JP2022514427A - バクテリアコロニーのバクテリア増殖を監視しコロニーバイオマスを予測するシステム及び方法 - Google Patents

Abstract

最も早期に微生物増殖を検出するための撮像方法である。本方法は、画像を用いてコロニーバイオマスを判定し、コロニーバイオマスは、コロニーを同定又は抗生物質感受性検査のための解析のためにいつ選び出すことができるかを判定する。試料源が純粋な試料源でない場合、選出前にコロニーのバイオマスを増大させるために更なる培養が必要になる場合がある。【選択図】図１９

Description

［関連出願］
本願は、２０１８年１２月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／７８２，５１３号の優先権を主張し、その開示内容の全体は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。

微生物の増殖を検出するための培養プレートのデジタル画像がますます注目されている。培養プレートを撮像し同プレート上の微生物増殖を検出するための方法が、「A System and Method for Image Acquisition Using Supervised High Quality Imaging」という名称で２０１６年８月６日に公開された特許文献１と、「Colony Contrast Gathering」という名称で２０１６年１０月２７日に公開された特許文献２と、「A Method and System for Automated Microbial Colony counting from Streaked Sample on Plated Media」という名称で２０１７年１０月２７日に公開された特許文献３とに記載されている。これら３つの文献の全体は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。上記文献は全て本願と同じ譲受人に譲渡されている。

特許文献１には、信号対雑音比を制御することにより、コロニー対象物を同定し、それらの対象物を、コロニーではないアーチファクト及び背景とは区別する技法が記載されている。特許文献２には、自動化された撮像技法に基づき培養プレートの画像を解析するシステム及び方法が記載されている。コロニー対象物は、栄養培地上での微生物増殖を促進するプロセスにおいて早期に特定され、これらの特定された対象物の変化が、経時的に、かつ、バクテリアコロニーの増殖をサポートする条件下で観測される。特許文献３に記載のシステム及び方法によれば、同定されたコロニーがカウントされ、これらのコロニーが同じ微生物に由来するものであるか否かが判断され、コロニーのカウントが所定の数以上であるか否かが更に判断される。

コロニーの検出、コロニーの計数、コロニーの個体群分化及びコロニーの同定は、現代の微生物学上の撮像システムの目的を定めるものである。このような目的を可能な限り早期に実現することにより、患者に結果を迅速に送り、その結果及び解析を経済的に提供するという目標が達成される。研究のワークフロー及び意思決定を自動化することにより、目標を達成することができる速度及びコストを向上させることができる。

微生物増殖の証拠を検出するための撮像技法に関して大きな進歩がなされたが、自動化されたワークフローをサポートできるように撮像技法を拡張することが依然として求められている。培養プレートを調べ微生物増殖を明らかにするための装置及び方法は、プレート確認の非常に視覚的な特性に部分的に起因して自動化が困難である。これに関して、培養プレート画像を自動的に解析し、自動化された解析に基づいて、次に行われるステップ（例えば、コロニーの同定、感受性検査等）を決めることができる技法を開発することが望ましい。

特にコロニーが異なるサイズ及び形状であり、互いに接触しているときに、プレート培養物におけるコロニーを同定及び区別することは困難である可能性がある。互いに「交わるように増殖する（grow into）」コロニーにより、隣接コロニーが異なる微生物である場合、その隣接コロニーからの微生物を選び出す危険性があるため、対象コロニーを選び出すことがより困難になる。下流の処理のためにコロニーの試料を選び出すには、適切な量のコロニーと、複数種の微生物を選び出すことを避けるための標的コロニーの純度との双方が必要となる。複数種の微生物が選び出されると、以降の検査の結果が損なわれてしまう。これらの問題は、増殖が既にプレートのいくつかの領域において重なり合っているときに悪化する。これらの理由により、可能な場合、コロニーを同定し、プロセスにおいて増殖を早期に判断することが好ましい。その一方で、コロニーの少なくともいくらかの増殖を可能にするために、培養時間が依然として必要とされている。このため、一方では、コロニーが増殖することが可能とされる時間が長いほど、コロニーはより多く、背景とのコントラスト及び互いのコントラストをなし始め、それらのコロニーを同定するのがより容易になる。しかし、他方で、コロニーがあまりに長く増殖を許され、プレートを満たし始める場合と互いに接触し始める場合との少なくともいずれかにおいて、純粋なコロニーを選び出すことがより困難になる。コロニーを互いに分離するのに十分な程度にコロニーが依然として小さい（相対的に乏しいコントラストにもかかわらず）が、検査のために適切な量の試料を提供するのに十分なだけ大きい培養時間においてコロニーを検出することが可能である場合、この問題を最小限にすることができるか、又は解決することさえもできる。

国際公開第２０１５／１１４１２１号 国際公開第２０１６／１７２５２７号 国際公開第２０１６／１７２５３２号

本明細書に記載されているのは、プレート培地における微生物の増殖を評価するための自動化された方法である。本方法によれば、生体試料が接種され光学的に略透明な容器内に配置された培養基が準備される。接種された培養基は、インキュベータにおいて培養される。接種された培養基は、デジタル撮像装置において、接種された培養基を有する光学的に透明な容器内に配置される。自動化された方法は、第１の時点（ｔ_０）において、培養された培地の第１のデジタル画像を得ることをも含む。第１のデジタル画像は複数のピクセルを有する。自動化された方法は、接種された培養基を有する透明な容器に対する、第１のデジタル画像内のピクセルの座標を求めることをも含む。自動化された方法は、接種された培養基を有する透明な容器をデジタル撮像装置から取り出し、接種された培養基を、更なる培養のためにインキュベータ内に設置することをも含む。自動化された方法は、更なる培養の後、接種された培養基を有する透明な容器をデジタル撮像装置内に設置することをも含む。自動化された方法は、第２の時点（ｔ_ｘ）において、接種された培地の第２のデジタル画像を得ることをも含む。第２のデジタル画像は複数のピクセルを有する。自動化された方法は、第１のデジタル画像を第２のデジタル画像と位置合わせすることをも含む。これにより、第２のデジタル画像内のピクセルの座標が、第１のデジタル画像内の対応するピクセルの座標と対応することになる。自動化された方法は、第２のデジタル画像内のピクセルを、第１のデジタル画像内の対応するピクセルと比較することも含む。自動化された方法は、第１のデジタル画像と第２のデジタル画像との間で変化したピクセルを特定することをも含む。第１のデジタル画像と第２のデジタル画像との間で変化していないピクセルは背景を示す。自動化された方法は、第２のデジタル画像における特定されたピクセルのいずれが、背景を示すピクセルとの関係で所定のレベルの基準コントラストを有するかを判断することをも含む。自動化された方法は、第２のデジタル画像における１つ以上の対象物を特定することをも含む。各対象物は、背景を示すピクセルとの関係で上記所定のレベルの基準コントラストを有し、背景ピクセルによって互いに離れていないピクセルを有する。自動化された方法は、特定された対象物をバイオマスと関係付けることをも含む。自動化された方法は、生体試料が純粋な試料として特定されるかどうかを判定し、純粋な試料として特定された場合、バイオマスが第１の基準を上回るかどうかを更に判定することをも含む。第１の基準は、特定された対象物によって覆われる培養基の所定のエリアである。特定された対象物のエリアが第１の基準を上回る場合、更なる解析のため、増殖しているマテリアルの少なくとも一部を選び出すことも含まれる。自動化された方法は、生体試料が純粋な試料でない場合に、光学的に透明な容器において接種された培養基を更に培養することをも含む。

本開示の一態様による、培養物を撮像解析及び検査するためのシステムの概略図である。 本開示の一態様による、培養物を撮像解析及び検査するための自動化された研究室ワークフロールーチンを示すフローチャートである。 図３Ａは、本開示の一態様による、コロニー形態が経時的に変化するときのコロニー形態の視覚表現による時間コントラストを示す画像である。図３Ｂは、本開示の一態様による、コロニー形態が経時的に変化するときのコロニー形態の視覚表現による時間コントラストを示す画像である。 本開示の一態様による、コロニー形態が経時的に変化するときのコロニー形態の視覚表現による時間コントラストを示す画像である。 図３Ｄは、異なる照明条件下の空間コントラストを示す画像である。図３Ｅは、異なる照明条件下の空間コントラストを示す画像である。 本開示の一態様による、画像情報を得て解析するための例示的なルーチンのフローチャートである。 本開示の一態様による、空間コントラストを得るための例示的なルーチンのフローチャートである。 本開示の一態様による、時間コントラストを得るための例示的なルーチンのフローチャートである。 本開示の一態様による、画像からアーチファクトをフィルタリングするための例示的なルーチンのフローチャートである。 本開示の一態様による、画像のピクセルをラベル付けするための例示的なルーチンのフローチャートである。 本開示の一態様による、コロニーを別個の対象物に分割するための例示的なルーチンのフローチャートである。 本開示の一態様による、例示的な対象物分割ルーチンのフローチャートである。 図１０の分割ルーチンの一部としてのコンフルエント状態のコロニーの測定値を示す図である。 本開示の一態様によるボロノイ図である。 図１３Ａは、本開示の一態様による分離係数（isolation factor）測定を示す図である。図１３Ｂは、本開示の一態様による分離係数測定を示す図である。図１３Ｃは、本開示の一態様による分離係数測定を示す図である。 本開示の一態様による、影響のボロノイ領域を示す図である。 図１５Ａは、本開示の一態様による、コロニー増殖の特徴化を示す画像である。図１５Ｂは、本開示の一態様による、コロニー増殖の特徴化を示す画像である。図１５Ｃは、本開示の一態様による、コロニー増殖の特徴化を示す画像である。 画像の試料コロニーの、ズームされ向きを変えられた画像を有する、撮像プレートのセクションを示す図である。 図１６Ｂは、画像の試料コロニーの、ズームされ向きを変えられた画像を有する、撮像プレートのセクションを示す図である。図１６Ｃは、図１６Ｂのそれぞれの画像のベクトル図である。 本開示の一態様による、標本のＳＨＱＩ、空間コントラスト及び時間コントラスト画像を示す図である。 図２のルーチンのタイムラインを、比較可能なマニュアル実行されるルーチンのタイムラインと比較するフローチャートである。 コロニーの選出を支援するのに十分なサイズのコロニー候補の同定をもたらす増殖タイムラインの図である。

本開示は、プレート培地における微生物の増殖を、そのプレート培地の１つ以上のデジタル画像において検出されるコントラストに少なくとも部分的に基づいて特定及び解析する装置、システム及び方法を提供する。本明細書において説明される方法の多くは、完全に又は部分的に自動化することができ、例えば、完全に又は部分的に自動化される研究室ワークフローの一部として組み込まれる。

本明細書に記載のシステムは、微生物の同定及びそのような微生物の微生物増殖検出のために微生物学試料を撮像する光学系において実施することが可能である。本明細書に詳細に記載されていない多くのそのような市販のシステムが存在する。１つの例は、ＢＤ Ｋｉｅｓｔｒａ^ＴＭ ＲｅａｄＡというコンパクトインテリジェント培養及び撮像システムである。他の例示的なシステムは、特許文献１及び米国特許出願公開第２０１５／０２９９６３９号に記載されているものを含み、それらの全体は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。そのような光学的撮像プラットフォームは、当業者には既知であり、本明細書では詳細に説明しない。

図１は、プレート培地の高品質撮像を提供するための処理モジュール１１０及び画像取得デバイス１２０（例えば、カメラ）を有するシステム１００の概略図である。処理モジュール及び画像取得デバイスは、プレート培地上で培養される培養物の増殖を可能にするために、プレート培地を培養するための培養モジュール（不図示）等の他のシステムコンポーネントに更に接続され、それによって、これらと更にインタラクトすることができる。このような接続は、培養のための標本を受け取り、これらをインキュベータに、次にインキュベータと画像取得デバイスとの間に移送する追跡システムを用いて、完全に又は部分的に自動化することができる。

処理モジュール１１０は、システム１００の他のコンポーネントに、様々なタイプの情報の処理に基づいてタスクを実行するように命令することができる。プロセッサ１１０は、１つ以上の動作を実行するハードウェアとすることができる。プロセッサ１１０は、中央処理装置（ＣＰＵ）等の任意の標準的なプロセッサとすることもできるし、又は特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）若しくはフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）等の専用プロセッサとすることもできる。１つのプロセッサブロックが示されているが、システム１００は、並列に動作する場合もしない場合もある複数のプロセッサ、又はインキュベータ及び／又は画像取得デバイス１２０内の試料容器に関する情報を記憶及び追跡するための他の専用ロジック及びメモリを含むこともできる。これに関して、処理ユニットは、限定ではないが、システム内の標本のロケーション（インキュベータ又は画像取得デバイス、内部のロケーション及び／又は向き等）、培養時間、捕捉画像のピクセル情報、試料のタイプ、培養基のタイプ、予防処置情報（例えば、有害な標本）等を含む、システム１００内の標本に関するいくつかのタイプの情報を追跡及び／又は記憶することができる。これに関して、プロセッサは、本明細書に記載の様々なルーチンを完全に又は部分的に自動化することが可能であり得る。１つの実施形態において、本明細書に記載のルーチンを実行するための命令は、非一時的コンピュータ可読媒体（例えば、ソフトウェアプログラム）上に記憶することができる。

図２は、培養物を撮像、解析、及び必要に応じた検査をするための例示的な自動化された研究室ルーチン２００を示すフローチャートである。ルーチン２００は、ＢＤ Ｋｉｅｓｔｒａ（商標）Ｔｏｔａｌ Ｌａｂ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ又はＢＤ Ｋｉｅｓｔｒａ（商標）Ｗｏｒｋ Ｃｅｌｌ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ等の自動化された微生物学研究室システムによって実施することができる。例示的なシステムは、相互接続された複数のモジュールを含み、各モジュールは、ルーチン２００の１つ以上のステップを実行する。

２０２において、培養基が準備され、生体試料が接種される。培養基は、光学的に透明な容器とすることができる。それにより、生体試料は、様々な角度から照明されているときにその容器内で観察することができる。接種は所定のパターンを辿ることができる。試料をプレート上にストリークするためのストリーキングパターン及び自動化方法は、当業者には既知であり、本明細書において詳細に説明しない。１つの自動化方法は、磁気制御されたビーズを用いてプレート上に試料をストリークする。２０４において、培地が培養され、生体試料の増殖が可能となる。

２０６において、培地及び生体試料の１つ以上のデジタル画像が捕捉される。以下でより詳細に説明されるように、培地のデジタル撮像は、培養プロセス中に複数回（例えば、培養の開始時、培養の最中の時点、培養の終了時に）行うことができ、それによって、培地の変化を観察及び解析することができる。培地の撮像は、インキュベータから培地を取り出すステップを含むことができる。複数の時点で培地の画像が取得される場合、培地は、２つの撮像セッション間で更なる培養のためにインキュベータに返される場合がある。

２０８において、生体試料は、捕捉されたデジタル画像の情報に基づいて解析される。デジタル画像の解析は、画像に含まれるピクセル情報の解析を含むことができる。いくつかの例において、ピクセル情報は、ピクセル単位で解析することができる。他の例において、ピクセル情報は、ブロック単位で解析することができる。また更なる例では、ピクセルは、ピクセルの全体領域に基づいて解析することができ、それによって、領域内の個々のピクセルのピクセル情報を、個々のピクセルの情報を組み合わせるか、試料ピクセルを選択するか、又は以下でより詳細に説明される統計的ヒストグラム演算等の他の統計的方法を用いることによって導き出すことができる。本開示において、「ピクセル」に適用されるものとして記載されている演算は、ブロック又は他のピクセルのグループに同様に適用可能であり、本明細書において「ピクセル」という用語は、そのような適用が含まれることを意図している。

解析は、培地において増殖が検出されるか否かを判断することを含むことができる。画像解析の観点から、撮像された対象物を（対象物とその隣接する周囲との差に基づいて）特定することによって、続いて経時的に対象物の変化を特定することによって、画像内で増殖を検出することができる。本明細書においてより詳細に説明するように、これらの差及び変化はともに「コントラスト」の形態を取る。増殖を検出することに加えて、１０８における画像解析は、検出された増殖の量の定量化、複数のコロニーの特定、姉妹コロニーの特定等を更に含むことができる。

２１０において、生体試料（特に、特定された姉妹コロニー）が量的に大きな増殖を呈するか否かが判断される。増殖が見つからない場合、又は僅かな量の増殖しか見つからない場合、ルーチン２００は２２０に進むことができ、２２０において、最終報告が出力される。２１０から２２０に進む場合、最終報告では、大量の増殖がないことを示すか、又は正常フローラの増殖を報告する可能性が高い。

生体試料が、量的に大きな増殖を呈すると判断された場合、２１２において、これまでの解析に基づいて、１つ以上のコロニーを画像から選び出すことができる。コロニーを選び出すことは、完全に自動化されたプロセスとすることができ、このプロセスにおいて、選び出されたコロニーのそれぞれがサンプリングされ、検査される。あるいは、コロニーを選び出すことを、部分的に自動化されたプロセスとすることができ、このプロセスにおいて、複数の候補コロニーが自動的に同定され、デジタル画像において視覚的に運用者に提示され、それによって、運用者は、サンプリング及び更なる検査のための１つ以上の候補の選択を入力することができる。選択された又は選び出されたコロニーのサンプリングは、それ自体をシステムによって自動化することができる。

２１４において、有機体懸濁液における試料をプレート培養すること等によって、サンプリングされたコロニーが、更なる検査のために用意される。２１６において、試料が、マトリックス支援レーザ脱離イオン化法（matrix-assisted laser desorption ionization, ＭＡＬＤＩ）撮像を用いて検査され、元の培地からサンプリングされた標本のタイプが同定される。２１８において、試料は、更に又は代替的に抗生物質感受性検査（antibiotic susceptibility testing, ＡＳＴ）にかけられ、同定された標本のための可能な処置が特定される。

２２０において、最終報告にて検査結果が出力される。報告は、ＭＡＬＤＩ及びＡＳＴの結果を含むことができる。上述したように、報告は、標本増殖の定量化を示すこともできる。このため、自動化システムは、接種された培養基から始めて、培養物において見つかった標本に関する最終報告を、追加の入力をほとんど又は全く行うことなく生成することができる。

図２の例示的なルーチン等のルーチンにおいて、検出及び同定されたコロニーは、多くの場合に、コロニー形成単位（ＣＦＵ）と呼ばれる。ＣＦＵは、１つ又はいくつかのバクテリアとして開始する微小な対象物である。時間とともに、バクテリアは、増殖してコロニーを形成する。バクテリアがプレート内に配置されたときからの時間において早期であるほど、検出されるバクテリアが少なく、結果として、コロニーが小さくなり、背景に対するコントラストが低くなる。言い換えると、コロニーサイズが小さいほど、より小さな信号をもたらし、一定の背景における信号が小さいほど、結果としてコントラストが小さくなる。これは、以下の式によって反映される。

コントラストは、画像内のＣＦＵ等の対象物又は他のアーチファクトを識別する際に重要な役割を果たすことができる。対象物は、明るさ、色及び／又はテクスチャがその周囲と大きく異なっている場合に、画像内で検出することができる。対象物が検出されると、解析は、検出された対象物のタイプを識別することも含むことができる。そのような識別は、識別された対象物のエッジの平滑性等のコントラスト測定値、又は対象物の色及び／又は明るさの均一性（又は均一性の欠如）にも依拠することができる。このコントラストは、画像センサによって検出されるためには、画像のノイズ（背景信号）に勝るように十分大きくなくてはならない。

人間のコントラストの知覚（ウェバーの法則によって支配される）は限られている。最適な条件下で、人間の目は、１％の光レベルの差を検出することができる。画像測定値（例えば、明るさ、色、コントラスト）の品質及び信頼性は、測定の信号対雑音比（signal-to-noise ratio, ＳＮＲ）によって特徴付けることができる。１００というＳＮＲ値（又は２０ｌｏｇ_１０を用いて４０ｄｂ）が、ピクセル輝度と無関係に、人間の検出能力に合致する。高ＳＮＲ撮像情報及び既知のピクセル別ＳＮＲ（SNR per pixel）情報を利用したデジタル撮像技法は、コロニーがまだ人間の目に見えない場合であっても、コロニーの検出を可能にすることができる。

本開示において、コントラストは少なくとも２つの方法で、すなわち空間的及び時間的に収集することができる。空間コントラスト又はローカルコントラストは、単一の画像における所与の領域（例えば、ピクセル、又は隣接するピクセルのグループ）と、その周囲との色又は明るさの差を定量化する。時間コントラスト（temporal contrast）又はタイムコントラスト（time contrast）は、１つの画像の所与の領域と、別の時点において得られた別の画像内の同じ領域との色又は明るさの差を定量化するものである。時間コントラストを支配する式は、空間コントラストのものと類似している。

ただし、ｔ_１はｔ_０よりも後の時点である。所与の画像の空間コントラスト及び時間コントラストの双方を用いて対象物を識別することができる。識別された対象物は、それらの重要性（例えば、それらがＣＦＵであるか、正常フローラであるか、塵であるか等）を判断するように更に検査することができる。

図３Ａ、図３Ｂ及び図３Ｃは、時間コントラストが撮像された試料に対して有し得る効果の視覚的な実証を提供する。図３Ａに示す画像は、複数の時点にて捕捉され（左から右、上の行から下の行）、試料における全体的な増殖を示す。図３Ａにおいて増殖が顕著であるが、図３Ｂの対応するコントラスト時間画像において増殖が更により顕著であり、シーケンスの更に早期の段階で気づくことができる。明確にするために、図３Ｃは、図３Ｂのズームされたセクションを示す。図３Ｃからわかるように、コロニーの一部分が長く撮像されているほど、コントラスト画像においてより明るいスポットが作成される。このようにして、各コロニーの質量中心を、コロニーの明るい中心又はピークによって示すことができる。このため、経時的に得られる画像データは、コロニー形態における変化に関する重大な情報を明らかにすることができる。

背景に対する対象物の空間コントラスト又は時間コントラストを最大限にするために、システムは、異なる背景における異なる入射光を用いて画像を捕捉することができる。例えば、上面照明法、底面照明法、又は側面照明法のうちの任意のものを、黒い背景又は白い背景で用いることができる。

図３Ｄ及び図３Ｅは、撮像された試料に対し照明法の条件が有し得る効果の視覚的実証を与える。図３Ｄにおける画像は、上面照明法を用いて捕捉されたのに対し、図３Ｅにおける画像は、底面法照明を用いて、概ね同じ時点（例えば、顕著でも大量でもない増殖が生じた時点に十分近い）に捕捉した。見て取ることができるように、図３Ｄ及び図３Ｅの試料における画像のそれぞれは、いくつかのコロニーを含むが、コロニーに関する追加の情報（この場合、溶血）は、図３Ｄの画像においては背面照明法又は底面照明法により見ることができるのに対し、図３Ｅの画像においては同じ情報を把握するのが困難である。

所与の時点において、複数の照明条件下で複数の画像を捕捉することができる。画像は、照明光レベル、照明角、及び／又は対象物とセンサとの間で展開されるフィルタ（例えば、赤色、緑色及び青色フィルタ）に起因してスペクトルが異なる、異なる光源を用いて捕捉することができる。このようにして、画像取得条件は、光源位置（例えば、上面、側面、底面）、背景（例えば、黒、白、任意の色、任意の輝度）、及び光スペクトル（例えば、赤色チャネル、緑色チャネル、青色チャネル）の観点で変動させることができる。例えば、第１の画像は、上面照明及び黒色背景を用いて捕捉することができ、第２の画像は、側面照明及び黒色背景を用いて捕捉することができ、第３の画像は、底面照明及び背景なし（すなわち、白色背景）を用いて捕捉することができる。さらに、特定のアルゴリズムを用いて、使用する空間コントラストを最大限にするために、一組の変動する画像取得条件を生成することができる。これらの又は他のアルゴリズムは、所与のシーケンスに従って及び／又は或る期間にわたって画像取得条件を変動させることによって、時間コントラストを最大限にするのにも有用とすることができる。いくつかのそのようなアルゴリズムは、特許文献１に記載されている。

図４は、コントラストに少なくとも部分的に基づいて、撮像プレートを解析するための例示的なルーチンを示すフローチャートである。図４のルーチンは、図２のルーチン２００の例示的なサブルーチンとみなすことができ、図２の２０６及び２０８が、少なくとも部分的に図４のルーチンを用いて行われるようになっている。

４０２において、時点ｔ_０における第１のデジタル画像が捕捉される。時点ｔ_０は、培養プロセスが開始してすぐの時点とすることができ、撮像プレート内のバクテリアはまだ視認可能なコロニーを形成し始めていない。

４０４において、第１のデジタル画像内の１つ以上のピクセルに座標が割り当てられる。いくつかの場合、座標は、撮像プレートの中心点から広がる動径座標と、中心点の周りの角度座標とを有する極座標とすることができる。座標は、のちのステップにおいて、第１のデジタル画像を、別の角度から及び／又は別の時点に取得されたプレートの他のデジタル画像と位置合わせするのに役立つように用いることができる。いくつかの場合、撮像プレートは、特定のランドマーク又は基準マークを有することができる。そのような基準マークはセンサによって検出可能である（すなわち、光学的に検出可能である）ことが有利である。座標空間において対象物を方向付けるために基準マークを使用することは、当業者には既知である。好適で光学的に検出可能な基準マークの例としては、光学的に透明な培養皿の底面上のドット又はライン等、中心から外れたマーク（off-center mark）が挙げられる。このようなマークは、培養皿の底面を「向いた」センサによって検出することができる。センサは、培養皿の支持体が光学的に透明である場合、培養皿の下方に位置決めされ、基準マークを検出することができる。センサは、培養皿に配置される培養基が光学的に透明である場合、センサが培養皿の上方に搭載されている場合にそのような基準マークを検出することができる。培養プレートの底面にある基準マークをプレートの上面又は底面から検出する難しさを避けるために、基準マークは、培養皿の側面に貼付されたバーコードラベル等のラベルとすることができる。バーコードラベルは、センサによって検出することができる。これらの例において、バーコードラベルの側部又は中心を基準マークとすることができる。基準マークに関連してピクセル座標を割り当てることができる。そのようにして、撮像装置の座標空間におけるプレートの向きを、撮像イベントごとに再現することができる。第１の画像におけるランドマークを覆う（複数の）ピクセルの座標を、他の画像における同じランドマークを覆う（複数の）ピクセルに割り当てることができる。したがって、相対的に早期の画像内のピクセルと、後期の画像における同一のピクセルとは同じ座標を共有しているため、両ピクセルを比較することができる。このようにして、画像ごとのピクセルの変化を容易に観測することができる。

４０６において、時点ｔ_ｘにおける第２のデジタル画像が捕捉される。時点ｔ_ｘは、撮像プレート内のバクテリアが視認可能なコロニーを形成する機会を有した、ｔ_０よりも後の時点である。

４０８において、第２のデジタル画像は、それまでに割り当てられた座標に基づいて、第１のデジタル画像と位置合わせされる。画像を位置合わせすることは、例えば、特許文献１に記載の方法及びシステムを用いた画像の正規化及び標準化を更に含むことができる。

４１０において、第２のデジタル画像のコントラスト情報が求められる。コントラスト情報は、ピクセル単位で収集することができる。例えば、第２のデジタル画像内のピクセルを、第１のデジタル画像内の（同じ座標における）対応するピクセルと比較し、時間コントラストの存在を判断することができる。さらに、第２のデジタル画像の隣接するピクセルを、互いに比較するか、又は背景ピクセルに既知の他のピクセルと比較して、空間コントラストの存在を判断することができる。ピクセルの色及び／又は明るさにおける変化はコントラストを示し、１つの画像から次の画像、又は１つのピクセル（又はピクセルの領域）から次のピクセル（又はピクセルの領域）へのそのような変化の大きさを、測定、計算、推定又は他の形で求めることができる。時間コントラスト及び空間コントラストの双方が所与の画像について求められる場合、画像の所与のピクセルの全体コントラストを、その所与のピクセルの空間コントラスト及び時間コントラストの組み合わせ（例えば、平均、加重平均）に基づいて求めることができる。

４１２において、第２のデジタル画像内の対象物が、４１０において計算されたコントラスト情報に基づいて識別される。類似のコントラスト情報を有する第２のデジタル画像の隣接する複数のピクセルは、同じ対象物に属するとみなすことができる。例えば、隣接する複数のピクセルとそれらの背景との明るさの差、又は複数のピクセルと第１のデジタル画像内のそれらピクセルとの明るさの差が概ね同じである（例えば、所定の基準内にある）場合、それらピクセルは、同じ対象物に属するとみなすことができる。例として、システムは、大きなコントラスト（例えば、基準量を超える）を有する任意のピクセルに「１」を割り当てることができ、次に、全て「１」を割り当てられた隣接するピクセルのグループを、対象物として識別することができる。対象物には、同じラベルを有するピクセルが或る特定の特性を共有するように、特定のラベル又はマスクを与えることができる。このラベルは、サブルーチン４００の後のプロセスの間に、他の対象物及び／又は背景から対象物を区別するのに役立つことができる。デジタル画像における対象物を識別することは、デジタル画像を複数の領域（例えば、前景及び背景）に分割又は区分することを含むことができる。分割の目標は、要素を解析することが容易になるように、画像を複数の要素の表現に変更することである。画像分割は、画像内の対象物の位置を特定することに用いられる。

４１４において、（４１２において識別された）所与の対象物の性質を特徴付けることができる。対象物の性質の特徴付けは、対象物の記述的な統計（例えば、エリア、反射率、サイズ、光学密度、色、プレートロケーション等）を導き出すことを含むことができる。記述的な統計は、（例えば、ＳＨＱＩ画像から、コントラスト画像から）対象物に関して収集された情報の集合の或る特定の特徴を最終的に量的に記述することができる。そのような情報は、種、濃度、混合物、時間及び培地に応じて評価することができる。一方、少なくともいくつかの場合、対象物を特徴付けることは、対象物の特徴に関する質的情報の集合から始めることができる。質的情報は、その後、量的に表される。以下の表１は、質的に評価することができ、その後、量的な表現に変えることができる例示的な特徴のリストを与える。

形状、又は視覚的に観察できるまでの時間等の、対象物のいくつかの特徴は、全体として対象物について一回測定することができる。他の特徴は、数回（例えば、ピクセルごと、共通のｙ座標を有するピクセルの行ごと、共通のｘ座標を有するピクセルの列ごと、共通の角座標を有するピクセルの射線（ray）ごと、共通の動径座標を有するピクセルの円について）測定することができ、次に、ヒストグラム等を用いて組み合わせて単一の測定値にすることができる。例えば、色をピクセルごとに測定することができ、増殖速度又はサイズをピクセルの行、列、射線若しくは円ごとに測定することができ、その他も同様である。

４１６において、特徴付けられた性質に基づいて対象物がコロニーの候補であるか否かが判断される。コロニーの候補の判断は、量的特徴（例えば、上記の表１に示すスコア）、又はその一部を分類器に入力することを含むことができる。分類器は、対象物を評価するために、教師あり機械学習アルゴリズムを実施するための混同行列、又は教師なし機械学習アルゴリズムを実施するためのマッチング行列を含むことができる。教師あり学習は、対象物が、可能性のある有機体の限られた組（例えば、２つ又は３つ）から区別される場合に好ましい場合がある（この場合、アルゴリズムは、トレーニングデータの比較的限られた組に対しトレーニングすることができる）。対照的に、教師なし学習は、対象物が、可能性のある有機体のデータベース全体から区別される場合に好ましい場合がある。この場合、包括的な、又は更には十分なトレーニングデータを提供することが困難である。混同行列又はマッチング行列の場合、差別化は、範囲において数値的に測定することができる。例えば、所与の対象物のペアについて、「０」は２つの対象物が互いに区別されるべきであることを意味し得るのに対し、「１」は、対象物を互いに差別化することが困難であることを意味し得る。

コロニーの候補は、更なる使用（例えば、検査、以下で説明する分割ルーチン等）のために、自動化システムのメモリに記憶することができる。

［複数の培地の使用］
上記の例において、単一の培地について培養物の評価を説明した。その一方で、これらの例は、培養物が複数の培地において評価される場合に同様に適用可能である。

バクテリアの特性（例えば、色、増殖率等）は、用いられる培養基（「培地」）のタイプに応じて変動する場合があるので、分類時に、培地ごとに異なる混同行列を適用することができる（例えば、サブルーチン４００の４１６）。このため、１つの培地のための分類器が２つの対象物について「０」を出力するのに対し、複数の培地のための分類器が同じ２つの対象物について「１」を出力することは、完全に理にかなっている。次に、分類器の集合結果をともに（マニュアルで、又は更なるマシン駆動の関係に基づいて）評価して、対象物についての全体的又は最終的な差別化又は分類に到達することができる。

複数の培地の評価は、単一の容器を用いて実施することができる。単一の容器は、複数の培地を同時に撮像することができるように、複数の培地（例えば、二重プレート、三重プレート、四重プレート等）を保持するように構成することができる。あるいは、いくつかの容器において培養物試料をストリークすることによって複数の培地を評価することができる。各容器は１つ以上の培地を保持する。次に、複数の容器のそれぞれは、上記で説明した撮像ルーチンにかけることができる。様々な培地において発見された増殖の、より十分な情報による識別を行うために、培地のそれぞれから導き出された情報（例えば、特徴付けられた特徴）を、分類器にまとめて入力することができる。

［コントラスト情報］
図５は、図４の４１０の一部として空間コントラストを得るための例示的なサブルーチン５００を示す流れ図である。サブルーチン５００は、入力として、１つ以上の背景条件及び照明条件５５１の組並びにフィルタ５５４を受信する。５０２において、入力された組５５１から、指定された照明条件及び背景条件の下でデジタル画像が得られる。次に５０４において、画像が複製される。５０６において、複製された画像のうちの１つが、フィルタ５５４を用いてフィルタリングされる。図５の例において、ローパスカーネルがフィルタとして用いられるが、当業者は、用いることが可能な他のフィルタを認識する。５０８において、フィルタリングされていない画像からフィルタリングされた画像を減算したものと、フィルタリングされていない画像にフィルタリングされた画像を加算したものとの比が計算される。５１０において、５０８の計算された比に基づいて空間コントラスト画像が得られる。このルーチン５００は、背景条件及び照明条件５５１のそれぞれについて繰り返すことができる。ルーチン５００の各反復の結果として、別の空間コントラスト画像が得られ、これを用いて、５１０においてそれまでに記憶された空間コントラスト画像を反復的に更新することができる。このため、包括的なコントラスト画像（照明条件のそれぞれからのコントラストを含む）を反復的に構築することができる。１つの実施形態では、各反復において、（反復的に構築されたコントラスト画像と比較して）コントラスト設定が依然としてゼロに設定されているクリアされたコントラスト画像を、各照明設定のための入力として提供することができる。５１２において、最後の画像が処理されたと判断されると、ルーチン５００が終了する。

図６は、同様に図４の４１０の一部として時間コントラストを得るための例示的なサブルーチン６００を示す流れ図である。サブルーチン６００は、入力として、１つ以上の背景及び照明条件の組６５１と、フィルタ６５５とを受信する。６０２において、特定の照明条件及び背景条件の下で得られた第１のデジタル画像及び第２のデジタル画像のそれぞれが得られる。６０４において、ｔ_０画像がフィルタリングされる。図６の例において、ローパスカーネルがフィルタとして用いられるが、当業者であれば、用いることができる他のフィルタを認識している。６０６において、フィルタリングされていないｔ_ｘ画像からフィルタリングされたｔ_０画像を減算したものと、フィルタリングされていないｔ_ｘ画像にフィルタリングされたｔ_０画像を加算したものとの比が計算される。６０８において、６０６にて計算された比に基づいて時間コントラスト画像が得られる。このルーチン６００は、異なる照明条件及び／又は異なる背景条件の下で繰り返すことができる。ルーチン６００の各繰り返しの結果として、別の時間コントラスト画像が得られ、これを用いて、６０８においてそれまでに記憶された時間コントラスト画像を反復的に更新することができる。空間コントラスト画像の構築と同様に、時間コントラスト画像を反復的に構築することができ、クリアされたコントラスト画像が各照明条件の入力に与えられる。６１０において、最後の画像が処理されたと判断されるとルーチン６００が終了する。

コントラストに関する包括的又は全体的な判断を行うために、空間コントラストの結果と時間コントラストの結果を更に組み合わせることができる。空間コントラスト及び時間コントラストの組み合わせは、本明細書において、「混合コントラスト」（mixed contrast, ＭＣ）と呼ばれる。１つの実施形態では、混合コントラストは、以下の式に従って、時点ｔ_０における空間コントラスト（spatial contrast, ＳＣ）画像と、時点ｔ_ｘにおける空間コントラスト画像と、ｔ_０画像及びｔ_ｘ画像の比較から導き出される時間コントラスト（temporal contrast, ＴＣ）画像とから導き出すことができる。

［フィルタリング］
画像解析を向上させるために、図４のサブルーチン４００に追加のプロセスを含めることができる。例えば、第１のデジタル画像を、時点ｔ_０における画像内に現れている対象物について解析することができる。ｔ_０において、バクテリアがまだ大幅に増殖し始めていないことがわかっているため、時点ｔ_０において発見された任意の対象物が、単に、コロニー候補を構成しない塵、気泡、アーチファクト、結露等であると仮定することができる。

１つのフィルタリングプロセスを捕捉画像に対して用いて、撮像プレート又はレンズ上に載っている塵及び他のアーチファクトを減算することができる。透明な培地（例えば、ＭａｃＣｏｎｋｅｙの寒天培養基、ＣＬＥＤ寒天培養基、ＣＨＲＯＭ寒天培養基等）を検討すると、捕捉画像において或るレベルの塵が存在することが予期される。所与の画像における塵の影響は、画像が得られる特定の照明条件及び背景条件に少なくとも部分的に基づいて示すことができる。例えば、白色の培地を用いる場合、反射性アーチファクト及び塵は、底面に黒色の背景を用いて培地が上方から照明されるときに最も観測可能である。別の更なる例として、色付きの、又は暗い培地を用いる場合、アーチファクト及び塵は、底面に白色の背景を用いて培地が上方から照明されるときに最も観測可能となる。更なる例として、ほとんどあらゆる培地において、光を吸収するアーチファクト及び塵は、背景と無関係に、培地が底面から照明されるときに観測可能となる。いずれの場合も、塵及びアーチファクトの管理は、微生物増殖の検出に大きく影響を与え得る複雑な画像処理の課題である。

塵及びアーチファクトは、２つのタイプ、すなわち、（Ａ）位置が変わり得るタイプと、（Ｂ）位置が変わり得ないタイプとに分けることができる。塵及びアーチファクトは、経時的に蓄積することができ、これは、タイプＡ及びＢの双方の数が時間とともに変動する場合があることを意味する。それにもかかわらず、観測結果は、タイプＡが、タイプＢよりも、経時的な量の変化を起こしやすいことを示している。当然ながら、タイプＡは、例えばプレートが撮像チャンバの内外に動かされることに起因した変化も、より起こしやすい。

通常、タイプＢは、インクドット（プレートの底面にプリントされたブランド、ロット番号及び情報）等、プレート自体に関連するアーチファクト、プラスチック射出成形ポイントに関連する欠陥、又は霜が付いた領域によって生じる。タイプＢは、培地の上に詰まるか、培地内にトラップされるか、又はプレートの下側に静電的に詰まった塵又は気泡によっても生じる可能性がある。

撮像の観点から、タイプＡの塵及びアーチファクトであっても、それら自体はほとんど位置が変化しない。一方、フィルタ及びレンズとして動作するプレート及び培地のプラスチックに起因して、タイプＡアーチファクトの観測される特徴及び位置は、培地の色、培地レベル、及びプラスチックに応じて僅かに変化する場合がある。タイプＢの塵及びアーチファクトも位置が変化しない。他方、タイプＢの塵及びアーチファクトが培地に連結し、培地が経時的に僅かな動き及びシフトを受けている限り（ほとんどが、インキュベータにおける経時的な僅かな乾燥に起因する）、タイプＢの塵及びアーチファクトは、培地に対して動く可能性がある。したがって、タイプＢの塵及びアーチファクトの位置も、少なくとも幾分、微細な変化を起こしやすい。

コントラストの観点で、タイプＡの塵の小片は、位置「ｐ_０」においてｔ_０空間コントラスト画像内に、及び位置「ｐ_ｘ」においてｔ_ｘ空間コントラスト画像内に存在するということができる。ｐ_０及びｐ_ｘが異なるロケーションであると仮定すると、塵又はアーチファクトは、双方のロケーションにおける時間コントラスト画像にも存在する（例えば、ｐ_ｘロケーションにおいて正のコントラストを示し、ｐ_０ロケーションにおいて負のコントラストを示す）。比較により、タイプＢの塵の小片は、時点ｔ_０及びｔ_ｘにおける双方の空間コントラスト画像の共通のロケーションに存在しているが、時間コントラスト画像にはない。

上記で説明したように、混合コントラスト結果を導出するために、空間コントラスト画像及び時間コントラスト画像を組み合わせることができる。タイプＡ及びタイプＢの双方の塵及びアーチファクトの影響を、混合コントラスト結果から更に除去することができる。１つの実施形態において、対象物（例えば、ＣＦＵ候補）が混合コントラスト結果において識別される場合、この対象物を、時点ｔ_０における空間コントラスト結果における対象物の近傍Ｎ（ｘ，ｙ）により検出された塵及びアーチファクトと比較することができる。このため、時点ｔ_０における空間コントラスト結果において同様の対象物が見つかっている場合、混合コントラスト結果において識別された対象物は、Ａタイプ又はＢタイプの偽陽性としてフラグを付けられる。対象物が、最初はＡタイプ又はＢタイプの偽陽性としてフラグを付けられない場合であっても、経時的に、対象物のサイズが大幅に変わっていないことがわかる場合、依然として、後に、その対象物がＢタイプの偽陽性であると判断することができる。偽陽性を記憶し、後に、以下で更に説明するフィルタリングマスク（例えば、バイナリマスク）等を通じて、後続の画像に適用することができる。

別のフィルタリングプロセスを用いて、（例えば、培養セッションの開始時に冷蔵庫からインキュベータに移送する間に）プレート上に形成された結露を減算することができる。１つの例示的な結露フィルタにおいて、プレートは底面照明法を用いて照らされ、それによって、結露のロケーションを通り抜ける光は、結露のないロケーションよりも少ない。次に、画像の光学密度を評価することができ、低い光学密度のエリアを画像から減算することができる。

さらに又は代替的に、画像マスクを構築し、ｔ_０画像及び／又は後続のデジタル画像の任意の解析の検討から或る対象物を外すことができる。図７は、ｔ_０画像の空間コントラストを用いて画像マスクを生成するための例示的なルーチン７００を示す流れ図である。ルーチン７００の例において、提供される唯一の入力は、時点ｔ_０において取得されるＳＨＱＩ画像７５１である。７０２において、ｔ_０画像の空間コントラストが求められる。７０４において、空間コントラスト情報を用いて、（例えば、明るさの）平均及び標準偏差等の、ｔ_０画像の対象物領域内のピクセルに関する統計的情報を収集する。７０６において、コントラストの基準を調整し、適切な数のピクセルが同基準を超えるようにする。例えば、所与のパーセンテージよりも多くのピクセルが画像の背景とみなされない場合、基準を大きくすることができる。７０８において、同基準を、同基準未満のこれらのピクセルに関する統計情報に基づいて更に調整する。最終的に、７１０においてバイナリマスクが生成される。バイナリマスクは、有効なピクセルではない様々なアーチファクトと、有効であるとみなされる他のピクセルとを区別する。次に、バイナリマスクを、潜在的なコロニーが存在する後続の時点において利用し、有効ではないピクセルを占める対象物を検出し、これらの対象物が候補コロニーとならないようにすることができる。

上記のフィルタリングプロセスは、塵、結露又は他のアーチファクトを誤って対象物に含めることを回避し、４１４において、有効なピクセルについてのみ性質の特徴付けが実行されればよいため、特徴化を速めることによって、サブルーチン４００を向上させることができる。

［対象物及びラベルの定義］
図４のサブルーチン４００に追加することができる別のプロセスは、４１２において識別された対象物にラベルを割り当てることである。対象物に特定のラベルを与えることができ、それにより、同じラベルを有するピクセルは、或る特定の特性を共有する。ラベルは、サブルーチン４００の後のプロセスにて、その対象物を他の対象物及び／又は背景から差別化するのに役立つことができる。図８は、時点ｔ_ｘにおいて取得された画像（すなわち、「ｔ_ｘ画像」）のピクセルにラベル付けをするための例示的なルーチン８００を示す流れ図である。図８の例において、バイナリマスク８５１（例えば、ルーチン７００の出力）と、ｔ_ｘ画像のための初期化されていない候補マスク８５２と、時間コントラスト画像８５３（例えば、サブルーチン６００の出力）とが入力として受信される。８０２において、候補マスク８５２が初期化される。初期化は、撮像プレート上の対象物領域を特定することと、バイナリマスク８５１を用いて、時点ｔ_ｘにおいて取得された画像内の「有効なピクセル」を特定することとを含むことができる。有効なピクセルとは、候補コロニーとして検討から外されておらず、ラベル付けのために検討される画像のピクセルである。８０４において、時間コントラスト画像８５３が、（例えば、明るさの）平均及び標準偏差等の、ｔ_ｘ画像の対象物領域内の有効なピクセルに関する統計的情報を収集するために用いられる。次に、８０６において、時間コントラスト画像８５３及びバイナリマスク８５１のそれぞれの統計情報（好ましくは、同様の照明条件及び背景条件下で生成される）が組み合わされ、基準コントラスト画像が形成される。基準コントラスト画像によって定められる基準を用いて、８０８にてｔ_ｘ画像の「コネクスコンポーネント（connex component）」にラベル付けがされる。コネクスコンポーネントは、実質的には、隣接するピクセル間の接続（又は隣接するピクセル間のグループ分け）を示すラベルであり、そしてこれは、複数のピクセルが同じ対象物の一部であることを示す。

コネクスコンポーネントがｔ_ｘ画像について定められると、（８１０において）各コネクスコンポーネントを個々に解析して、そのステータスを単一の対象物として検証することができる。図８の例では、８１２において、ラベルに関連付けられたピクセルの統計的計算が行われる。この計算は、ピクセルの明るさ又は色の平均及び／又は標準偏差を求めるためにヒストグラムを利用することができる。８１４において、ピクセルが基準エリアに一致するか否かが判断される。基準エリアに一致しない場合、処理は８３０に進み、８３０においてラベルが更新される。ラベルを更新することは、解析されたコンポーネントを１つのラベルとして保持すること、又はコンポーネントを２つのラベルに分けることを含むことができる。基準エリアが一致しない場合、コンポーネントは単一のラベルとして保持される。基準エリアが一致する場合、８１６において、ヒストグラムが平滑化され、８１８において、分散してラベル付けされたピクセルのピークが特定される。ピークは更に、最小のエリアを有することによって定めることができる。なぜなら、最小エリアよりも小さいピークは無視することができるためである。８２０において、識別されたピークの数をカウントすることができる。１つのピークのみが存在する場合、処理は８３０に進み、ラベルが更新され、それによってコンポーネントが１つの対象物として保持される。２つ以上のピークが存在する場合、８２４において、基準コントラスト画像を用いて、ピーク間のコントラストが大きいか否かが更に評価される。次に、処理は８３０に進み、識別された複数のピークに基づいてラベルが更新され、それによって、コントラストが大きい結果として、コンポーネントが２つに分割され、そうでない場合は１つとして保持される。

［分割］
サブルーチン４００の一部として含むことができる別のプロセスは、時点ｔ_ｘにおけるコンフルエント状態（集密状態）のコロニーを別々の対象物に分けるための分割プロセスである。時点ｔ_ｘにおいて、コロニーが互いに重なるか又は接触するところまで増殖している場合、領域内の別個のコロニーを評価するために、コンフルエント領域を通るように境界を引くことが必要となることがある。

いくつかの例において、隣接する２つのコロニーが異なる特徴（例えば、異なる色、異なるテクスチャ）を有する場合、分割は、単に、コンフルエント領域の特徴解析を含むことができる。一方、空間コントラスト及び時間コントラスト単独では、コロニー間の境界を特定するのに常に十分とは限らない。図９は、そのようなコロニーを（例えば、別個のラベルを有する）別個の対象物に分けるための、又は言い換えれば、コロニーを分割するための例示的なルーチン９００を示す流れ図である。図９の例示的なルーチン９００は、時点ｔ_０において取得される第１のデジタル画像９５１と、時点ｔ_ｘにおいて取得される第２のデジタル画像と、ｔ_０画像バイナリマスク９５３（例えば、ルーチン７００によって生成されたマスク）とを入力として用いる。９０２において、ｔ_０画像９５１及びｔ_ｘ画像９５２に基づいて時間コントラスト画像が生成される。９０４において、時間コントラスト画像は、バイナリマスク９５３を用いて分割される。９０６において、画像のセグメントにラベルが付けられる。９０８において、各ラベルのピーク又は最大値が特定される。所与のセグメントの最大値は、通常、セグメントの中心点又は質量中心である。９１０において、ラベルごとに、（例えば、解析中のラベルの、近傍のラベルの）最大値を用いて、所与のラベルが近傍に対し一意であるか、又は１つ以上の近傍ラベルと組み合わせるべきであるかに関して更なる判断を行う。ラベルが一意のコンポーネントまで切り詰められると、ラベルごとの性質の特徴付け（例えば、ルーチン４００のステップ４１４及び４１６）を、９１２において実行することができ、候補コロニーの大域リストを９１４において生成することができる。

包含係数（inclusion factor）等の様々な係数を用いて、所与のラベルの局所最大値が、１つのコロニーに属するか又は別々のコロニーに属するかを判断することができる。包含係数とは、複数の近傍ピクセルが隣接する対象物に関連付けられているか否かを示す係数である。そのような係数を分割ストラテジにおいて用いて、所与のラベルにおける２つの局所最大値を２つの別個の対象物に分けるか、又はそれらを単一の対象物に統合するかを判断することができる。

図１０は、そのような例示的な分割のやり方を示す流れ図である。ルーチン１０００は、図９におけるステップ９１０のサブルーチンとして用いることができる。図１０に示すように、２つの局所最大値１０５１及び１０５２が特定される。１００２において、最大値ごとに周囲領域が特定される。図１０の例において、領域「Ａ」は最大値１０５１を取り囲み、領域「Ｂ」は最大値１０５２を取り囲む。以下の例示的な式のために、領域Ａのサイズが領域Ｂのサイズ以上であるとする。いくつかの例において、各領域は、領域の水平軸に沿った水平距離（ｘＡ，ｘＢ）と、領域の垂直軸に沿った垂直距離（ｙＡ，ｙＢ）とを有する長円形状として与えることができる。図１１は、図１０のルーチンをわかりやすくするために、領域Ａ及びＢ並びにそれぞれの最大値の例示的な図を提供する。

１００４において、各局所最大値１０５１及び１０５２について最大値から対象物のエッジまでの距離が求められる。いくつかの例では、求められる距離は、１００２において割り当てられた領域の距離の平均又は距離の中央値であり、以下、距離マップと呼ぶ。領域Ａの距離マップを以後ｒＡと呼び、領域Ｂの距離マップをｒＢと呼ぶ。

１００６において、２つの局所最大値間の距離「ｄ」と、１００４において求められた距離とに基づいて包含係数が計算される。１つの実施形態において、包含係数は、以下の式を用いて計算される。

１００８において、包含係数が、所定の範囲（例えば、０．５～１）未満であるか、所定の範囲よりも大きいか、又は所定の範囲内にあるかが判断される。包含係数が所定の範囲未満である場合、両最大値は、同じ対象物に関連付けられると判断される。所定の範囲よりも大きい場合、両最大値は、別々の対象物に関連付けられると判断される。

包含係数が上記範囲内に入る場合、両最大値が同じ対象物に属するか又は別々の対象物に属するかは、直ちに明らかとはならず、更なる処理が必要となる。続いて、ルーチン１０００は１０１０に進み、１０１０において、２つの最大値のそれぞれの周囲の領域の凸性が、２つの最大値間の位置における第３の領域「Ｃ」の座標を用いて計算される。いくつかの例において、この領域は、２つの領域の重み付けされた中心とすることができ、領域Ｃの中心点は、より大きな領域Ａよりも、より小さな領域Ｂに近くなるようになっている。領域Ｃについて、水平距離ｘＣ及び垂直距離ｙＣ並びに距離マップＨも計算することができる。例えば、凸性は、以下の式に従って、上記の値及びｄ（Ａ，Ｃ）を用いて計算することができる。ｄ（Ａ，Ｃ）は、領域Ｃの中心点と最大値Ａとの距離である。

１０１２において、凸性値が所与の基準よりも大きいか（より凸であるか）否かが判断される。例えば、ΔΗを基準０と比較することができる。凸値が基準よりも大きい場合、両最大値は、別々の対象物に関連付けられると判断される。そうでない場合、１０１４において、領域Ｃの１つ以上のパラメータが、領域Ｃのサイズが大きくなるように更新される。例えば、ｄｉｓｔＯｆｆｓｅｔは、ΔＨに基づいて更新することができ、例えば、ΔＨは、０～１の値で上限を設けられ（ΔＨが１よりも大きい場合、ΔＨは１に丸められる）、次に、ｄｉｓｔＯｆｆｓｅｔに加えられる。

１０１６において、領域Ｃのサイズが、基準以上であるか否かが判断される。基準以上である場合、両最大値は、同じ対象物に関連付けられると判断される。換言すれば、領域Ａと領域Ｂとの差がはっきりしていないため、領域Ｃが領域Ａ及びＢに影を落とし始めるほど増加する場合、これは、最大値１０５１及び１０５２が同じ対象物に属することを良好に示す。上記の例において、これは、ｄｉｓｔＯｆｆｓｅｔが最大値間の距離ｄ以上であることによって示すことができる。そうでない場合、動作は１０１０に戻り、領域Ａ及びＢの凸性が、領域Ｃの更新された（複数の）パラメータに基づいて再計算される。

全ての最大値について関連付けが求められると、求められた関連付けを、例えば行列（関連付け行列とも呼ばれる）に記憶することができる。記憶された情報を用いて、最大値のリスト全体を、候補対象物の最終リストに変換することができる。例えば、関連付け行列の場合、最大値のリスト全体からマスターリスト作成することができ、次に、各最大値を、反復的に見直し、関連付けられた最大値が依然としてリスト上に残っている場合、この最大値をマスターリストから除くことができる。

図９及び図１０の例において、第２の画像が取得される時点ｔ_ｘ（このため、ルーチン９００を実行することができる最も早い時点）は、培養プロセスが始まって僅か数時間後とすることができる。そのような時点は、通常、完全に形成されたコロニーを同定するには早すぎると考えられるが、分割画像を作成するには十分である場合がある。分割画像は、必要に応じて、後続の時点で得られる未来の画像に適用されてもよい。例えば、コロニーの予想される増殖を予測するために、コロニー間の境界を引くことができる。次に、コロニー間がコンフルエント状態になった場合、境界を利用して、コンフルエント状態のコロニーを分離することができる。

［時点ｔ_０よりも後の２つ以上の画像を用いた解析］
上記で説明したプロセス及びルーチンは、時点ｔ_０の後に得られる１つの画像（例えば、時点ｔ_０における第１のデジタル画像と、時点ｔ_ｘにおける第２のデジタル画像）のみを必要とするが、別のプロセスは、少なくとも、時点ｔ_０よりも後に得られる第２の画像を必要とする。例えば、時点ｔ_ｘにおける画像にコンフルエント状態のコロニーを含まれることが発見された場合、時点ｔ_ｎ（ここで、０＜ｎ＜ｘ）において得られた別の画像を用いて、個々のコロニーを同定し、分けることができる。

例えば、ｔ_０＝培養が始まって０時間後（この時点において増殖は生じていない）、及びｔ_ｘ＝培養が始まって２４時間後（この時点において、多くの増殖が生じたため、コロニーはコンフルエント状態になっている）の場合、時点ｔ_ｎ＝１２時間（この時点において、コロニーは増殖を開始しているが、まだコンフルエント状態ではない）における画像から、個々のコロニーの存在が明らかになる。次に、時点ｔ_ｎにおける画像に基づいてコロニーの増殖を予想し、時点ｔ_ｘにおけるコンフルエント状態のコロニー間の境界を推定することができる。これに関して、時点ｔ_ｎにおける画像は、増殖が速いコロニーを、増殖が遅いコロニーと区別するのに役立つことができる。当業者であれば、時点ｔ_０と時点ｔ_ｘとの間で得られる画像の数が増えるにつれ、コロニーの増殖速度をより正確に予想することができることを認識するべきである。

上記の概念の１つの用途において、時点ｔ_ｎにおいて得られた画像（又は、より包括的には、時点ｔ_０とｔ_ｘとの間で取得された画像）を用いて、時間とともに増殖するコロニーと思われる対象物であるコロニーのシードを識別し、これらのシードを、対応するマスク及びラベルと関連付けることができる。各シードは、一意のラベルが付けられ、そのラベルは、複数の特徴（例えば、ＳＨＱＩ画像から生成された画像に基づく位置、形態及びヒストグラム、赤色チャネル、緑色チャネル、青色チャネル、ルミナンス、クロミナンス、色相又は合成画像）、及び特性（例えば、分離状態・非分離状態、時系列の繁殖を予想するための他の情報）とともに記憶される。いくつかの記憶された特徴（例えば、ヒストグラム）は、プレートのグローバルなインジケータを抽出するために、特定のシードに寄与するのではなく、プレートレベルで計算することもできる。次に、シードにより記憶された特徴を用いて、時点ｔ_ｘにおけるコロニーの抽出を行うことができ、これらの特徴はまた、トレーニング及び／又は検査のために分類器への入力として提供される。

ｔ_０よりも後に得られた複数の画像を用いた増殖速度の追跡から、ワークフローのルーチンの最中にプレート上又は撮像レンズ内に現れる塵、アーチファクト又は他の異物を検出することもできる。例えば、塵の小片が、ｔ_０よりも後であるがｔ_ｎの前に撮像レンズ上に落ちた場合、この小片によって生成されるスポットは、時点ｔ_０において可視ではなかったため、最初は増殖中のコロニーであると解釈される可能性がある。他方、後続の撮像により、スポットに対するサイズの変化がないことが明らかになると、スポットが増殖していないためコロニーではないと判断することができる。

増殖速度及び分割の追跡とは別に、コロニーの他の態様は、ｔ_０とｔ_ｘとの間の追加の画像の助けにより追跡することができる。コロニー内で経時的に遅く進展する僅かな形態変化の場合、これらの僅かな変化は、より多くの画像を捕捉することによって、より迅速に特定することができる。いくつかの場合、増殖は、通常のｘ軸及びｙ軸に加えて、あるいはそれに代えて、ｚ軸に沿って測定することができる。例えば、肺炎連鎖球菌は、血液寒天培地内で増殖するときに、沈んだ中心をゆっくり形成することが知られているが、沈んだ中心は、通常、解析２日目まで可視ではない。バクテリア増殖の時間進行を調べることにより、初期の沈んだ中心を検出することができ、中心が完全に沈むのを待たなければならない場合に比べ、バクテリアをはるかに早く同定することができる。

他の場合、コロニーは、経時的に色が変わることが知られている場合がある。したがって、ｔ_０よりも後の時点において第１の色（例えば、赤色）を有し、次に、後続の時点において第２の色（例えば、緑色）を有するコロニーの撮像を用いて、コロニー内で増殖するバクテリアを特定することができる。色の変化は、色空間（例えば、ＲＧＢ、ＣＭＹＫ等）によるベクトル又は経路として測定することができる。コロニーの他の色彩特徴に対する変化も同様に測定することができる。

［対象物の特性］
図４に関連して先に述べたように、撮像プレート上の対象物の性質は、撮像プレート上で行われる画像解析の一部として特徴付けることができる。特徴付けられた性質は、（単一の画像に関する）静的な特徴と、（複数の画像に関する）動的な画像との双方を含むことができる。

静的な特徴は、所与の時点における対象物の属性及び／又は周囲の背景を反映することを目的とする。静的な特徴は以下を含む。
（ｉ）重心：これは、座標空間（例えば、ｘ－ｙ、極）において撮像された対象物の重心を与える静的特徴である。対象物の重心は、対象物の極座標のように、所与の照明条件及び背景条件の下で特徴の集合の不変性を与える。重心は、まず、画像内の全てのコロニーについて重み付けされた質量中心を求めることによって得ることができる（Ｍは、全ての検出されたコロニーのためのバイナリマスクである）。重み付けされた質量中心は、画像の各ピクセルが等しい値であるという仮定に基づいて求めることができる。次に、所与のコロニーについての重心を、以下の式によってｘ－ｙ座標において表すことができる（ただし、Ｅ＝｛ｐ｜ｐ∈Ｍ｝であり（Ｅは現在のコロニーのバイナリマスクである）、ｘ座標の範囲は、［０，画像幅］であり、ｙ座標の範囲は、［０，画像高さ］であり、各ピクセルは１単位である）。

（ｉｉ）極座標：これも静的な特徴であり、重心等の撮像プレート上のロケーションを更に特徴付けるために用いることができる。通常、極座標は、径方向軸（ｄ）及び角度軸（Θ）に沿って測定され、プレート中心の座標は［０，０］である。ｉｇｖ_{（ｘ，ｙ）}の座標ｄ及びΘは、（ｄはミリメートル単位、Θは度単位で）以下の式によって与えられる（ただし、ｋは、ミリメートルに対応するピクセルによるピクセル密度であり、「バーコード」は、プレートと過去及び／又は未来の画像との位置合わせを確実にするための、撮像プレートのランドマーク特徴である）。

（ｉｉｉ）画像ベクトル：次に、２次元極座標を１次元画像ベクトルに変換することができる。画像ベクトルは、径方向軸の関数として（通常、コロニーの中心が最も高い輝度を有する）、及び／又は角度軸の関数として、画像のピクセルの輝度を特徴付けることができる。多くの場合に、画像ベクトルは、撮像された複数の対象物間の類似性・差異をより正確に分類することができる。
（ｉｖ）所与の対象物の形状及びサイズを記述する形態学的特徴
（ａ）エリア：これは形態学的特徴であり、撮像された対象物（「ブロブ（blob）」とも呼ばれる）におけるピクセルの数に基づいて求めることができる。ただし、対象物の孔はカウントしない。ピクセル密度が利用可能であれば、エリアは、物理的サイズ（例えば、ｍｍ^２）において測定することができる。あるいは、ピクセル密度が利用できないときは、ピクセルの総数でサイズを示すことができ、ピクセル密度（ｋ）は１に等しくなるようにセットされる。１つの実施形態において、エリアは、以下の式から計算される。

（ｂ）外周：対象物の外周も形態学的特徴であり、対象物のエッジを測定し、各エッジのトータルの長さを合算することによって求めることができる（例えば、１平方単位のエリアを有する単一のピクセルは、４単位の外周を有する）。エリアと同様、長さは、（例えば、ｋが利用可能でないときに）ピクセル単位、又は（例えば、ｋが利用可能であるときに）物理的な長さの観点で測定することができる。いくつかの状況において、外周は、対象物における任意の孔の外周も含むことができる。さらに、内側の角を２ではなく√２としてカウントすることにより、（斜めのエッジがラダー状のボックスへとデジタル化されるときに結果として生じる）ラダー効果（ladder effect）を補償することができる。１つの実施形態では、外周は、以下の式を用いることによって求めることができる。

（ｃ）循環性：対象物の循環性も形態学的特徴であり、エリア及び外周の組み合わせに基づいて求めることができる。１つの実施形態では、循環性は、以下の式を用いて計算される。

（ｄ）半径の変動係数（ＲＣＶ：radius coefficient of variation）：これも形態学的特徴であり、対象物の半径の変動を示すのに用いられる。これは、Ｎ個の全ての方向すなわち重心から延びるＮ個の角度θにおける対象物の平均半径

と、これら半径の標準偏差σ_Ｒとの比を取ることによるものである。１つの実施形態では、この値は、以下の式を用いて計算することができる。

（ｖ）コンテクスト特徴。精査の対象物の、検出された別の対象物及びプレート壁のエッジに対する近傍の地形学的な（topographical）関係を記述するものである。例えば、撮像されたコロニーの場合、コロニーの１つのコンテクスト特徴は、コロニーが自由であるか、制限された自由空間を有するか、又はリソースへのアクセスを求めて周囲の他のコロニーと競合しているかであり得る。そのような特徴は、同じ知覚環境内で増殖する複数のコロニーを分類し、及び／又は異なる環境内で増殖する複数のコロニーを区別するのに役立つ傾向にある。
（ａ）影響領域：これは、対象物と、その近傍の対象物との間の空間を考慮するコンテクスト特徴であり、解析対象の対象物が消費して占有する可能性がある領域（他の異なる対象物が消費して当該領域を最初に占有することなく）を予測する。影響領域は、図１２に示す図等のボロノイ図の形態で表すことができる。図１２は、コロニー１２０１と、その近傍のコロニー、例えば１２０５との距離ｄに基づく影響領域（影付き）を示す。１つの実施形態において、対象物のエッジから影響領域のエッジまでの距離（Ｄ_ＮＣ）は、以下の式を用いて特徴付けることができる。

（ｂ）プレート壁までの距離：これは、最も近くにあるプレート壁から対象物のエッジまでの距離（Ｄ_ＰＷ）を計算するコンテクスト特徴である。１つの実施形態において、この距離は、以下の式を用いて特徴付けることができる。

（ｃ）分離係数：これは、対象物のサイズ、及び（例えば、別の対象物、プレート壁の）最も近いエッジまでの距離に基づいて、所与の対象物の相対的な分離を特徴付けるコンテクスト特徴である。図１３Ａ～図１３Ｃは、分離係数の態様を示す。図１３Ａは、最近傍のエッジがコロニーからプレート壁までの距離ｄにある例を示す。図１３Ｂ及び図１３Ｃは、最近傍のエッジが別のコロニーに属する例を示す。そのような場合、解析対象のコロニーを中心として周りに円が描かれ、次に、円が近傍のコロニーに接触するまで拡張される（図１３Ｂのように最初は小さく、その後、図１３Ｃに示すように大きくなる）。図１３Ａ～図１３Ｃの実施形態において、分離係数（isolation factor, ＩＦ）は、以下の式を用いて特徴付けることができる。

（ｄ）近傍占有比：これは、所与の対象物についての所与の距離ｄ内のプレートの境界を画されたボロノイ影響領域（Ｖ）のエリア断片を特徴付けるコンテクスト特徴である。１つの実施形態では、近傍の占有比（occupancy ratio, ＯＲ）は、以下の式を用いて特徴付けることができる（この式の場合、

である）。

（ｅ）相対的近傍占有比：いくつかの例では、所与の距離ｄは、対象物の平均半径に所定の係数（

）を乗じて導き出すことができる。その結果が相対的近傍占有比（relative neighboring occupancy ratio ,ＲＮＯＲ）であり、以下の式を用いて所与の係数ｘについて導き出すことができる。

（ｖｉ）所与の対象物の光特性を記述するスペクトル特徴。色（赤色光、緑色光及び青色光チャネル、色相、ルミナンス及びクロミナンス、又は任意の他の色空間変換）、テクスチャ及びコントラスト（経時的及び／又は空間にわたる）が、そのような特徴の例である。スペクトル特徴は、コロニーマスクを用いた培養中に様々な時点において及び／又は様々な照明条件下で捕捉された画像から導出することができ、所与のコロニーについてのボロノイ影響領域に更に関連付けることができる。
（ａ）チャネル画像：これは、特定のカラーチャネル（例えば、赤色（Ｒ）、緑色（Ｇ）、青色（Ｂ））を用いて画像をスペクトル分解するのに用いられるスペクトル特徴である。
（ｂ）ルーマ：これもまた、ＲＧＢチャネルを入力として用いて画像の明るさを特徴付けるのに用いられるスペクトル特徴である。
（ｃ）色相：これは、画像のエリアが、知覚色（例えば、赤色、黄色、緑色、青色）又はそれらの組み合わせに類似して見えるように特徴付けられているスペクトル特徴である。色相（Ｈ_２）は、通常、以下の式を用いて特徴付けられる。

（ｄ）クロマ：これは、画像のエリアが同様に白で照明される場合に、その明るさに対しそのエリアの彩度を特徴付けるスペクトル特徴である。クロマ（Ｃ_２）は、通常、以下の式を用いて特徴付けられる。

（ｅ）放射分散：色相及びクロマコントラストの放射分散を解析することにより、アルファ溶血、ベータ溶血及びガンマ溶血の区別が可能になる。
（ｆ）最大コントラスト：この特徴は、画像の中心点（例えば、撮像されたコロニーの中心）から所与の半径ｒにおけるピクセルについて、測定された平均コントラストの最大値を計算することによって、画像の分解能を特徴付ける。この特徴を用いて、解析される対象物によって生じる増殖に基づいて、時点ｔ_０に取得された画像と、時点ｔ_ｘにおいて取得された画像との間の知覚される差を記述することができる。最大コントラストは、以下のように特徴付けることができる。

（ｖｉｉ）解析される対象物の近傍における培地の変化を記述する背景特徴。例えば、撮像されたコロニーの場合、変化は、コロニーの周りの微生物増殖（例えば、溶血の兆候、ＰＨの変化、又は特定の酵素反応）によって生じ得る。

動的な特徴は、対象物の属性及び／又は周囲の背景の変化を経時的に反映することを目的とする。時系列処理により、静的特徴を経時的に関係付けることが可能になる。これらの特徴の離散的な一次導関数及び二次導関数は、経時的に特徴付けられるそのような性質における変化の瞬間的な「速度」及び「加速度」（又は横ばい若しくは減速度）を与える。動的な特徴の例は以下を含む。
（ｉ）時間とともに上記の静的な特徴を追跡するための時系列処理。所与の培養時点に測定された各特徴を、その相対的な培養時間に従って参照し、特徴が、後の培養時点において測定される特徴に関係付けられるようにすることができる。画像の時系列を用いて、上記で説明したように、経時的に現れ、増殖するＣＦＵ等の対象物を検出することができる。対象物についてそれまでに捕捉された画像の進行中の解析に基づいて、自動化されたプロセスにより、撮像のための時点をプリセットするか又は定めることができる。各時点において、画像は、単一の取得構成による全シリーズについての、又は、複数の取得構成により捕捉された画像のシリーズ全体としての、所与の取得構成とすることができる。
（ｉｉ）経時的な上記の特徴（例えば、先に述べたような増殖速度の追跡）に対する変化の瞬間速度及び加速度（又は横ばい若しくは減速度）を与えるための、そのような特徴の離散的な一次導関数及び二次導関数。
（ａ）速度：経時的な特徴の一次導関数。特徴ｘの速度（Ｖ）は、以下の式に基づき、時間単位で表される期間であるΔｔを用いて、（ｘ単位）／時間の観点で特徴付けることができる。

（ｂ）加速度：速度の一次導関数でもある、経時的な特徴の二次導関数。加速度（Ａ）は、以下の式に基づいて特徴付けることができる。

上記の画像特徴は、対象物又は対象物のコンテクストから測定され、様々な培地及び培地条件において増殖する有機体の特異性を捉えることを目的とする。列挙された特徴は、包括的であることを意図するものではなく、当業者であれば、当該技術分野において既知の多岐にわたる既知の画像処理ベースの特徴に従って、この特徴の組を変更、拡張又は限定することができる。

画像の特徴は、画像内のピクセルごと、ピクセルグループごと、対象物ごと、又は対象物のグループごとに収集することができる。画像の領域を、更には画像全体をより包括的に特徴付けるために、収集された特徴の分布をヒストグラムに構成することができる。ヒストグラム自体は、到来する画像特徴データを解析するか又は他の形で処理するために、いくつかの統計的特徴に頼ることができる。

統計的ヒストグラム特徴は、以下を含むことができる。
（ｉ）最小値：ヒストグラム内で捉えられた分布の最も小さな値。これは、以下の関係によって特徴付けることができる。

（ｉｉ）最大値：ヒストグラム内で捉えられた分布の最も大きな値。これは、以下の関係に従って特徴付けることができる。

（ｉｉｉ）和：ヒストグラム内で捉えられた全ての個々の値の和。和は、以下の関係によって定義することができる。

（ｉｖ）平均（mean）：算術平均（arithmetic mean）又は平均（average）。これは、以下の関係に従って、全てのスコアの和をスコア数（Ｎ）で除したものである。

（ｖ）四分位１（Ｑ１）：分布の第一四分位数におけるスコア。スコアの２５％がＱ１未満であり、７５％がＱ１を超える。これは、以下の関係によって記述される。

（ｖｉ）中央値（Ｑ２）：分布の第二四分位数におけるスコア。スコアの５０％が中央値未満であり、５０％が中央値を超える。中央値は、極端なスコアに対し平均よりも敏感でなく、これにより、通常、高度に歪んだ分布の場合に、中央値は平均よりも良好な尺度となる。これは以下の関係によって記述される。

（ｖｉｉ）四分位３（Ｑ３）：分布の第三四分位数におけるスコア。スコアの７５％がＱ３未満であり、２５％がＱ３を超える。これは、以下の関係によって記述される。

（ｖｉｉｉ）最頻値：分布において最も頻繁に生じるスコア。これは代表値（measure of central tendency：中心傾向の尺度）として用いられる。代表値としての最頻値の利点は、その意味が明らかであることである。さらに、最頻値は、公称データとともに用いることができる唯一の代表値である。最頻値は、標本変動の影響を大きく受け、したがって、通常、唯一の代表値としては用いられない。また、多くの分布は、２つ以上の最頻値を有する。これらの分布は、「多峰性」と呼ばれる。最頻値は以下の関係によって記述される。

（ｉｘ）三項平均（trimean）：２５パーセンタイルと５０パーセンタイル（中央値）の２倍と７５パーセンタイルとを足し合わせ、４で除することにより計算されるスコア。三項平均は、極端なスコアに対し、中央値とほぼ同じくらい耐久性があり、歪んだ分布において、算術平均ほどサンプリング変動の影響を受けない。他方、正規分布の場合、三項平均は通常、平均よりも効果的でない。三項平均は、以下の関係に従って記述される。

（ｘ）トリム平均：或る特定のパーセンテージの最低スコア及び最高スコアを除外したのち、残りのスコアの平均を算出することによって計算されるスコア。例えば、５０％トリムされた平均は、スコアの下位２５％及び上位２５％を除外し、残りのスコアの平均を取ることにより計算される。別の例として、中央値は、１００％トリムされた平均であり、算術平均は、０％トリムされた平均である。トリム平均は通常、極端なスコアの影響を算術平均よりも受けにくい。したがって、歪んだ分布の場合、トリム平均は、平均よりもサンプリング変動の影響を受けにくい。正規分布の場合、トリム平均は通常、平均よりも効果的でない。例として、５０％トリムされた平均は、以下の関係によって記述される。

（ｘｉ）範囲：最大値と最小値との差。範囲は、広がりの有用な尺度とすることができる。その一方で、範囲は、２つの値のみに基づくため、極端なスコアに対し敏感である。この敏感さに起因して、範囲は通常、広がりの唯一の尺度としては用いられないが、それにもかかわらず、標準偏差又は半四分位範囲等の広がりの他の尺度を補足するものとして用いる場合に有益である。
（ｘｉｉ）半四分位範囲：第三四分位（Ｑ３）と第一四分位（Ｑ１）との間の差の２分の１として計算される広がりの尺度。分布におけるスコアの半分がＱ３とＱ１との間にあるため、半四分位範囲は、上記スコアの半分を覆うのに必要な距離の半分である。対称分布において、中央値の１半四分位範囲下から、中央値の１半四分位範囲上まで及ぶ区間は、スコアの半分を含むことになる。他方、これは、歪んだ分布の場合には当てはまらない。範囲とは異なり、半四分位範囲は、通常、極端なスコアによる影響をほぼ受けない。その一方で、半四分位範囲は、標準偏差よりも、正規分布におけるサンプリング変動の影響をより大きく受けるため、概ね正規分布しているデータの場合には多くは用いられない。半四分位範囲は、以下の関係に従って定義される。

（ｘｉｉｉ）分散：分布の広がりの尺度。分散は、以下の関係に従って、平均から各数の平均二乗偏差を得ることによって計算される。

（ｘｉｖ）標準偏差：分布の値がどの程度広く平均から散らばっているかを測定する分散の関数。標準偏差は、分散の二乗根である。標準偏差は、通常、範囲よりも、極端なスコアに対し敏感ではないが、通常、半四分位範囲よりも敏感である。このため、極端なスコアの可能性が存在するとき、標準偏差を補うために半四分位範囲を用いることができる。
（ｘｖ）歪み：平均を中心とした分散の非対称性の尺度。分布は、その尾部のうちの一方が他方よりも長い場合、歪んでいる。正の歪みは、非対称の尾部がより正の値（平均よりも大きい）に向かって延びている分布を示す。負の歪みは、非対称の尾部がより負の値（平均未満）に向かって延びている分布を示す。歪みは、以下の関係に従って計算することができる。

（ｘｖｉ）尖度：正規分布と比較した、分布の鋭さ又は平坦さ（又は相対的ピーク幅）の尺度である。正の尖度は、比較的尖った分布を示す。負の尖度は、比較的平坦な分布を示す。尖度は、分布の尾部のサイズに基づき、以下の関係によって求められる。

上記の統計的方法は、画像内の各点における局所的な特徴を計算し、局所的な特徴の分布から統計の組を導き出すことによって、濃淡値の空間分布を解析するのに有用である。これらの統計的方法を用いて、解析された領域のためのテクスチャを記述し、統計的に定めることができる。

テクスチャは、テクスチャ記述子を用いて特徴付けることができる。テクスチャ記述子は、画像の所与の領域にわたって計算することができる（以下で更に詳細に述べる）。１つの一般的に適用されるテクスチャ方法は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする、Haralick, R.他「Texture features for image classification」IEEE Transactions of System, Man and Cybernetics, Vol. 3, pp. 610-621 (1973)に紹介されている共起法（co-occurrence method）である。この方法において、方向θにおける距離ｄによって分離された複数のピクセルの濃淡度ペアの相対周波数（相対頻度）が組み合わされ、相対変位ベクトル（ｄ，θ）が形成される。相対変位ベクトルは、計算されて、濃淡度共起行列（grey level co-occurrence matrix, ＧＬＣＭ）と呼ばれる行列に記憶される。この行列は、二次統計テクスチャ特徴を抽出するのに用いられる。Haralickは、２次元確率密度関数ｐ_ｉｊを記述するために１４個の異なる特徴を提案し、それらの特徴のうちの４つが、他のものよりも一般的に用いられる。

テクスチャは、テクスチャ記述子を用いて特徴付けることができる。テクスチャ記述子は、画像の所与の領域にわたって計算することができる（以下で更に詳細に述べる）。１つの一般的に適用されるテクスチャ方法は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする、Haralick, R.他「Texture features for image classification」IEEE Transactions of System, Man and Cybernetics, Vol. 3, pp. 610-621 (1973)に紹介されている共起法（co-occurrence method）である。この方法において、方向θにおける距離ｄによって分離された複数のピクセルの濃淡度ペアの相対周波数（相対頻度）が組み合わされ、相対変位ベクトル（ｄ，θ）が形成される。相対変位ベクトルは、計算されて、濃淡度共起行列（grey level co-occurrence matrix, ＧＬＣＭ）と呼ばれる行列に記憶される。この行列は、二次統計テクスチャ特徴を抽出するのに用いられる。Haralickは、２次元確率密度関数ｐ_ｉｊを記述するために１４個の異なる特徴を提案し、それらの特徴のうちの４つが、他のものよりも一般的に用いられる。
（ｉ）角度方向の第２のモーメント（Angular Second Moment, ＡＳＭ）は、以下のように計算される。

（ｉｉ）コントラスト（Ｃｏｎ）は、以下のように計算される。

（ｉｉｉ）相関（Ｃｏｒ）は、以下のように計算される（ただし、σ_ｘ及びσ_ｙは、対応する分布の標準偏差である）。

（ｉｖ）エントロピー（Ｅｎｔ）は、以下のように計算される。

これらの４つの特徴は、同様に引用することにより本明細書の一部をなすものとする、Strand, J.他「Local frequency features for the texture classification」Pattern Recognition, Vol. 27, No. 10, pp 1397-1406 (1994) [Strand94]にも挙げられている。

所与の画像について、上記の特徴が評価される画像の領域を、マスク（例えば、コロニーマスク）によって、又はマスクを超えて広がるボロノイ影響領域によって定めることができる。

図１４に、考えられるいくつかの領域を示す。領域１４１０は、コロニー自体と同程度だけの広がりを有するコロニーマスクである。領域１４２０は、コロニーのボロノイ影響領域である（画像又はプレートのエッジにより境界が定められている）。更なる説明のために、ピクセル１４３０は、領域１４２０内であるが領域１４１０の外にあるピクセルである。言い換えると、領域１４１０によって表されるコロニーは、ピクセル１６３０にまで拡張されることが考えられるが、まだ拡張されていない。ピクセル１４４０は、領域１４１０及び１４２０双方の外側にあるピクセルである。換言すれば、コロニーがこの画像の時点でピクセル１４１０を占有しないだけではなく、ピクセル１４１０が未来のいずれの時点においてもコロニーによって占有されることも予測されない（この場合、このピクセルは別のコロニーによって既に占有されている）。

培養プロセスに沿って複数の時点でコロニーマスクを用い、上述したような、それらに関連付けられたボロノイ影響領域を用いると、コロニーの異なる態様、及び周囲の局所的な増殖中の培地に対するそれらの影響を示す複数のヒストグラムを生成することができる。コロニーマスク及びボロノイ影響領域自体は、経時的に、例えばコロニーが成長する際に調整することができる。例えば、図１５Ａ～図１５Ｃは、コロニーの増殖をどのように用いて、経時的にコロニーのマスクを調整することができるかを示す。図１５Ａは、寒天培地における２４時間の増殖後の血液培養物の一部である。図１５Ｂは、同じ培養物の、過去のｔ_０にて捕捉された画像と比較したコントラスト画像である。図１５Ｃは、９時間（最も明るい）、１２時間（中間）及び２４時間（最も暗い）の増殖を示すグレースケール画像である。図１５Ｃにおける各影は、コロニーごとに異なるマスクを作るのに用いることができる。代替的に又は付加的に、増殖が生じると、マスクは、それぞれのボロノイ影響領域に従って分離することができる。

上記の特徴リストにおける特徴のうちの任意の１つ又は組み合わせを、様々な培養条件下の撮像プレートの様々な培地において増殖する有機物の特異性を捉えるための特徴の組として用いることができる。このリストは、包括的であることを意図したものではなく、当業者であれば、撮像されることが意図される対象物、及び当該技術分野において既知の多岐にわたる画像処理ベースの特徴に従って、この特徴の組を変更、拡張又は限定することができる。このため、上記の例示的な特徴は、例示として与えられ、限定するものではない。

当業者は、対象物の形状及び特徴を求めるための他の測定及び手法を認識しており、上記の例は、例示として与えられ、限定するものではない。

［コントラストの構築］
画像の系列におけるどの画像が、増殖の検出、カウント又は同定のための値をもたらすかを最初に予測するのは多くの場合、困難である。これは、部分的には、画像コントラストが、異なるコロニー形成ユニット（ＣＦＵ）について、及び異なる培地にわたって変動することに起因する。いくつかのコロニーの所与の画像において、増殖検出のために、或るコロニーは、背景に対し、非常に望ましいコントラストを有する場合があるのに対し、別のコロニーは、背景に対し、適切なコントラストを有しない場合がある。これによって、単一の手法を用いて培地におけるコロニーを同定することも困難になる。

したがって、空間（空間差）及び時間（共通撮像条件下での時間差）を通じて、そして様々な撮像条件（例えば、赤色チャネル、緑色チャネル及び青色チャネル、明るい背景及び暗い背景、スペクトル画像又は任意の他の色空間変換）を用いることによって利用可能な全ての材料からコントラストを構築することが望ましい。また、複数の入手可能なソースからコントラストを収集して、コロニーを検出するためのアルゴリズムへの入力として、標準化された画像を提供することも望ましい。

画像データは、任意の数の要因に基づいて区切ることができる。例えば、画像データは、特定の時点及び／又は要求される特定の情報（例えば、空間画像情報は、時間画像情報が必要とするほど多くの時点を必要としない場合がある）に限定することができる。照明構成及び色空間を選択し、特定のコントラスト目標を達成することもできる。所望のサイズ（又は目標範囲内のサイズ）を有する対象物（例えば、コロニー）を検出するために、空間周波数を変動させることもできる。

別々の対象物を検出するために、コントラストは［０，１］区間の絶対値又は［－１，－１］区間の符号付きの値に設定することができる。コントラスト出力のスケール及びオフセットを指定することもできる（例えば、符号付きコントラストを有する８ビット画像の場合、オフセットは１２７．５とすることができ、スケールは１２７．５とすることができる）。コントラストが極値に設定される例では、絶対オフセットをゼロに設定し、スケールを２５６に設定することができる。

空間コントラストを用いて、均一な背景における別々の対象物を検出することができる。ある式を利用して、距離ｒ内のロケーション（ｘ，ｙ）において画像Ｉ上の空間コントラスト

の自動的な評価を提供することができる。距離ｒが

以上の距離に制限され、コントラスト演算子Ｋを用いてコントラスト設定が制御される１つの実施形態において、以下の式が適用される。

時間コントラストを用いて、（撮像プレート上に現れ、及び又は消費するＣＦＵ等の）動いている対象物又は経時的に変化する対象物を検出することができる。ある式を利用して、時点ｔ_０及びｔ_ｘ間のロケーション（ｘ，ｙ）における画像Ｉ上の時間コントラスト

の自動評価を提供することができる。１つの実施形態において、以下の式が適用される。

空間コントラストの収集は、事前にプログラムされたシーケンスに従ってプレートの複数のＳＨＱＩ画像を生成することによって、自動化された形式で行うことができる。所与の培養時間において複数の画像を生成してコロニー検出調査を進めることができる。１つの実施形態では、画像データ（特に、コントラスト収集演算子にコントラスト入力を提供するのに用いられるベクトル「ｖｅｃｔ」）が、以下の式に従って所与の時点において検出されたコロニーからのいくつかの異なる半径（Ｒ_ｍｉｎ～Ｒ_ｍａｘ）において、いくつかの構成（ＣＦＧ_１～ＣＦＧ_Ｎ）にわたって収集される。

所与の画像Ｉ_{（ｘ，ｙ）}（例えば、ＳＨＱＩ撮像がソースであるとき）についてＳＮＲがわかっている場合、ＳＮＲ重み付きコントラストが最大にされる構成は、

が

にわたって最大であるとき、最良の構成（最良のＣＦＧ）として特定することができる。

コントラスト演算子Ｋは、この既知のＳＮＲ情報から更に利益を得て、上記の式は以下のようになる。

時間コントラスト収集も、事前にプログラムされたシーケンスに従って、プレートの複数のＳＨＱＩ画像を生成することによって、自動化された形式で行うことができる。複数の培養時点にわたって複数の画像を生成してコロニー検出調査を進める。複数の培養時点のうちの少なくとも１つはｔ_０である。１つの実施形態において、画像データは、以下に従って、時点ｔ_０、及び時点ｔ_ｘまでの１つ以上の後続の培養時点におけるいくつかの構成にわたって収集される。

上記の例では、ベクトルは、２つの時点（例えば、ｔ_０及びｔ_ｘ）における画像の差に基づいた、これらの２つの時点間のベクトルとすることができる。一方、ｔ_０とｔ_ｘとの間の別の時点が含まれる他の用途では、ベクトルは、画像が取得される時点と同じだけ多くの点にわたってマッピングすることができる。数学的に言えば、ベクトルに含めることができる点の数に制限はない。

空間コントラストと同様、所与の画像Ｉ_{（ｘ、ｙ）}についてＳＮＲがわかっている場合、ＳＮＲ重み付きコントラストが最大にされる構成は、

が

にわたって最大であるとき、最良の構成（最良のＣＦＧ）として特定することができる。

コントラスト演算子Ｋは、この既知のＳＮＲ情報から更に利益を得て、上記の式は以下のようになる。

上記の例において、Ｍａｘ演算子は、パーセンタイル（例えば、Ｑ１、中央値、Ｑ３、又は任意の他のパーセンタイル）、又は加重和等の任意の他の統計演算子に置き換えることができる。加重値は、トレーニング用データベースから抽出された事前作業から生じ、それによって、教師ありのコントラスト抽出の分野をニューラルネットワークに広げることができる。さらに、複数のアルゴリズムを用いることができ、複数のアルゴリズムの結果は、Ｍａｘ演算子等の別の演算子を用いて更に組み合わされる。

［画像の位置合わせ］
時間とともに複数の画像が得られる場合、それらの画像から有効な時間的推定を得るために、それらの画像の極めて正確な位置合わせが必要となる。このような位置合わせは、機械的な位置合わせデバイス及び／又はアルゴリズム（例えば、画像追跡、画像マッチング）によって達成することができる。当業者であれば、この目標を達成するためのこれらの解決策及び技法を認識している。

例えば、プレート上の対象物の複数の画像が収集された場合、対象物のロケーションの座標を決定することができる。次に、後続の時点に収集された対象物の画像データは、座標に基づいて以前の画像データと関連付けることができ、その後、これらを用いて、経時的な対象物の変化を求めることができる。

（例えば、分類器への入力として用いられるときの）画像の高速で有益な使用のために、画像の不変性が最大限となるように、これらの画像を空間的基準において記憶することが重要である。コロニーの基本的な形状記述子は通常、円形であるため、極座標系を用いてコロニー画像を記憶することができる。コロニーの質量中心は、コロニーが最初に検出されたときに、コロニーのロケーションの中心として特定することができる。中心点は、その後、コロニーの、後続の各画像の極変換のための原点中心（origin center）としての役割を果たすことができる。図１６Ａは、中心点「Ｏ」を有する撮像プレートのズームされた部分を示す。点「Ｏ」から延びる２つの射線「Ａ」及び「Ｂ」が（わかりやすくするために）画像上に重ね合わされて示されている。各射線はそれぞれの（円で囲まれた）コロニーと交差する。図１６Ａの円で囲まれたコロニーが、図１６Ｂの画像１６１１及び１６１２において更に詳細に示されている。図１６Ｂにおいて、画像１６１１（射線「Ａ」と交差するコロニー）は、向きを変えて画像１６１３（「Ａ’」）となり、画像１６１３の径方向の軸が画像１６１２の径方向の軸と位置が合わせられ、それによって、向きが変わった画像の最も左の部分が、図１６Ａの点「Ｏ」に最も近くなり、向きが変わった画像の最も右の部分が、点「Ｏ」から最も遠くなる。この極の方向の変更により、（照明等の要素に関して）撮像プレートの複数の方向を向いたコロニーのより容易な解析が可能になる。

図１６Ｃにおいて、極変換が、図１６Ｂの画像１６１１、１６１２及び１６１３のそれぞれについて完了する。極変換画像１６２１、１６２２及び１６２３において、それぞれの向きが変わった画像１６１１、１６１２及び１６１３の径方向軸（各それぞれの撮像されたコロニーの中心から延びる）が、図１６Ｃの複数の画像における左から右へとプロットされ、（それぞれのコロニーの）角度軸が上から下へとプロットされている。

極画像ごとに、径方向軸及び／又は角度軸に沿って、例えば、形状の特徴及び／又はヒストグラムの特徴（例えば、対象物の色又は輝度の平均及び／又は標準偏差）を用いて、まとめられた１次元ベクトルの組を生成することができる。回転を検討すると、形状及びヒストグラムの特徴がほとんど不変である場合であっても、いくつかのテクスチャの特徴が、回転時に大きな変動を示す可能性があるため、不変性は保証されない。したがって、照明ごとに同じ視点又は角度からコロニー画像のそれぞれを提示することに大きな利点がある。なぜなら、次に対象物のテクスチャの差を用いて互いを区別することができるためである。照明条件は、ほとんどの場合、プレート撮像中心の周りの角度位置にリンクした変動を示すため、コロニー及びプレートの中心を通る射線（図１６Ｂの画像１６１１、１６１２及び１６１３のそれぞれにおいて線として示される）は、各画像の極変換のための原点（Θ）としての役割を果たすことができる。

別の位置合わせの課題は、プレート培地が完全に凍って固い状態でないため、得らされた１つのものから次のものへと僅かにシフトする場合があることにより生じる。したがって、或る時点において取得された画像の或る特定の座標にあるプレートの領域が、後の時点において取得された同じ座標におけるプレートの領域と必ず完全に合致することを無条件に期待することはできない。換言すれば、培地の僅かな歪みは、所与のピクセルと、培養プロセス中の異なる時点において捕捉された対応するピクセルとの厳密なマッチングに関して、僅かな不確実性をもたらす場合がある。

この不確実性を考慮するために、時点ｔ_ａにおける所与のピクセル輝度値

を、別の時点ｔ_ｂにおけるこのピクセルの局所近傍Ｎ（ｘ，ｙ）における最も近い輝度値

と比較することができる。局所近傍の選択は、ある時点から次の時点への撮像プレートの再位置決めにおける１つ以上の誤差又は不正確性（例えば、撮像された培地の不完全な再位置決めに起因した位置正確度の誤差、ある時点から次の時点への撮像された培地の未知の高さに起因する視差の誤差）を求めることを含むことができる。１つの例において、約３ピクセル～約７ピクセルの範囲内の設定「ｘ」及び「ｙ」は、ピクセルあたり約５０ミクロンの分解能を有する画像に適していることがわかっている。

当業者であれば、ｔ_ｂのソース画像から２つのｔ_ｂの画像、すなわち、ｔ_ｂの濃淡度拡張（grey level dilation）（

と呼ばれる）に対応する第１の画像と、ｔ_ｂの濃淡度の衰え（grey level erosion）（

と呼ばれる）に対応する第２の画像とを生成することが効果的な解決策であると認識するであろう。これらはともに、再位置決めの距離の不確実性ｄに合致するカーネルサイズを有する。

の場合、コントラストは０であり、その他の場合、コントラストは、以下の式を用いて、

と

との間の

に最も近い値から推定される。

［ＳＮＲの改善］
通常の照明条件下で、光子ショット雑音（センサに到来する光子の到着率における統計的変動）が、検出システムのＳＮＲを制限する。最近のセンサは、有効平方ミクロンあたり約１７００個～約１９００個の電子であるフルウェルキャパシティを有する。このため、プレート上の対象物を撮像する際、主な関心事は、対象物を撮像するために用いられるピクセルの数ではなく、センサ空間内で対象物によって覆われるエリアである。センサのエリアを増大させることにより、撮像される対象物のためのＳＮＲが改善する。

画像品質は、センサを飽和させることなく（フレームごとのピクセルごとに記録することができる光子の最大数）、光子雑音がＳＮＲを支配する照明条件（

）を用いて画像を捕捉することによって改善することができる。ＳＮＲを最大化するために、画像平均化技法が一般的に用いられる。暗い領域のＳＮＲは、明るい領域のＳＮＲよりもはるかに低いので、以下の式によって示すように、これらの技法を用いて大きな明るさ（又は色）の差を有する画像に対処する。

ただし、Ｉは、センサにおける電子ストリームによって生成される平均電流である。物質の吸収・反射における差及び電磁スペクトルにわたる光に起因して色が知覚されるとき、捕捉された色に対する信頼性は、高ＳＮＲを有する輝度を記録するシステムの能力に依拠する。画像センサ（例えば、ＣＣＤセンサ、ＣＭＯＳセンサ等）は、当業者に既知であり、本明細書では詳細に説明しない。

従来のＳＮＲの撮像上の制限を克服するために、撮像システムは、画像取得時に撮像プレートの解析を行い、解析に基づいて、照明条件及び露出時間をリアルタイムで調整することができる。このプロセスは、引用することにより本明細書の一部をなすものとする特許文献１に記載され、包括的に、管理された高品質撮像（ＳＨＱＩ：Supervised High Quality Imaging）と呼ばれる。システムは、異なるカラーチャネル内のプレートの様々な明るさの領域のための撮像条件をカスタマイズすることもできる。

画像の所与のピクセルｘ、ｙについて、現在のフレームＮにおいて取得されたピクセルのＳＮＲ情報を、以前に、又は後に取得されたフレーム（例えば、Ｎ－１、Ｎ＋１）にて取得された同じピクセルのＳＮＲ情報と組み合わせることができる。例として、組み合わされたＳＮＲは、以下の式によって表される。

新たな取得により画像データを更新した後、取得システムは、環境制約（例えば、対象物領域内のピクセルあたり必要とされる最小ＳＮＲ）に従って、ＳＮＲを最大にする最良の次の取得時点を予測することができる。例えば、明るい条件及び暗い条件の最適照明において捕捉された２つの画像の情報をマージすることで、２つのみの取得において暗い領域のＳＮＲが√１１だけ上がる場合に、非飽和状態で捕捉される５つの画像の平均を取ることにより、暗い領域（最大輝度の１０％）のＳＮＲが√５だけ上がる。

［画像のモデル化］
状況次第で、１つ以上の画像のピクセル間の空間コントラスト又は時間コントラストを計算するとき、所与の画像のためのピクセル情報が利用可能ではない場合があるか、又は劣化している場合がある。利用不可能性は、例えば、プレートの画像が、細胞増殖の前の時間内に捕捉されなかった（例えば、プレートが時点ｔ_０において、又はその直後に撮像されなかった）場合に生じ得る。信号情報の劣化は、例えば、画像が時点ｔ_０において捕捉されたが、捕捉画像のピクセルが、バクテリアの増殖前の撮像プレートを正確に反映していないときに生じる場合がある。そのような不正確性は、プレートの後続の時系列画像内に再び現れない一時的なアーチファクト（例えば、プレートが最初にインキュベータに入れられたときに、熱衝撃に起因してプレートの下で一時的に形成される結露）によって生じ得る。

そのような状況において、利用不可能な又は劣化した画像（又は画像の或る特定のピクセル）は、プレートのモデル画像と置き換えるか、又はこのモデル画像を用いて向上させることができる。モデル画像は、プレートが、利用不可能な又は劣化した画像の特定の時点をどのように調べることが予期されるかを反映するピクセル情報を提供することができる。時点ｔ_０におけるモデル画像の場合、モデルは、プレートの平面画像又は標準画像とすることができ、３次元撮像・モデル化技法を用いて算術的に構築することができる。モデルは、可能な限りリアルなモデルを生成するために、物理的な設計パラメータ（例えば、直径、高さ、複数の培地を収容するための仕切り、プラスチック材料等）と、培地パラメータ（例えば、培地のタイプ、培地の組成、培地の高さ又は厚み等）と、照明パラメータ（例えば、光源の角度、光源の色又は（複数の波長）、背景の色等）と、位置決めパラメータ（例えば、撮像チャンバにおけるプレートの位置）とのそれぞれを含むことができる。

劣化した画像の場合、劣化した画像の向上は、（例えば、下にある結露が、一部の光を、プレートを通らないようにブロックし、それによって結露を有するプレートのセクションが僅かに、より透明でなくなることに起因して）ピクセル情報が画像の他の部分ほど鮮明でないときに、信号回復を用いて画像の劣化したピクセル特徴を鮮明にすることにより達成することができる。信号の回復は、画像の他の部分について輝度情報を求めることと、輝度情報の輝度中央値を特定することと、次に、画像のよりシャープでない領域のための輝度情報を、残りの画像の輝度中央値に置き換えることとを含むことができる。

［適用例］
以下の開示は主に、標準的な尿の報告量（ＣＦＵ／ｍｌバケットグループ）のシミュレーションを行うために、様々な希釈の生理食塩水において行われる検査に基づく。分離株ごとの懸濁液を、０．５マクファーランド濁度の標準液に適応させ、ＢＤ Ｕｒｉｎｅ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒチューブ（型番３６４９５１）において、推定される１×１０^６、１×１０^５、５×１０^４、１×１０^４、１×１０^３及び１×１０^２ＣＦＵ／ｍｌの懸濁液において希釈物を準備するのに用いた。標本チューブは、標準的な尿のストリーキングパターン、すなわち、＃４Ｚｉｇｚａｇ（プレートあたり０．０１ｍｌの分注）を用いた、Ｋｉｅｓｔｒａ ＩｎｏｑｕｌＡ（ＷＣＡ１）を使用して処理した。

プレートは、ＲｅａｄＡ Ｃｏｍｐａｃｔ（３５℃、非ＣＯ_２）を用いて処理し、最初の２４時間は２時間ごとに、次の２４時間は６時間ごとに撮像し、計４８時間培養した。培養時間は、１時間で最初の読み値として入力され、許容されるマージンを±１５分とした。２時間～２４時間での次の読み値は、許容されるマージンを±３０分として２時間ごとにセットした。２４～４８の読み値は、許容されるマージンを±３０分として６時間ごとにセットした。純粋な実現可能性の調査の後、これを変更し、許容されるマージンを無いものとした。これを行うことで、所望の１８時間～２４時間の範囲で画像の取得が改善された。

その他の場合、４８時間の期間にわたり、最初の２４時間については２時間間隔で、次の２４時間については６時間間隔で画像を得ることができる。この場合、４８時間の期間にわたり、時点ｔ_０（０時間）にて得られる画像を含めて合計１７個の画像が得られる。

取得した全ての画像を、既知の対象物のピクセルサイズと、正規化された照明条件と、ピクセル単位の帯域ごとの高い信号対雑音比とを用いて、スペクトル的にバランスをとったレンズの幾何収差及び色収差について補正した。本明細書に記載の方法及びシステムにおいて用いるのに適したカメラは、当業者に既知であり、本明細書においては詳細に説明しない。例として、４メガピクセルカメラを用いて９０ｍｍのプレートの画像を捕捉することにより、コロニーが適切なコントラストを有する直径において１００μｍの範囲内にあるとき、最大で３０コロニー／ｍｍ^２の局所的密度（＞１０^５ＣＦＵ／プレート）の計数が可能になるはずである。

以下の培地を用いて、その培地上で増殖したコロニーのコントラストを評価した。

ＴＳＡＩＩ５％羊血液（ＢＡＰ）： 尿培養のために広く用いられる非選択的な培地。

ＢＡＶ： コロニー形態及び溶血に基づくコロニー計数及び推定ＩＤのために用いられる。

ＭａｃＣｏｎｋｅｙＩＩ寒天培地（ＭＡＣ）： 最も一般的なグラム陰性ＵＴＩ病原体のための選択的培地。ＭＡＣは、コロニーを生成する乳糖の分化のために用いられる。ＭＡＣは、プロテウスの遊走も阻害する。ＢＡＰ及びＭＡＣは、尿培養のために一般的に広く用いられる。いくつかの培地は、いくつかのグラム陰性の部分阻害に起因して、コロニーのカウントに用いることが推奨されない。

コリスチンナリジクス酸寒天培地（ＣＮＡ）： 最も一般的なグラム陽性ＵＴＩ病原体のための選択的培地。ＣＮＡは、尿培養のためにＭＡＣほど一般的に用いられないが、グラム陰性コロニーの過度な増殖が生じた場合に、コロニーの同定に役立つ。

ＣＨＲＯＭＡｇａｒオリエンタシオン（ＣＨＲＯＭＡ）： 尿培養のために広く用いられる非選択的培地。ＣＨＲＯＭＡは、コロニーの色及び形態に基づくコロニーの計数及びＩＤのために用いられる。大腸菌及びエンテロコッカス属は、この培地によって同定され、確認検査を必要としない。ＣＨＲＯＭＡは、コストに起因して、ＢＡＰほど用いられない。混合試料の場合、ＣＬＥＤ培地も用いた。

システイン・乳糖電解質欠損（ＣＬＥＤ）寒天培地： 乳糖発酵に基づく尿中病原体のコロニー計数及び推定ＩＤのために用いられる。

標本処理ＢＤ Ｋｉｅｓｔｒａ（商標）ＩｎｏｑｕｌＡ（商標）を用いて、細菌学標本の処理を自動化し、標準化を可能にし、一貫した高品質のストリーキングを確保した。ＢＤ Ｋｉｅｓｔｒａ（商標）ＩｎｏｑｕｌＡ（商標）標本プロセッサは、磁性ローリング粒子（magnetic rolling bead）技術を使用し、カスタマイズ可能なパターンを用いて培地プレートをストリークする。磁性ローリング粒子は、直径５ｍｍである。

図１７に、ＣＨＲＯＭａｇａｒ（上段の図）及び血液寒天培地（下段の図）培地の双方においてモルガン菌増殖を取り出す際のコントラスト収集アルゴリズム性能の１つの例を示す。ＣＨＲＯＭａｇａｒ及びＢＡＰはともに、微生物学研究において一般的に用いられている非選択的増殖培地である。図１７の中央の画像のそれぞれは、プレートの上方からの光により照明（上面照明）した撮像プレートを表す。左側の画像は、中央の画像に対応する空間コントラストを表す。空間コントラストは、１ミリメートルの中央値のカーネルに基づく。最後に、右側の画像は、中央にある画像の時間コントラストを表す。時間コントラストは、各画像の捕捉時点における様々な照明条件（異なるカラーチャネル、照明設定等）を用いて、培養の０時間（ｔ_０）～１２時間（ｔ_ｘ）に捕捉された画像から編集される。

図１７に示すように、局所コントラストは、特にエッジ遷移が小さい場合に、半透明のコロニーを扱うときに制限がある。なぜならな、空間コントラストアルゴリズムを単独で用いると、最もコントラストが高いコンフルエント状態の領域しか画像から選び出すことができない可能性があるためである。空間コントラストは対象物を捉えるのに失敗する可能性がある。図１７から、分離したコロニーにおける時間コントラストの有効性も明らかである。

また、図１７（特に、下段の血液寒天培地の画像）は、透明な培地における増殖を検出するために空間コントラストを単独で用いることの問題を強調するものである。透明ケースにプリントされるインクは、非常に目立ったエッジを有し、このため、目立った空間コントラストを有する。この結果、任意の他の空間コントラストを見るのが非常に困難になる。なぜならば、コロニーは、同程度に目立つように作られたエッジを有していないためである。このため、空間コントラストと併せた時間コントラストの使用が、本開示において大いに有益である。

最終的に、上記で説明したコントラスト判断の結果は、撮像された培地におけるコロニーの高速検出及び同定のための方法を自動化することができるというものである。自動化された方法は、比較可能なマニュアル方法を上回る大きな利点をもたらす。

図１８に、自動化された検査プロセス１８００（例えば、図２のルーチン２００）のタイムラインを、比較可能な、マニュアル実行される検査プロセス１８０５のタイムラインと比較した、フローチャートのペアを示す。各プロセスは、検査のための標本を研究室において受け付ける（１８１０、１８１５）ことから開始する。次に、各プロセスは、培養１８２０、１８２５に進み、培養中、標本を複数回、撮像することができる。自動化されたプロセスにおいて、自動化された評価１８３０は、概ね１２時間の培養の後に行われ、その時間後、標本内に増殖（又は通常の増殖）がないかどうかを明確に判断する（１８４０）ことができる。図１７における結果から示されるように、自動化プロセスにおける時間コントラストの使用により、１２時間しか経過していなくても、コロニーを検出する能力が大幅に向上する。対照的に、マニュアルプロセスにおけるマニュアル評価１８３５は、培養プロセスが始まってほぼ２４時間が経過するまで行うことができない。２４時間経過して初めて、標本内に増殖（又は通常の増殖）がないかどうかを明確に判断する（１８４５）ことができる。

図１９に、コロニー半定量化を判断することができるタイムラインを示す。２０００において、プレート２００５に接種がなされる。２０１０において、新たに接種されたプレート２００５の基準画像が得られる。これは、本明細書において前述した背景画像である。所定の期間の間、培養が進行し、この期間後、２０１５において、プレート２００５の別の画像が得られる。この画像は、微生物増殖を示し得る対象物又はアーチファクトの変化の証拠のために、２０１０において得られた画像と比較される。微生物の増殖を示すものがない場合、プレートは培養され、所定時間の後、２０２０において別の画像が得られる。ステップ２０２０において、対象物又はアーチファクトの変化が微生物増殖の証拠として検出される。画像解析の観点から、撮像された対象物を（対象物とその隣接する周囲との差に基づいて）識別し、次に、対象物の経時的な変化を特定することによって、増殖を画像から検出することができる。より詳細に上述したように、これらの差及び変化はともに「コントラスト」の形態を取る。増殖を検出することに加えて、２０２０における画像解析は、コロニーとして特定された対象物が、解析のために取り入れるのに適切なバイオマスを有するか否かを判断することを更に含むことができる。図１９には、ステップ２０２０において十分なバイオマスが識別されておらず、更なる培養が必要とされたことを示している。２０２５において、画像からコロニーの証拠が示されたが、これらのコロニー対象物は、コロニーを定量化するだけでなく、コロニーの性質（すなわち、他の識別されたコロニー対象物の姉妹であるのか、純粋な（すなわち、単一の微生物種の）コロニーであるのか、又は混合（すなわち、複数の微生物種）のコロニーであるのか）を判断するために更に評価する必要があった。コロニーのコンフルエンス状態及びその判断方法は、対象物の分割を説明した上記セクションで説明した。所定時間の後に増殖が見つからない場合、又は僅かな量の増殖しか見つからない場合、２０２２において、プレート２００５は無菌として解放される。最終報告は、大量の増殖がないことを示すか、又は正常フローラの増殖を報告する可能性が高い。

バイオマスは、対象物をバイオマスに関係付けることによって求められる。対象物のサイズが求められ、バイオマスの基準を示す所定の対象物サイズと比較される。ステップ２０２５において、対象物が純粋な試料から形成されている場合、対象物によって覆われる培養基のエリアが第１の基準以上であるとき、バイオマスを下流の検査のために選び出すことができる。生体試料が純粋な試料でない場合、接種がなされた試料皿が更に培養される。ステップ２０２５において得られた画像に基づいて対象物が全て選び出されているわけではない場合、接種された培養プレートが更に培養され、ステップ２０３０において再び撮像される。画像内のコロニーに関係付けられた対象物のサイズは、第２の所定のサイズ基準と比較される。対象物のサイズ、ひいてはバイオマスが第２の基準を超える場合、バイオマスの少なくとも一部が選び出される。第２の所定の基準は、ｉ）対象物が純粋な試料からのものである場合のバイオマスによって覆われる基準エリアと、ｉｉ）対象物が純粋でない試料によるものである場合のバイオマスの直径とのいずれかである。第２の所定の基準バイオマスは、第１の基準よりも大きい。これは、図１９におけるステップ２０２５での対象物のサイズを、ステップ２０３０での対象物のサイズと比較することによってわかる。ステップ２０３０における対象物は、ステップ２０２５における対象物よりも著しく大きいが、対象物・バイオマスが純粋な試料からのものであるとの確信がある場合、ステップ２０２５において識別された対象物を選び出すことができる。

生体試料が量的に大きい増殖を呈することが判断された場合、（適切なバイオマスを有する標的コロニーが検出されるときに応じて）２０２５又は２０３０において、１つ以上のコロニーを、解析のために選び出されるコロニー候補として特定することができる。コロニーを選び出すことは、完全に自動化されたプロセスとすることができ、このプロセスにおいて、選び出されたコロニーのそれぞれがサンプリングされ、検査される。あるいは、コロニーを選び出すことは、部分的に自動化されたプロセスとすることができ、このプロセスにおいて、複数の候補コロニーが自動的に同定され、デジタル画像において視覚的にオペレータに提示され、それによって、オペレータは、サンプリング及び更なる検査のための１つ以上の候補の選択を入力することができる。選択された又は選び出されたコロニーのサンプリングはそれ自体、システムにより自動化することができる。２０２５及び２０３０に関してコロニーが選び出され得る時間は、２０２５において最初に観測されるときの、この観測されるコロニーについての情報によって左右される。コロニーが純粋と推定される試料（深い傷又は切り込み等）とみなされるものから進展した場合、コロニーを観測し、収集するのに十分な量が存在すればすぐに、このコロニーを選び出すことができる。そのような試料を処理する際には時間が肝要であり、１つ以上の更なる培養サイクルをなくすことは、検査結果を何時間も早く提供することができることを意味する。試料が純粋でないと推定される場合、コロニーが更に増殖してこれらのコロニーの同定及び定量化を支援することができるように、更なる培養サイクルが必要となる。

再び図１８を参照すると、自動化されたプロセスの使用は、より高速のＡＳＴ及びＭＡＬＤＩの検査も可能にする。自動化されたプロセスにおけるそのような検査１８５０は、初期評価１８３０の直後に開始することができ、結果は、２４時間の時点までに取得（１８６０）及び報告（１８７５）することができる。対照的に、マニュアルプロセスにおけるそのような検査８５５は、多くの場合、３６時間の時点に近づくまで開始することができず、データをレビューし（１８６５）、報告する（１８７５）ことができるようになるには、更に８時間～１２時間を要する。

まとめると、マニュアル検査プロセス１８０５は、最大で４８時間かかることが示され、１８時間～２４時間の培養期間を必要とし、その後初めてプレートが増殖について評価され、試料がどの程度長く培養されていたかを更に追跡する方法はない。対照的に、自動検査プロセス１８００は、（背景と、及び互いと比較して、）コロニー間での比較的乏しいコントラストであっても検出することができ、微生物学者がタイミングを追跡する必要なく撮像及び培養を行うことができるため、標本を特定し、更なる検査（例えば、ＡＳＴ、ＭＡＬＤＩ）のために準備することができるようになる前に、１２時間～１８時間の培養しか必要とせず、プロセス全体は、約２４時間以内に完了することができる。このため、本開示の自動化プロセスは、本明細書に記載のコントラスト処理の支援により、検査結果の品質又は正確度に悪影響を及ぼすことなく、より高速な試料の検査をもたらす。

本発明を、特定の実施形態を参照しながら本明細書にて説明したが、これらの実施形態は本発明の原理及び応用形態を例示するにすぎないことを理解されたい。それゆえ、添付の特許請求の範囲によって定められるような本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、例示的な実施形態に数多くの変更を加えることができること、及び他の構成を考案することができることは理解されたい。

Claims (11)

1. プレート培地における微生物の増殖を評価するための自動化された方法であって、
   光学的に略透明な容器内に配置され、生体試料が接種された培養基を準備するステップと、
   前記接種された培養基をインキュベータにおいて培養するステップと、
   前記接種された培養基を有する前記光学的に略透明な容器をデジタル撮像装置内に置くステップと、
   第１の時点（ｔ_０）における、前記接種された培養基の、複数のピクセルを有する第１のデジタル画像を得るステップと、
   前記接種された培養基を有する前記光学的に略透明な容器に対する、前記第１のデジタル画像内の複数のピクセルの座標を求めるステップと、
   前記接種された培養基を有する前記光学的に略透明な容器を前記デジタル撮像装置から取り出し、前記接種された培養基を更に培養するために前記インキュベータ内に置くステップと、
   更なる培養の後、前記接種された培養基を有する前記光学的に略透明な容器を、前記デジタル撮像装置内に置くステップと、
   第２の時点（ｔ_ｘ）における、前記接種された培養基の、複数のピクセルを有する第２のデジタル画像を得るステップと、
   前記第２のデジタル画像内の複数のピクセルの座標が、前記第１のデジタル画像内の複数のピクセルの対応する各ピクセルについて求められた座標と対応するものとなるように、前記第１のデジタル画像と前記第２のデジタル画像との位置を合わせるステップと、
   前記第２のデジタル画像内の複数のピクセルを、対応する前記第１のデジタル画像内の複数のピクセルと比較するステップと、
   前記第１のデジタル画像と前記第２のデジタル画像との間で変化したピクセルを特定するステップであって、前記第１のデジタル画像と前記第２のデジタル画像との間で変化していないピクセルは背景を示す、ステップと、
   前記第２のデジタル画像において前記特定されたピクセルのいずれが、背景を示すピクセルとの関係で所定のレベルの基準コントラストを有するかを判定するステップと、
   前記第２のデジタル画像において１つ以上の対象物を特定するステップであって、各対象物は、背景を示すピクセルとの関係で前記所定のレベルの基準コントラストを有し、背景ピクセルによって互いに離れていない複数のピクセルを有する、ステップと、
   前記特定された対象物をバイオマスと関係付けるステップと、
   前記生体試料が純粋な試料として特定されるかどうかを判定し、純粋な試料として特定された場合に、前記バイオマスが第１の基準を上回るかどうかを更に判定するステップであって、前記第１の基準は、前記特定された対象物によって覆われた前記培養基の所定のエリアであり、前記特定された対象物のエリアが前記第１の基準を上回る場合に、更なる解析のために前記バイオマスの少なくとも一部が選び出される、ステップと、
   前記生体試料が純粋な試料でない場合に、前記光学的に略透明な容器において前記接種された培養基を更に培養するステップと
   を含む方法。
2. 所定の期間後に対象物が特定されなかった場合に、前記接種された培養基を有する前記光学的に略透明な容器に対し、増殖の無いプレートとしてフラグ付けがなされる、請求項１に記載の方法。
3. 前記更に培養するステップの後に、複数のピクセルを有する第３のデジタル画像が得られ、
   前記方法は、
   前記第２のデジタル画像から前記第３のデジタル画像までに変化した別のピクセルを特定するステップと、
   前記特定されたピクセル及び前記第３のデジタル画像内で特定された前記別のピクセルのうちのいずれのピクセルが、背景を示すピクセルとの関係で所定のレベルの基準コントラストを有するかを判定するステップと、
   前記第３のデジタル画像において１つ以上の対象物を特定するステップであって、各対象物は、背景を示すピクセルとの関係で前記所定のレベルの基準コントラストを有し、背景ピクセルによって互いに離れていない複数のピクセルを有する、ステップと、
   前記特定された対象物をバイオマスと関係付けるステップと、
   前記バイオマスが第２の基準を上回るかどうかを判定するステップであって、前記第２の基準は、ｉ）前記対象物が純粋な試料によるものである場合の、前記バイオマスによって覆われる基準エリアと、ｉｉ）前記対象物が純粋でない試料によるものである場合の、前記バイオマスの直径とのいずれかである、ステップと、
   前記バイオマスが前記第２の基準を上回る場合に、解析のために前記バイオマスの少なくとも一部を選び出すステップであって、前記第２の基準バイオマスは前記第１の基準よりも大きい、ステップと
   を更に含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記光学的に略透明な容器において基準となるマークの位置に基づいて、前記第２のデジタル画像と前記第１のデジタル画像との位置を合わせるステップを更に含む請求項１に記載の方法。
5. 前記光学的に略透明な容器において基準となるマークの位置に基づいて、前記第３のデジタル画像と前記第２のデジタル画像との位置を合わせるステップを更に含む請求項３に記載の方法。
6. 前記基準となるマークは、
   前記光学的に略透明な容器の底面において光学的に検出可能な、中心からずれたマークドットと、
   前記光学的に略透明な容器の側面に設けられた、光学的に検出可能なラベルの端部と、
   前記光学的に略透明な容器の光学的に検出可能なラベルの中心と
   からなる群から選択される、請求項４又は５に記載の方法。
7. 所定の一連の照明条件に従って前記第１の時点において第１のデジタル画像を複数得るステップを更に含み、複数の前記第１のデジタル画像の各々は、異なる照明条件下で得られ、各照明条件は、前記接種された培養基を有する前記光学的に略透明な容器の、照明源に対する指定された向きと、前記デジタル撮像装置において前記光学的に略透明な容器の下に位置する指定された背景色とを含む、請求項１に記載の方法。
8. 前記デジタル撮像装置は、
   前記接種された培養基を有する前記光学的に略透明な容器の上面に向けて下向きに設けられた照明源と、
   前記接種された培養基を有する前記光学的に略透明な容器の底面に向けて上向きに設けられた照明源と、
   前記接種された培養基を有する前記光学的に略透明な容器の側面に向けて方向付けられた照明源と
   を備える、請求項１に記載の方法。
9. 前記光学的に略透明な容器の前記指定された向きが上にある照明源に対するものである場合、及び前記光学的に略透明な容器の前記指定された向きが横にある照明源に対するものである場合に、前記指定された背景色は黒色であり、
   前記光学的に略透明な容器の前記指定された向きが下にある照明源に対するものである場合、前記指定された背景色は白色である、
   請求項８に記載の方法。
10. 前記照明源は、赤色波長を放射する照明源と、緑色波長を放射する照明源と、青色波長を放射する照明源とを有する、請求項８に記載の方法。
11. 前記対象物が微生物のコロニーである、請求項１に記載の方法。

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