CN115210753A - 用于菌落计数的图像中的强度差异补偿 - Google Patents

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CN115210753A
CN115210753A CN202180017216.7A CN202180017216A CN115210753A CN 115210753 A CN115210753 A CN 115210753A CN 202180017216 A CN202180017216 A CN 202180017216A CN 115210753 A CN115210753 A CN 115210753A
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吉特什·N·乔希
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Abstract

本文所述的实施方案涉及确定生长培养基上的关注区域。计算被配置为照射生长培养基的多个照明源的总亮度控制值。总亮度控制值生成与关注区域处的目标强度基本上匹配的至少一个图像。计算多个照明源中的每个照明源的单独亮度值，方法是单独地调节每个照明源的亮度以生成至少一个图像，该至少一个图像与每个相应照明源的影响区域中的目标强度基本上匹配。基于以下项来确定每个照明源的校准亮度值：每个照明源以相应的单独亮度值打开时的图像强度，和每个照明源在单独打开时在每个相应的影响区域内生成的强度。

Description

用于菌落计数的图像中的强度差异补偿
技术领域
本公开整体涉及成像装置。更具体地，本公开涉及对图像强度差异进行补偿。
背景技术
对于食物产品的开发商和分销商而言，对食物或其他材料中的生物污染进行测试已成为重要的并且通常已成为强制性的要求。另外生物学测试也用来识别下述样品中的细菌或其他因子：诸如取自内科病人的血样之类的实验室样品、开发用于实验目的的实验室样品、以及其他类型的生物样品。可使用各种技术和装置来改善生物学测试并且使所述生物学测试过程合理化和标准化。
可使用生物生长板来计数或识别细菌的存在，从而使得可进行改善的测定(就食物测试而言)或者可进行正确的诊断(就医学用途而言)。在其他应用中，可使用生物生长板来使实验室样品中的细菌或其他生物剂快速生长，如，用于实验目的。
已经开发出多种生物生长板。作为一个示例，明尼苏达州圣保罗的3M公司(3MCompany of St.Paul,Minn)(以下称为“3M”)已经开发出生物生长板。生物生长板由3M以商品名PETRIFILM板出售。生物生长板可用于方便常常与食物污染相关的细菌或其他生物剂的快速生长和检测，包括(例如)好氧菌、大肠杆菌、大肠菌群、肠杆菌、酵母、霉菌、金黄色酿脓葡萄球菌、李氏杆菌、弯曲杆菌等。PETRIFILM板或其他生长培养基的使用可简化食物样品的细菌测试。
发明内容
本文所述的实施方案涉及一种方法，该方法包括确定生长培养基上的关注区域。计算被配置为照射生长培养基的多个照明源的总亮度控制值。总亮度控制值生成与关注区域处的目标强度基本上匹配的至少一个图像。基于总亮度值来计算多个照明源中的每个照明源的单独亮度值，方法是单独调节每个照明源的亮度以生成至少一个图像，该至少一个图像与每个相应照明源的影响区域中的目标强度基本上匹配。基于以下项来确定每个照明源的校准亮度值：每个照明源以相应的单独亮度值打开时的图像强度，和每个照明源在单独打开时在每个相应的影响区域内生成的强度。
实施方案涉及一种系统，该系统包括处理器和存储计算机程序指令的存储器，该计算机程序指令在由处理器执行时致使处理器执行操作。该操作包括确定生长培养基上的关注区域。计算被配置为照射生长培养基的多个照明源的总亮度控制值。总亮度控制值生成与关注区域处的目标强度基本上匹配的至少一个图像。基于总亮度值来计算多个照明源中的每个照明源的单独亮度值，方法是单独调节每个照明源的亮度以生成至少一个图像，该至少一个图像与每个相应照明源的影响区域中的目标强度基本上匹配。基于以下项来确定每个照明源的校准亮度值：每个照明源以相应的单独亮度值打开时的图像强度，和每个照明源在单独打开时在每个相应的影响区域内生成的强度。
实施方案涉及一种非暂态计算机可读介质，该非暂态计算机可读介质存储用于设计微结构的计算机程序指令，该计算机程序指令在由处理器执行时致使处理器执行操作。该操作包括确定生长培养基上的关注区域。计算被配置为照射生长培养基的多个照明源的总亮度控制值。总亮度控制值生成与关注区域处的目标强度基本上匹配的至少一个图像。基于总亮度值来计算多个照明源中的每个照明源的单独亮度值，方法是单独调节每个照明源的亮度以生成至少一个图像，该至少一个图像与每个相应照明源的影响区域中的目标强度基本上匹配。基于以下项来确定每个照明源的校准亮度值：每个照明源以相应的单独亮度值打开时的图像强度，和每个照明源在单独打开时在每个相应的影响区域内生成的强度。
上述发明内容并非意图描述每个实施方案或每种具体实施。相反，根据附图，参考如下示例性实施方案的详细描述和权利要求书，对例示性实施方案更完整的理解将变得显而易见。
附图说明
考虑到结合附图对各种实施方案的以下详细描述，可以更完全地理解和领会本技术。
图1A至图1C示出了根据本文所述实施方案的在培养基上具有背景材料的生长培养基，该背景材料干扰手动计数器和装置的判读；
图2A至图2D示出了根据本文所述实施方案的不同类型的菌落特征品种；
图3示出了根据本文所述实施方案的当菌落计数较高和/或菌落在培养基上彼此紧密排列时可能发生的菌落的不同形态的示例；
图4示出了根据本文所述实施方案的当与背景培养基相比时相对较小和/或淡白的菌落；
图5示出了根据本文所述实施方案的扩散菌落的示例；
图6A示出了根据本文所述实施方案的没有生长的板的示例；
图6B和图6C示出了根据本文所述实施方案的其中微生物生长使生长培养基变亮的视图的示例；
图7示出了根据本文所述实施方案的用于对光输出差异进行补偿的过程；
图8示出了根据本文所述实施方案的用于计算总亮度控制值的更详细的过程；
图9示出了根据本文所述实施方案的使用图8中计算的总亮度控制值的关注区域的热图的示例；
图10示出了根据本文所述实施方案的用于计算单独亮度值的更详细的过程；
图11A至图11D示出了根据本文所述实施方案的不同的单独照明源打开的示例性关注区域；
图12示出了根据本文所述实施方案的用于计算校准亮度值的更详细的过程；
图13A示出了根据本文所述实施方案的使用最终校准亮度值拍摄的图像的示例；
图13B示出了根据本文所述实施方案的图13A的图像的热图；
图14示出了根据本文所述实施方案对准光谱的过程；
图15A和图15B分别示出了根据本文所述实施方案的未对准的正态直方图和对准的正态直方图的示例；
图16A和图16B分别示出了根据本文所述实施方案的未对准的非正态直方图和对准的非正态直方图的示例；
图17示出了根据本文所述实施方案的用于生成归一化因子的过程；
图18示出了根据本文所述实施方案可如何使用归一化来在5×5滑动窗口上产生均匀图像的示例；
图19A和图19B示出了仅使用本文所述的校准照明系统的示例性图像；
图20示出了根据本文所述实施方案的示例性直方图，其解释了每个红色、绿色和蓝色通道的光分布以及平场归一化对图像均匀性的影响；
图21A至图21F示出了根据本文所述实施方案的归一化之前和之后的红色、绿色和蓝色通道中的每个通道的热图表示；并且
图22示出了被配置为实施本文所述过程的系统的高级框图。
附图主要是为了清楚起见，并且因此未必按比例绘制。此外，可示意性地示出包括但不限于紧固件、电子部件(电线、电缆等)等的各种结构/部件或将它们从一些或全部视图中移除，以更好地示出所描绘实施方案的各方面，或者其中包括此类结构/部件对于理解本文所述的各种示例性实施方案不是必需的。然而，在特定附图中缺少此类结构/部件的图示/描述不应被解释为以任何方式限制各种实施方案的范围。
具体实施方式
食品工业常规监测微生物的指标组的水平。这些生物体被认为是质量和卫生指标，并且可能对人类造成健康危害。量化指示生物体的常用方法是使用平板计数(菌落计数)。这通过在合适的生长培养诸如干膜或琼脂平板上培养靶微生物并且对菌落进行计数来完成。食品生产商、参考实验室、食品加工商和制造商在全球的食品工业中进行了数百万次的菌落计数。菌落计数可在多个阶段进行，包括对进料、加工产品、成品和/或从食品加工环境内取得的环境样品进行计数。
对生长培养基上的菌落进行计数是非常复杂的，并且可极大地受益于生长培养基图像质量的改善。这一领域的独特挑战和要求使这项工作变得复杂，其示例包括但不限于：生长培养基的判读挑战和菌落计数装置的准确性要求。由于这些要求，在开发稳健的系统时涉及大量的数据。生长培养基上可能出现的各种外观和特征使得菌落判读对于人工操作者和自动菌落计数解决方案两者具有挑战性。
在生长培养基上培养的生物体可与多种样品的背景区分开。这些样品可包括农产品、乳制品、肉类和家禽、糖果、加工食品、原料和/或来自食品生产设施的环境样品中的一种或多种。通常使用人工计数器来对生物生长板上的细菌菌落或特定生物剂的量进行扫描或计数。使用对细菌菌落和/或其他生物剂进行自动检测和/或计数的成像装置可提高菌落检测和/或计数的准确性、效率和/或一致性。例如，可将食物样品或实验室样品置于生物生长板上，然后可将该板插入培养室中。培养后，可将生物生长板置于成像装置中以对细菌生长进行自动检测和计数。该成像装置可自动化地对生物生长板上的细菌或其他生物剂进行检测和计数，并因而通过降低人为误差而改善了此生物学测试过程。
这些样品将背景材料(纤维、颗粒、颜色)沉积在培养基上，这些背景材料干扰如图1A至图1C的示例中所示的手动计数器和装置的判读。图1A示出了培养基上的背景材料110的示例。图1B示出了没有背景材料的菌落120的示例。图1C示出了在生长培养基上具有颗粒和菌落的混合物130的生长培养基。
菌落特征品种繁多，其包括大小、形状、颜色、气泡产生、区域产生等。某些培养基类型用于培养多种类型的生物体。在这些情况下，必须识别菌落特征，以便可将相关菌落与其他类型的菌落区分开。图2A至图2D示出了不同类型的菌落特征品种。在图2A中，示出了生长培养基上的产生气泡的菌落210。如图2B所示，可存在产生气泡的菌落240和不产生气体的菌落230的混合物。区分这些不同类型的菌落可能是有用的。根据各种配置，生长培养基上可能存在不与气体相关的不规则气泡250，如图2C所示。区分气泡和不与气体相关的气泡可能是有用的，使得不与气体相关的气泡不被包括在菌落计数中。根据各种配置，菌落可在生长培养基上产生强度不同的酸性区域260，如图2D所示。区分产生酸性区域的菌落和不产生酸性区域的菌落可能是有用的。
图3示出了例如当菌落计数较高和/或菌落在培养基上彼此紧密排列时可能发生的菌落的不同形态的示例。识别和/或区分具有不同形态的所有菌落可能是有用的。当菌落靠近在一起时，可能难以区分不同的形态。
在一些情况下，当与背景培养基相比时，菌落可相对较小和/或淡白410，如图4所示。这可能使得难以检测菌落的存在。
在一些配置中，菌落可扩散、遮盖生长培养基和/或改变培养基的外观。这种类型的生长可影响培养基的区域或整个生长板。这些情况也使得难以检测生长。图5示出了扩散菌落的示例。
图6A示出了没有生长的板的示例。图6B和图6C示出了其中微生物生长使生长培养基变亮的视图的示例。在图6A至图6C的情况下，可能难以从生长培养基区中辨别出任何细菌生长。
图1A至图6C中描述的示例示出了菌落计数装置需要克服的一些复杂性和挑战。错误结果的后果可能是召回、拒收产品、重大损失、损害品牌声誉和/或损害消费者。
用于照射生长培养基以检测微生物生长的装置可受到来自光源的输出差异的影响。对光源的这些差异、光的漫射、光的反射、透镜空间效率和/或相机响应进行补偿可能有助于对菌落计数装置的图像中的光水平产生非常一致的响应。一致亮度的图像允许准确的细菌菌落识别和/或分类结果，因为每个局部化的菌落区域可对来自食物样品的分离菌落具有恒定的响应。本文所述的装置和方法可用于将菌落与样品中的其他污染区分开，该其他污染包括可引起培养基背景变化的pH差异和/或其他来源。本文所述的实施方案涉及对光源输出的差异和图像捕获系统对其产生的光的响应进行补偿。图像捕获系统可包括除光源之外的多个部件。例如，图像捕获系统可包括一个或多个反射器、透镜、相机和可能受光源差异影响的光路。对光源输出的差异进行补偿允许均匀的图像响应，使得可精确地检测培养基的变化。本文所述的过程可例如在工厂中一次完成，并且/或者可在现场重复。例如，本文所述的过程可定期地和/或按用户确定的需要重复。
图7示出了根据本文所述实施方案的用于对光输出差异进行补偿的过程。确定生长培养基上的关注区域710。关注区域在本文中也可被称为关注区(ROI)。关注区域可包括生长培养基上包含关注对象的任何区域。例如，关注区域可包括生长培养基上包含细菌生长的区域。例如，生长培养基可包括生物生长板。
计算生成至少一个图像的总亮度控制值，该至少一个图像与多个照明源的关注区域处的目标强度基本上匹配720。目标强度可以是固定值，其被选择为确保在该目标值之上存在足够的强度范围，使得明亮的图像仍然可包含对计数有用的信息。目标值允许小于饱和值的图像，并且不导致大量像素具有255的最大值。可通过评估期望的图像系列并且确定期望的最大亮度的范围来选择目标强度。
本文对术语“亮度”和“强度”进行了各种引用。应当理解，“亮度”通常用于指照明源的光输出，并且“强度”用于指使用照明源捕获的图像的亮度。照明源可以是任何合适的照明装置。例如，照明源可包括发光二极管(LED)、白炽装置、生物发光装置、激光器、反射的阳光、燃烧装置(诸如油灯或蜡烛)和/或荧光装置。根据各种配置，计算总亮度控制值包括将光谱的所有照明源的亮度同时调节到等于或低于目标强度的亮度水平。
以从低于目标强度的共同亮度开始增加的亮度值迭代地捕获关注区域的多个图像。可为每个图像捕获平均强度，并且可基于该平均值计算总亮度控制值。
计算多个照明源中的每个照明源的单独亮度值，方法是单独地调节每个照明源的亮度以生成至少一个图像，该至少一个图像与每个相应照明源的影响区域中的目标强度基本上匹配730。根据本文所述的各种配置，计算单独的亮度值包括：对于光谱的每个照明源，以从低于亮度控制值的亮度水平开始增加的亮度水平迭代地捕获每个照明源的关注区域的多个图像。根据各种配置，在每个照明源是唯一打开的照明源的情况下捕获图像。在一些情况下，从某个亮度水平开始捕获多个图像，使得图像的强度显著低于目标水平，其中一次打开一个照明源。可计算所打开照明源的影响区域的每个捕获图像的平均强度，并且可基于该平均值计算每个照明源的单独亮度值。
可基于总亮度控制值和单独亮度值来确定每个照明源的校准亮度值740。根据本文所述的各种实施方案，确定每个照明源的校准亮度值包括计算目标强度值与该光源的影响区域的每个单独亮度水平处的单独强度之间的差异。根据各种实施方案，基于以下项来确定每个照明源的校准亮度值：每个照明源以相应的单独亮度值打开时的图像强度，和每个照明源在单独打开时在每个相应的影响区域内生成的强度。
根据本文所述的各种实施方案，可计算用于补偿每个单独亮度值的差异的百分比变化。捕获关注区域的多个图像。可为每个捕获的图像捕获平均强度，并且可基于平均值和百分比变化值来确定每个照明源的校准亮度值。根据各种配置，使用关注区域的平均强度，确定关注区域的平均强度与目标强度之间的百分比差。为每个单独光源捕获的数据可用于确定每个光源的亮度需要调节的量，以将其强度移动相同的百分比。将改变每个单独光源的图像强度的百分比与捕获的强度对目标强度的百分比相同的值可以是单独光源亮度值。
可对一个或多个光谱执行图7所示的步骤。例如，可针对诸如红、绿和蓝的三个光谱来执行图7的步骤。红色、绿色和蓝色表示原色，但除了原色之外或者作为原色的替代，也可使用其他颜色。例如，可使用来自可见、红外和/或紫外光谱的任何颜色。
图8示出了根据本文所述实施方案的用于计算总亮度控制值的更详细的过程。应当理解，图8和本文所示的其他流程图可针对单个光谱完成，或者可针对另外的光谱重复。确定其中将要进行菌落计数的关注区域810。可通过识别装置图像上的清晰图像区域的边界来确定关注区域。更具体地，可通过在表示区域边界的图像中寻找已知的较暗区域来找到用于计数的关注区域。黑暗区域可由围绕关注区域的阻挡来自图像平面的光的一个或多个框、或不被照明使得背部照明仅覆盖计数区域的区域来限定。计算每个光谱的所有照明源的亮度，以使关注区域的平均强度与目标强度基本上匹配815。同时将所有照明源调节到低于目标强度水平的亮度水平，使得可单独地调整亮度水平820。根据各种配置，将所有照明源同时调节到生成刚好低于目标水平的强度的亮度水平。
以增加的亮度水平迭代地捕获多个图像830。每个捕获图像的初始亮度水平处的强度可显著低于目标强度值，而不导致强度达到最低值(例如，0的强度)。最低值可表示图像捕获装置可观察到的最低黑色。可将亮度水平调节得足够低，以确保所得图像强度显著低于目标强度水平。该低起始值可用于正确地创建表示对任何亮度的强度响应的线性方程。该方程继而用于计算生成与目标值最佳匹配的强度的亮度。将通过以下方式来创建该较低起始点：分析给定图像系统的响应和校准条件，并且设置足够低于目标的值，使得系统中的任何差异都不会导致该水平高于目标强度。在一些情况下，调节起始亮度，使其为约目标强度的1/2或更小。根据各种配置，使用小的增量来增加每个后续图像的亮度水平。根据各种配置，增量足够小以提供足够的点来创建开始和结束之间的精确方程。捕获更多数量的图像增加了所需的时间。因此，可能需要平衡所需的时间并且生成准确的方程，可增加亮度水平，直到达到刚好小于饱和值的图像强度。例如，可增加亮度直到刚好在关注区域中的任何像素为白色之前。计算多个图像中的每个图像的平均强度840。使用亮度水平和平均强度来创建最佳拟合方程850。可使用任何合适的技术来创建最佳拟合方程。例如，可使用线性回归、2阶曲线拟合、多点平均和曲线平滑中的一者或多者来创建最佳拟合方程。计算总亮度控制值，其将基本上生成目标平均强度860。根据各种配置，通过对目标强度的最佳拟合方程求解来计算总亮度控制值。
确定是否已经针对每个光谱计算了所有总亮度控制值870。如果在870确定没有为所有光谱计算出所有总亮度控制值，则过程继续到计算另一光谱的照明源的亮度815。如果确定已经计算了所有总亮度控制值，则过程完成880，并且在后续步骤中使用所计算的总亮度控制值。
图9示出了使用图8中计算的总亮度控制值的关注区域的热图的示例。如可观察到的，关注区域的大部分是相对均匀的，但一些区域，特别是沿着周边的区域，比所述区域的其余部分更暗，如910处所示。图9的热图示出了均匀性。换句话讲，热图中的每个像素表示强度相对于目标强度值的偏移。在图9中，大多数值相对于目标强度值偏移+1或+2。根据各种具体实施，目标强度值为约200，因此大部分热图接近或等于200。910中所示的较暗区域表示负偏移。例如，较暗区域中的一个或多个像素强度值可偏移-9(200-9＝191)或-14(200-14＝186)。
图10示出了根据本文所述实施方案的用于计算单独亮度值的更详细的过程。确定照明源的影响区域1010。这可通过仅在照明源打开的情况下捕获至少一个图像并且确定所捕获图像的图像强度是目标强度的阈值百分比的区域来完成。在一些情况下，阈值百分比可在约85％到约100％的范围内。根据各种配置，阈值百分比为约95％。
对于正被测试的光谱，以从低于在图8中计算的总亮度控制值的水平开始增加的亮度水平迭代地捕获照明源的影响区域的多个图像1030。根据各种配置，一次捕获一个光源的图像。亮度水平可一次应用于一个光源并且/或者一次循环通过一个光源的整个范围。在一些情况下，从显著低于总亮度控制值的亮度水平开始捕获图像。例如，可从将给予图像至少1/2的目标强度的亮度水平开始捕获图像，而不导致强度达到0。根据各种配置，使用小的增量来增加每个后续图像的亮度水平。根据各种配置，以不同的亮度捕获至少五个图像来创建良好的代表性方程。可增加每个捕获图像的亮度水平，直到达到高于目标强度值但小于饱和值的图像强度。根据各种配置，亮度水平增加到显著高于总亮度控制值的水平。根据各种配置，增加亮度水平，直到测试的至少两个点高于目标强度。可增加亮度水平，直到达到目标强度的约120％而不导致饱和。计算在每个照明源的影响区域处的多个图像中的每个图像的平均强度1040。可为串联或并联的每个光源计算平均强度。使用单独照明源的亮度水平和平均强度来创建最佳拟合方程1050。可使用任何合适的技术来创建最佳拟合方程。例如，可使用线性回归来创建最佳拟合方程。计算单独亮度值，该单独亮度值将在正被测试的单独照明源的影响区域处生成目标平均强度1060。根据各种配置，通过对目标平均强度的最佳拟合方程求解来计算单独亮度值。
确定是否已经针对当前光谱计算了所有单独的照明源亮度值1070。如果在1070确定没有计算出所有照明源亮度水平，则该过程继续到计算正被测试的当前光谱的另一照明源的亮度值1020。如果确定已经计算了所有单独的照明源亮度值，则确定是否已经针对所有光谱计算了所有单独的照明源亮度值1080。如果确定没有为所有光谱计算出所有照明源亮度值，则该过程继续到计算其他光谱的单独照明源亮度值。如果确定已经针对所有光谱完成了所有照明源亮度值，则过程完成1090，并且在校准过程的后续步骤中使用所计算的单独亮度值。
图11A至图11D示出了不同的单独照明源打开的示例性关注区域。如可观察到的，各个照明源具有不同的影响区域，如关注区域的不同区中的较亮区域所证明的。
图12示出了根据本文所述实施方案的用于计算校准亮度值的更详细的过程。所有照明源都以在图10中计算的它们相应的单独亮度值打开1210。
以针对每个照明源确定的基本上相同的亮度水平迭代地捕获多个图像，以在它们的影响区域中生成与正被测试的光谱的目标强度水平匹配的图像1230。正被使用的亮度水平可与正被测试的不同光谱的亮度水平相同或不同。计算多个图像中的每个图像的平均强度1240。确定所有图像的所有平均强度的总平均值1250。通过从目标强度中减去总平均值来计算达到目标强度所需的变化量1260。为每个照明源确定将给出与图12中计算的每个单独亮度值相同的强度变化量的校准亮度值1270。
确定是否已经针对正被测试的当前光谱计算了所有校准亮度值1282。如果在1282确定没有为当前光谱计算出所有校准亮度值，则该过程继续到捕获正被测试的当前光谱的更多图像1230。如果在1282确定已经针对当前光谱计算了所有校准亮度值，则确定是否已经针对所有光谱计算了所有校准亮度值1284。如果在1284确定没有为所有光谱计算出所有校准亮度值，则该过程继续到以单独亮度值打开所有照明源以用于待测试的下一光谱。如果在1284确定已经针对所有光谱计算了所有校准亮度值，则过程完成1290。
图13A和图13B示出了使用最终校准亮度值的图像的示例(图13A)和图像的热图(图13B)。如可在图13B中观察到的，除了沿着周边的一些小的不均匀性1310之外，热图基本上是均匀的。
在照明装置的校准之后，光谱可被进一步对准以使得光谱之间和装置之间的亮度对强度响应尽可能相似。例如，每个光谱的强度直方图可用于进一步细化结果。每个光谱可通过在其所有照明源上略微增加或减少该光谱的亮度控制来对准。
图14示出了根据本文所述实施方案对准光谱的过程。捕获关注区域的多个图像1410。根据各种配置，在不改变正被测试的当前光谱的照明源亮度的情况下捕获多个图像。对每个图像的像素强度求平均以形成平均像素强度1420。以每个强度水平为所捕获的当前光谱生成像素的直方图1430。确定每个直方图的平均像素强度的平均强度值和峰值1440。确定是否已经生成了所有光谱直方图1450。如果在1450确定没有生成所有光谱直方图，则捕获多个图像以用于另一光谱并且该过程继续。如果在1460确定已经生成了所有光谱直方图，则在1460确定直方图是否是正态的。根据各种配置，当直方图峰值和平均值在阈值内彼此接近时出现正态直方图。如果在1460确定直方图不是正态的，则将每个光谱的所有照明源的亮度控制调节相同的量，以使每个图像的强度直方图的峰值与目标强度基本上对准1462，并且过程完成1470。如果在1460确定直方图是正态的，则将每个光谱的所有照明源的亮度控制调节相同的量，以使每个光谱的图像的平均点与目标强度基本上对准1464，并且过程完成1470。图15A和图15B分别示出了未对准的正态直方图和对准的正态直方图的示例。图16A和图16B分别示出了根据本文所述实施方案的未对准的非正态直方图和对准的非正态直方图的示例。
根据本文所述的各种实施方案，可使用平场归一化过程来进一步增强图像质量以用于菌落计数。使用平场归一化过程可允许在用于菌落计数(菌落计算)的像素尺度上对生长培养基上的光水平的基本上一致的响应。相机响应的反射、漫射、可变性等是影响菌落计数图像质量的固定图案变化。平场归一化可通过数学上平滑图像以去除由成像系统引起的固定图案变化来补偿所有固定图案变化。
平场归一化过程可通过根据(1)创建以先前校准的光源亮度照明的多个图像的平均值来开始。根据各种实施方案，丢弃一个或多个高和/或低值，并且然后对来自多个图像的该像素的剩余值求平均。
Figure BDA0003817655380000141
这里，m和n在表示2维图像中的强度值的二维阵列中偏移。m是在水平方向上的偏移，n是通常从左上角在垂直方向上的偏移。Iavg[m,m]是多个图像在m、n处的像素值的平均值。L是平均图像数，并且Il是该组图像中图像l的像素m、n处的强度值。一旦计算了平均值，就将使用(2)中所示的二次方程来计算平场，或换句话讲，计算平滑图像值。
Iq[m，n]＝β1+β2·m+β3·n+β4·m·n+β5·m2+β6·n2 (2)
这里，Iq是如上定义的象素位置m、n处的平滑图像值。这些平滑值是均匀或平坦响应的结果。β值是描述像素位置m、n处的平滑图像值的两个双变量二阶方程的系数。根据各种配置，(2)是2阶曲线拟合，用于使每个像素对设定的亮度水平设置具有最平坦的响应(例如，相同的响应)。
(2)中的β值可通过最小化根据(3)的方程拟合中的平方误差来确定，其中I是Iavg，并且Iq是从上述方程计算的平场值。
Figure BDA0003817655380000151
这里，sq_err是在每个像素处的平均值与用(2)计算的平滑值之间的误差的平方。根据各种配置，最小化sq_err以选择上述β值。M是水平穿过图像的像素维度数量，并且N是沿图像垂直向下的像素维度数量。变量m和n是定义像素位置的偏移。Iavg[m,n]是像素m、n处的平均值，并且Iq[m,n]是用先前方程中的待测β值计算的值。根据各种实施方案，sq-err计算图像中每个像素的平均值与平场值之间的差值的平方。最小化该平方误差产生描述平场值的二阶方程。
一旦定义了二次方程β值，就可计算用于乘以每个像素以达到平场(平滑值)的平场增益，如(4)所示。
Figure BDA0003817655380000161
这里，变量m和n是对上述二维图像的像素的偏移。Iq[m,n]是具有在图像中的位置m、n处计算的β值的方程。I[m,n]是图像中位置m、n处的平均像素强度。GainFlatField[m,n]是理想Iq与像素[m,n]处的平均值的比率，并且表示对于平场平滑响应，任何像素强度值应该被乘以多少来对其进行调节。
为了进一步微调增益以调节平场增益值从而实现装置与装置之间的一致性，可应用(5)来确定总增益。这允许缩放平滑图像增益，使得所得的调节响应将达到期望的目标强度。
Figure BDA0003817655380000162
生成平场归一化因子的过程可涉及使用表示期望的色彩平衡和亮度的光学卡。可能希望使用由行业标准仪器验证的光学卡。为每个颜色通道(光谱)生成归一化因子。例如，可为利用这三个光谱的系统中的红色、蓝色和绿色通道中的每个通道生成归一化因子。
图17所示的过程可用于生成归一化因子。虽然图17所示的示例描述了具有红色、蓝色和绿色通道的系统，但应当理解，该过程可应用于任何数量的颜色通道和/或与这里列出的通道不同的颜色通道。使用1710已经校准了照明系统的仪器。可根据本文讨论的实施方案和/或使用一个或多个不同的过程来校准照明系统。使用校准过程正确地设置所有颜色通道。在该示例中，设置了所有三个通道(红色、蓝色和绿色)
捕获1720每个彩色通道的光学卡的单色图像。将来自彩色通道的所有单色图像相组合。在仅使用一个彩色通道的情况下，可跳过该步骤。在该示例中，单色图像被组合成RGB24图像。在捕获1720单色图像和在组合1730单色图像的步骤被重复多次。在该示例中，创建多个白卡RGB24图像。白卡可以是对于每个正被校准的光谱具有基本上平衡或接近平衡的反射率的介质(例如，纸张)。如果介质基本上不平衡，则可补偿不平衡的量以对准每个光谱。如本文所述，关注区(ROI)被示出1750为培养基上的细菌生长区。虽然该示例使用细菌生长作为ROI，但应当理解，可使用与细菌生长结合或作为细菌生长的替代的其他类型的生长来定义ROI。
使用(6)计算1760每个图像的归一化因子。
对于范围(0，图像数)内的指数：
Figure BDA0003817655380000171
如(7)所示，计算1770归一化因子的平均值。
Norm_factor＝mean(norm_factor,axis＝0) (7)
从(7)计算的平均值可用作仪器标准化因子，并且其将用于归一化由仪器捕获的所有图像。
根据本文所述的各种实施方案，可通过将所捕获图像的每个像素值除以归一化因子的相应像素来执行每个所捕获图像的归一化。图18示出了可如何使用归一化来基于每个像素在5×5滑动窗口上产生均匀图像的示例。在该示例中，示出了对应于所捕获图像中的每个像素的强度值1810。将每个像素除以它们相应的归一化因子1820，以创建具有归一化强度值的输出图像1830。
图19A和图19B示出了仅使用本文所述的校准照明系统(19A)和除了平场归一化过程之外还使用校准照明系统的示例性图像。可观察到，与图19A的左和右边缘上的较暗区域所证明的不均衡和不均匀的ROI相比，图19B中的图像的ROI的中心区在整个范围内基本上是均匀的。
图20示出了根据本文所述实施方案的示例性直方图，其解释了每个红色、绿色和蓝色通道的光分布以及平场归一化对图像均匀性的影响。平场归一化之前的像素强度分布在约102至约230的范围内。在平场归一化之后，像素强度的分布减小到约155至约225的范围。根据各种实施方案，像素强度的分布减小到约178至约220的范围。
图21A至图21F示出了根据本文所述实施方案的归一化之前和之后的红色、绿色和蓝色通道中的每个通道的热图表示。具体地，图21A示出了归一化之前的红色通道热图。图21B示出了归一化之后的红色通道热图。图21C示出了归一化之前的蓝色通道热图。图21D示出了归一化之后的蓝色通道热图。如可通过该示例观察到的，在图21D所示的归一化之后，在热图中基本上消除了拐角中的不均匀性2150。图21E示出了归一化之前的绿色通道热图。图21F示出了归一化之后的绿色通道热图。如可通过该示例观察到的，在图21D所示的归一化之后，在热图中基本上消除了拐角中的不均匀性2170。
上述方法可使用熟知的计算机处理器、存储器单元、存储装置、计算机软件和其他部件在计算机上实施。图22示出了这种计算机的高级框图。计算机2200包含处理器2210，该处理器通过执行定义这种操作的计算机程序指令来控制计算机2200的整体操作。应当理解，处理器2210可包括能够执行指令的任何类型的装置。例如，处理器2210可包括中央处理单元(CPU)、图形处理单元(GPU)、现场可编程门阵列(FPGA)和专用集成电路(ASIC)中的一者或多者。计算机程序指令可被存储在存储装置2220(例如，磁盘)中，并且当期望执行计算机程序指令时被加载到存储器2230中。因此，本文所述方法的步骤可由存储在存储器2230中的计算机程序指令来定义并且由执行该计算机程序指令的处理器2210来控制。计算机1500可包括用于经由网络与其他装置通信的一个或多个网络接口2250。计算机2200也包括使得用户能够与计算机1500交互的用户接口2260。用户接口2260可包括I/O装置2262(例如，键盘、鼠标、扬声器、按钮等)以允许用户与计算机交互。此类输入/输出装置2262可与根据本文所述的实施方案的一组计算机程序结合使用。用户接口也包括显示器2264。根据各种实施方案，图22是出于说明性目的的计算机的可能部件的高级表示，并且计算机可包含其他部件。
示例性实施方案
实施方案1.一种方法，包括：
确定生长培养基上的关注区域；
计算被配置为照射所述生长培养基的多个照明源的总亮度控制值，所述总亮度控制值生成与所述关注区域处的目标强度基本上匹配的至少一个图像；
基于所述总亮度控制值来计算所述多个照明源中的每个照明源的单独亮度值，方法是单独调节每个照明源的亮度以生成至少一个图像，所述至少一个图像与每个相应照明源的影响区域中的目标强度基本上匹配；以及
基于以下项来确定每个照明源的校准亮度值：每个照明源以相应的单独亮度值打开时的图像强度，和每个照明源在单独打开时在每个相应的影响区域内生成的强度。
实施方案2.根据实施方案1和3-11中任一项所述的方法，还包括针对多个光谱中的每个光谱完成根据实施方案1所述的步骤。
实施方案3.根据实施方案1、2和4-11中任一项所述的方法，还包括：
以所述校准亮度值来捕获所述关注区域的多个图像；
基于所述多个图像以多个亮度值中的每个亮度值来生成每个图像的强度的像素直方图；
确定所述像素直方图的平均值和峰值；
基于所述像素直方图的所述平均值和所述峰值中的至少一者来调节所述校准亮度值。
实施方案4.根据实施方案1-3和5-11中任一项所述的方法，还包括使用线性回归、2阶曲线拟合、多点平均和曲线平滑中的一者或多者来计算所述总亮度控制值和所述单独亮度值中的至少一者。
实施方案5.根据实施方案1-4和6-11中任一项所述的方法，其中计算所述总亮度控制值包括：
将所述多个照明源中的所有照明源的亮度同时调节到低于所述目标强度的亮度；
以从低于所述目标强度的亮度开始增加的亮度水平迭代地捕获所述关注区域的多个图像；
计算每个捕获图像的平均强度；以及
基于平均值来确定所述总亮度控制值。
实施方案6.根据实施方案1-5和7-11中任一项所述的方法，其中计算所述单独亮度值包括：
对于所述多个照明源中的每个照明源：
以从低于所述总亮度控制值开始增加的亮度水平迭代地捕获所述关注区域的多个图像；
计算每个捕获图像的平均强度；以及
基于平均值来确定所述单独亮度值。
实施方案7.根据实施方案1-6和8-11中任一项所述的方法，其中所述关注区域包括细菌生长区。
实施方案8.根据实施方案1-7和9-11中任一项所述的方法，还包括：
使用平场归一化过程来计算归一化因子；以及
基于所述归一化因子来调节所述校准亮度值。
实施方案9.根据实施方案8所述的方法，其中所述平场归一化过程包括：
使用多个光谱中的每个光谱的所述校准亮度值来捕获单色图像；以及
使用所述单色图像来计算所述光谱中的每个光谱的所述归一化因子。
实施方案10.根据实施方案1-9和11中任一项所述的方法，其中确定所述校准亮度值包括：
计算所述目标强度与每个单独亮度值处的图像强度之间的差异；
计算每个单独亮度值的百分比变化值以补偿所述差异；
捕获所述关注区域的多个图像；
计算每个捕获图像的平均强度；以及
基于平均值和所述百分比变化值来确定所述校准亮度值。
实施方案11.根据实施方案1-10中任一项所述的方法，还包括：
对于所述多个照明源中的每个照明源：
在所述照明源打开的情况下捕获至少一个图像；以及
通过确定其中图像强度是所述目标强度的阈值百分比的图像区域来确定影响区域。
实施方案12.一种系统，包括：
处理器；和
存储器，所述存储器存储计算机程序指令，所述计算机程序指令在由所述处理器执行时致使所述处理器执行包括如下的操作：
确定生长培养基上的关注区域；
计算被配置为照射所述生长培养基的多个照明源的总亮度控制值，所述总亮度控制值生成与所述关注区域处的目标强度基本上匹配的至少一个图像；
基于所述总亮度控制值来计算所述多个照明源中的每个照明源的单独亮度值，方法是单独调节每个照明源的亮度以生成至少一个图像，所述至少一个图像与每个相应照明源的影响区域中的目标强度基本上匹配；以及
基于以下项来确定每个照明源的校准亮度值：每个照明源以相应的单独亮度值打开时的图像强度，和每个照明源在单独打开时在每个相应的影响区域内生成的强度。
实施方案13.根据实施方案12和14-19中任一项所述的系统，其中所述照明源包括发光二极管(LED)、白炽装置和荧光装置中的一者或多者。
实施方案14.根据实施方案12、13和15-19中任一项所述的系统，其中所述处理器被进一步配置为：
以所述校准亮度值来捕获所述关注区域的多个图像；
基于所述多个图像以多个亮度值中的每个亮度值来生成每个图像的强度的像素直方图；以及
确定所述像素直方图的平均值和峰值。
实施方案15.根据实施方案12-14和16-19中任一项所述的系统，其中所述处理器被进一步配置为使用线性回归来计算所述总亮度控制值和所述单独亮度值中的至少一者。
实施方案16.根据实施方案12-15和17-19中任一项所述的系统，其中计算所述总亮度控制值包括：
将所述多个照明源中的所有照明源的亮度同时调节到低于所述目标强度的亮度；
以从低于所述目标强度的亮度开始增加的亮度水平迭代地捕获所述关注区域的多个图像；
计算每个捕获图像的平均强度；以及
基于平均值来确定所述总亮度控制值。
实施方案17.根据实施方案12-16、18和19中任一项所述的系统，其中计算所述单独亮度值包括：
对于所述多个照明源中的每个照明源：
以从低于所述亮度控制值开始增加的亮度水平迭代地捕获所述关注区域的多个图像；
计算每个捕获图像的平均强度；以及
基于平均值来确定所述单独亮度值。
实施方案18.根据实施方案12-17和19中任一项所述的系统，其中所述关注区域包括细菌生长区。
实施方案19.根据实施方案12-18中任一项所述的系统，其中所述处理器被进一步配置为：
使用平场归一化过程来计算归一化因子；以及
基于所述归一化因子来调节所述校准亮度值。
实施方案20.一种非暂态计算机可读介质，所述非暂态计算机可读介质存储用于设计微结构的计算机程序指令，所述计算机程序指令在由处理器执行时致使所述处理器执行包括如下的操作：
确定生长培养基上的关注区域；
计算被配置为照射所述生长培养基的多个照明源的总亮度控制值，所述总亮度控制值生成与所述关注区域处的目标强度基本上匹配的至少一个图像；
基于所述总亮度控制值来计算所述多个照明源中的每个照明源的单独亮度值，方法是单独调节每个照明源的亮度以生成至少一个图像，所述至少一个图像与每个相应照明源的影响区域中的目标强度基本上匹配；以及
基于以下项来确定每个照明源的校准亮度值：每个照明源以相应的单独亮度值打开时的图像强度，和每个照明源在单独打开时在每个相应的影响区域内生成的强度。
除非另外指明，否则说明书和权利要求书中所使用的表达结构尺寸、量和物理特性的所有数字在所有情况下均应理解成由术语“约”修饰。因此，除非有相反的说明，否则在上述说明书和所附权利要求书中列出的数值参数均为近似值，这些近似值可根据本领域的技术人员利用本文所公开的教导内容来寻求获得的期望特性而变化。由端点表述的数值范围的使用包括该范围内的所有数字(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4和5)以及该范围内的任何范围。
上述各种实施方案可以通过使用交互方式提供特定结果的电路和/或软件模块实施。计算领域技术人员可以使用本领域公知的知识，在模块级别或整体上容易地实施这样描述的功能。例如，本文示出的流程图可以用于创建供处理器执行的计算机可读指令/代码。此类指令可按照本领域熟知的方法存储在计算机可读介质上，并传输至处理器执行。以上示出的结构和程序仅为可用来促进上述实施方案的实施方案的代表性示例。
提出示例性实施方案的以上描述是出于举例说明和描述的目的。并非旨在穷举性地描述本发明的构思或将本发明的构思限制在本发明所公开的明确形式内。按照上述教导，可以使用许多修改形式和变型形式。所公开的实施方案的任何或所有特征可以单独应用或以任何组合应用，并非旨在为限制性的，而纯粹是例示性的。本发明的范围由所附权利要求书限定，而不是由详细描述限定。

Claims (20)

1.一种方法，包括：
确定生长培养基上的关注区域；
计算被配置为照射所述生长培养基的多个照明源的总亮度控制值，所述总亮度控制值生成与所述关注区域处的目标强度基本上匹配的至少一个图像；
基于所述总亮度控制值来计算所述多个照明源中的每个照明源的单独亮度值，方法是单独调节每个照明源的亮度以生成至少一个图像，所述至少一个图像与每个相应照明源的影响区域中的目标强度基本上匹配；以及
基于以下项来确定每个照明源的校准亮度值：每个照明源以相应的单独亮度值打开时的图像强度，和每个照明源在单独打开时在每个相应的影响区域内生成的强度。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括针对多个光谱中的每个光谱完成根据权利要求1所述的步骤。
3.根据权利要求1所述的方法，还包括：
以所述校准亮度值来捕获所述关注区域的多个图像；
基于所述多个图像以多个亮度值中的每个亮度值来生成每个图像的强度的像素直方图；
确定所述像素直方图的平均值和峰值；
基于所述像素直方图的所述平均值和所述峰值中的至少一者来调节所述校准亮度值。
4.根据权利要求1所述的方法，还包括使用线性回归、2阶曲线拟合、多点平均和曲线平滑中的一者或多者来计算所述总亮度控制值和所述单独亮度值中的至少一者。
5.根据权利要求1所述的方法，其中计算所述总亮度控制值包括：
将所述多个照明源中的所有照明源的亮度同时调节到低于所述目标强度的亮度；
以从低于所述目标强度的亮度开始增加的亮度水平迭代地捕获所述关注区域的多个图像；
计算每个捕获图像的平均强度；以及
基于平均值来确定所述总亮度控制值。
6.根据权利要求1所述的方法，其中计算所述单独亮度值包括：
对于所述多个照明源中的每个照明源：
以从低于所述总亮度控制值开始增加的亮度水平迭代地捕获所述关注区域的多个图像；
计算每个捕获图像的平均强度；以及
基于平均值来确定所述单独亮度值。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述关注区域包括细菌生长区。
8.根据权利要求1所述的方法，还包括：
使用平场归一化过程来计算归一化因子；以及
基于所述归一化因子来调节所述校准亮度值。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述平场归一化过程包括：
使用多个光谱中的每个光谱的所述校准亮度值来捕获单色图像；以及
使用所述单色图像来计算所述光谱中的每个光谱的所述归一化因子。
10.根据权利要求1所述的方法，其中确定所述校准亮度值包括：
计算目标强度值与每个单独亮度值处的图像强度之间的差异；
计算每个单独亮度值的百分比变化值以补偿所述差异；
捕获所述关注区域的多个图像；
计算每个捕获图像的平均强度；以及
基于平均值和所述百分比变化值来确定所述校准亮度值。
11.根据权利要求1所述的方法，还包括：
对于所述多个照明源中的每个照明源：
在所述照明源打开的情况下捕获至少一个图像；以及
通过确定其中图像强度是所述目标强度的阈值百分比的图像区域来确定影响区域。
12.一种系统，包括：
处理器；和
存储器，所述存储器存储计算机程序指令，所述计算机程序指令在由所述处理器执行时致使所述处理器执行包括如下的操作：
确定生长培养基上的关注区域；
计算被配置为照射所述生长培养基的多个照明源的总亮度控制值，所述总亮度控制值生成与所述关注区域处的目标强度基本上匹配的至少一个图像；
基于所述总亮度控制值来计算所述多个照明源中的每个照明源的单独亮度值，方法是单独调节每个照明源的亮度以生成至少一个图像，所述至少一个图像与每个相应照明源的影响区域中的目标强度基本上匹配；以及
基于以下项来确定每个照明源的校准亮度值：每个照明源以相应的单独亮度值打开时的图像强度，和每个照明源在单独打开时在每个相应的影响区域内生成的强度。
13.根据权利要求12所述的系统，其中所述照明源包括发光二极管(LED)、白炽装置和荧光装置中的一者或多者。
14.根据权利要求12所述的系统，其中所述处理器被进一步配置为：
以所述校准亮度值来捕获所述关注区域的多个图像；
基于所述多个图像以多个亮度值中的每个亮度值来生成每个图像的强度的像素直方图；以及
确定所述像素直方图的平均值和峰值。
15.根据权利要求12所述的系统，其中所述处理器被进一步配置为使用线性回归来计算所述总亮度控制值和所述单独亮度值中的至少一者。
16.根据权利要求12所述的系统，其中计算所述总亮度控制值包括：
将所述多个照明源中的所有照明源的亮度同时调节到低于所述目标强度的亮度；
以从低于所述目标强度的亮度开始增加的亮度水平迭代地捕获所述关注区域的多个图像；
计算每个捕获图像的平均强度；以及
基于平均值来确定所述总亮度控制值。
17.根据权利要求12所述的系统，其中计算所述单独亮度值包括：
对于所述多个照明源中的每个照明源：
以从低于所述总亮度控制值开始增加的亮度水平迭代地捕获所述关注区域的多个图像；
计算每个捕获图像的平均强度；以及
基于平均值来确定所述单独亮度值。
18.根据权利要求12所述的系统，其中所述关注区域包括细菌生长区。
19.根据权利要求12所述的系统，其中所述处理器被进一步配置为：
使用平场归一化过程来计算归一化因子；以及
基于所述归一化因子来调节所述校准亮度值。
20.一种非暂态计算机可读介质，所述非暂态计算机可读介质存储用于设计微结构的计算机程序指令，所述计算机程序指令在由处理器执行时致使所述处理器执行包括如下的操作：
确定生长培养基上的关注区域；
计算被配置为照射所述生长培养基的多个照明源的总亮度控制值，所述总亮度控制值生成与所述关注区域处的目标强度基本上匹配的至少一个图像；
基于所述总亮度控制值来计算所述多个照明源中的每个照明源的单独亮度值，方法是单独调节每个照明源的亮度以生成至少一个图像，所述至少一个图像与每个相应照明源的影响区域中的目标强度基本上匹配；以及
基于以下项来确定每个照明源的校准亮度值：每个照明源以相应的单独亮度值打开时的图像强度，和每个照明源在单独打开时在每个相应的影响区域内生成的强度。
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