exemplo: (tempo de exposição Max + tempo de exposição Min)/2). Isso é determinado a partir da calibração para a placa e meio em particular para a nova placa sob análise.
[050]O valor de cinza, o tempo de exposição de referência e a relação sinal- ruído são atualizados após cada nova aquisição de imagem (isto é, N=2, 3, 4 . . . N) de acordo com a seguinte modalidade. O valor de cinza s’- para a posição de imagem (x,y) corresponde à enésima captura de imagem da placa usando o tempo de exposição e a respectiva Relação Sinal-Ruído (J - ■. ■ ). Nesta modalidade: • é o ponto de valor de referência de preto em (x,y) correspondendo ao tempo de exposição ;':■:; • ^ é o ponto de tempo de referência atualizado em (x,y) após N aquisições; • é o valor de cinza atualizado em (x,y) após N aquisições no tempo de exposição equivalente - ■. ■ ; e • >-'- é a SNR atualizada em x,y após N aquisições.
[051]Portanto, a SNR atualizada para um pixel na enésima aquisição de imagem é a raiz quadrada da relação sinal-ruído atualizada elevada ao quadrado da aquisição de imagem atual. Cada aquisição fornece um valor atualizado (por exemplo, E’x,y,N) para cada pixel. Este valor atualizado é então usado para calcular o valor atualizado para a próxima aquisição de imagem. SNR = 0 para um pixel quando um pixel está saturando para um dado tempo de exposição e intensidade da fonte de luz. Somente os pixels não-saturados são ‘atualizados. O enésimo tempo de exposição corresponde a uma otimização supervisionada, cujo objetivo é maximizar a SNR para os objetos de interesse. O objeto de interesse pode ser toda a placa, as colônia, uma parte da placa ou toda a imagem.
[052]Após atualizar os dados de imagem com uma nova aquisição, o sistema de aquisição é capaz de propor o próximo melhor tempo de aquisição que maximizaria a SNR de acordo com as restrições ambientais (SNR mínima necessária, restrições de saturação, tempo de aquisição máxima permitida, região de interesse). Nas concretizações em que a aquisição de imagem é supervisionada: x,y E objeto implica que, no modo supervisionado, os pixels do objeto somente são considerados para as avaliações. Nessas concretizações em que a aquisição de imagem não é supervisionada, o objeto padrão é a imagem inteira.
[053]Com referência à FIG. 7, a partir da análise da imagem adquirida, o tempo de exposição para a próxima imagem (N+1) na série de aquisição de imagem em um dado intervalo de tempo é determinado usando ou o modo automático ou o modo supervisionado descrito acima. Referindo-se à FIG. 7, para o processo automatizado, cada pixel é ponderado igualmente (isto é, designa-se um valor de 1). Para a abordagem supervisionada, os pixels associados a objetos (por exemplo, culturas) são ponderados de maneira diferente. O processo supervisionado requer etapas de imagiologia adicionais. Se uma fração significativa (por exemplo, maior do que 1 em 100.000) de pixels estiver saturando e seus pesos não forem igual a 0, então se propõe um novo tempo de exposição que é mais curto (por exemplo, 1/5) do que o tempo de exposição mínimo anterior usado para capturar a imagem. Este ajuste aprimora a probabilidade de adquirir informação não-saturada para os pixels em saturação. Em concretizações alternativas, um novo tempo de exposição é calculado. Se não houver saturação de pixel significativa, então, para cada pixel, a partir do mapa de exposição e intensidade, o tempo de exposição máximo que não resultará na saturação de pixel é determinado. A partir disso, um tempo de exposição para a imagem é determinado, e uma imagem de intensidade é simulada. A partir disso, o mapa de SNR ponderado correspondente é determinado.
[054]Referindo-se à FIG. 8, a imagem de amostra é usada para atualizar os dados de imagem, pixel por pixel, no mapa de imagem. Esses dados de amostra são então alimentados ao analisador de imagem e a análise de imagem é realizada informada por restrições predeterminadas na SNR para cada pixel, outras restrições de saturação, restrições de objeto, etc. e restrições de tempo ou tráfego (isto é, a duração da captura e da análise).
[055]Em uma modalidade especificamente, a imagem adquirida é analisada pixel por pixel em busca de pixels saturados. Se EN resultar numa saturação de pixel que exceda limites predeterminados, um valor inferior para EN+1 é selecionado. Por exemplo, o tempo de exposição mínimo não foi adquirido ainda e o percentual de pixels saturados (*v xy,NE.(xv V ■' '= çr.jat) excede o limite predeterminado (por exemplo > 1/105) um novo tempo de exposição é proposto em um incremento predeterminado (por exemplo, um quinto do tempo de exposição mínimo anteriormente utilizado. O limite inferior (isto é, o tempo de exposição mínimo aceitável) também é predeterminado. Essas restrições sobre o tempo de exposição permitem convergência mais rápida para condições de aquisição de imagem sem saturação.
[056]Uma nova imagem é adquirida no novo tempo de exposição. Para a nova imagem, as restrições verificadas secundárias são a SNR mínima desejada por pixel (esta é o limiar SNR inferior) e o tempo de aquisição geral (ou Nmax) permitido para essa imagem. Se o tempo de aquisição geral para esta cena tiver alcançado o limite de tempo, ou se cada SNR atualizada para cada pixel for tal que s então os dados de imagem são considerados aceitáveis e a aquisição da cena termina para o intervalo de tempo (por exemplo, t0). Quando a aquisição de imagem começa no tempo tx (por exemplo, t1), o melhor tempo de exposição (ENfinal) levando a condições de sub-saturação a partir da exposição de aquisição anterior (por exemplo, no tempo t0) é usado como o valor inicial para E. O processo para aquisição de imagem em tx é, em outros casos, idêntico ao processo no tempo to.
[057]Se a restrição de saturação for suspensa (nenhuma saturação significativa), o próximo tempo de exposição ideal é determinado e investigado. Primeiramente, os limites de tempo de exposição são calculados sobre a região de interesse. Esses limites de tempo de exposição são: I) o tempo de exposição para saturar os pixels mais claros; e ii) o tempo de exposição para saturar os pixels mais escuros.
[058]O tempo de exposição para saturar os pixels não-saturados mais claros, , é determinado a partir do valor de cinza que corresponde à intensidade máxima absoluta e Es-„, (seu tempo de exposição relacionado) a partir do seguinte:
[059]O tempo de exposição para saturar os pixels não-saturados mais claros, , é determinado a partir do valor de cinza que corresponde à intensidade máxima absoluta e (seu tempo de exposição relacionado) a partir do seguinte:
[060]O próximo tempo de exposição ideal é escolhido dentre todos os tempos de exposição candidatos dentro de Emax e Emin por simulação. Especificamente, um tempo de exposição é determinado por simulação que irá maximizar a SNR média atualizada (para todos os pixels abaixo do limiar de relação sinal-ruído mínimo), após adicionar a imagem simulada no tempo de exposição testado ^=-.-:,.-i. A imagem simulada em é gerada como se segue (para todo e qualquer pixel). gv' t
[061]O valor de cinza " •-- . . são dados de pixel correspondendo aos dados de imagem atualizados atuais. Se um novo ponto de tempo E∑es∑x-i for selecionado, o valor de cinza esperado é:
[062]Após atualizar este calor com um valor para o pixel a partir da imagem simulada na imagem no ponto de tempo , a SNR para este pixel (x, y) será:
[063]O próximo melhor tempo de exposição é então determinado por: Se a aquisição e análise de imagem for supervisionada x, y e objeto, a SNR é integrada somente para os objetos de interesse.‘ No modo automático, o objeto é a iagem inteira.
[064]A FIG. 9 descreve as etapas finais para aquisição de imagem. Essas etapas são técnicas de processamento de imagem convencionais bem-conhecidas pelos versados na técnica e não são descritas em detalhes aqui.
[065]A FIG. 10 ilustra o método pelo qual a integridade do sistemas é determinada durante a aquisição da imagem. Observe que, uma vez que a integridade do sistema seja verificada, as amostras são carregadas no sistema e os dados das amostras são capturados. A captura de dados é informada pela informação de calibração, como discutido acima. Os dados capturados são fornecidos tanto para a verificação de integridade do sistema quanto para um analisador de eventos do sistema.
[066]Uma vez que a imagem tenha sido adquirida como descrito acima, ela é comparada com uma imagem da placa que foi incubada por um período de tempo diferente. Por exemplo, uma imagem de uma placa é adquirida como descrito aqui após a placa ter sido incubada por quatro horas (T1=4). Após quatro ou mais horas, outra imagem da placa é adquirida como descrito acima (Tx=8 hrs). A imagem de alta SNR adquirida em Tx+1 pode então ser comparada com a imagem de alta SNR em tX. As alterações nas duas imagens são avaliadas para averiguar evidências de crescimento microbiano. As decisões sobre o processamento adicional (por exemplo, a placa é positiva, a placa é negativa, a placa requer incubação adicional) se baseiam nesta comparação.
[067]Embora a invenção aqui apresentada tenha sido descrita com referência a concretizações específicas, deve-se compreender que essas concretizações são meramente ilustrativas dos princípios e aplicações da presente invenção. Portanto, deve-se entender que diversas modificações podem ser feitas nas modalidades ilustrativas e que outras configurações podem ser concebidas sem divergir do espírito e âmbito da presente invenção, conforme definido pelas reivindicações em anexo.
Claims (14)
1. Sistema para imagiologia de amostras biológicas dispostas em meio de cultura, o sistema CARACTERIZADO por compreender: um módulo de calibração de sistema que proporciona valores padrão para capturar uma imagem de uma amostra biológica disposta em meio de cultura disposto em uma placa; um módulo de aquisição de imagem compreendendo uma câmera, em que o módulo de aquisição de imagem é adaptado para adquirir dados para uma série de imagens em um dado intervalo de tempo, em comunicação com o módulo de calibração de sistema, a aquisição de imagem configurada para: i) adquirir dados para uma primeira imagem usando valores padrão para fluxo de fótons e tempo de exposição a partir do módulo de calibração de sistema e criar um mapa pixel por pixel dos dados de imagem, cada pixel associado a uma relação sinal-ruído (SNR), um fluxo de fótons e tempo de exposição, e uma intensidade, ii) atualizar o tempo de aquisição de imagem por meio de análise dos dados de imagem para identificar pixels saturados e selecionar um dentre um novo fluxo de fótons, um novo tempo de exposição, ou ambos, com base em se uma relação de pixels saturados para não saturados é maior ou menor do que um limiar de saturação predeterminado e, com base nessa determinação, iii) usar o novo valor para o fluxo de fótons, o tempo de exposição, ou ambos, para adquirir dados para uma nova imagem, e iv) atualizar o mapa dos dados de imagem com os novos valores para a relação sinal-ruído, o fluxo de fótons, o tempo de exposição, ou ambos, e a intensidade de pixel, em que o módulo de aquisição de imagem é configurado para adquirir dados para uma nova imagem se a relação sinal-ruído dos pixels insaturados for menor do que um limiar de SNR predeterminado ou se o número de pixels saturados exceder o limiar de saturação predeterminado, em que o módulo de aquisição de imagem finaliza a aquisição de imagem quando a relação sinal-ruído de pixels insaturados satisfaz ou excede o limiar de SNR predeterminado, um tempo alocado predeterminado para aquisição de imagem tiver decorrido, ou um número máximo predeterminado de imagens tiver sido adquirido; e um módulo de apresentação de imagem que transforma os dados de imagem a partir do módulo de aquisição de imagem em uma imagem para visualização ou análise.
2. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o fluxo de fótons é um valor definido e o sistema controla uma integração de sensor de câmera pelo controle de tempo de exposição, em que o módulo de calibração determina fluxo de fótons padrão e tempo de exposição para uma variedade de placas e meios de cultura.
3. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a relação sinal-ruído é determinada para pelo menos uma parte da imagem da amostra disposta no meio de cultura.
4. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o módulo de aquisição de imagem adquire dados de imagem a partir da câmera para pelo menos um ou mais canais ou uma ou mais bandas espectrais.
5. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o módulo de aquisição de imagem atribui um valor de cinza para cada pixel para cada aquisição de imagem, e o valor de cinza para cada pixel é atualizado após cada aquisição de imagem.
6. Sistema, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o valor de cinza atualizado é o valor de cinza anterior menos um valor de referência predeterminado, em que o valor de referência predeterminado é um valor predeterminado baseado na placa, o meio de placa e o tempo de exposição para o módulo de aquisição de imagem atribuem um valor de cinza para cada pixel para cada aquisição, e o valor de cinza para cada pixel é atualizado após cada aquisição de imagem.
7. Sistema, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o novo valor para o fluxo de fótons é adquirido usando um novo tempo de exposição ou um novo valor de intensidade de luz, ou ambos.
8. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o módulo de aquisição de imagem é configurado para operar em pelo menos um dentre um modo automático onde todos os pixels são tratados igualmente ou um modo supervisionado, onde os pixels analisados são aqueles que foram identificados como associados a um ou mais objetos de interesse.
9. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o fluxo de fótons é um valor definido e o sistema controla uma integração de sensor de câmera mediante o controle de tempo de exposição.
10. Método para imagiologia de amostras biológicas dispostas em meio de cultura, o método CARACTERIZADO por compreender: determinar valores padrão para adquirir uma imagem de uma amostra biológica disposta em meio de cultura suportado em uma placa; adquirir dados correspondendo a uma série de imagens em um primeiro tempo durante um primeiro intervalo de tempo, os dados da primeira imagem na série sendo adquiridos usando padrões predeterminados para fluxo de fótons e tempo de exposição; criar um mapa pixel por pixel dos dados de imagem; associar dados para cada pixel a uma relação sinal-ruído (SNR), um valor para fluxo de fótons, tempo de exposição, e uma intensidade; atualizar pelo menos um dentre o valor de fluxo de fótons de imagem e o valor de tempo de exposição por meio de: i) analisar os dados de imagem para pixels saturados e da relação sinal-ruído para os pixels, e selecionar um novo valor para pelo menos um dentre fluxo de fótons e tempo de exposição com base em se uma relação de pixels saturados para não saturados é maior ou menor do que um limiar predeterminado e se a relação sinal-ruído de pixels insaturados satisfaz ou excede um limiar de SNR predeterminado e, com base nessa determinação, usar o novo valor para fluxo de fótons, tempo de exposição, ou ambos, para adquirir uma nova imagem e atualizar o mapa da imagem com os novos valores para relação sinal-ruído, fluxo de fótons e tempo de exposição, e intensidade de pixels, ii) adquirir dados para a nova imagem usando o pelo menos um novo valor para fluxo de fótons e tempo de exposição, e iii) opcionalmente, repetir as etapas i) e ii); finalizar a aquisição de dados de imagem para o intervalo de tempo quando os dados de imagem estiverem no ou acima do limiar de SNR predeterminado, um tempo alocado máximo predeterminado para aquisição de imagem tenha decorrido, ou um número máximo predeterminado de imagens tiver sido adquirido; repetir as etapas de adquirir, criar, associar, atualizar e finalizar para um segundo tempo durante um segundo intervalo de tempo; e transformar os dados de imagem adquiridos nos primeiro e segundo intervalos de tempo em primeira e segunda imagens, a primeira imagem adquirida no primeiro tempo e a segunda imagem adquirida em um segundo tempo.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o valor para fluxo de fótons é constante e o valor de tempo de exposição atualizado, e em que os valores padrão predeterminados são baseados em placa, cultura de placa e tempo de exposição.
12. Método, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO por adicionalmente compreender determinar os pixels para os quais o mapa de imagem será criado, em que os pixels são associados a um objeto de interesse.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que os valores padrão compreendem um nível de preto para os pixels associados a um objeto de interesse em um tempo de exposição padrão.
14. Método, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o mapa pixel por pixel é um valor de cinza, a relação sinal-ruído e o tempo de exposição para cada pixel.
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