BR112021011795A2 - Sistema e método para monitorar o crescimento bacteriano de colônias bacterianas e prever biomassa de colônia - Google Patents

Abstract

sistema e método para monitorar o crescimento bacteriano de colônias bacterianas e prever biomassa de colônia. um método de formação de imagem para detecção precoce de crescimento microbiano. o método usa imagens para determinada biomassa da colônia, e a biomassa da colônia determina quando a colônia pode ser escolhida para análise para identificação ou teste de susceptibilidade a antibióticos. se a fonte de amostra não for uma fonte de amostra pura, pode ser necessária incubação adicional para permitir um aumento na biomassa das colônias antes da escolha.

Description

SISTEMA E MÉTODO PARA MONITORAR O CRESCIMENTO BACTERIANO DE COLÔNIAS BACTERIANAS E PREVER BIOMASSA DE COLÔNIA PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica a prioridade do Pedido Provisório US No. 62/782,513 depositado em 20 de dezembro de 2018, a totalidade do qual é incorporada neste documento por referência.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] Há um foco maior em imagens digitais de placas de cultura para detecção de crescimento microbiano. Técnicas para formação de imagens de placas de cultura para detectar crescimento microbiano nas mesmas são descritas na Publicação PCT No. WO/2015/114121 intitulada, "A System and Method for Image Acquisition Using Supervised High Quality Imaging", que foi publicada em 6 de agosto de 2016, WO/2016/172527 intitulado "Colony Contrast Gathering", que foi publicado em 27 de outubro de 2016 e WO/2016/172532, intitulado "A Method and System for Automated Microbial Colony counting from Streaked Sample on Plated Media", que foi publicado em 27 de outubro de 2017, cuja totalidade é incorporada neste documento por referência. Todas as referências acima são comumente atribuídas com o presente pedido.

[003] WO/2015/114121 descreve técnicas para identificar objetos de colônia e diferenciar esses objetos de artefatos de não colônia e fundo, controlando a relação sinal-ruído. WO/2016/172527 descreve um sistema e método que interpreta imagens de placa de cultura com base em técnicas de formação de imagem automatizadas. Objetos de colônia são identificados no início do processo para facilitar o crescimento microbiano em meio nutriente e as mudanças nesses objetos identificados são observadas ao longo do tempo e sob condições que suportam o crescimento de colônias bacterianas. WO/2016/172532 descreve um sistema e método pelo qual as colônias identificadas são contadas para determinar se as colônias vêm do mesmo microrganismo e ainda determinar se a contagem de colônias atende ou excede um número predeterminado.

[004] A detecção de colônias, enumeração de colônias, diferenciação de populações de colônias e identificação de colônias definem os objetivos para um sistema de formação de imagem de microbiologia moderno. Ter esses objetivos realizados com antecedência atinge as metas de entregar resultados a um paciente rapidamente e fornecer esses resultados e análises de maneira econômica. Automatizar o fluxo de trabalho do laboratório e a tomada de decisões pode melhorar a velocidade e o custo em que esses objetivos podem ser alcançados.

[005] Embora um progresso significativo tenha sido feito em relação às tecnologias de formação de imagem para detectar evidências de crescimento microbiano, ainda se busca estender essas tecnologias de formação de imagem para suportar um fluxo de trabalho automatizado. Aparelhos e métodos para inspecionar placas de cultura para indicações de crescimento microbiano são difíceis de automatizar, devido em parte à natureza altamente visual da inspeção de placas. A este respeito, é desejável desenvolver técnicas que possam interpretar automaticamente as imagens da placa de cultura e determinar as próximas etapas a serem realizadas (por exemplo, identificação de colônias, teste de suscetibilidade, etc.) com base na interpretação automatizada.

[006] Identificar e distinguir colônias em uma cultura plaqueada pode ser difícil, especialmente quando as colônias são de tamanhos e formatos diferentes e se tocam. As colônias que “crescem” entre si tornam mais difícil escolher a colônia de interesse, devido ao risco de colher microrganismo de uma colônia adjacente, onde essa colônia adjacente é um microrganismo diferente. A escolha de uma amostra de uma colônia para processamento posterior requer uma quantidade adequada da colônia e pureza da colônia alvo para evitar a escolha de várias espécies de micro- organismos, que contaminariam os resultados do teste a jusante. Esses problemas são agravados quando o crescimento já atingiu a confluência em algumas regiões da placa. Por essas razões, é preferível, se possível, identificar as colônias e determinar o crescimento antecipadamente no processo. No entanto, o tempo de incubação ainda é necessário para permitir pelo menos algum crescimento das colônias. Assim, por um lado, quanto mais tempo as colônias podem crescer, mais elas começam a contrastar com sua origem e entre si, e se torna mais fácil identificá-las. Porém, por outro lado, se as colônias crescerem muito e começarem a encher as placas e/ou se tocarem, fica mais difícil escolher uma colônia pura. Se alguém fosse capaz de detectar colônias em um tempo de incubação quando as colônias ainda fossem pequenas o suficiente para serem isoladas umas das outras - apesar do contraste relativamente pobre - mas grande o suficiente para fornecer uma quantidade adequada de amostra para teste, este problema poderia ser minimizado ou mesmo resolvido.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007] Um método automatizado para avaliar o crescimento microbiano em meios plaqueados é descrito aqui. De acordo com o método, um meio de cultura provido é inoculado com uma amostra biológica disposta em um recipiente que é substancialmente opticamente transparente. O meio de cultura inoculado é incubado em uma incubadora. O meio de cultura inoculado é colocado no recipiente opticamente transparente que transporta o meio de cultura inoculado em um aparelho de formação de imagem digital. O método automatizado também inclui a obtenção de uma primeira imagem digital do meio inoculado em um primeiro tempo (t0), a primeira imagem digital tendo uma pluralidade de pixels. O método automatizado também inclui a determinação de coordenadas dos pixels na primeira imagem digital em relação ao recipiente transparente que transporta o meio de cultura inoculado. O método automatizado também inclui a remoção do recipiente transparente que transporta o meio de cultura inoculado do aparelho de formação de imagem digital e a colocação do meio de cultura inoculado na incubadora para posterior incubação.

O método automatizado também inclui, após incubação adicional, colocar o recipiente transparente que transporta o meio de cultura inoculado no aparelho de formação de imagem digital.

O método automatizado também inclui a obtenção de uma segunda imagem digital do meio inoculado em um segundo tempo (tx), a segunda imagem digital tendo uma pluralidade de pixels.

O método automatizado também inclui o alinhamento da primeira imagem digital com a segunda imagem digital, de modo que as coordenadas de um pixel na segunda imagem digital correspondam às coordenadas de um pixel correspondente na primeira imagem digital.

O método automatizado também inclui a comparação dos pixels da segunda imagem digital com os pixels correspondentes da primeira imagem digital.

O método automatizado também inclui a identificação de pixels que mudaram entre a primeira imagem digital e a segunda imagem digital, onde os pixels que não mudaram entre a primeira imagem digital e a segunda imagem digital são indicativos de fundo.

O método automatizado também inclui determinar quais dos pixels identificados na segunda imagem digital têm um nível predeterminado de contraste de limite com pixels indicativos de fundo.

O método automatizado também inclui a identificação de um ou mais objetos na segunda imagem digital, cada objeto incluindo pixels que possuem o referido nível de contraste de limite com os pixels indicativos de fundo e que não estão separados uns dos outros por pixels de fundo.

O método automatizado também inclui correlacionar os objetos identificados com uma biomassa.

O método automatizado também inclui determinar se a amostra biológica é identificada como uma amostra pura e, em caso afirmativo, determinar ainda se a biomassa está acima de um primeiro limite, sendo o primeiro limite uma área predeterminada do meio de cultura coberto pelo objeto identificado, e, se a área do objeto identificado estiver acima do primeiro limite, pegar pelo menos uma porção do material em crescimento para análise posterior.

O método automatizado também inclui, se a amostra biológica não for uma amostra pura,

incubar ainda mais o meio de cultura inoculado no recipiente opticamente transparente.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[008] A figura 1 é um diagrama esquemático de um sistema para análise de imagem e teste de uma cultura de acordo com um aspecto da divulgação.

[009] A figura 2 é um fluxograma que ilustra uma rotina de fluxo de trabalho de laboratório automatizado para análise de imagem e teste de uma cultura de acordo com um aspecto da divulgação.

[010] As figuras 3A, 3B e 3C são imagens que mostram um contraste temporal por uma representação visual da morfologia da colônia à medida que muda ao longo do tempo de acordo com um aspecto da divulgação.

[011] As figuras 3D e 3E são imagens que mostram o contraste espacial sob diferentes condições de iluminação.

[012] A figura 4 é um fluxograma de uma rotina de exemplo para obter e analisar informações de imagem de acordo com um aspecto da divulgação.

[013] A figura 5 é um fluxograma de uma rotina de exemplo para obter contraste espacial de acordo com um aspecto da divulgação.

[014] A figura 6 é um fluxograma de uma rotina de exemplo para obter contraste temporal de acordo com um aspecto da divulgação.

[015] A figura 7 é um fluxograma de uma rotina de exemplo para filtrar artefatos de uma imagem de acordo com um aspecto da divulgação.

[016] A figura 8 é um fluxograma de uma rotina de exemplo para rotular pixels de uma imagem de acordo com um aspecto da divulgação.

[017] A figura 9 é um fluxograma de uma rotina de exemplo para separar colônias em objetos separados de acordo com um aspecto da divulgação.

[018] A figura 10 é um fluxograma de uma rotina de segmentação de objeto de exemplo de acordo com um aspecto da divulgação.

[019] A figura 11 é uma ilustração que mostra medições de colônias confluentes como parte da rotina de segmentação da figura 10.

[020] A figura 12 é um diagrama de Voronoï de acordo com um aspecto da divulgação.

[021] As figuras13A, 13B e 13C são diagramas que ilustram medições de fator de isolamento de acordo com um aspecto da divulgação.

[022] A figura 14 é um diagrama que ilustra as regiões de Voronoï de influência de acordo com um aspecto da divulgação.

[023] As figuras 15A, 15B e 15C são imagens que ilustram uma caracterização do crescimento da colônia de acordo com um aspecto da divulgação.

[024] As figuras 16A e 16B mostram uma seção de uma placa de imagem, com imagens ampliadas e reorientadas de colônias de amostra da imagem.

[025] A figura 16C mostra diagramas de vetor das respectivas imagens da figura 16B.

[026] A figura 17 representa SHQI, contraste espacial e imagens de contraste temporal de um espécime de acordo com um aspecto da divulgação.

[027] A figura 18 é um fluxograma comparando a linha do tempo da rotina da figura 2 à linha do tempo de uma rotina realizada manualmente comparável.

[028] A figura 19 é uma ilustração da linha do tempo de crescimento que produzirá uma identificação de candidatos a colônias de tamanho suficiente para suportar a escolha das colônias.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[029] A presente divulgação provê aparelhos, sistemas e métodos para identificar e analisar o crescimento microbiano no meio plaqueado com base, pelo menos em parte, no contraste detectado em uma ou mais imagens digitais do meio plaqueado. Muitos dos métodos descritos neste documento podem ser total ou parcialmente automatizados, tal como sendo integrados como parte de um fluxo de trabalho de laboratório total ou parcialmente automatizado.

[030] Os sistemas descritos neste documento são capazes de ser implementados em sistemas ópticos para formar imagens de amostras de microbiologia para a identificação de micróbios e a detecção de crescimento microbiano de tais micróbios. Existem muitos desses sistemas disponíveis comercialmente, que não são descritos em detalhes neste documento. Um exemplo é o sistema inteligente de incubação e formação de imagem BD Kiestra™ ReadA Compact. Outros exemplos de sistemas incluem aqueles descritos na Publicação PCT No. WO2015/114121 e na Publicação de Patente U.S. 2015/0299639, cuja totalidade é aqui incorporada por referência. Essas plataformas de imagem óptica são bem conhecidas daqueles versados na técnica e não são descritas em detalhes neste documento.

[031] A figura 1 é um esquemático de um sistema 100 tendo um módulo de processamento 110 e dispositivo de aquisição de imagem 120 (por exemplo, câmera) para prover imagens de alta qualidade de meio plaqueado. O módulo de processamento e o dispositivo de aquisição de imagem podem ser ainda conectados e, assim, interagir ainda mais com outros componentes do sistema, tais como um módulo de incubação (não mostrado) para incubar o meio plaqueado para permitir o crescimento de uma cultura inoculada no meio plaqueado. Essa conexão pode ser total ou parcialmente automatizada por meio de um sistema de rastreamento que recebe os espécimes para incubação e os transporta para a incubadora e, em seguida, entre a incubadora e o dispositivo de aquisição de imagem.

[032] O módulo de processamento 110 pode instruir os outros componentes do sistema 100 para executar tarefas com base no processamento de vários tipos de informação. O processador 110 pode ser hardware que realiza uma ou mais operações. O processador 110 pode ser qualquer processador padrão, tal como uma unidade de processamento central (CPU), ou pode ser um processador dedicado, tal como um circuito integrado específico de aplicação (ASIC) ou uma arranjo de portas programáveis em campo (FPGA). Embora um bloco de processador seja mostrado, o sistema 100 também pode incluir vários processadores que podem ou não operar em paralelo, ou outra lógica e memória dedicadas para armazenar e rastrear informações relacionadas aos recipientes de amostra na incubadora e/ou dispositivo de aquisição de imagem 120. A este respeito, a unidade de processamento pode rastrear e/ou armazenar vários tipos de informações sobre um espécime no sistema 100, incluindo, mas não se limitando à localização do espécime no sistema (incubadora ou dispositivo de aquisição de imagem, localizações e/ou orientação nele, etc.), o tempo de incubação, informações de pixel das imagens capturadas, o tipo de amostra, o tipo de meio de cultura, informações de manuseio preventivo (por exemplo, espécimes perigosos), etc. A este respeito, o processador pode ser capaz de automatizar total ou parcialmente as várias rotinas aqui descritas. Em uma modalidade, as instruções para realizar as rotinas descritas neste documento podem ser armazenadas em um meio legível por computador não transitório (por exemplo, um programa de software).

[033] A figura 2 é um fluxograma que mostra um exemplo de rotina de laboratório automatizado 200 para geração de imagens, análise e, opcionalmente, teste de uma cultura. A rotina 200 pode ser implementada por um sistema automatizado de laboratório de microbiologia, tal como o BD Kiestra™ Total Lab Automation ou BD Kiestra™ Work Cell Automation. Os sistemas de exemplo incluem módulos interconectados, cada módulo configurado para executar uma ou mais etapas da rotina 200.

[034] Em 202, um meio de cultura é provido e inoculado com uma amostra biológica. O meio de cultura pode ser um recipiente opticamente transparente, de modo que a amostra biológica possa ser observada no recipiente enquanto iluminada a partir de vários ângulos. A inoculação pode seguir um padrão predeterminado. Padrões de estriamento e métodos automatizados para estriamento de uma amostra em uma placa são bem conhecidos por aqueles versados na técnica e não são discutidos em detalhes neste documento. Um método automatizado usa grânulos controlados magneticamente para espalhar a amostra na placa. Em 204, o meio é incubado para permitir o crescimento da amostra biológica.

[035] Em 206, uma ou mais imagens digitais do meio e da amostra biológica são capturadas. Como será descrito em mais detalhes abaixo, a imagem digital do meio pode ser realizada várias vezes durante o processo de incubação (por exemplo, no início da incubação, em um momento no meio da incubação, no final da incubação) para que as mudanças no meio possam ser observadas e analisadas. A imagem do meio pode envolver a remoção do meio da incubadora. Onde várias imagens são tiradas do meio em momentos diferentes, o meio pode ser devolvido à incubadora para posterior incubação entre as sessões de formação de imagem.

[036] Em 208, a amostra biológica é analisada com base nas informações das imagens digitais capturadas. A análise da imagem digital pode envolver a análise das informações de pixel contidas na imagem. Em alguns casos, as informações de pixel podem ser analisadas em uma base de pixel a pixel. Em outros casos, as informações de pixel podem ser analisadas em uma base de bloco a bloco. Em ainda outros casos, os pixels podem ser analisados com base em regiões inteiras de pixels, em que as informações de pixels de pixels individuais na região podem ser derivadas combinando informações dos pixels individuais, selecionando pixels de amostra ou usando outros métodos estatísticos, tais como as operações de histograma estatístico descritas em mais detalhes abaixo. Na presente divulgação, as operações que são descritas como sendo aplicadas a "pixels" são igualmente aplicáveis a blocos ou outros agrupamentos de pixels, e o termo "pixel" se destina a incluir tais aplicações.

[037] A análise pode envolver determinar se o crescimento é detectado no meio. A partir de uma perspectiva de análise de imagem, o crescimento pode ser detectado em uma imagem que identifica um objeto com imagem (com base nas diferenças entre o objeto e seus arredores adjacentes) e, em seguida, identificar mudanças no objeto ao longo do tempo. Conforme descrito em mais detalhes neste documento, essas diferenças e mudanças são ambas formas de "contraste". Além de detectar o crescimento, a análise de imagem em 108 pode ainda envolver quantificar a quantidade de crescimento detectado, identificar colônias distintas, identificar colônias irmãs, etc.

[038] Em 210, é determinado se a amostra biológica (particularmente, as colônias irmãs identificadas) exibe um crescimento quantitativamente significativo. Se nenhum crescimento, ou uma quantidade insignificante de crescimento, for encontrado, então a rotina 200 pode prosseguir para 220, na qual um relatório final é produzido. No caso de avançar de 210 para 220, o relatório final provavelmente indicará a falta de crescimento significativo, ou relatará o crescimento da flora normal.

[039] Se for determinado que a amostra biológica exibe um crescimento quantitativamente significativo, então em 212, uma ou mais colônias podem ser colhidas das imagens com base na análise anterior. A coleta de colônias pode ser um processo totalmente automatizado, no qual cada uma das colônias coletadas é amostrada e testada. Alternativamente, a coleta de colônias pode ser um processo parcialmente automatizado, no qual múltiplas colônias candidatas são automaticamente identificadas e apresentadas visualmente em uma imagem digital para um operador, de modo que o operador pode inserir uma seleção de um ou mais candidatos para amostragem e testes adicionais. A amostragem de colônias selecionadas ou colhidas pode ser automatizada pelo sistema.

[040] Em 214, uma colônia amostrada é preparada para os testes adicionais, como por plaqueamento da amostra em uma suspensão de organismo. Em 216, a amostra é testada usando formação de imagem por ionização de dessorção a laser assistida por matriz (MALDI) para identificar o tipo de espécime que foi amostrada do meio original. Em 218, a amostra também é, ou alternativamente, submetida a teste de sensibilidade a antibióticos (AST) para identificar possíveis tratamentos para a espécime identificada.

[041] Em 220, os resultados do teste são emitidos em um relatório final. O relatório pode incluir os resultados de MALDI e AST. Conforme mencionado acima, o relatório também pode indicar uma quantificação do crescimento do espécime. Assim, o sistema automatizado é capaz de iniciar com um meio de cultura inoculado e gerar um relatório final referente a um espécime encontrado na cultura, com pouca ou nenhuma entrada adicional.

[042] Em rotinas, como a rotina de exemplo da figura 2, as colônias detectadas e identificadas são frequentemente referidas como Unidades Formadoras de Colônias (UFC). UFCs são objetos microscópicos que começam como uma ou algumas bactérias. Com o tempo, a bactéria cresce para formar uma colônia. Quanto mais cedo as bactérias são colocadas na placa, menos bactérias há para serem detectadas e, consequentemente, menor a colônia e menor o contraste com o fundo. Dito de outra forma, um tamanho de colônia menor produz um sinal menor, e um sinal menor em um fundo constante resulta em um contraste menor. Isso é refletido pela seguinte equação: | | (1) 𝐶𝑜𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑡𝑒 =

[043] O contraste pode desempenhar um papel importante na identificação de objetos, tais como CFUs ou outros artefatos, nas imagens. Um objeto pode ser detectado em uma imagem se for significativamente diferente em brilho, cor e/ou textura de seus arredores. Uma vez que um objeto foi detectado, a análise também pode envolver a identificação do tipo de objeto que foi detectado. Essas identificações também podem se basear em medidas de contraste, tais como a suavidade das bordas do objeto identificado ou a uniformidade (ou falta de uniformidade) da cor e/ou brilho do objeto. Este contraste deve ser grande o suficiente para superar o ruído da imagem (sinais de fundo) para ser detectado pelo sensor de imagem.

[044] A percepção humana de contraste (regida pela lei de Weber) é limitada. Em condições ideais, os olhos humanos podem detectar uma diferença de nível de luz de 1%. A qualidade e a confiança das medições de imagem (por exemplo, brilho, cor, contraste) podem ser caracterizadas por uma relação sinal-ruído (SNR) das medições, em que um valor SNR de 100 (ou 40db usando 20log10), independente de intensidades de pixel, corresponderiam às capacidades de detecção humana. As técnicas de formação de imagem digital que utilizam informações de imagem de SNR alta e SNR conhecida por informações de pixel podem permitir a detecção de colônias mesmo quando essas colônias ainda não forem visíveis aos olhos humanos.

[045] Na presente divulgação, o contraste pode ser coletado de pelo menos duas maneiras: espacialmente e temporalmente. O contraste espacial, ou contraste local, quantifica a diferença de cor ou brilho entre uma determinada região (por exemplo, pixel, grupo de pixels adjacentes) e seus arredores em uma única imagem. O contraste temporal, ou contraste de tempo, quantifica a diferença de cor ou brilho entre uma determinada região de uma imagem em relação à mesma região em outra imagem tirada em um momento diferente. A fórmula que rege o contraste temporal é semelhante à do contraste espacial: | ( 0) ( 1 )| (2) 𝐶𝑜𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑡𝑒 𝑇𝑒𝑚𝑝𝑜𝑟𝑎𝑙 = ( 0) ( 1)

[046] Em que t1 é um tempo subsequente a t0. Os contrastes espaciais e temporais de uma determinada imagem podem ser usados para identificar objetos. Os objetos identificados podem então ser testados para determinar sua significância (por exemplo, se eles são CFUs, flora normal, poeira, etc.).

[047] As figuras 3A, 3B e 3C fornecem uma demonstração visual do efeito que o contraste temporal pode ter em uma amostra de imagem. As imagens mostradas na figura 3A foram capturados em diferentes pontos no tempo (da esquerda para a direita, linha de topo para linha de fundo) mostrando o crescimento geral na amostra. Embora o crescimento seja perceptível na figura 3A, o crescimento é ainda mais perceptível e pode ser notado ainda mais cedo na sequência, a partir das imagens temporais de contraste correspondentes da figura 3B. Para fins de clareza, a figura 3C mostra uma seção ampliada da figura 3B. Como pode ser visto na figura 3C, quanto mais tempo a imagem de uma porção de uma colônia tiver sido formada, mais brilhante será o ponto na imagem de contraste. Desta forma, o centro de massa de cada colônia pode ser denotado pelo centro brilhante, ou pico, da colônia. Assim, os dados de imagem obtidos ao longo do tempo podem revelar informações importantes sobre as mudanças na morfologia da colônia.

[048] Para maximizar o contraste espacial ou temporal de um objeto contra seu fundo, o sistema pode capturar imagens usando diferentes luzes incidentes em diferentes fundos. Por exemplo, qualquer uma das luzes de topo, de fundo ou lateral pode ser usada em um fundo preto ou branco.

[049] As figuras 3D e 3E fornecem uma demonstração visual do efeito que as condições de iluminação podem ter em uma amostra de imagem. A imagem na figura 3D foi capturada usando iluminação de topo, enquanto a imagem na figura 3E foi capturada aproximadamente ao mesmo tempo (por exemplo, perto o suficiente para que nenhum crescimento perceptível ou significativo tenha ocorrido) usando iluminação de fundo. Como pode ser visto, cada uma das imagens nas amostras das figuras 3D e 3E contém várias colônias, mas informações adicionais sobre as colônias (neste caso, hemólise) podem ser vistas graças à iluminação de fundo ou de fundo na imagem da figura 3D, ao passo que essa mesma informação é difícil de entender na imagem da figura 3E.

[050] Em um determinado ponto no tempo, várias imagens podem ser capturadas em várias condições de iluminação. As imagens podem ser capturadas usando diferentes fontes de luz que são espectralmente diferentes devido ao nível de luz de iluminação, ângulo de iluminação e/ou filtros implantados entre o objeto e o sensor (por exemplo, filtros vermelhos, verdes e azuis). Desta forma, as condições de aquisição de imagem podem ser variadas em termos de posição da fonte de luz (por exemplo, topo, lado, fundo), fundo (por exemplo, preto, branco, qualquer cor, qualquer intensidade) e espectro de luz (por exemplo, canal vermelho, canal verde, canal azul). Por exemplo, uma primeira imagem pode ser capturada usando iluminação de topo e um fundo preto, uma segunda imagem capturada usando iluminação lateral e um fundo preto e uma terceira imagem capturada usando iluminação inferior e sem fundo (ou seja, um fundo branco). Além disso, algoritmos específicos podem ser usados para criar um conjunto de condições de aquisição de imagem variáveis, a fim de maximizar o uso de contraste espacial. Esses ou outros algoritmos também podem ser úteis para maximizar o contraste temporal, variando as condições de aquisição de imagem de acordo com uma dada sequência e/ou ao longo de um período de tempo. Alguns desses algoritmos são descritos na Publicação PCT Nº WO2015 / 114121.

[051] A figura 4 é um fluxograma que mostra uma rotina de exemplo para analisar uma placa com imagem com base, pelo menos em parte, no contraste. A rotina da figura 4 pode ser pensada como uma sub-rotina de exemplo da rotina 200 da figura 2, de modo que 206 e 208 da figura 2 são realizadas, pelo menos em parte, usando a rotina da figura 4.

[052] Em 402, uma primeira imagem digital é capturada no tempo t0. O tempo t0 pode ser um tempo logo após o início do processo de incubação, de modo que as bactérias na placa com imagem ainda não começaram a formar colônias visíveis.

[053] Em 404, as coordenadas são atribuídas a um ou mais pixels da primeira imagem digital. Em alguns casos, as coordenadas podem ser coordenadas polares, tendo uma coordenada radial se estendendo de um ponto central da placa de formação de imagem e uma coordenada angular em torno do ponto central. As coordenadas podem ser usadas em etapas posteriores para ajudar a alinhar a primeira imagem digital com outras imagens digitais da placa tiradas de diferentes ângulos e/ou em momentos diferentes. Em alguns casos, a placa com imagem pode ter um ponto de referência ou marca de referência específico. É vantajoso se essas marcas de referência forem detectáveis por um sensor (ou seja, opticamente detectáveis). O uso de marcas de referência para orientar um objeto no espaço de coordenadas é bem conhecido por aqueles versados na técnica. Exemplos de marcas de referência detectáveis opticamente adequadas incluem uma marca fora do centro, tal como um ponto ou linha no fundo do prato de cultura opticamente transparente. Essa marca pode ser detectada por um sensor “apontado” para o fundo da placa de cultura. O sensor pode ser posicionado abaixo da placa de cultura e detecta a marca de referência se o suporte para a placa de cultura for opticamente transparente. O sensor pode detectar tais marcas de referência se montado acima da placa de cultura se o meio de cultura disposto na placa de cultura for opticamente transparente. Para evitar as dificuldades de detecção da marca de referência na parte inferior da placa de cultura no topo ou fundo da placa; a marca de referência pode ser um rótulo, como um rótulo de código de barras, afixado na lateral do prato de cultura. O rótulo do código de barras pode ser detectado por um sensor. Tanto o lado quanto o centro do rótulo do código de barras podem ser a marca de referência nesses exemplos. As coordenadas de pixel podem ser atribuídas em relação à marca de referência. Dessa forma, a orientação da placa no espaço de coordenadas do aparelho de formação de imagem pode ser replicada de evento de imagem para evento de imagem. As coordenadas do (s) pixel (es) que cobrem o ponto de referência na primeira imagem podem ser atribuídas ao (s) pixel (es) que cobre o mesmo ponto de referência nas outras imagens. Portanto, os pixels em uma imagem anterior podem ser comparados com o pixel idêntico na imagem posterior porque eles compartilham as mesmas coordenadas. Desta forma, quaisquer mudanças nos pixels de uma imagem para outra podem ser prontamente observadas.

[054] Em 406, uma segunda imagem digital é capturada no tempo tx. O tempo tx é um tempo após t0 no qual as bactérias na placa com imagem tiveram a oportunidade de formar colônias visíveis.

[055] Em 408, a segunda imagem digital é alinhada com a primeira imagem digital com base nas coordenadas atribuídas anteriormente. O alinhamento das imagens pode envolver ainda normalização e padronização das imagens, por exemplo, usando os métodos e sistemas descritos na Publicação PCT No. WO2015/114121.

[056] Em 410, a informação de contraste da segunda imagem digital é determinada. As informações de contraste podem ser coletadas em uma base de pixel por pixel. Por exemplo, os pixels da segunda imagem digital podem ser comparados com os pixels correspondentes (nas mesmas coordenadas) da primeira imagem digital para determinar a presença de contraste temporal. Além disso, os pixels adjacentes da segunda imagem digital podem ser comparados uns com os outros, ou com outros pixels conhecidos como pixels de fundo, para determinar a presença de contraste espacial. Mudanças na cor do pixel e/ou brilho são indicativas de contraste, e a magnitude de tais mudanças de uma imagem para a próxima ou de um pixel (ou região de pixels) para a próxima, pode ser medida, calculada, estimada ou determinada de outra forma. Nos casos em que o contraste temporal e o contraste espacial são determinados para uma determinada imagem, um contraste geral de um determinado pixel da imagem pode ser determinado com base em uma combinação (por exemplo, média, média ponderada) dos contrastes espaciais e temporais daquele dado pixel.

[057] Em 412, os objetos na segunda imagem digital são identificados com base na informação de contraste computada em 410. Pixels adjacentes da segunda imagem digital com informação de contraste semelhante podem ser considerados pertencentes ao mesmo objeto. Por exemplo, se a diferença de brilho entre os pixels adjacentes e seu fundo, ou entre os pixels e seu brilho na primeira imagem digital, for quase a mesma (por exemplo, dentro de um limite predeterminado), então os pixels podem ser considerados pertencem ao mesmo objeto. Como exemplo, o sistema pode atribuir um "1" a qualquer pixel com contraste significativo (por exemplo, acima do valor limite) e, em seguida, identificar um grupo de pixels adjacentes todos atribuídos a "1" como um objeto. O objeto pode receber um rótulo ou máscara específica, de modo que pixels com o mesmo rótulo compartilhem certas características. O rótulo pode ajudar a diferenciar o objeto de outros objetos e/ou fundo durante os processos posteriores da sub-rotina 400. A identificação de objetos em uma imagem digital pode envolver a segmentação ou partição da imagem digital em várias regiões (por exemplo, primeiro plano e fundo). O objetivo da segmentação é mudar a imagem em uma representação de vários componentes para que seja mais fácil analisá-los. A segmentação de imagens é usada para localizar objetos de interesse nas imagens.

[058] Em 414, as características de um determinado objeto (identificado em 412) podem ser caracterizadas. A caracterização das características de um objeto pode envolver a derivação de estatísticas descritivas do objeto (por exemplo, área, refletância, tamanho, densidade óptica, cor, localização da placa, etc.). As estatísticas descritivas podem, em última análise, descrever quantitativamente certas características de uma coleção de informações coletadas sobre o objeto (por exemplo, de uma imagem SHQI, de uma imagem de contraste). Essas informações podem ser avaliadas em função das espécies, concentrações, misturas, tempo e meios. No entanto, em pelo menos alguns casos, a caracterização de um objeto pode começar com uma coleção de informações qualitativas sobre as características do objeto, em que a informação qualitativa é subsequentemente representada quantitativamente. A Tabela 1 abaixo provê uma lista de exemplos de características que podem ser avaliados qualitativamente e posteriormente convertidos em uma representação quantitativa: Tabela 1: Atributos qualitativos de objetos, e critérios para converter quantitativamente os atributos

Número Característica Pontuação Critério 1 Crescimento 0 Sem crescimento 1 Crescimento 2 Tempo esperado para observar n/a tempo recorde em visualmente horas 3 Tamanho (diâmetro) 1 ‹1 mm 2 ›1 a 4 mm 3 ›4 mm 4 Taxa de crescimento (Δ diâmetro / 1 ‹1 mm 2horas) 2 ›1 a 2 mm 3 ›2 mm 5 Cor 1 Cinza / branco 2 rose-rosa 3 incolor 4 vermelho 5 azul 6 Azul - verde 7 marrom 8 Amarelo pálido a amarelo 9 Verde 6 Hemólise 0 Nenhum 1 Beta pequeno (‹1mm) 2 Beta grande (›1mm) 3 alfa 7 Formato 1 convexa 2 plano 3 espalhado 4 Côncavo 8 Superfície / borda 1 lisa 2 áspera 3 mucoide 4 pés

[059] Algumas características de um objeto, como formato ou o tempo até que ele seja observado visualmente, podem ser medidas uma única vez para o objeto como um todo. Outras características podem ser medidas várias vezes (por exemplo, para cada pixel, para cada linha de pixels com uma coordenada y comum, para cada coluna de pixels com uma coordenada x comum, para cada raio de pixels com uma coordenada angular comum, para um círculo de pixels com uma coordenada radial comum) e então combinados, por exemplo, usando um histograma, em uma única medição. Por exemplo, a cor pode ser medida para cada pixel, taxa de crescimento ou tamanho para cada linha, coluna, raio ou círculo de pixels e assim por diante.

[060] Em 416, é determinado se o objeto é um candidato à colônia com base nas características caracterizadas. A determinação do candidato à colônia pode envolver a entrada das características quantitativas (por exemplo, as pontuações mostradas na Tabela 1, acima), ou um subconjunto das mesmas, em um classificador. O classificador pode incluir uma matriz de confusão para implementar um algoritmo de aprendizado de máquina supervisionado, ou uma matriz de correspondência para implementar um algoritmo de aprendizado de máquina não supervisionado, para avaliar o objeto. A aprendizagem supervisionada pode ser preferida nos casos em que um objeto deve ser discriminado de um conjunto limitado (por exemplo, dois ou três) de organismos possíveis (neste caso, o algoritmo poderia ser treinado em um conjunto relativamente limitado de dados de treinamento). Em contraste, a aprendizagem não supervisionada pode ser preferida nos casos em que um objeto deve ser discriminado de um banco de dados inteiro de possíveis organismos, caso em que seria difícil fornecer dados de treinamento abrangentes - ou mesmo suficientes. No caso de confusão ou de uma matriz de correspondência, a diferenciação poderia ser medida numericamente em um intervalo. Por exemplo, para um determinado par de objetos, um “0” pode significar que os dois objetos devem ser discriminados um do outro, enquanto um “1” pode significar que os objetos são difíceis de diferenciar um do outro.

[061] Candidatos de colônia podem ser armazenados em uma memória do sistema automatizado para uso posterior (por exemplo, teste, a rotina de segmentação descrita abaixo, etc.).

USO DE MÚLTIPLOS MEIOS

[062] Nos exemplos acima, a avaliação de uma cultura é descrita para um único meio. No entanto, os exemplos são igualmente aplicáveis a casos em que uma cultura é avaliada em múltiplos meios de comunicação.

[063] Uma vez que as características das bactérias (por exemplo, cor, taxa de crescimento, etc.) podem variar dependendo do tipo de meio de cultura ("meios") usado, diferentes matrizes de confusão podem ser aplicadas para cada meio durante a classificação (por exemplo, 416 da sub-rotina 400). Portanto, é perfeitamente razoável que o classificador para umo meio geraria um “0” para dois objetos, enquanto um classificador para umo meio diferente geraria um “1” para os mesmos dois objetos. Os resultados coletivos dos classificadores podem então ser avaliados juntos (manualmente ou com base em outros relacionamentos conduzidos pela máquina) para chegar a uma diferenciação ou classificação geral ou final para os objetos.

[064] A avaliação de múltiplos meios pode ser implementada usando um único contêiner. O único contêiner pode ser configurado para conter vários meios (por exemplo, placa quadrada de duas placas, três placas, etc.) de modo que os vários meios de comunicação possam ser formados em imagem juntos ao mesmo tempo. Alternativamente, vários meios podem ser avaliados riscando uma amostra de cultura em vários recipientes, cada recipiente contendo um ou mais meios. Cada um dos recipientes múltiplos pode então ser submetido às rotinas de imagem descritas acima. A informação derivada de cada uma dos meios (por exemplo, recursos caracterizados) pode então ser inserida coletivamente no classificador a fim de fazer uma identificação ainda mais informada do crescimento manchado nas vários meios.

INFORMAÇÕES DE CONTRASTE

[065] A figura 5 é um diagrama de fluxo que mostra um exemplo de sub-rotina 500 para obter contraste espacial como parte de 410 da figura 4. A sub-rotina 500 recebe como entradas: um conjunto de uma ou mais condições de fundo e iluminação 551 e um filtro 554. Em 502, a imagem digital é obtida sob uma iluminação especificada e condição de fundo a partir do conjunto de entrada 551. Em 504, a imagem é então clonada. Em 506, uma das imagens clonadas é filtrada usando o filtro

554. No exemplo da figura 5 um kernel passa-baixa é usado como filtro, mas o versado na técnica está ciente de outros filtros que podem ser usados. Em 508, uma relação da imagem filtrada subtraída da imagem não filtrada e a imagem filtrada adicionada à imagem não filtrada é calculada. Em 510, uma imagem de contraste espacial é obtida com base na relação computada de 508. Esta rotina 500 pode ser repetida para cada uma das condições de fundo e iluminação 551. Cada repetição da rotina 500 resulta em outra imagem de contraste espacial, que pode ser usada para atualizar iterativamente a imagem de contraste espacial armazenada anteriormente em 510. Assim, uma imagem de contraste abrangente (incluindo contraste de cada uma das condições de iluminação) pode ser construída iterativamente. Em uma modalidade, em cada iteração, a imagem de contraste limpa, na qual as configurações de contraste ainda estão definidas para zero (em comparação com a imagem de contraste construída iterativamente) pode ser provida como uma entrada para cada configuração de iluminação. Se for determinado em 512 que a última imagem foi processada, a rotina 500 termina.

[066] A figura 6 é um diagrama de fluxo que mostra uma sub-rotina de exemplo 600 para obter contraste temporal também como parte de 410 da figura 4. A sub-rotina 600 recebe como entradas: um conjunto de uma ou mais condições de fundo e iluminação 651; e um filtro 655. Em 602, cada uma das primeira e segunda imagens digitais tiradas sob condições específicas de iluminação e de fundo é obtida. Em 604, a imagem t0 é filtrada. No exemplo da figura 6 um kernel passa-baixo é usado como filtro, mas o versado na técnica está ciente de outros filtros que podem ser usados. Em 606, uma relação da imagem filtrada t0 subtraída da imagem tx não filtrada e a imagem t0 filtrada adicionada à imagem tx não filtrada é computada. Em 608, uma imagem de contraste temporal é obtida com base na relação calculada de 606. Esta rotina 600 pode ser repetida sob diferentes condições de iluminação e/ou diferentes condições de fundo. Cada repetição da rotina 600 resulta em outra imagem de contraste temporal, que pode ser usada para atualizar iterativamente a imagem de contraste temporal armazenada anteriormente em 608. Tal como acontece com a construção de uma imagem de contraste espacial, uma imagem de contraste temporal pode ser construída iterativamente, com uma imagem de contraste apagada provida uma entrada para cada condição de iluminação. Se for determinado em 610 que a última imagem foi processada, a rotina 600 termina.

[067] Os resultados de contraste espacial e temporal podem ainda ser combinados para fazer uma determinação abrangente ou geral em relação ao contraste. A combinação de contraste espacial e temporal é aqui referida como "contraste misto" (MC). Em uma modalidade, o contraste misto pode ser derivado de uma imagem de contraste espacial (SC) no tempo t0, uma imagem de contraste espacial no tempo tx e uma imagem de contraste temporal (TC) derivada de uma comparação de imagens t0 e tx, de acordo com a seguinte equação: 0, 0 ( , ) (3) 𝑀𝐶⬚ 0 = ⬚ 2 ⬚ ⬚

FILTRAGEM

[068] Processos adicionais podem ser incluídos na sub-rotina 400 da figura 4 para melhorar a análise da imagem. Por exemplo, a primeira imagem digital pode ser analisada para objetos que aparecem na imagem no tempo t0. Uma vez que se sabe que nenhuma bactéria ainda começou a crescer significativamente em t0, pode-se supor que quaisquer objetos avistados no tempo t0 sejam meramente poeira, bolhas de ar, artefatos, condensação, etc. que não constituam um candidato à colônia.

[069] Um processo de filtragem pode ser usado em uma imagem capturada para subtrair a poeira e outros artefatos que pousam na placa ou lente com imagem formada. Ao considerar meios transparentes (por exemplo, ágar MacConkey, ágar CLED, CHROMagar, etc.), é esperado que algum nível de poeira esteja presente em uma imagem capturada. O impacto da poeira em uma determinada imagem pode ser ditado, pelo menos em parte, com base nas condições de fundo e iluminação particular sob as quais a imagem é tirada. Por exemplo, ao usar meio branco, artefatos reflexivos e poeira serão mais observáveis quando o meio for iluminado de cima com fundo preto por baixo. Como outro exemplo adicional, ao usar meio colorido ou escuro, artefatos e poeira serão mais observáveis quando o meio for iluminado de cima com um fundo branco por baixo. Como outro exemplo, na maioria dos meios, artefatos e poeira que absorvem luz serão observáveis quando o meio for iluminado por baixo, independentemente do fundo. Em qualquer caso, o gerenciamento de poeira e artefatos é um desafio complexo de processamento de imagem que pode impactar significativamente a detecção de crescimento microbiano.

[070] A poeira e os artefatos podem ser divididos em dois tipos: (A) aqueles que são capazes de mudar de posição; e (B) aqueles que não são capazes de mudar de posição. Poeira e artefatos podem se acumular com o tempo, o que significa que o número de ambos os tipos A e B pode variar com o tempo. No entanto, as observações mostraram que o tipo A é mais sujeito a mudanças na quantidade ao longo do tempo do que o tipo B. Claro, o tipo A também é mais sujeito a mudanças, como devido à placa sendo movida para dentro ou para fora da câmara de formação de imagem.

[071] Geralmente, o tipo B é causado por artefatos que estão ligados à própria placa, como pontos de tinta (marca, número do lote e informações impressas embaixo da placa), imperfeições ligadas ao ponto de injeção do molde de plástico ou uma região fosca. O tipo B também pode ser causado por poeira ou bolhas de ar presas no topo do meio, presas dentro do meio ou eletrostaticamente presas na parte inferior da placa.

[072] Do ponto de vista da formação de imagem, mesmo a poeira e os artefatos do tipo A são, por si próprios, em sua maioria imutáveis na posição. No entanto, devido ao plástico da placa e ao meio agindo como filtro e lente, as características observadas e a posição dos artefatos do tipo A podem mudar ligeiramente dependendo da cor do meio, do nível do meio e do plástico. A poeira e os artefatos do tipo B também não mudam de posição. No entanto, na medida em que a poeira e os artefatos do tipo B estão conectados ao meio, e o meio está sujeita a movimentos leves e mudanças ao longo do tempo (principalmente devido à ligeira dessecação ao longo do tempo na incubadora), a poeira e os artefatos do tipo B podem se mover com o meio. Portanto, a posição da poeira e dos artefatos do tipo B também é pelo menos um pouco sujeita a mudanças sutis.

[073] Em termos de contraste, pode-se dizer que uma mancha de poeira do tipo A está presente na imagem de contraste espacial t0 em uma posição "p0" e na imagem de contraste espacial tx em uma posição "px". Assumindo que p0 e px são locais diferentes, então a poeira ou artefato também estará presente em uma imagem de contraste temporal em ambos os locais (por exemplo, mostrando contraste positivo na localização de px e contraste negativo na localização de p0). Em comparação, uma mancha de poeira do tipo B estará presente em uma localização comum de ambas as imagens de contraste espacial nos tempos t0 e tx, embora ausente da imagem de contraste temporal.

[074] Como explicado acima, imagens de contraste espacial e temporal podem ser combinadas a fim de derivar resultados de contraste mistos. O impacto de ambos poeira e artefatos dos tipos A e B pode ser ainda mais eliminado dos resultados de contraste mistos. Em uma modalidade, se um objeto (por exemplo, um candidato CFU) for identificado no resultado de contraste misto, ele pode ser comparado à poeira e artefatos detectados com a vizinhança N (x, y) do objeto no resultado de contraste espacial em tempo t0. Então, se um objeto semelhante for encontrado no resultado de contraste espacial no tempo t0, o objeto identificado no resultado de contraste misto é sinalizado como um falso positivo do tipo A ou tipo B. Mesmo se um objeto não for sinalizado como um tipo A ou falso positivo de tipo B no início, se ao longo do tempo o objeto não mudar significativamente de tamanho, ainda pode ser determinado posteriormente que o objeto é um falso positivo de tipo B. Os falsos positivos podem ser armazenados e posteriormente aplicados às imagens subsequentes, como através das máscaras de filtragem (por exemplo, máscara binária) descritas mais abaixo.

[075] Outro processo de filtragem pode ser usado para subtrair a condensação formada na placa (por exemplo, durante o trânsito do refrigerador para a incubadora no início de uma sessão de incubação). Em um filtro de condensação de exemplo, a placa é iluminada usando iluminação de fundo, de modo que menos luz penetre através de locais de condensação do que locais sem condensação. A densidade óptica da imagem pode então ser avaliada e áreas de baixa densidade óptica podem ser subtraídas da imagem.

[076] Adicionalmente ou alternativamente, uma máscara de imagem pode ser construída para descontar objetos de qualquer análise da imagem t0 e/ou imagens digitais subsequentes. A figura 7 é um diagrama de fluxo que mostra uma rotina de exemplo 700 para criar uma máscara de imagem usando contraste espacial da imagem t0. No exemplo da rotina 700, a única entrada provida é a imagem SHQI 751 obtida no tempo t0. Em 702, o contraste espacial da imagem t0 é determinado. Em 704, as informações de contraste espacial são usadas para coletar informações estatísticas sobre os pixels na região de interesse da imagem t0, como meio e desvio padrão (por exemplo, de brilho). Em 706, um limite de contraste é ajustado para garantir que um número apropriado de pixels exceda esse limite. Por exemplo, se mais de uma determinada porcentagem de pixels não for considerada fundo da imagem, o limite pode ser aumentado. Em 708, o limite é ainda ajustado com base em informações estatísticas sobre os pixels abaixo do limite. Finalmente, em 710, uma máscara binária é gerada. A máscara binária diferencia entre vários artefatos que não são pixels válidos e outros pixels que são considerados válidos. A máscara binária pode então ser usada em um momento subsequente quando houver colônias potenciais a serem detectadas e para excluir objetos que ocupam os pixels inválidos de serem colônias candidatas.

[077] Os processos de filtragem acima podem melhorar a sub-rotina 400, evitando a inclusão acidental de poeira, condensação ou outros artefatos como objetos e acelerando a caracterização da propriedade em 414, uma vez que tal caracterização teria que ser realizada apenas para pixels válidos.

DEFININDO OBJETOS E RÓTULOS

[078] Outro processo que pode ser adicionado à sub-rotina 400 da figura 4 está atribuindo rótulos aos objetos identificados em 412. O objeto pode receber um rótulo específico, de modo que pixels com o mesmo rótulo compartilhem certas características. O rótulo pode ajudar a diferenciar o objeto de outros objetos e/ou fundo durante os processos posteriores da sub-rotina 400. A figura 8 é um diagrama de fluxo que mostra uma rotina de exemplo 800 para rotular os pixels de uma imagem tirada no tempo tx (ou "imagem tx"). No exemplo da figura 8, uma máscara binária 851 (por exemplo, a saída da rotina 700), uma máscara candidata não inicializada 852 para a imagem tx e uma imagem de contraste temporal 853 (por exemplo, a saída da sub- rotina 600) são recebidas como entradas. Em 802, a máscara candidata 852 é inicializada. A inicialização pode envolver a identificação de uma região de interesse na placa de imagem formada, bem como o uso da máscara binária 851 para identificar "pixels válidos" na imagem obtida no tempo tx. Pixels válidos são pixels da imagem que não foram descontados como colônias candidatas e serão considerados para rotulagem. Em 804, a imagem de contraste temporal 853 é usada para coletar informações estatísticas sobre os pixels válidos na região de interesse da imagem tx, como meio e desvio padrão (por exemplo, de brilho). Então, em 806, as informações estatísticas de cada imagem de contraste temporal 853 e a máscara binária 851 (que são geradas de preferência sob condições de iluminação e de fundo semelhantes) são combinadas para formar uma imagem de contraste de limite. Usando o limite definido pela imagem de contraste de limite, "componentes connex" da imagem tx são rotulados em 808. Um componente connex é efetivamente um rótulo que indica uma conexão entre (ou agrupamento entre) pixels adjacentes, que por sua vez indica que os pixels são parte do mesmo objeto.

[079] Uma vez que os componentes connex foram definidos para a imagem tx, cada componente connex pode ser analisado individualmente (em 810) para validar seu status como um único objeto. No exemplo da figura 8, um cálculo estatístico dos pixels associados ao rótulo é feito em 812. O cálculo pode utilizar um histograma para determinar a média e/ou desvio padrão de brilho ou cor dos pixels. Em 814, é determinado se os pixels atendem a uma área limite. Se a área limite não for atendida, as operações prosseguem para 830, no qual o rótulo é atualizado. Atualizar um rótulo pode envolver manter o componente analisado como um rótulo ou dividir o componente em dois rótulos. Caso a área limite não seja atingida, o componente é mantido como um único rótulo. Se a área limite for alcançada, então em 816, o histograma é suavizado e em 818, os picos dos pixels rotulados distribuídos são identificados. Os picos podem ser posteriormente definidos tendo uma área mínima, uma vez que os picos menores do que a área mínima podem ser desconsiderados. Em 820, o número de picos identificados é contado. Se houver apenas um pico, as operações prosseguem para 830 e o rótulo é atualizado, pelo que o componente é mantido como um objeto. Se houver mais de um pico, então em 824, a imagem de contraste do limite é usada para avaliar se o contraste entre os picos é significativo. As operações então prosseguem para 830 e o rótulo é atualizado com base nos vários picos identificados, em que contraste significativo resulta no componente sendo dividido em dois e, de outra forma, mantido como um.

SEGMENTAÇÃO

[080] Outro processo que pode ser incluído como parte da sub-rotina 400 é um processo de segmentação para separar colônias confluentes no tempo tx em objetos separados. Se no tempo tx as colônias cresceram a ponto de se sobreporem ou se tocarem, pode ser necessário traçar um limite através da região confluente para avaliar colônias separadas na região.

[081] Em alguns casos, onde duas colônias vizinhas têm características diferentes (por exemplo, cor diferente, textura diferente), a segmentação pode simplesmente envolver a análise de características da região confluente. No entanto, o contraste espacial e temporal por si só nem sempre é suficiente para identificar uma fronteira entre as colônias. A figura 9 é um diagrama de fluxo que mostra um exemplo de rotina 900 para separar tais colônias em objetos separados (por exemplo, com rótulos separados) ou, em outros termos, segmentar as colônias. A rotina de exemplo 900 da figura 9 usa uma primeira imagem digital 951 tirada no tempo t0, uma segunda imagem digital tirada no tempo tx e uma máscara binária de imagem t0 953 (por exemplo, a máscara gerada pela rotina 700) como entradas. Em 902, uma imagem de contraste temporal é gerada com base nas imagens t0 e tx 951 e 952. Em 904, a imagem de contraste temporal é segmentada usando a máscara binária 953. Em 906, rótulos são aplicados aos segmentos da imagem. Em 908, os picos ou máximos de cada marcador são identificados. O máximo de um determinado segmento é geralmente o ponto central ou centro de massa do segmento. Em 910, para cada rótulo, os máximos (por exemplo, do rótulo em análise, de rótulos vizinhos) são usados para fazer outras determinações quanto a se um determinado rótulo é único para seus vizinhos ou deve ser combinado com um ou mais rótulos vizinhos. Uma vez que os rótulos foram reduzidos aos seus componentes únicos, a caracterização das características para cada rótulo (por exemplo, as etapas 414 e 416 da rotina 400) pode ser realizada em 912 e uma lista global de colônias candidatas pode ser gerada em

914.

[082] Vários fatores, tais como fatores de inclusão, podem ser aplicados para determinar se os máximos locais de um determinado rótulo pertencem a uma colônia ou a colônias diferentes. Fatores de inclusão são fatores que indicam se pixels vizinhos estão ou não associados a um objeto adjacente. Esses fatores podem ser usados em uma estratégia de segmentação para determinar se deve-se dividir dois máximos locais em um determinado rótulo em dois objetos separados ou fundi-los em um único objeto.

[083] A figura 10 é um diagrama de fluxo que mostra tal estratégia de segmentação de exemplo. A rotina 1000 pode ser usada como uma sub-rotina da etapa 910 na figura 9. Como mostrado na figura 10, dois máximos locais 1051 e 1052 são identificados. Em 1002, uma região circundante é identificada para cada máximo. No exemplo da figura 10, a região "A" envolve o máximo de 1051 e a região "B" envolve o máximo de 1052. Para fins das equações de exemplo abaixo, assume-se que a região A é maior ou igual em tamanho à região B. Em alguns casos, cada região pode receber um formato oval com uma distância horizontal (xA, xB) ao longo de um eixo horizontal da região e uma distância vertical (yA, yB) ao longo de um eixo vertical da região. A figura 11 provê uma ilustração de exemplo das regiões A e B e seus respectivos máximos, a fim de esclarecer a rotina da figura 10.

[084] Em 1004, uma distância do máximo a uma borda do objeto é determinada para cada máximo local 1051 e 1052. Em alguns casos, a distância determinada é uma distância média ou mediana da região atribuída em 1002, doravante referida como um mapa de distância. O mapa de distância da região A é doravante referido como rA, e o da região B como rB.

[085] Em 1006, um fator de inclusão é calculado com base em uma distância "d" entre os dois máximos locais e as distâncias determinadas em 1004. Em uma modalidade, o fator de inclusão é calculado usando a seguinte equação: (4) 𝐹𝑎𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝐼𝑛𝑐𝑙𝑢𝑠ã𝑜 = 2

[086] Em 1008, é determinado se o fator de inclusão é menor, maior ou dentro de um intervalo predeterminado (por exemplo, entre 0,5 e 1). Se o fator de inclusão for menor do que o intervalo predeterminado, os máximos são determinados como associados ao mesmo objeto. Se for maior do que o intervalo predeterminado, os máximos são determinados para serem associados a objetos separados.

[087] Para fatores de inclusão dentro do intervalo, não é imediatamente claro se os máximos pertencem ao mesmo objeto ou a objetos diferentes, e mais processamento é necessário. A rotina 1000 então continua em 1010, em que a convexidade das respectivas regiões circundantes dos dois máximos é calculada usando as coordenadas de uma terceira região "C" em uma posição entre os dois máximos. Em alguns casos, a região pode ser um centro ponderado das duas regiões, de modo que o ponto central da região C esteja mais próximo da região menor B do que da região maior A. Distâncias horizontais e verticais xC e yC, e um mapa de distância H, também pode ser calculado para a região C. Por exemplo, a convexidade pode ser calculada usando os valores acima e d (A, C), que é a distância entre os pontos centrais da região C e máximo A, de acordo com as seguintes equações: ( )∗ . (5) 𝑥𝐶 = ( )∗ . (6) 𝑦𝐶 = ( , ) (7) 𝑅 = 𝑟𝐴 + (𝑟𝐵 − 𝑟𝐴) ∗ (8) 𝛥𝐻 = 𝐻 − (0.9𝑅)

[088] Em 1012, é determinado se o valor de convexidade é maior (mais convexo) do que um determinado limite. Por exemplo, ΔH pode ser comparado a um valor limite de 0. Se o valor de convexidade for maior do que o valor limite, os máximos são determinados como associados a objetos separados. Caso contrário, em 1014, um ou mais parâmetros da região C são atualizados de modo que o tamanho da região C seja aumentado. Por exemplo, dist.deslocamento pode ser atualizado com base em ΔH, por exemplo, ΔH é limitado a um valor entre 0 e 1 (se ΔH for maior que 1, é arredondado para 1) e é então adicionado a dist.deslocamento.

[089] Em 1016, é determinado se o tamanho da região C atende ou excede um valor limite. Se este valor limite for atingido ou excedido, os máximos serão determinados como associados ao mesmo objeto. Em outras palavras, se a diferença entre as regiões A e B é tão indeterminada que a região C é aumentada até começar a ofuscar as regiões A e B, esta é uma boa indicação de que os máximos 1051 e 1052 devem pertencer ao mesmo objeto. No exemplo acima, isso pode ser indicado por distdeslocamento encontrando ou excedendo a distância d entre os máximos. Caso contrário, as operações retornam a 1010 e a convexidade das regiões A e B são recalculadas com base nos parâmetros atualizados da região C.

[090] Uma vez que as associações para cada máximo são determinadas, as associações determinadas podem ser armazenadas, por exemplo, em uma matriz (também chamada de matriz de associação). As informações armazenadas podem ser usadas para reduzir a lista completa de máximos a uma lista final de objetos candidatos. Por exemplo, no caso de uma matriz de associação, uma lista principal pode ser criada a partir da lista completa de máximos e, em seguida, cada máximo pode ser revisado iterativamente e removido da lista principal se um máximo associado ainda permanecer na lista.

[091] No exemplo das figuras 9 e 10, o tempo tx em que a segunda imagem é obtida (e, portanto, o primeiro tempo em que a rotina 900 pode ser executada) pode ser de apenas algumas horas no processo de incubação. Esse momento é geralmente considerado muito cedo para identificar colônias totalmente formadas, mas pode ser suficiente para criar uma imagem de segmentação. A imagem de segmentação pode, opcionalmente, ser aplicada a imagens futuras que serão tiradas em um momento subsequente. Por exemplo, os limites entre as colônias podem ser traçados para prever um crescimento esperado das colônias. Então, em um caso de confluência entre as colônias, os limites podem ser utilizados para separar as colônias confluentes. ANÁLISE COM DUAS OU MAIS IMAGENS APÓS TEMPO t0

[092] Enquanto os processos e rotinas descritos acima requerem apenas uma imagem tirada após o tempo t0 (por exemplo, uma primeira imagem digital no tempo t0 e uma segunda imagem digital no tempo tx), outros processos requerem pelo menos uma segunda imagem tirada após o tempo t0. Por exemplo, se for descoberto que a imagem no tempo tx inclui colônias confluentes, outra imagem tirada no tempo tn (em que 0 < n < x) pode ser usada para identificar e dividir as colônias individuais.

[093] Por exemplo, se t0 = 0 horas em incubação (momento em que nenhum crescimento ocorreu) e tx = 24 horas em incubação (momento em que ocorreu tanto crescimento que as colônias estão agora confluentes), uma imagem no momento tn = 12 horas (momento em que as colônias teriam começado a crescer, mas ainda não seriam confluentes) revelariam a presença de colônias individuais. O crescimento da colônia poderia então ser projetado com base na imagem no tempo tn para estimar os limites entre as colônias confluentes no tempo tx. A este respeito, a imagem no momento tn poderia ajudar a diferenciar uma colônia de crescimento rápido de uma colônia de crescimento lento. Os versados na técnica devem reconhecer que à medida que o número de imagens tiradas entre o tempo t0 e o tempo tx aumenta, mais precisamente a taxa de crescimento das colônias pode ser projetada.

[094] Em uma aplicação do conceito anterior, a imagem tirada no tempo tn (ou mais geralmente, imagens tiradas entre os tempos t0 e tx) poderia ser usada para identificar sementes de colônia, que são objetos suspeitos de serem colônias que crescerão ao longo do tempo e associar as sementes às máscaras e rótulos correspondentes. Cada semente receberia um rótulo único e o rótulo seria armazenado junto com diferentes características (por exemplo, posição, morfologia e histograma com base em imagens geradas a partir de imagens SHQI: canal vermelho, canal verde, canal azul, luminância, crominância, matiz ou imagem composta) e propriedades (por exemplo, estado isolado / não isolado, outras informações para projetar propagação cronológica). Algumas características armazenadas (por exemplo, histograma) também podem ser calculadas no nível da placa, em vez de serem atribuídas a sementes específicas, a fim de extrair indicadores globais da placa. As características armazenadas de sementes podem então ser usadas para realizar a extração de colônias no tempo tx, bem como ser fornecidas como entrada para os classificadores para treinamento e/ou teste.

[095] O rastreamento da taxa de crescimento usando várias imagens tiradas após t0 também pode ser usado para detectar poeira, artefatos ou outros objetos estranhos que aparecem na placa ou na lente de formação de imagem no meio da rotina de fluxo de trabalho. Por exemplo, se uma partícula de poeira pousasse na lente de imagem após t0, mas antes de tn, o ponto criado pela mancha poderia inicialmente ser interpretado como uma colônia em crescimento, uma vez que não era visível no momento t0. No entanto, com as imagens subsequentes não revelando nenhuma mudança no tamanho do ponto, pode ser determinado que a mancha não está crescendo e, portanto, não é uma colônia.

[096] Além de rastrear a taxa de crescimento e segmentação, outros aspectos das colônias podem ser rastreados com a ajuda de imagens adicionais entre t0 e tx. No caso de mudanças morfológicas sutis que se desenvolvem em uma colônia lentamente ao longo do tempo, essas mudanças sutis podem ser identificadas mais rapidamente, capturando mais imagens. Em alguns casos, o crescimento pode ser medido ao longo de um eixo z, além ou em vez de ao longo dos eixos x e y usuais. Por exemplo, o estreptococo pneumonia é conhecido por formar lentamente um centro submerso quando cultivado em ágar de sangue, mas o centro submerso geralmente não é visível até o segundo dia de análise. Observando a progressão temporal do crescimento da bactéria, um centro de afundamento incipiente pode ser detectado e a bactéria identificada muito mais cedo do que se fosse necessário esperar que o centro afundasse completamente.

[097] Em outros casos, uma colônia pode ser conhecida por mudar de cor ao longo do tempo. Portanto, a imagem de uma colônia com uma primeira cor (por exemplo, vermelho) em um momento após t0 e, em seguida, tendo uma segunda cor (por exemplo, verde) em um momento subsequente, pode ser usada para determinar a identidade das bactérias que crescem na colônia. A mudança de cor pode ser medida como um vetor ou caminho através do espaço de cor (por exemplo, RGB, CMYK, etc.) Mudanças em outras características cromáticas da colônia podem ser medidas de forma semelhante.

CARACTERÍSTICAS DO OBJETO

[098] Conforme discutido acima em conexão com a figura 4, as características de um objeto em uma placa de imagem formada podem ser caracterizadas como parte da análise de imagem realizada na placa de imagem. As características caracterizadas podem incluir características estáticas (relativas a uma única imagem) e imagem dinâmica (relativas a uma pluralidade de imagens).

[099] As características estáticas visam refletir os atributos do objeto e/ou o fundo circundante em um determinado momento. As características estáticas incluem o seguinte: (i) Centro de gravidade: este é uma característica estática que fornece um centro de gravidade de um objeto com imagem formada em um espaço de coordenadas (por exemplo, x - y, polar). O centro de gravidade de um objeto, como as coordenadas polares do objeto, fornece invariância no conjunto de características sob determinadas condições de iluminação e fundo. O centro de gravidade pode ser obtido determinando primeiro um centro de massa ponderado para todas as colônias na imagem (M sendo a máscara binária de todas as colônias detectadas). O centro de massa ponderado pode ser determinado com base na suposição de que cada pixel da imagem tem o mesmo valor. O centro de gravidade para uma determinada colônia pode então ser descrito em coordenadas x-y pela seguinte equação (em que E = {p│p∈M} (E é a máscara binária da colônia atual), o intervalo para a coordenada x é [0, largura da imagem], o intervalo da coordenada y é [0, altura da imagem] e cada pixel é uma unidade): 1 1 (9) 𝑖𝑔𝑣( , ) 𝑥=∑ ×∑ ∈ 𝑝 , 𝑦=∑ ×∑ ∈ 𝑝 ∈ 1 ∈ 1

(ii) Coordenadas polares: este também é um recurso estático e pode ser usado para caracterizar ainda mais os locais na placa com imagem formada, como um centro de gravidade.

Geralmente, as coordenadas polares são medidas ao longo de um eixo radial (d) e um eixo angular (Ɵ), com as coordenadas do centro da placa sendo [0,0]. As coordenadas d e Ɵ de 𝑖𝑔𝑣( , ) são fornecidas (em milímetros para d, e em graus para Ɵ) pelas seguintes equações (onde k é uma densidade de pixels com pixels correspondentes a milímetros, e “código de barras” É um recurso de referência da placa com imagem formada para garantir o alinhamento da placa com imagens anteriores e/ou futuras): (10) 𝑑 = 𝑘 × 𝑑𝑖𝑠𝑡 𝑖𝑔𝑣( , ) , 0( , )

(11) 𝜃 = â𝑛𝑔𝑢𝑙𝑜 (𝑐ó𝑑𝑖𝑔𝑜 𝑑𝑒 𝑏𝑎𝑟𝑟𝑎𝑠, 𝑂( , ) , 𝑖𝑔𝑣( , ) )

(iii) Vetor de imagem: as coordenadas polares bidimensionais podem, por sua vez, ser transformadas em um vetor de imagem unidimensional.

O vetor de imagem pode caracterizar a intensidade dos pixels de uma imagem em função do eixo radial (geralmente, com o centro da colônia tendo a maior intensidade) e/ou em função do eixo angular.

Em muitos casos, o vetor de imagem pode ser mais preciso na classificação de semelhanças / distinções entre os objetos de imagem. (iv) Características morfométricas, que descrevem o formato e o tamanho de um determinado objeto. (a) Área: Esta é uma característica morfométrica e pode ser determinada com base no número de pixels no objeto de imagem (também chamado de “bolha”), sem contar os orifícios no objeto.

Quando a densidade de pixels está disponível, a área pode ser medida em tamanho físico (por exemplo, mm2). Caso contrário, quando a densidade de pixels não estiver disponível, o número total de pixels pode indicar o tamanho e a densidade de pixels (k) é definida como um.

Em uma modalidade, a área é calculada usando a seguinte equação: (12) 𝐴 = 𝑘2 × ∑ ∈ 1

(b) Perímetro: O perímetro do objeto também é uma característica morfométrica e pode ser determinado medindo as bordas da objeção e adicionando o comprimento total das bordas (por exemplo, um único pixel tendo uma área de 1 unidade quadrada tem um perímetro de 4 unidades). Tal como acontece com a área, o comprimento pode ser medido em termos de unidades de pixel (por exemplo, quando k não está disponível) ou comprimentos físicos (por exemplo, quando k está disponível). Em algumas circunstâncias, o perímetro também pode incluir o perímetro de quaisquer orifícios no objeto.

Além disso, o efeito escada (que resulta quando as bordas diagonais são digitalizadas em caixas tipo escada) pode ser compensado contando os cantos internos como √2, em vez de 2. Em uma modalidade, o perímetro pode ser determinado usando as seguintes equações: (13) 𝑃 =𝑘×∑ ∈ 𝑞 𝑛 𝑡 (14) 𝑛 = 𝑙 𝑝 𝑟 𝑏 (15) se: (𝑡 ∈ 𝑀, 𝑙 ∈ 𝑀, 𝑟 ∈ 𝑀, 𝑏 ∈ 𝑀) = 2, (𝑙 ∈ 𝑀 ≠ 𝑟 ∈ 𝑀), (𝑡 ∈ 𝑀 ≠ 𝑏 ∈ 𝑀)

(p é interior e p é um canto) então: 𝑛 = √2 também: 𝑞 𝑛 = 4 − ∑(𝑡 ∈ 𝑀, 𝑙 ∈ 𝑀, 𝑟 ∈ 𝑀, 𝑏 ∈ 𝑀)

(c) Circularidade: a circularidade do objeto também é uma característica morfométrica e pode ser determinada com base na combinação da área e do perímetro.

Em uma modalidade, a circularidade é calculada usando a seguinte equação: 4 (16) 𝐶 = 2

(d) Coeficiente de variação do raio (RCV): Este também é um recurso morfométrico e é usado para indicar a variação no raio do objeto, tomando uma relação entre o raio médio 𝑅 do objeto em todas as N direções ou ângulos θ que se estendem do centro de gravidade e desvio padrão dos raios 𝜎 . Em uma modalidade,

este valor pode ser calculado usando as seguintes equações: ∑2 0 (17) 𝑅 = ∑2 0( )2 (18) 𝜎 = 1

(19) 𝑅𝐶𝑉 =

(v) Recursos contextuais, que descrevem as relações topográficas de vizinhança do objeto sob escrutínio com os outros objetos detectados e bordas de paredes de placa.

Por exemplo, no caso de uma colônia com imagem formada, uma característica contextual da colônia pode ser se a colônia é livre, tem espaço livre limitado ou está competindo por acesso a recursos com outras colônias vizinhas.

Tais características tendem a ajudar a classificar as colônias que crescem no mesmo ambiente percebido e/ou discriminar as colônias que crescem em diferentes ambientes. (a) Região de Influência: esta é uma característica contextual que considera o espaço entre um objeto e seus objetos vizinhos e prevê uma região que o objeto em análise pode gastar para ocupar (sem outros, diferentes objetos gastando para ocupar a mesma região primeiro). A região de influência pode ser expressa na forma de um diagrama de Voronoï, como o diagrama mostrado na figura 12, que mostra uma região de influência (sombreada) com base na distância d entre uma colônia 1201 e suas colônias vizinhas, por exemplo, 1205. Em uma modalidade, a distância da borda do objeto até a borda da região de influência (DNC) pode ser caracterizada usando a seguinte equação: (20) 𝐷 = 𝑘 × 𝑀𝑖𝑛[𝑑𝑖𝑠𝑡(𝑝 ∈ 𝐸, 𝑝́ ∈ 𝑀 ∈ 𝐸)]

(b) Distância à parede da placa: este é um recurso contextual que calcula a distância da borda do objeto da parede da placa mais próxima (DPW). Em uma modalidade, esta distância pode ser caracterizada usando a seguinte equação: (21) 𝐷 = 𝑘 × 𝑀𝑖𝑛[𝑑𝑖𝑠𝑡(𝑝 ∈ 𝐸, 𝑝́ ∈ 𝑃𝑙𝑎𝑐𝑎)]

(c) Fator de isolamento: esta é uma característica contextual que caracteriza o isolamento relativo de um determinado objeto com base no tamanho do objeto e na distância até a borda mais próxima (por exemplo, de outro objeto, uma parede de placa). As figuras 13A a C ilustram aspectos do fator de isolamento.

A figura 13A ilustra um caso em que a borda mais próxima está a distância d da colônia a uma parede de placa.

As figuras 13B e 13C ilustram um caso em que a borda mais próxima pertence a outra colônia.

Nesse caso, um círculo é desenhado centrado em torno da colônia em análise e, em seguida, expandido (primeiro pequeno, como na figura 13B, depois maior como na figura 13C) até que o círculo toque uma colônia vizinha.

Nas modalidades das figuras 13A a C, o fator de isolamento (IF) pode ser caracterizado usando a seguinte equação: ( , ) (22) 𝑆𝑒 =

(d) Relação de ocupação vizinha: esta é uma característica contextual que caracteriza a fração da área da região de influência de Voronoȉ de uma placa dentro de uma determinada distância d para um determinado objeto.

Em uma modalidade, a relação de ocupação vizinha (OR) pode ser caracterizada usando a seguinte equação (na qual para esta equação, 𝐸 = 𝑝 𝑝 ∈ 𝑉, 𝑑𝑖𝑠𝑡 𝑝, 𝑖𝑔𝑣( , ) <𝑑 2 ×∑ ∈ 1 (23) 𝑂𝑅(𝑑) = 2 2

(e) Relação de ocupação relativa vizinha: em alguns casos, a distância d dada pode ser derivada usando o raio médio do objeto multiplicado por um fator predeterminado (𝑑 = 𝑥 × 𝑅). O resultado é uma relação de ocupação vizinha relativa

(RNOR) e pode ser derivada para um determinado fator x usando as seguintes equações: (24) 𝑅𝑁𝑂𝑅(𝑥) = 𝑁𝑂𝑅(𝑑)

(vi) Recursos espectrais, que descrevem as propriedades da luz de um determinado objeto.

Cor (canais de luz vermelha, verde e azul; matiz, luminância e crominância ou qualquer outra transformação do espaço de cores), textura e contraste (ao longo do tempo e/ou através do espaço) são exemplos de tais características.

As características espectrais podem ser derivadas de imagens capturadas em vários pontos de tempo e/ou sob várias condições de iluminação durante a incubação usando máscaras de colônia e podem ainda ser associadas a uma região de Voronoï de influência para uma determinada colônia. (a) Imagem do canal: este é um recurso espectral no qual um canal de cor específica (por exemplo, vermelho (R), verde (G), azul (B)) é usado para resolver espectralmente a imagem. (b) Luma: este também é um recurso espectral usado para caracterizar o brilho de uma imagem usando canais RGB como entrada. (c) Matiz: esta é uma característica espectral em que uma área da imagem é caracterizada como aparentando ser semelhante a uma cor percebida (por exemplo, vermelho, amarelo, verde, azul) ou uma combinação das mesmas.

O matiz (H2) é geralmente caracterizado usando as seguintes equações: (25) 𝐻2 = 𝑎𝑡𝑎𝑛2(𝛽, 𝛼) 1 (26) 𝛼 = 𝑅 − (𝐺 + 𝐵) 2 √3 (27) 𝛽 = (𝐺 − 𝐵) 2

(d) Croma: esta é uma característica espectral para caracterizar o colorido de uma área de uma imagem em relação ao seu brilho, se essa área fosse iluminada de forma semelhante em branco.

O croma (C2) é geralmente caracterizado usando a seguinte equação: (28) 𝐶2 = 𝛼 2 + 𝛽2

(e) Dispersão radial: a análise da dispersão radial do contraste de matiz e croma permite a discriminação de hemólise alfa, beta e gama. (f) Contraste máximo: esta característica caracteriza a resolução da imagem ao calcular o máximo de um contraste médio medido por pixels em um determinado raio r de um ponto central da imagem (por exemplo, o centro de uma colônia com imagem). Este recurso pode ser usado para descrever as diferenças perceptuais entre uma imagem tirada nos tempos t0 e tx com base no crescimento induzido pelo objeto analisado. O contraste máximo pode ser caracterizado da seguinte forma: (29) 𝐶𝑜𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑡𝑒𝑀𝑎𝑥 = 𝑀𝐴𝑋(𝐶𝑜𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑡𝑒𝑀é𝑑𝑖𝑜 ) (vii) Características de fundo, que descrevem mudanças no meio na vizinhança do objeto analisado. Por exemplo, no caso de uma colônia com imagem, as mudanças podem ser causadas pelo crescimento microbiano ao redor da colônia (por exemplo, sinais de hemólise, mudanças no pH ou reações enzimáticas específicas).

[0100] As características dinâmicas visam refletir uma mudança nos atributos do objeto e/ou fundo circundante ao longo do tempo. O processamento de série temporal permite que recursos estáticos sejam relacionados ao longo do tempo. A primeira e a segunda derivadas discretas dessas características fornecem "velocidade" e "aceleração" instantâneas (ou platô ou desaceleração) da mudança em tais recursos a serem caracterizados ao longo do tempo. Exemplos de características dinâmicas incluem o seguinte: (i) Processamento de série temporal para rastrear as características estáticas acima ao longo do tempo. Cada característica medida em um determinado tempo de incubação pode ser referenciada de acordo com seu tempo de incubação relativo para permitir que as características sejam relacionadas àquelas medidas em tempos de incubação posteriores. Uma série temporal de imagens pode ser usada para detectar objetos, como CFUs, que aparecem e aumentam com o tempo, conforme descrito acima. Os pontos de tempo para a geração de imagens podem ser predefinidos ou definidos por um processo automatizado com base na análise contínua de imagens dos objetos capturados anteriormente. Em cada momento, a imagem pode ser uma determinada configuração de aquisição, seja para toda a série de uma única configuração de aquisição, ou como uma série inteira de imagens capturadas de múltiplas configurações de aquisição. (ii) Primeira e segunda derivadas discretas das características acima para fornecer velocidade e aceleração instantâneas (ou platô ou desaceleração) das mudanças em tais características ao longo do tempo (por exemplo, rastreamento da taxa de crescimento, como discutido acima): (a) Velocidade: uma primeira derivada de um recurso ao longo do tempo. A velocidade (V) de um recurso x pode ser caracterizada em termos de (x unidades) / hora, com Δt sendo um intervalo de tempo expresso em horas, com base nas seguintes equações: (30) 𝑉 = lim ∆ →0 1 0 (31) 𝑉1,0 = 1 0 2 1 (32) 𝑉2,1 = 2 1 (b) Aceleração: uma segunda derivada da característica ao longo do tempo, também a primeira derivada da velocidade. A aceleração (A) pode ser caracterizada com base na seguinte equação: ⬚ (33) 𝐴 = lim ∆ →0

[0101] As características da imagem acima são medidas a partir dos objetos ou do contexto dos objetos e visam capturar as especificidades dos organismos que crescem em vários meios e condições de incubação. As características listadas não pretendem ser exaustivas e qualquer pessoa versada na técnica pode modificar, ampliar ou restringir este conjunto de características de acordo com a variedade de características baseadas em processamento de imagem conhecidos no campo.

[0102] As características da imagem podem ser coletadas para cada pixel, grupo de pixels, objeto ou grupo de objetos na imagem. Uma distribuição das características coletadas pode ser construída em um histograma para caracterizar regiões da imagem de forma mais geral, ou mesmo a imagem inteira. O próprio histograma pode contar com várias características estatísticas para analisar ou processar os dados de recursos de imagem recebidos.

[0103] As características do histograma estatístico podem incluir o seguinte: (i) Mínimo: o menor valor da distribuição capturado no histograma. Isso pode ser caracterizado pela seguinte relação: (34) 𝑀𝑖𝑛 = 𝑖 ℎ(𝑖) > 0, ∑ 0 ℎ(𝑖) =0 (ii) Máximo: o maior valor da distribuição capturado no histograma. Isso pode ser caracterizado de acordo com a seguinte relação: ∗ (35) 𝑀𝑎𝑥 = 𝑖 ℎ(𝑖) > 0, ∑∞ 1 ℎ(𝑖) =0 (iii) Soma: a soma de todos os valores individuais capturados no histograma. A soma pode ser definida pela seguinte relação: (36) 𝑆𝑢𝑚 = ∑ 𝑖 × ℎ(𝑖) (iv) Média: a média aritmética ou média. Esta é a soma de todas as pontuações dividida pelo número de pontuações (N) de acordo com a seguinte relação: ∑ á × () (37) 𝑀é𝑑𝑖𝑎 = (v) Quartil 1 (Q1): A pontuação no 25º percentil da distribuição. 25% das pontuações estão abaixo de Q1 e 75% estão acima de Q1. Isso é descrito pela seguinte relação: 1 (38) 𝑄1 = 𝑖 ∑ ℎ(𝑖) < , ∑ 4 ℎ(𝑖) ≥ 4 (vi) Mediana (Q2): A pontuação no 50º percentil da distribuição. 50% das pontuações estão abaixo da mediana e 50% acima da mediana. A mediana é menos sensível a pontuações extremas do que a média e isso geralmente a torna uma medida melhor do que a média para distribuições altamente enviesadas. Isso é descrito pela seguinte relação:

(39) 𝑀𝑒𝑑𝑖𝑎𝑛𝑎 = 𝑄2 = 𝑖 ∑ ℎ(𝑖) < , ∑ 2 ℎ(𝑖) ≥ 2

(vii) Quartil 3 (Q3): A pontuação no 75º percentil da distribuição. 75% por cento das pontuações estão abaixo de Q3 e 25% acima de Q3. Isso é descrito pela seguinte relação: 3 3 (40) 𝑄3 = 𝑖 ∑ ℎ(𝑖) < 𝑁, ∑ 4 ℎ(𝑖) ≥ 𝑁 4

(viii) Modo: a pontuação que ocorre com mais frequência em uma distribuição.

Isso é usado como uma medida de tendência central.

A vantagem do modo como medida de tendência central é que seu significado é óbvio.

Além disso, é a única medida de tendência central que pode ser usada com dados nominais.

O modo está altamente sujeito a flutuações de amostra e, portanto, geralmente não é usado como a única medida de tendência central.

Além disso, muitas distribuições têm mais de um modo.

Essas distribuições são chamadas de "multimodais". O modo é descrito pela seguinte relação: á (41) 𝑀𝑜𝑑𝑜 = 𝑖 ℎ(𝑖) ≥ ℎ(𝑖)

(ix) Trimeano: uma pontuação calculada adicionando o 25º percentil mais duas vezes o 50º percentil (mediana) mais o 75º percentil e dividindo por quatro.

O trimeano é quase tão resistente a pontuações extremas quanto a mediana e está menos sujeito a flutuações de amostragem do que a média aritmética em distribuições assimétricas.

No entanto, geralmente é menos eficiente do que a média para distribuições normais.

Trimeano é descrito de acordo com a seguinte relação: 1 2 2 3 (42) 𝑇𝑟𝑖𝑀𝑒𝑎𝑛𝑜 = 4

(x) Média aparada: uma pontuação calculada descartando uma determinada porcentagem da pontuação mais baixa e mais alta e, em seguida, computando a média das pontuações restantes.

Por exemplo, uma média aparada de 50% é calculada descartando os 25% mais baixos e mais altos das pontuações e tomando a média das pontuações restantes.

Por exemplo, a mediana é a média aparada em 100% e a média aritmética é a média aparada em 0%. A média aparada é geralmente menos suscetível aos efeitos de pontuações extremas do que a média aritmética.

Portanto, é menos suscetível à flutuação de amostragem do que a média para distribuições assimétricas.

Geralmente é menos eficiente do que a média para distribuições normais.

A título de exemplo, a média aparada de 50% é descrita pela seguinte relação: ∑ 3 × () (43) 𝑀é𝑑𝑖𝑎𝐴𝑝𝑎𝑟𝑎𝑑𝑎50 = 3 1 ∑ () 1

(xi) Intervalo: a diferença entre o maior e o menor valor.

O intervalo pode ser uma medida útil de propagação.

No entanto, é sensível a pontuações extremas, uma vez que se baseia em apenas dois valores.

Devido a essa sensibilidade, o intervalo geralmente não é usado como a única medida de dispersão, mas pode, no entanto, ser informativo se usado como um suplemento a outras medidas de dispersão, como desvio padrão ou intervalo interquartílico. (xii) Intervalo interquartílico: uma medida de dispersão calculada como a metade da diferença entre o 75º percentil (Q3) e o 25º percentil (Q1). Uma vez que metade das pontuações em uma distribuição está entre Q3 e Q1, o intervalo interquartílico é a metade da distância necessária para cobrir essa metade das pontuações.

Em uma distribuição simétrica, um intervalo que se estende de um intervalo semi-interquartílico abaixo da mediana a um semi-interquartílico acima da mediana conterá metade das pontuações.

No entanto, isso não é verdade para uma distribuição distorcida.

Ao contrário do intervalo, o intervalo semi-interquartílico geralmente não é substancialmente afetado por pontuações extremas.

No entanto, ele está mais sujeito à flutuação de amostragem em distribuições normais do que o desvio padrão e, portanto, não é frequentemente usado para dados distribuídos aproximadamente normalmente.

O intervalo semi-interquartílico é definido de acordo com a seguinte relação: 3 1 (44) 𝐼𝑛𝑡𝑒𝑟𝑣𝑎𝑙𝑜𝑆𝑒𝑚𝑖𝐼𝑛𝑡𝑒𝑟𝑄𝑢𝑎𝑟𝑡í𝑙𝑖𝑐𝑜 = 2

(xiii) Variância: Uma medida de dispersão de distribuição.

A variância é calculada tomando o desvio médio quadrático de cada número de sua média, de acordo com a seguinte relação: 1 á (45) 𝑉𝑎𝑟𝑖â𝑛𝑐𝑖𝑎 = ∑ ℎ(𝑖) × (𝑖 − 𝑀é𝑑𝑖𝑎)2 1 (xiv) Desvio padrão: uma função de variância que mede quão amplamente os valores de uma distribuição estão dispersos da média. O desvio padrão é a raiz quadrada da variância. Embora geralmente menos sensível a pontuações extremas do que o intervalo, o desvio padrão é geralmente mais sensível do que o intervalo semi-interquartílico. Assim, o intervalo semi-interquartílico pode ser usado para complementar o desvio padrão quando existe a possibilidade de pontuações extremas. (xv) Enviesamento: Uma medida da assimetria de uma distribuição em torno de sua média. Uma distribuição é enviesada se uma de suas caudas for mais longa que a outra. O enviesamento positivo indica uma distribuição com uma cauda assimétrica estendendo-se em direção a valores mais positivos (maiores do que a média). O enviesamento negativo indica uma distribuição com uma cauda assimétrica estendendo-se em direção a valores mais negativos (menos do que a média). A assimetria pode ser calculada de acordo com a seguinte relação: N i Média 3 (46) Enviesamento = (N ∑máx h(i) × 1)×(N 2) i min StdDev (xvi) Curtose: Uma medida de inclinação ou nivelamento de uma distribuição (ou uma largura de pico relativa), em comparação com uma distribuição normal. A curtose positiva indica uma distribuição relativamente elevada. A curtose negativa indica uma distribuição relativamente plana. A curtose é baseada no tamanho da cauda de uma distribuição e é determinada pela seguinte relação: ×( 1) é 4 ( 1)2 á (47) 𝐶𝑢𝑟𝑡𝑜𝑠𝑒 = ( ∑ ℎ(𝑖) × − 3( 1)×( 2)×( 3) 2)×( 3)

[0104] Os métodos estatísticos acima são úteis para analisar as distribuições espaciais de valores de cinza, calculando características locais em cada ponto da imagem e derivando um conjunto de estatísticas das distribuições das características locais. Com esses métodos estatísticos, as texturas para as regiões analisadas podem ser descritas e definidas estaticamente.

[0105] A textura pode ser caracterizada usando descritores de textura. Os descritores de textura podem ser calculados sobre uma determinada região da imagem (discutida em mais detalhes abaixo). Um método de textura comumente aplicado é o método de co-ocorrência, introduzido por Haralick, R., et al. “Recursos de textura para classificação de imagem,” IEEE Transactions of System, Man and Cybernetics, Vol. 3, pp. 610-621 (1973), que é aqui incorporado por referência. Neste método, as frequências relativas de pares de pixels de nível de cinza separados por uma distância d na direção θ são combinadas para formar um vetor de deslocamento relativo (d, θ). O vetor de deslocamento relativo é calculado e armazenado em uma matriz, conhecida como matriz de co-ocorrência de nível de cinza (GLCM). Esta matriz é usada para extrair recursos de textura estatística de segunda ordem. Haralick sugere quatorze características diferentes para descrever uma função de densidade de probabilidade bidimensional pij, quatro de cujas características são mais comumente usadas do que as outras:

[0106] A textura pode ser caracterizada usando descritores de textura. Os descritores de textura podem ser calculados sobre uma determinada região da imagem (discutida em mais detalhes abaixo). Um método de textura comumente aplicado é o método de co-ocorrência, introduzido por Haralick, R., et al. “Texture features for image classification,” IEEE Transactions of System, Man and Cybernetics, Vol. 3, pp. 610-621 (1973), que é aqui incorporado por referência. Neste método, as frequências relativas de pares de pixels de nível de cinza separados por uma distância d na direção θ são combinadas para formar um vetor de deslocamento relativo (d, θ). O vetor de deslocamento relativo é calculado e armazenado em uma matriz, conhecida como matriz de co-ocorrência de nível de cinza (GLCM). Esta matriz é usada para extrair características de textura estatística de segunda ordem. Haralick sugere quatorze características diferentes para descrever uma função de densidade de probabilidade bidimensional pij, quatro de cujas características são mais comumente usadas do que as outras: (i) O segundo momento angular (ASM) é calculado pelo seguinte: 1 1 2 (48) 𝐴𝑆𝑀 = ∑ 0 ∑ 0 𝑝 (ii) O contraste (Con) é calculado pelo seguinte: 1 1 (49) 𝐶𝑜𝑛 = ∑ 0 ∑ 0 (𝑖 − 𝑗)2 𝑝 (iii) A correlação (Cor) é calculada pelo seguinte (em que σx e σy são desvios padrão das distribuições correspondentes): 1 (50) 𝐶𝑜𝑟 = ∑ 01 ∑ 01 𝑝 log 𝑝 (iv) A entropia (Ent) é calculada da seguinte forma: 1 1 (51) 𝐸𝑛𝑡 = ∑ 0 ∑ 0 𝑝 log 𝑝

[0107] Estas quatro características também estão listadas em Strand, J., et al. “Local frequency features for the texture classification,” Pattern Recognition, Vol. 27, No. 10, pp 1397-1406 (1994) [Strand94], que também é aqui incorporado por referência.

[0108] Para uma determinada imagem, a região da imagem sobre a qual as características acima são avaliadas pode ser definida por uma máscara (por exemplo, uma máscara de colônia), ou por uma região de Voronoï de influência que se estende além da máscara.

[0109] A figura 14 ilustra algumas regiões possíveis. A região 1410 é uma máscara de colônia que se estende apenas até a própria colônia. A região 1420 é a região de Voronoï de influência da colônia (delimitada pela borda da imagem ou placa). Para ilustração adicional, o pixel 1430 é um pixel dentro da região 1420, mas fora da região 1410. Em outras palavras, espera-se que a colônia representada pela região 1410 se expanda para o pixel 1630, mas ainda não o fez. O pixel 1440 é um pixel fora de ambas as regiões 1410 e 1420. Em outras palavras, não apenas a colônia não ocupa o pixel 1410 no momento da imagem, mas também não está previsto que seja ocupada pela colônia em qualquer momento no futuro (neste caso, já está ocupado por uma colônia diferente).

[0110] Usando máscaras de colônias em diferentes pontos no tempo ao longo do processo de incubação e suas regiões de Voronoï de influência associadas, conforme descrito acima, é possível gerar vários histogramas que descrevem diferentes aspectos das colônias e seu impacto no meio de cultivo local circundante. As máscaras de colônias e as próprias regiões de Voronoï de influência podem ser ajustadas ao longo do tempo, por exemplo, à medida que as colônias crescem. Por exemplo, as figuras 15A a C ilustram como o crescimento de uma colônia pode ser usado para ajustar uma máscara da colônia ao longo do tempo. A figura 15A é uma porção de uma hemocultura após 24 horas de crescimento em ágar. A figura 15B é uma imagem de contraste da mesma cultura, em comparação com uma imagem previamente capturada em t0. A figura 15C é uma imagem em escala de cinza que ilustra o crescimento em 9 horas (mais claro), 12 horas (médio) e 24 horas (mais escuro). Cada sombra na figura 15C pode ser usada para projetar uma máscara diferente para a colônia. Alternativamente ou adicionalmente, conforme ocorre o crescimento, as máscaras podem ser separadas de acordo com suas respectivas regiões de Voronoï de influência.

[0111] Qualquer uma ou combinação de características na lista de recursos acima pode ser usada como um conjunto de recursos para capturar especificidades de organismos que crescem em vários meios de uma placa de imagem sob várias condições de incubação. Esta lista não pretende ser exaustiva, e qualquer pessoa com conhecimento na área pode modificar, ampliar ou restringir este conjunto de recursos de acordo com os objetos pretendidos a serem visualizados e a variedade de recursos baseados em processamento de imagem conhecidos no campo. Assim, as características do exemplo acima são oferecidas a título de ilustração, não de limitação.

[0112] Aqueles versados na técnica estão cientes de outras medidas e abordagens para determinar os formatos e características do objeto, e os exemplos acima são oferecidos a título de ilustração, não de limitação.

CONSTRUÇÃO DE CONTRASTE

[0113] Muitas vezes é difícil prever inicialmente qual imagem em uma série de imagens trará valores para detecção, contagem ou identificação de crescimento. Isso ocorre em parte porque o contraste da imagem varia para as diferentes unidades formadoras de colônias (UFC) e entre diferentes meios de comunicação. Em uma determinada imagem de várias colônias, uma colônia pode ter um contraste altamente desejável com o fundo, enquanto outra colônia pode não ter um contraste adequado com o fundo para a detecção de crescimento. Isso também torna difícil usar uma abordagem única para identificar colônias no meio.

[0114] É, portanto, desejável construir contraste de todo o material disponível através do espaço (diferenças espaciais) e tempo (diferenças temporais em condições de imagem comuns), bem como usando várias condições de imagem (por exemplo, canais vermelhos, verdes e azuis, fundos claros e escuros, imagens espectrais ou qualquer outra transformação do espaço de cores). Também é desejável reunir contraste de várias fontes disponíveis para fornecer uma imagem padronizada como uma entrada para um algoritmo de detecção de colônias.

[0115] Os dados da imagem podem ser delimitados com base em vários fatores. Por exemplo, os dados de imagem podem ser limitados a pontos de tempo específicos e/ou informações específicas buscadas (por exemplo, informações de imagem espacial podem não exigir tantos pontos de tempo quanto as informações de imagem temporal exigem). As configurações de iluminação e espaços de cores também podem ser selecionadas para atingir objetivos de contraste específicos. As frequências espaciais também podem ser variadas a fim de detectar objetos (por exemplo, colônias) com um tamanho desejado (ou tamanho dentro de um intervalo alvo).

[0116] Para detectar objetos discretos, o contraste pode ser definido para valores absolutos em [0,1] ou com sinal [-1, -1]. Uma escala e um deslocamento da saída de contraste também podem ser especificados (por exemplo, para imagem de 8 bits com deslocamento de contraste assinado pode ser 127,5 e a escala pode ser 127,5). Em um exemplo onde o contraste é definido para um extremo, o deslocamento absoluto pode ser definido para zero e a escala para 256.

[0117] O contraste espacial pode ser usado para detectar objetos discretos em um fundo homogêneo. Uma fórmula pode ser utilizada para fornecer avaliação automatizada de contraste espacial 𝐶( , , ) em uma imagem I na localização (x, y) dentro da distância r. Em uma modalidade, em que a distância r é limitada a distâncias maiores ou iguais a (𝑥 − 𝑥)2 + (𝑦 − 𝑦)2 , e um operador de contraste K é usado para controlar as configurações de contraste, as seguinte equações são aplicadas: ( , ) , (52) 𝐶( , , ) = , ( , ) , , 1 (53) 𝐾( , , ) 2 ∑ 𝐼( , )

[0118] O contraste temporal pode ser usado para detectar objetos em movimento ou objetos que mudam ao longo do tempo (como UFCs que aparecem e ou se gastam em uma placa de imagem). Uma fórmula pode ser utilizada para fornecer ( , 0) avaliação automatizada de contraste temporal 𝐶( , ) em uma imagem I na localização (x, y) entre os tempos t0 e tx. Em uma modalidade, a seguinte equação é aplicada: 0 ( , 0) ( , ) ( , ) (54) 𝐶( , ) = 0 ( , ) ( , )

[0119] A coleta de contraste espacial pode ser implementada de forma automatizada, gerando uma pluralidade de imagens SHQI de uma placa de acordo com uma sequência pré-programada. Múltiplas imagens seriam geradas em um determinado tempo de incubação para futuras investigações de detecção de colônias. Em uma modalidade, em que os dados de imagem (particularmente, um vetor "vect" usado para fornecer entradas de contraste para o operador de coleta de contraste) são coletados em várias configurações (CFG1 a CFGN) em vários raios diferentes da colônia detectada (Rmin a Rmáx) em um determinado momento de acordo com o seguinte: ( , ) 〈 1 ,…, 〉 ( , ) ( , , ) (55) 𝐶( , ) á = ( , á )𝑀á𝑥 ( , ) ( , , )

[0120] Se SNR é conhecido para uma determinada imagem 𝐼( , ) (por exemplo, quando a imagem SHQI é a fonte), a configuração em que o contraste ponderado de SNR é maximizado pode ser identificada como a melhor configuração (Melhor CFG) quando: ( , ) ( , , ) (56) ∗ 𝑆𝑁𝑅( , ) é máximo sobre: ( , ) ( , , ) ( , á ) 〈 1 ,…, 〉 ( , ) ( , , ) (57) ∗ 𝑆𝑁𝑅( , ) ( , ) ( , , ) ( , á )

[0121] O operador de contraste K ainda se beneficia desta informação de SNR conhecida e a equação acima torna-se: 〈 1 ,…, 〉 , ( , ) ( , ) ( , , ) (58) 𝐶( , ) = ( , ) ( , , ) ⬚

[0122] A coleta de contraste temporal também pode ser implementada de forma automatizada, gerando uma pluralidade de imagens SHQI de uma placa de acordo com uma sequência pré-programada. Múltiplas imagens seriam geradas em vários tempos de incubação, pelo menos um dos quais é t0, para futuras investigações de detecção de colônias. Em uma modalidade, os dados de imagem são coletados ao longo de várias configurações no tempo t0 e um ou mais tempos de incubação subsequentes até o tempo tx de acordo com o seguinte: 1 0 〈 ,… , 〉 〈 〉 ( , ) ( , ) 1 ,…, (59) 𝐶( , ) 0 = ⬚𝑀𝑎𝑥 1 0 ( , ) ( , )

[0123] No exemplo acima, o vetor pode ser um vetor entre dois pontos de tempo (por exemplo, t0 e tx) com base nas diferenças nas imagens nesses dois momentos. No entanto, em outras aplicações, nas quais os tempos adicionais entre t0 e tx são incluídos, o vetor pode ser mapeado em tantos pontos quantos os momentos em que as imagens são tiradas. Matematicamente falando, não há limite para o número de pontos que podem ser incluídos no vetor.

[0124] Tal como acontece com o contraste espacial, se SNR é conhecido para uma determinada imagem 𝐼( , ), a configuração em que o contraste ponderado de SNR é maximizado pode ser identificada como a melhor configuração (Melhor CFG) quando: 1 0 ( , ) ( , ) (60) ∗ 𝑆𝑁𝑅( , ) é máximo sobre 1 0 ( , ) ( , ) ⬚ 〈 1 ,…, 〉 1 0 ( , ) ( , ) (61) ∗ 𝑆𝑁𝑅( , ) 1 0 ( , ) ( , ) ⬚

[0125] O operador de contraste K ainda se beneficia desta informação de SNR conhecida e a equação acima torna-se: 〈 1 ,…, 〉 ⬚ 1 0 〈 ,… 〉 ( , ) ( , ) (62) 𝐶( , ) 0 = 1 0 ( , ) ( , ) ⬚

[0126] Nos exemplos acima, o operador Máx pode ser substituído por qualquer outro operador estatístico, como um percentil (por exemplo, Q1, mediana, Q3 ou qualquer outro percentil) ou soma ponderada. Os valores ponderados podem originar-se de um pré-trabalho extraído de um banco de dados de treinamento, abrindo assim o campo de extração de contraste supervisionado para redes neurais. Além disso, vários algoritmos podem ser usados, com os resultados dos vários algoritmos sendo combinados usando outro operador, como o operador Máx.

ALINHAMENTO DE IMAGEM

[0127] Quando múltiplas imagens são obtidas ao longo do tempo, um alinhamento muito preciso das imagens é necessário para obter estimativas temporais válidas delas. Tal alinhamento pode ser alcançado por meio de um dispositivo de alinhamento mecânico e/ou algoritmos (por exemplo, rastreamento de imagem, correspondência de imagem). Aqueles versados na área estão cientes dessas soluções e técnicas para atingir esse objetivo.

[0128] Por exemplo, nos casos em que várias imagens de um objeto na placa são coletadas, as coordenadas da localização de um objeto podem ser determinadas. Os dados de imagem do objeto coletados em um momento subsequente podem então ser associados aos dados de imagem anteriores com base nas coordenadas e, então, usados para determinar a mudança no objeto ao longo do tempo.

[0129] Para uso rápido e valioso de imagens (por exemplo, quando usado como entrada para classificadores), é importante armazenar as imagens em uma referência espacial para maximizar sua invariância. Como o descritor de forma básico para uma colônia é geralmente circular, um sistema de coordenadas polares pode ser usado para armazenar imagens da colônia. O centro de massa da colônia pode ser identificado como o centro da localização da colônia quando a colônia é detectada pela primeira vez. Esse ponto central pode servir mais tarde como centro de origem para uma transformada polar de cada imagem subsequente da colônia. A figura 16A mostra uma porção ampliada de uma placa de imagem tendo um ponto central "O". Dois raios “A” e “B” estendendo-se do ponto “O” são mostrados (para fins de clareza) sobrepostos na imagem. Cada raio se cruza com uma colônia respectiva (circulada). As colônias circuladas da figura 16A mostradas em detalhes ainda maiores nas imagens 1611 e 1612 figura 16B. Na figura 16B, a imagem 1611 (o raio de intersecção da colônia "A") é reorientada na imagem 1613 ("A") de modo que o eixo radial da imagem 1613 esteja alinhado com o da imagem 1612, de modo que a parte mais à esquerda da imagem reorientada seja mais próxima do ponto "O" da figura 16A, e a parte mais à direita da imagem reorientada é a mais distante do ponto "O". Essa reorientação polar permite uma análise mais fácil das colônias de orientação diferente (com relação a fatores como iluminação) de uma placa com imagem formada

[0130] Na figura 16C, uma transformada polar é concluída para cada uma das imagens 1611, 1612 e 1613 da figura 16B. Nas imagens de transformada polar 1621, 1622 e 1623, o eixo radial das respectivas imagens reorientadas 1611, 1612 e 1613 (estendendo-se do centro de cada respectiva colônia com imagens formadas) é plotado da esquerda para a direita nas imagens da figura 16C, e o eixo angular (das respectivas colônias) é traçado de cima para baixo.

[0131] Para cada imagem polar, conjuntos de vetores dimensionais resumidos podem ser gerados usando, por exemplo, características de formato e/ou características de histograma (por exemplo, média e/ou desvio padrão de cor ou intensidade de um objeto) ao longo do eixo radial e/ou angular. Mesmo que as características de formato e histograma sejam quase sempre invariáveis ao se considerar a rotação, é possível que algumas características de textura mostrem variações significativas quando girados; portanto, a invariância não é garantida. Portanto, há um benefício significativo em apresentar cada uma das imagens da colônia do mesmo ponto de vista ou ângulo de iluminação, já que as diferenças de textura dos objetos podem então ser usadas para discriminar entre si. Como as condições de iluminação mostram principalmente variações ligadas à posição angular em torno de um centro de imagem de placa, o raio que atravessa a colônia e o centro da placa (mostrado como uma linha em cada uma das imagens 1611, 1612 e 1613 da figura 16B) pode servir como origem (Ɵ) para cada transformada polar da imagem.

[0132] Outro desafio de alinhamento surge do fato de que o meio da placa não está absolutamente congelado e rígido e, portanto, pode mudar ligeiramente de um para o outro. Portanto, não se pode absolutamente supor que a região de uma placa em certas coordenadas de uma imagem tirada em um momento irá necessariamente se alinhar perfeitamente com a região da placa nas mesmas coordenadas tomadas em um momento posterior. Dito de outra forma, leves deformações do meio podem levar a um pouco de incerteza quanto à correspondência exata de um determinado pixel com o pixel correspondente capturado em um ponto de tempo diferente durante o processo de incubação.

[0133] A fim de contabilizar esta incerteza, um determinado valor de intensidade de pixel no tempo ta, 𝐼( a, ) , pode ser comparado com o valor de intensidade mais próximo na vizinhança local N(x, y) deste pixel em um ponto de tempo diferente tb, 𝐼N(b , ). A seleção de uma vizinhança local pode envolver a determinação de um ou mais erros ou imprecisões no reposicionamento da placa de imagem de um momento para o outro (por exemplo, um erro de precisão de posição devido ao reposicionamento imperfeito do meio de imagem formada, um erro de paralaxe devido a uma altura desconhecida do meio com imagem formada de um momento para o outro). Em um exemplo, foi observado que definir "x" e "y" dentro do intervalo de cerca de 3 a cerca de 7 pixels é adequado para uma imagem com resolução de cerca de 50 mícrons por pixel.

[0134] Qualquer pessoa com conhecimento na técnica reconhecerá como uma solução eficiente para gerar duas imagens tb a partir da imagem de origem tb: a primeira correspondendo a uma dilatação de nível de cinza de tb (referido , , como 𝐷𝐼𝐿⬚ ), e o segundo a uma erosão de nível cinza de tb, (referido como 𝐸𝑅𝑂⬚ ), ambos com um tamanho de kernel correspondendo à incerteza de distância de reposicionamento d. , ,

[0135] Se 𝐸𝑅𝑂( , ) ≤ 𝐼( a, ) ≤ 𝐷𝐼𝐿( , ) então o contraste é 0, caso contrário, o , , contraste é estimado a partir do valor mais próximo de 𝐼( a, ) dentre 𝐸𝑅𝑂( , ) 𝑒 𝐷𝐼𝐿( , ) usando o seguinte: ⬚ a b ( , ) ( , ) ( , ) (63) 𝐶( , ) = a b ( , ) ( , ) ⬚ , , , (64) 𝐾( b, ) = 𝐸𝑅𝑂( , ) 𝑠𝑒 𝐸𝑅𝑂( , ) − 𝐼( a, ) < 𝐷𝐼𝐿( , ) − 𝐼( a, ) , , , (65) 𝐾( b, ) = 𝐷𝐼𝐿( , ) 𝑠𝑒 𝐷𝐼𝐿( , ) − 𝐼( a, ) ≤ 𝐸𝑅𝑂( , ) − 𝐼( a, )

MELHORIA DE SNR

[0136] Em condições de iluminação típicas, o ruído de disparo de fóton (variação estatística na taxa de chegada de fótons incidentes no sensor) limita a SNR do sistema de detecção. Os sensores modernos têm uma capacidade total de poço de cerca de 1.700 a cerca de 1.900 elétrons por mícron quadrado ativo. Assim, ao criar imagens de um objeto em uma placa, a principal preocupação não é o número de pixels usados para criar a imagem do objeto, mas sim a área coberta pelo objeto no espaço do sensor. Aumentar a área do sensor melhora a SNR para o objeto de imagem.

[0137] A qualidade da imagem pode ser melhorada capturando a imagem com condições de iluminação sob as quais o ruído do fóton governa a SNR (ruído do fóton = √sinal) sem saturar o sensor (número máximo de fótons que podem ser registrados por pixel por quadro). A fim de maximizar a SNR, técnicas de média de imagem são comumente usadas. Essas técnicas são usadas para abordar imagens com diferenças significativas de brilho (ou cor), uma vez que a SNR das regiões escuras é muito menor do que a SNR das regiões claras, conforme mostrado pela seguinte fórmula: (66) (𝑆𝑁𝑅 = )

[0138] Em que I é a corrente média criada pelo fluxo de elétrons no sensor. Como as cores são percebidas devido a uma diferença na absorção / reflexão da matéria e da luz em todo o espectro eletromagnético, a confiança nas cores capturadas dependerá da capacidade do sistema de registrar a intensidade com um SNR alto. Sensores de imagem (por exemplo, sensores CCD, sensores CMOS, etc.) são bem conhecidos por aqueles versados na técnica e não são descritos em detalhes neste documento.

[0139] Para superar as limitações de imagem SNR clássicas, o sistema de formação de imagem pode conduzir a análise de uma placa de imagem formada durante a aquisição de imagem e ajustar as condições de iluminação e tempos de exposição em tempo real com base na análise. Este processo é descrito na Publicação PCT No. WO2015/114121, incorporada por referência e geralmente referida como Supervised High Quality Imaging (Formação de Imagem de Alta Qualidade Supervisionada) (SHQI). O sistema também pode personalizar as condições de imagem para as várias regiões de brilho da placa dentro dos diferentes canais de cores.

[0140] Para um determinado pixel x, y de uma imagem, as informações SNR do pixel adquiridas durante um quadro atual N podem ser combinadas com as informações SNR do mesmo pixel adquiridas durante os quadros adquiridos anteriores ou subsequentes (por exemplo, N-1, N+1). Por exemplo, a SNR combinada é ditada pela seguinte fórmula: ′ ′2 2 (67) SNRx,y,N 1 = SNRx,y,N + SNRx,y,N 1

[0141] Depois de atualizar os dados de imagem com uma nova aquisição, o sistema de aquisição é capaz de prever o melhor momento de aquisição seguinte que maximizaria SNR de acordo com as restrições ambientais (por exemplo, SNR mínima necessária por pixel dentro de uma região de interesse). Por exemplo, a média de 5 imagens capturadas em condições de não saturação aumentará a SNR de uma região escura (10% da intensidade máxima) em √5, ao mesclar as informações de duas imagens capturadas em condições de claro e escuro, a iluminação ideal aumentará as regiões de SNR de escuro por √11 em apenas duas aquisições.

MODELAGEM DE IMAGEM

[0142] Em algumas circunstâncias, ao calcular o contraste espacial ou temporal entre pixels de uma ou mais imagens, as informações de pixel para uma determinada imagem podem não estar disponíveis ou podem estar degradadas. A indisponibilidade pode ocorrer, por exemplo, se uma imagem da placa não foi capturada dentro do tempo antes do crescimento bacteriano (por exemplo, a placa não foi capturada no tempo t0 ou logo depois disso. A degradação da informação do sinal pode ocorrer, por exemplo, quando uma imagem for capturada no tempo t0, mas os pixels da imagem capturada não refletem com precisão a placa de imagem antes do crescimento bacteriano. Essas imprecisões podem ser causadas por artefatos temporários que não reaparecem em imagens de série temporal subsequentes da placa (por exemplo, condensação temporária formando sob a placa devido a choque térmico quando a placa é colocada pela primeira vez na incubadora).

[0143] Em tais circunstâncias, a imagem indisponível ou degradada (ou certos pixels da imagem) pode ser substituída ou aprimorada com uma imagem modelo de uma placa. A imagem do modelo pode fornecer informações de pixel refletindo como a placa deve olhar no momento específico da imagem indisponível ou degradada. No caso de uma imagem modelo no tempo t0, o modelo pode ser uma imagem simples ou padrão de uma placa e pode ser construído matematicamente usando técnicas de formação de imagem / modelagem tridimensionais. O modelo pode incluir cada um dos parâmetros de design físico (por exemplo, diâmetro, altura, divisores para alojar múltiplos meios de comunicação, material plástico, etc.), parâmetros de meio (por exemplo, tipo de meio, composição de meio, altura ou espessura de meio, etc.) parâmetros de iluminação (por exemplo, ângulo da fonte de luz, cor ou comprimento (s) de onda da fonte de luz, cor de fundo, etc.) e parâmetros de posicionamento (por exemplo, posição da placa na câmara de formação de imagem) para produzir um modelo o mais real possível.

[0144] No caso de uma imagem degradada, o aprimoramento da imagem degradada pode ser realizado usando a restauração do sinal para aguçar as características do pixel degradado da imagem quando a informação do pixel não é tão nítida quanto o resto da imagem (por exemplo, devido à condensação sob o bloqueio alguma luz que passa através da placa e, portanto, torna a seção da placa com condensação ligeiramente menos transparente). A restauração do sinal pode envolver determinar as informações de intensidade para o resto da imagem, identificar uma intensidade mediana das informações de intensidade e, em seguida, substituir as informações de intensidade para as regiões menos nítidas da imagem pela intensidade mediana do resto da imagem.

APLICAÇÕES

[0145] A presente divulgação é amplamente baseada em testes realizados em solução salina em várias diluições para simular quantidades típicas de relatório de urina (grupos de balde CFU / ml). Uma suspensão para cada isolado foi ajustada para um padrão de 0,5 McFarland e usada para preparar diluições estimadas em 1 X 106, 1 X 105, 5 X 104, 1 X 104, 1 X 103 e 1 X 102 CFU / ml suspensão em Tubos Vacutainer de urina BD (Cat. No. 364951). Os tubos de espécimes foram processados usando Kiestra InoqulA (WCA1) com o padrão de intervalo de urina padrão - # 4 Zigzag (0,01 ml dispensado por placa).

[0146] As placas foram processadas usando o ReadA Compact (35oC, não- CO2) e geradas a cada 2 horas nas primeiras 24 horas e a cada 6 horas nas segundas 24 horas com uma incubação total de 48 horas. Os tempos de incubação foram inseridos como primeira leitura em 1 hora com a margem permitida definida como +/- 15 minutos. Para a próxima leitura, foram definidas 2 a 24 horas para cada duas horas com uma margem permitida de +/- 30 minutos. Para leitura, 24 a 48 foram definidos para cada 6 horas com margens permitidas de +/- 30 minutos. Após os puros estudos de viabilidade, isso foi mudado para eliminar a margem permitida. Isso foi feito para melhorar as aquisições de imagens no intervalo de tempo desejado de 18 a 24 horas.

[0147] Em outros casos, as imagens podem ser obtidas ao longo de um intervalo de 48 horas, em intervalos de duas horas para as primeiras 24 horas e, em seguida, em intervalos de 6 horas para as próximas 24 horas. Nesses casos, um total de dezessete imagens seriam obtidas no intervalo de 48 horas, incluindo uma imagem obtida no tempo t0 (0 horas).

[0148] Todas as imagens adquiridas foram corrigidas para aberrações geométricas e cromáticas da lente, espectralmente balanceadas, com tamanho de pixel de objeto conhecido, condições de iluminação normalizadas e alta relação sinal / ruído por banda por pixel. Câmeras adequadas para uso nos métodos e sistemas descritos neste documento são bem conhecidas por aqueles versados na técnica e não são descritas em detalhes neste documento. Por exemplo, usar uma câmera de 4 megapixels para capturar uma imagem de placa de 90 mm deve permitir a enumeração de até 30 colônias / mm2 de densidades locais (> 105 CFU / placa) quando as colônias estão no intervalo de 100 μm de diâmetro com contraste adequado.

[0149] Os seguintes meios foram usados para avaliar o contraste das colônias cultivadas nele:

[0150] Sangue de ovelha 5% TSAII (BAP) é um meio não seletivo com uso mundial para cultura de urina.

[0151] O BAP é usado para enumeração de colônias e ID presumida com base na morfologia da colônia e hemólise.

[0152] Agar MacConkey II (MAC): um meio seletivo para os patógenos UTI Gram negativos mais comuns. MAC é usado para diferenciação de colônias produtoras de lactose. O MAC também inibe a enxameação de Proteus. BAP e MAC são comumente usados em todo o mundo para cultura de urina. Alguns meios não são recomendados para uso para contagem de colônias devido à inibição parcial de alguns gram negativos.

[0153] Ágar Ácido Nalidíxico Colistina (CNA): um meio seletivo para a maioria dos patógenos Gram positivos de ITU. O CNA não é tão comumente usado como o MAC para cultura de urina, mas ajuda a identificar colônias se ocorrer crescimento excessivo de colônias Gram negativas.

[0154] Orientação CHROMAgar (CHROMA): um meio de não seleção usado em todo o mundo para cultura de urina. CHROMA é usado para enumeração de colônias e ID com base na cor e morfologia da colônia. E. coli e Enterococcus são identificados pelo meio e não requerem testes de confirmação. O CHROMA é usado menos do que o BAP devido ao custo. Para amostras mistas, o meio CLED também foi usado.

[0155] Agar com deficiência de eletrólito de lactose e cistina (CLED): usado para enumeração de colônias e ID presuntiva de patógenos urinários com base na fermentação de lactose.

[0156] O processamento de espécimes BD Kiestra™ InoqulA™ foi usado para automatizar o processamento de espécimes bacteriológicos para permitir a padronização e garantir estrias consistentes e de alta qualidade. O processador de espécimes BD Kiestra™ InoqulA™ usa uma tecnologia de esferas rolantes magnéticas para estriar placas de meio usando padrões personalizáveis. O filete magnético tem 5 mm de diâmetro.

[0157] A figura 17 ilustra um exemplo de desempenho de algoritmo de coleta de contraste na recuperação de crescimento de Morganella morganii em ambos os meios CHROMagar (imagens de topo) e ágar sangue (imagens de fundo). CHROMagar e BAP são ambos meios de cultivo não seletivos comumente usados em laboratórios de microbiologia. Cada uma das imagens do meio da figura 17 apresenta uma placa com imagem iluminada por uma luz acima da placa (iluminação de topo). As imagens à esquerda apresentam contraste espacial correspondente das imagens do meio. O contraste espacial é baseado em um kernel médio de 1 milímetro. Por último, as imagens à direita apresentam contraste temporal da imagem do meio. O contraste temporal é compilado a partir de imagens capturadas entre 0 horas (t0) e 12 horas (tx) de incubação usando várias condições de iluminação (diferentes canais de cores, configurações de iluminação, etc.) em cada momento de captura de imagem.

[0158] Conforme mostrado na figura 17, o contraste local tem suas limitações ao lidar com colônias semitransparentes, especialmente onde as transições de borda são pequenas, pois apenas as regiões de confluência mais contrastadas podem ser escolhidas a partir da imagem usando o algoritmo de contraste espacial sozinho. o contraste espacial pode falhar em escolher o objeto. Também é evidente a partir da figura 17 a eficiência do contraste temporal em colônias isoladas.

[0159] A figura 17 (particularmente as imagens de ágar sangue no fundo) também destacam as questões do uso de contraste espacial sozinho para detectar o crescimento em meios transparentes. A tinta impressa na caixa transparente tem bordas muito fortes e, portanto, um forte contraste espacial. Isso acaba dificultando a visualização de qualquer outro contraste espacial, uma vez que as colônias não possuem bordas tão definidas. Assim, o uso de contraste temporal em conjunto com contraste espacial é de benefício considerável na presente divulgação.

[0160] Em última análise, o resultado das determinações de contraste descritas acima é que os métodos para detecção e identificação rápida de colônias em um meio com imagem formada podem ser automatizados. Os métodos automatizados fornecem vantagens significativas sobre os métodos manuais comparáveis.

[0161] A figura 18 mostra um par de fluxogramas comparando uma linha do tempo de um processo de teste automatizado 1800 (por exemplo, a rotina 200 da figura 2) com uma linha do tempo de um processo de teste realizado manualmente comparável 1805. Cada processo começa com o espécime para teste sendo recebido em um laboratório 1810, 1815. Cada processo prossegue com a incubação 1820, 1825, durante a qual o espécime pode ser feito imagem várias vezes. No processo automatizado, uma avaliação automatizada 1830 é feita após aproximadamente 12 horas de incubação, após o que pode ser determinado definitivamente se não há crescimento (ou crescimento normal) no espécime 1840. Como mostrado a partir dos resultados na figura 17, o uso de contraste temporal no processo automatizado melhora muito a capacidade de detecção de colônias, mesmo após apenas 12 horas.

Em contraste, no processo manual, uma avaliação manual 1835 não pode ser feita antes de quase 24 horas no processo de incubação. Somente após 24 horas pode ser determinado definitivamente se não há crescimento (ou crescimento normal) no espécime 1845.

[0162] A figura 19 ilustra uma linha do tempo pela qual a semiquantificação da colônia pode ser determinada. A placa 2005 é inoculada em 2000. Uma imagem de referência da placa recentemente inoculada 2005 é obtida em 2010. Esta é a imagem de fundo descrita anteriormente neste documento. A incubação prossegue por um intervalo de tempo predeterminado, após o qual outra imagem da placa 2005 é obtida em 2015. Essa imagem é comparada com a imagem obtida em 2010 para evidências de mudanças em objetos ou artefatos que possam ser indicativos de crescimento microbiano. Se não houver indicação de crescimento microbiano, a placa é incubada e, após um tempo predeterminado, outra imagem é obtida em 2020. Na etapa 2020, uma mudança em um objeto ou artefato é detectada como evidência de crescimento microbiano. A partir de uma perspectiva de análise de imagem, o crescimento pode ser detectado em uma imagem identificando um objeto com imagem formada (com base nas diferenças entre o objeto e seus arredores adjacentes) e, em seguida, identifica mudanças no objeto ao longo do tempo. Conforme descrito em mais detalhes acima, essas diferenças e mudanças são formas de "contraste". Além de detectar o crescimento, a análise de imagem em 2020 pode ainda envolver determinar se os objetos identificados como colônias têm biomassa adequada a ser colhida para análise. A figura 19 indica que biomassa suficiente não foi identificada na etapa 2020, e incubação adicional foi necessária. Em 2025, a imagem evidenciava colônias, mas esses objetos de colônia precisavam ser avaliados para não apenas quantificar a colônia, mas também avaliar a natureza da colônia (ou seja, é uma irmã de outros objetos de colônia identificados; é uma colônia pura (ou seja, única espécie de micro- organismos) ou é uma colônia mista (ou seja, várias espécies de micro-organismos).

A confluência da colônia e como ela é determinada é descrita na seção acima que descreve a segmentação do objeto. Se nenhum crescimento ou uma quantidade insignificante de crescimento for encontrada após um tempo predeterminado, a placa 2005 é liberada como estéril em 2022. O relatório final provavelmente indicará a falta de crescimento significativo, ou relatará o crescimento da flora normal.

[0163] A biomassa é determinada pela correlação de um objeto com uma biomassa. O tamanho do objeto é determinado e comparado com um tamanho de objeto predeterminado indicativo de uma biomassa limite. Na etapa 2025, se o objeto for formado a partir de uma amostra pura, então a biomassa pode ser escolhida para teste a jusante quando a área do meio de cultura coberta pelo objeto atinge ou excede um primeiro limite. Se a amostra biológica não for uma amostra pura, o prato de amostra inoculado é incubado novamente. Se os objetos de interesse não foram todos escolhidos com base na imagem obtida na etapa 2025, a placa de cultura inoculada é ainda incubada e gerada novamente na etapa 2030. O tamanho dos objetos correlacionados com as colônias na imagem são comparados com um segundo limite de tamanho. Se o tamanho do objeto e, portanto, a biomassa, estiver acima do segundo limite, pelo menos uma porção da biomassa é escolhida. O segundo limite predeterminado é um de: i) uma área limite coberta pela biomassa se o objeto for de uma amostra pura; ou ii) um diâmetro da biomassa se o objeto for de uma amostra que não é pura. A segunda biomassa limite predeterminada é maior do que o primeiro limite. Isso pode ser visto comparando o tamanho dos objetos na etapa 2025 na figura 19 com o tamanho dos objetos na etapa 2030. Os objetos na etapa 2030 são visivelmente maiores do que os objetos na etapa 2025, mas os objetos identificados na etapa 2025 podem ser escolhidos se houver confiança de que o objeto / biomassa é de uma amostra pura.

[0164] Se for determinado que a amostra biológica exibe um crescimento quantitativamente significativo, então em 2025 ou 2030 (dependendo de quando uma colônia alvo com biomassa adequada for detectada) uma ou mais colônias podem ser identificadas como colônias candidatas a serem escolhidas para análise. A escolha de colônias pode ser um processo totalmente automatizado, no qual cada uma das colônias escolhidas é amostrada e testada. Alternativamente, a escolha de colônias pode ser um processo parcialmente automatizado, no qual vários candidatos à colônia são identificados automaticamente e apresentados visualmente em uma imagem digital para um operador, de modo que o operador possa inserir uma seleção de um ou mais candidatos para amostragem e testes adicionais. A amostragem de colônias selecionadas ou escolhidas pode ser automatizada pelo sistema. O momento em que a colônia pode ser escolhida, em relação a 2025 e 2030, depende do que se sabe sobre a colônia observada quando ela é observada pela primeira vez em 2025. Se a colônia se desenvolveu a partir do que é considerado ser uma amostra presumivelmente pura (tal como uma ferida profunda ou uma incisão) então a colônia pode ser escolhida assim que houver quantidade suficiente para observar a colônia e coletá-la. O tempo é crítico ao processar essas amostras, e evitar um ou mais ciclos de incubação adicionais significa que os resultados do teste podem ser providos horas mais cedo. Se as amostras não forem presumivelmente puras, são necessários ciclos de incubação adicionais para permitir que as colônias cresçam ainda mais para auxiliar na identificação e quantificação dessas colônias.

[0165] Com referência novamente à figura 18, o uso de um processo automatizado também permite testes de AST e MALDI mais rápidos. Esse teste 1850 em um processo automatizado pode começar logo após a avaliação inicial 1830, e os resultados podem ser obtidos em 1860 e relatados em 1875 na marca de 24 horas. Em contraste, esse teste 1855 em um processo manual muitas vezes não começa até perto da marca de 36 horas e leva mais 8 a 12 horas para ser concluído antes que os dados possam ser revisados em 1865 e relatados em 1875.

[0166] Ao todo, o processo de teste manual 1805 é mostrado para levar até

48 horas, requer um período de incubação de 18 a 24 horas, somente após o qual a placa é avaliada quanto ao crescimento e, além disso, não tem como controlar quanto tempo uma amostra está em incubação. Em contraste, como o processo de teste automatizado 1800 pode detectar até mesmo um contraste relativamente fraco entre as colônias (em comparação com o fundo e entre si) e pode realizar imagens e incubação sem que um microbiologista tenha que controlar o tempo, apenas 12 a 18 horas de incubação são necessárias antes que o espécime possa ser identificado e preparado para testes adicionais (por exemplo, AST, MALDI), e todo o processo possa ser concluído em cerca de 24 horas. Assim, o processo automatizado da presente divulgação, auxiliado com o processamento de contraste aqui descrito, fornece testes mais rápidos de amostras sem afetar adversamente a qualidade ou precisão dos resultados do teste.

[0167] Embora a invenção neste documento tenha sido descrita com referência a modalidades particulares, deve ser entendido que essas modalidades são meramente ilustrativas dos princípios e aplicações da presente invenção. Deve, portanto, ser entendido que numerosas modificações podem ser feitas às modalidades ilustrativas e que outras disposições podem ser concebidas sem se afastar do espírito e do escopo da presente invenção, conforme definido pelas reivindicações anexas.

Claims (11)

REIVINDICAÇÕES

1. Método automatizado para avaliar o crescimento microbiano em meios plaqueados, o método CARACTERIZADO pelo fato de compreender: prover um meio de cultura inoculado com uma amostra biológica disposta em um recipiente que é substancialmente opticamente transparente; incubar o meio de cultura inoculado em uma incubadora; colocar o recipiente substancialmente opticamente transparente que transporta o meio de cultura inoculado em um aparelho de formação de imagem digital; obter uma primeira imagem digital dos meios de cultura inoculados em um primeiro momento (t0), a primeira imagem digital tendo uma pluralidade de pixels; determinar as coordenadas dos pixels na primeira imagem digital em relação ao recipiente substancialmente opticamente transparente que transporta o meio de cultura inoculado; remover o recipiente substancialmente opticamente transparente que transporta o meio de cultura inoculado do aparelho de formação de imagem digital e colocar o meio de cultura inoculado na incubadora para incubação posterior; após incubação adicional, colocar o recipiente substancialmente opticamente transparente que transporta o meio de cultura inoculado no aparelho de formação de imagem digital; obter uma segunda imagem digital do meio de cultura inoculado em um segundo tempo (tx), a segunda imagem digital tendo uma pluralidade de pixels; alinhar a primeira imagem digital com a segunda imagem digital, de modo que as coordenadas da pluralidade de pixels na segunda imagem digital correspondam às coordenadas determinadas de cada pixel correspondente na pluralidade de pixels na primeira imagem digital; comparar os pixels da segunda imagem digital com pixels correspondentes da primeira imagem digital; identificar pixels que mudaram entre a primeira imagem digital e a segunda imagem digital, em que os pixels que não mudaram entre a primeira imagem digital e a segunda imagem digital são indicativos de fundo; determinar qual dos pixels identificados na segunda imagem digital tem um nível predeterminado de contraste de limite com pixels indicativos de fundo; identificar um ou mais objetos na segunda imagem digital, cada objeto compreendendo pixels que possuem o nível predeterminado de contraste de limite com os pixels indicativos de fundo e que não estão separados uns dos outros por pixels de fundo; correlacionar os objetos identificados com uma biomassa; determinar se a amostra biológica é identificada como uma amostra pura e, em caso afirmativo, determinar ainda se a biomassa está acima de um primeiro limite, o primeiro limite sendo uma área predeterminada do meio de cultura coberta pelo objeto identificado e, se uma área do objeto identificado está acima do primeiro limite, escolhendo pelo menos uma porção da biomassa para análise posterior; e se a amostra biológica não for uma amostra pura, incubar adicionalmente o meio de cultura inoculado no recipiente substancialmente opticamente transparente.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de, se nenhum objeto for identificado após um período de tempo predeterminado, sinalizar o recipiente substancialmente opticamente transparente com o meio de cultura inoculado como uma placa sem crescimento.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que, após a etapa de incubação adicional, uma terceira imagem digital compreendendo pixels é obtida, o método CARACTERIZADO pelo fato de compreender ainda: identificar pixels adicionais que mudaram da segunda imagem digital para a terceira imagem digital;

determinar quais dos pixels identificados e dos pixels identificados adicionais na terceira imagem digital têm um nível predeterminado de contraste de limite com os pixels indicativos de fundo; identificar um ou mais objetos na terceira imagem digital, cada objeto compreendendo pixels que possuem o referido nível predeterminado de contraste de limite com os pixels indicativos de fundo e que não estão separados uns dos outros por pixels de fundo; correlacionar os objetos identificados com uma biomassa; e determinar se a biomassa está acima de um segundo limite, em que o segundo limite é um de: i) uma área limite coberta pela biomassa se o objeto for de uma amostra pura; ou ii) um diâmetro da biomassa se o objeto for de uma amostra não pura; e se a biomassa estiver acima do segundo limite, escolher pelo menos uma porção da biomassa para análise, em que a biomassa do segundo limite é maior do que a do primeiro limite.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de compreender ainda alinhar a segunda imagem digital com a primeira imagem digital, em que o referido alinhamento é baseado em uma localização de uma marca de referência no recipiente substancialmente opticamente transparente.

5. Método, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de compreender ainda alinhar a terceira imagem digital com a segunda imagem digital, em que o referido alinhamento é baseado em uma localização de uma marca de referência no recipiente substancialmente opticamente transparente.

6. Método, de acordo com as reivindicações 4 e 5, CARACTERIZADO pelo fato de a marca de referência ser selecionada a partir do grupo que consiste em um ponto de marca opticamente detectável fora do centro em um fundo do recipiente substancialmente opticamente transparente, uma extremidade de um rótulo opticamente detectável disposta em um lado do recipiente substancialmente opticamente transparente e um centro de um rótulo opticamente detectável no recipiente substancialmente opticamente transparente.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de compreender ainda obter uma pluralidade de primeiras imagens digitais no primeiro tempo de acordo com uma série predeterminada de condições de iluminação, em que cada uma das primeiras imagens digitais é obtida sob uma condição de iluminação diferente, cada condição de iluminação compreendendo uma determinada orientação do recipiente substancialmente opticamente transparente que transporta o meio de cultura inoculado em relação a uma fonte de iluminação, e uma cor de fundo especificada na qual o recipiente substancialmente opticamente transparente é colocado no aparelho de formação de imagem digital.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de o aparelho de formação de imagem digital compreender: uma fonte de iluminação direcionada para baixo em direção a um topo do recipiente substancialmente opticamente transparente que transporta o meio de cultura inoculado; uma fonte de iluminação direcionada para cima em direção a um fundo do recipiente substancialmente opticamente transparente carregando o meio de cultura inoculado; e uma fonte de iluminação direcionada para um lado do recipiente substancialmente opticamente transparente que transporta o meio de cultura inoculado.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de para a orientação especificada do recipiente substancialmente opticamente transparente em relação à fonte de iluminação do topo e a orientação especificada do recipiente substancialmente opticamente transparente em relação à fonte de iluminação lateral, a cor de fundo especificada ser preta; e para a orientação especificada do recipiente substancialmente opticamente transparente em relação à fonte de iluminação do fundo, a cor de fundo especificada ser branca.

10. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de as fontes de iluminação compreenderem uma fonte de iluminação que emite comprimentos de onda vermelhos; uma fonte de iluminação que emite comprimentos de onda verdes; e uma fonte de iluminação que emite comprimentos de onda azuis.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de os objetos serem colônias de microrganismos.