JP4863932B2

JP4863932B2 - コロニー数の計数方法

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Publication number: JP4863932B2
Application number: JP2007147919A
Authority: JP
Inventors: 孝西田; 勝蘭李; 千束甲斐; 邦光豊島
Original assignee: N Tech KK; Yakult Honsha Co Ltd; TOHOSHOJI KK
Current assignee: N Tech KK; Yakult Honsha Co Ltd; TOHOSHOJI KK
Priority date: 2007-06-04
Filing date: 2007-06-04
Publication date: 2012-01-25
Anticipated expiration: 2027-06-04
Also published as: EP2161341B1; TW200907052A; CN101680021A; US20100166271A1; US8831326B2; EP2161341A4; EP2161341A1; KR20100036276A; WO2008149636A1; JP2008295424A; TWI400331B; KR101284130B1

Description

本発明は、シャーレを利用して培地中に菌類、カビ等の微生物を培養した後、生成した微生物のコロニー数を数えるコロニー数の計数方法に関する。

食品工業分野では、微生物の計数対象となる製品が問題を起こさないように、あるいは、食品の製造工程で有用な微生物が適正に増殖していること等を確認する必要がある。この確認に用いられる生菌検出システムとして、培地を利用した培養型の計数手段が利用されることが多い。例えば、微生物計数の公定法として寒天培地を利用して微生物のコロニー数を計測する方法が採用されている。特に微生物の分散度が低い計数対象製品において、微生物を短時間に培養して微生物のコロニーを生成させ、簡易に精度良く微生物の数を計測する手段として広く利用されている。

そして、寒天培地等に生成したコロニー数を目視で計数する旧来の方法に替えて、ＣＣＤカメラ等を利用して撮像した計数対象培地の画像データをデータ処理してコロニー数を自動的に計数する幾つかの手段が提案されている。すなわち、連結したコロニーを形状から識別してコロニーを計数する方法（特許文献１参照）、群体微生物に対して色相の濃淡を利用して外周円弧を検出して微生物数を計数する方法（特許文献２参照）が提案されている。

また、色相を利用したＣＣＤカメラ画像を簡易にデータ処理してコロニー数を精度良く計数する方法（特許文献３参照）が提案されている。本件発明の出願人は、コロニーの検査領域を分割して単色のＣＣＤカメラを利用してコロニーを精度良く自動的に計数する検査方法（特許文献４参照）を提案している。

しかしながら、従来のコロニー計数手段では、同じ計数対象シャーレのコロニー数を計数しても、対象シャーレに対する照明の平面位置や照明角度、及びＣＣＤカメラのシャーレまでの距離等を変動させてコロニー数を計数した場合、計測の度に計数したコロニー数の値が異なることが従来から経験により明らかとなってきた。この理由は、主として寒天培地等のいろいろな深度に点在して生成した微小なコロニーに対して、照明やＣＣＤカメラの相対位置、及びコロニー同士の相対位置等が複雑に関係して、ＣＣＤカメラによるコロニーの画像データが変化して、画像データのデータ処理方法と連動してコロニーの自動的な計数値が変動するものと考えられる。

このため、特に正確なコロニー数の把握を義務付けられている食品業界において、同一シャーレ内のコロニー計測値変動幅のばらつきを排除して計測データが安定する実用的なコロニー数の計数方法が求められていた。
特開平９−１４０３９７号公報特開２００１−２２９２９号公報特開２００４−１９４６１０号公報特開２００６−３４５７５０号公報

本発明は、上記課題に鑑みて提案されたものであって、撮像条件によるコロニー数の計数のばらつきを排除して、簡易な手段で信頼性の高い安定したコロニー数の計数値を取得できるコロニーの計数方法を提供することを目的とする。

請求項１に記載の発明は、シャーレ内の培地で生成された微生物のコロニーを、前記シャーレの培地面の中心付近を回転軸とし該回転軸の延長線方向に配置した撮像手段により撮像してデータ処理することによりコロニー数を計数するに際して、前記シャーレの１回転を所定数に分割して得た指定角度ずつ前記回転軸を中心にして前記シャーレを回転させると共に、前記指定角度ずつのシャーレの回転ごとに前記シャーレの培地面全体を撮像して前記指定角度における前記シャーレの培地面全体の画像データを取得し、前記指定角度における前記シャーレの培地面全体の画像データをデータ処理して前記指定角度ごとの培地面全体のコロニー数を個別に計数し、前記各指定角度ごとに個別に計数したコロニー数を数値処理して前記シャーレ内のコロニー数を算定することを特徴とするコロニー数の計数方法に係る。

請求項２に記載の発明は、シャーレ内の培地で生成された微生物のコロニーを、前記シャーレの培地面の中心付近を回転軸とし該回転軸の延長線方向に配置した撮像手段により撮像してデータ処理することによりコロニー数を計数するに際して、前記シャーレの１回転を所定数に分割して得た指定角度ずつ前記撮像手段を回転させると共に、前記指定角度ずつの前記撮像手段の回転ごとに前記シャーレの培地面全体を撮像して前記指定角度における前記シャーレの培地面全体の画像データを取得し、前記指定角度における前記シャーレの培地面全体の画像データをデータ処理して前記指定角度ごとの培地面全体のコロニー数を個別に計数し、前記各指定角度ごとに個別に計数したコロニー数を数値処理して前記シャーレ内のコロニー数を算定することを特徴とするコロニー数の計数方法に係る。

請求項３に記載の発明は、前記各指定角度における前記シャーレの培地面全体の撮像に際して、前記撮像手段は一の指定角度につき複数回ずつ撮像して前記一の指定角度における複数の画像データを取得し、前記取得した画像データをそれぞれデータ処理して前記一の指定角度におけるコロニー数を複数回計数し、前記各指定角度ごとにそれぞれ個別に計数されたコロニー数を数値処理して前記シャーレ内のコロニー数を算定することを特徴とする請求項１又は２に記載のコロニー数の計数方法に係る。

請求項４に記載の発明は、前記シャーレを前記指定角度回転させるごとに一旦停止して前記撮像手段により前記シャーレの培地面全体を撮像する請求項１又は３に記載のコロニー数の計数方法に係る。

請求項５に記載の発明は、前記撮像手段を前記指定角度回転させるごとに一旦停止して前記撮像手段により前記シャーレの培地面全体を撮像する請求項２又は３に記載のコロニー数の計数方法に係る。

請求項１の発明に係るコロニー数の計数方法によれば、シャーレ内の培地で生成された微生物のコロニーを、前記シャーレの培地面の中心付近を回転軸とし該回転軸の延長線方向に配置した撮像手段により撮像してデータ処理することによりコロニー数を計数するに際して、前記シャーレの１回転を所定数に分割して得た指定角度ずつ前記回転軸を中心にして前記シャーレを回転させると共に、前記指定角度ずつのシャーレの回転ごとに前記シャーレの培地面全体を撮像して前記指定角度における前記シャーレの培地面全体の画像データを取得し、前記指定角度における前記シャーレの培地面全体の画像データをデータ処理して前記指定角度ごとの培地面全体のコロニー数を個別に計数し、前記各指定角度ごとに個別に計数したコロニー数を数値処理して前記シャーレ内のコロニー数を算定するため、シャーレやコロニーに対し照明や撮像手段が特定の位置にある場合に取得されてしまう偏った画像データに基づいたコロニー計数値を採用する不具合が解消される。よって、複数の撮像条件により平準化された安定したデータ算定が可能となる。

請求項２の発明に係るコロニー数の計数方法によれば、シャーレ内の培地で生成された微生物のコロニーを、前記シャーレの培地面の中心付近を回転軸とし該回転軸の延長線方向に配置した撮像手段により撮像してデータ処理することによりコロニー数を計数するに際して、前記シャーレの１回転を所定数に分割して得た指定角度ずつ前記撮像手段を回転させると共に、前記指定角度ずつの前記撮像手段の回転ごとに前記シャーレの培地面全体を撮像して前記指定角度における前記シャーレの培地面全体の画像データを取得し、前記指定角度における前記シャーレの培地面全体の画像データをデータ処理して前記指定角度ごとの培地面全体のコロニー数を個別に計数し、前記各指定角度ごとに個別に計数したコロニー数を数値処理して前記シャーレ内のコロニー数を算定するため、シャーレやコロニーに対し照明や撮像手段が特定の位置にある場合に取得されてしまう偏った画像データに基づいたコロニー計数値を採用する不具合が解消される。よって、複数の撮像条件により平準化された安定したデータ算定が可能となる。加えて、大きさや重さ、壊れやすさ等から容易に被撮像物品を回転できない場合にも都合よい。

請求項３の発明に係るコロニー数の計数方法によれば、請求項１又は２に記載の発明において、前記各指定角度における前記シャーレの培地面全体の撮像に際して、前記撮像手段は一の指定角度につき複数回ずつ撮像して前記一の指定角度における複数の画像データを取得し、前記取得した画像データをそれぞれデータ処理して前記一の指定角度におけるコロニー数を複数回計数し、前記各指定角度ごとにそれぞれ個別に計数されたコロニー数を数値処理して前記シャーレ内のコロニー数を算定するため、各指定角度ごとに生ずる画像データの撮影条件等のばらつきを複数回の撮像により排除でき、シャーレ内のコロニー数をさらに安定して計数できる。

請求項４の発明に係るコロニー数の計数方法によれば、請求項１又は３に記載の発明において、前記シャーレを前記指定角度回転させるごとに一旦停止して前記撮像手段により前記シャーレの培地面全体を撮像するため、指定角度ごとの撮影画像が鮮明になり、その画像データ処理によるコロニー計数の精度が向上する。

請求項５の発明に係るコロニー数の計数方法によれば、請求項２又は３に記載の発明において、前記撮像手段を前記指定角度回転させるごとに一旦停止して前記撮像手段により前記シャーレの培地面全体を撮像するため、指定角度ごとの撮影画像が鮮明になり、その画像データ処理によるコロニー計数の精度が向上する。

以下、本件発明のコロニー数計数方法を図１ないし図５に基づいて説明する。
図１は本発明に係るコロニー計数を実施する装置の構造断面図、図２は図１の装置の上面図、図３はシャーレ内の培地で生成されたコロニーを例示する撮像画像の模式図、図４は本発明に係るコロニー計数の工程を示すフローチャート、図５は他の実施形態に係るコロニー計数を実施する装置の構造断面図である。

（第１の実施形態）
図１の構造断面図及び図２の上面図を用い、本発明のコロニー数の計数方法を実施するために好適な計数装置５０を説明する。この計数装置５０は、シャーレ回転載置装置５５、撮像手段（ＣＣＤカメラ７）、データ処理装置９を有する。

シャーレ回転載置装置５５には、上部に支え板５を有する架台１７、この上に透明回転板２２、駆動モーター１９が備えられる。透明回転板２２は回転台１６の上にねじ等の図示省略の手段で固定され、さらに回転台１６は支持ローラー２３（図示では３箇所）により、支え板５上で回転可能に支持される。回転台１６には駆動ベルト２１が張設され、支え板５上の駆動モーター１９に固定された駆動プーリー２０の駆動が駆動ベルト２１に伝達されて駆動される。計数対象となるシャーレ２（当該シャーレの培地１）は、円盤状の透明回転板２２の略回転中心位置上に載置される。そして、計数対象となるシャーレ２の培地面１ｆの中心付近に回転軸Ｃ１が設定される。回転軸Ｃ１はシャーレの培地面１ｆと直交している。

回転台１６が取り付けられている支え板５は、図示の架台１７の上部に配置され、同支え板５上には拡散板４が備えられる。架台１７の内部には、下方から順に照明装置６、平行板１８が備えられる。平行板１８は照明装置６の光線を上方に平行光線として安定して進行させる。拡散板４はこの光線を均一に拡散させて培地１の画像を正確に撮影させる機能を果たしている。

撮像手段の一例として開示するＣＣＤカメラ７は、シャーレ２の上方、すなわち回転軸Ｃ１の延長線方向に配置される。シャーレ２はシャーレ開口部３を下方に向けた状態（ひっくり返した状態）で透明回転板２２に載置され、その培地１は下方の照明装置６に照明される。そして、ＣＣＤカメラ７はシャーレの底面方向から当該シャーレの外周を含めた培地の画像を透過光として撮像する。図示の実施形態によると、回転軸Ｃ１はシャーレ２の培地面１ｆの中心に設定され、ＣＣＤカメラ７はシャーレ２の回転軸Ｃ１をほぼそのままのばした延長線上に配置される。なお、ＣＣＤカメラとシャーレの回転軸の位置関係は、シャーレ全体の撮像が可能な位置であれば良く、厳密な延長線上ではなく、多少の軸の位置ずれも許容される。また、シャーレ（培地面）に設定される回転軸の位置も、必ずしも厳密ではなくシャーレの大きさ（直径）、透明回転板に載せるときの位置のずれ等により影響される。このため、回転軸はシャーレ全体の撮像、シャーレの回転に支障を来さない範囲で概ねシャーレの中心に設定される。図示において、シャーレは蓋を外してひっくり返した状態で透明回転板に載置されているが、シャーレの蓋をしたままで載置しても良く、いずれでも適宜である。

データ処理装置９はパーソナルコンピューター等の適宜の演算装置であり、ＣＣＤカメラ７からの信号ケーブル８ｃが接続されている。シャーレを撮影した際の画像データがデータ処理装置９に送られ、詳細後述のデータ処理が実施されることにより、シャーレ内のコロニーＫの数が計数される。また、必要に応じて撮影したシャーレの画像等は画像モニター１２に表示される。さらに、駆動モーター１９とデータ処理装置９の間にも信号ケーブル８ｍが備えられる。データ処理装置９の制御に基づいて、ＣＣＤカメラ７による撮像と連動して駆動モーター１９の駆動が行われ、所定量の透明回転板２２（シャーレ２）の回転が行われる。

図示のＣＣＤカメラ７はその支持具を省略している。撮像手段は当該実施形態のＣＣＤカメラの他にＣＭＯＳイメージセンサ等の公知の機器を用いることができる。また、培地１の撮像に際してシャーレ開口部３を下方にして下方から照明する構成を例示したが、シャーレ１を上向きに配置して照明装置６とＣＣＤカメラ７を上下逆の配置とすることも可能であり、特に図示した実施形態に限定されるものではない。図中、符号２ａはシャーレ側壁である。

図３はＣＣＤカメラ７によりシャーレ２の底面を撮影した際の撮像画像１４の例である。シャーレ側壁２ａの内側は培地１であり、計数対象となる微生物のコロニーＫが多様な形状で生成している。本件発明の実施形態のコロニー計数手法において、シャーレ側壁２ａ内部のコロニー計数領域１３は、中心部を占める中心画像領域１０とその外側の外周画像領域１１に分割されている。図示のとおり、ＣＣＤカメラ７による撮像ではシャーレの全体（その培地面１ｆ全体）が撮像され、画像データとしてデータ処理装置９に取り込まれる。

上記の中心画像領域１０、外周画像領域１１のシャーレ側壁２ａの内径に対する寸法、または比率は特に指定されない。過去の経験に基づいて中心画像領域１０は、シャーレ側壁２ａの影響が少なく良好な画像が取得できる領域から選定される。外周画像領域１１は、シャーレ側壁２ａに近接して撮像画像によるコロニーＫの計数が困難な領域から指定される。

図４に示すフローチャートに従って、コロニーの計数方法の全体を説明する。まず、角度分割設定（Ｊ０）において、シャーレを１回転させるときにその３６０°をいずれの所定数に分割するか設定される。以下の実施形態において、分割数（所定数に該当）に対応するコロニー計数は、撮像及びデータ処理工数とのバランスで比較的効率良く実施されると考えられる６分割（所定数＝６）に設定される。すなわち、指定角度を６０°としてこの指定角度ごとに回転軸Ｃ１を中心としてシャーレを回転、停止させ、ＣＣＤカメラ７でその培地面全体の撮影を１ずつ行うコロニーの計数方法に設定されている。以下、６分割（所定数＝６）を例にして説明する。

透明回転板２２上に載置されたシャーレに対し、ＣＣＤカメラ７による１番目のシャーレ撮像（Ｊｉ＝Ｊ１）が実施され、そのシャーレ全体の撮像画像の画像データ１４（図３参照）は信号ケーブル８ｃで送信されデータ処理装置９に入力される（Ｓ１）。詳細後述のデータ処理により当該指定角度のコロニー計数が行われる。シャーレは指定角度（６０°）だけ回転後に停止され、当初から６０°回転した２番目のシャーレ撮像（Ｊｉ＝Ｊ２）が行われる。以下、順次シャーレの回転軸を中心とした指定角度の回転、そして指定角度の回転ごとに一旦停止され、当該指定角度ごとの撮像及びコロニー計数が継続される。

データ処理装置９に取り込まれた撮像画像１４の画像データから計数対象となる計数画像が生成される（Ｓ２）。撮像画像１４の画像データ処理においては、図３に示したとおり、あらかじめ設定した条件に従ってシャーレ側壁２ａの内側にコロニーＫを計数する計数領域１３が決定される（Ｓ３）。また、計測領域１３をシャーレ２の反射光等によるデータの外乱が多い外周画像領域１１とデータが安定している中心画像領域１０に分割される（Ｓ４）。そして、それぞれの画像領域１０，１１に適合した画像データの前処理及び計数手段を採用して、コロニー数は個別に計数される（Ｓ５、Ｓ６）。

例えば、シャーレ側壁２ａに近接して反射光等によるデータの外乱が多い外周画像領域１１の画像データに関しては、あらかじめ指定した一つのしきい値を使用してデータの２値化画像を作成することによりコロニー数は計数される。また、計数領域１３の面積の主要部を占めてデータが安定している中心画像領域１０では、対象物としてのコロニーＫと背景の培地との違いが際立つように自動しきい値決定法の判別分析法により２値化を行う方法が用いられコロニーＫは計数される。

外周画像領域１１のコロニー計数値と中心画像領域１０のコロニー計数値はそれぞれの領域ごとで統合される（Ｓ７）。続いて、領域ごとに統合された計数値から当該指定角度における計測領域１３全体のコロニー数が計数されて取得され（Ｓ８）、当該指定角度におけるコロニー数のデータとしてデータ処理装置９に記録される（Ｓ９）。

なお、撮像画像１４の画像データからのコロニー数を計数するに際し、上記の方法（背景技術に示した特許文献４（特開２００６−３４５７５０号公報））をはじめとする公知の計数方法が適用される。

そして、Ｓ９の個別角度のコロニー数記録により蓄積された各指定角度ごとのコロニー数データの数（累計）がＪ０で設定した分割数に到達したか否か確認される（Ｓ１０）。この実施形態によると、分割数（所定数）が６に達したか否か確認される。

ここで、分割数（所定数）が６に達していなければ、シャーレはさらに６０°回転され（Ｓ１１）、計数対象のシャーレに対する第２度目の撮像が実施されて（Ｊｉ＝Ｊ２）撮像画像１４は取得され、フローチャートの撮像画像データ入力（Ｓ１）から各指定角度のコロニー数記録（Ｓ９）に至るコロニーＫの計数に関するデータ処理が継続して実施される。

以後、順次各指定角度ごとにコロニー数の計数は継続し、個々の指定角度のコロニー数記録により蓄積された各指定角度ごとのコロニー数データの数（累計数）が分割数（所定数）と同じ６、つまり第６番目（３００°）に達したことを確認して、当該シャーレに対する撮像及びコロニー数の計数を終了する。

そして、これまでデータ処理装置９に記録した０°，６０°，１２０°，１８０°，２４０°，３００°の各々の角度に対する６個のコロニー数が数値処理され、最終的に当該シャーレにおけるコロニー数が算定される（Ｓ１２）。この実施形態においては、第１番目（０°）ないし第６番目（３００°）の６個のコロニー計数値に基づいてそれらの平均値を算出することによって、シャーレのコロニー数は算定される。以後、コロニー計数の対象シャーレを別のシャーレに更新して、０°から始まる指定角度６０°ごとのコロニー数計数及びデータ記録を実施しながら、順次、各シャーレに対するコロニー数の算定を実施する。なお、シャーレの撮像に当たり、第１番目を６０°からはじめて第６番目を３６０°として終えてもよい。

実施形態では、３６０°を６分割する角度としたが、特に６分割に制限されるものではなく、シャーレ撮像以降のコロニー計数工数と計数値の精度向上の価値を勘案して、シャーレの１回転を望ましい分割数（所定数）に分け、同分割数に基づく指定角度ずつシャーレを回転させてコロニー数を計数することができる。本件発明のコロニー数の計数方法によれば、コロニー数の計算値に端数が発生することもあるが、計数したコロニー数の利用目的に応じて、そのままデータを端数付で使用するか、四捨五入等の処理を行って整数として使用するかは自由に選択できる。

この実施形態のコロニー数の計数方法にあっては、従来指摘されていたような、シャーレやコロニーに対し照明や各種カメラが特定の位置にある場合に取得されてしまう偏った画像データに基づいたコロニー計数値を採用する不具合が解消される。つまり、複数の撮像条件により平準化された安定したデータ算定が可能となる。とりわけ、各指定角度の回転ごとに一旦停止されることから、指定角度ごとの撮像画像が鮮明になり、その画像データ処理によるコロニー計数の精度は向上する。また、コロニー計数値の安定化と信頼性向上により、微生物等の試験条件とコロニー数の相関が明確となり、微生物に関する技術開発や不具合原因究明等の方向付けが明確となり、技術研究活動を加速させる効果がある。

（第２の実施形態）
第２実施形態においては、第１実施形態で説明した１回転の分割数（所定数）から得られる指定角度において、その一の指定角度につき、ＣＣＤカメラ７により複数回撮像される。そして、当該一の指定角度における複数枚の培地面全体の画像データが取得される。取得された当該一の指定角度における複数枚の培地面全体の画像データそれぞれについて、図３に示し前記したコロニー計数方法によるデータ処理が適用され、一の指定角度におけるコロニー数が複数回計数される。続いて、各指定角度ごとにそれぞれ個別に計数されたコロニー数が数値処理されることによって、当該シャーレ内のコロニー数が算定される。ちなみに、第２実施形態に当たり、図４のフローチャート中、Ｊｉのシャーレ撮像は、「複数回のシャーレ撮像」となる。

例えば、分割数（所定数）を６とすると、対応する指定角度は６０°となる。まず、第１番目（０°）に５回撮像される。次に指定角度６０°回転した第２番目（６０°）でも５回撮像され、続く第３番目（１２０°）でも５回撮像される。そして、最終第６番目（３００°）でも５回撮像される。こうして取得された合計３０の培地面全体の画像データそれぞれについてコロニー数が計数される。すると、当該シャーレにつき３０個のコロニー計数値が生じる。そこで、数値処理をして３０個のコロニー計数値から平均値が算出される。この平均値が当該計数対象シャーレのコロニー数の算定値となる。

あるいは、個々の指定角度ごとで取得した５枚の培地面全体の画像データから得られる５個のコロニー計数値が平均され、いったん一の指定角度におけるコロニー数の算定値が求められる。全ての指定角度におけるコロニー数の算定値が求められ、これらの平均が算出されるようにすることもできる。

また、各指定角度で計数した５個のコロニー数の平均値から例えば５％以上差異のある特異な数値データを除去して該当する指定角度のコロニー数の平均値とし、全体のコロニー数の平均値を算出して、計数対象シャーレのコロニー数として設定する等、使用目的に応じた各種のデータ処理を実施してコロニー数を算定することができる。加えて、数値データの取捨にあたり適宜の検定を行うことにより算出数値の信頼度を高めることもできる。また、一の指定角度での撮像枚数は、コロニーを計数する目的や条件に応じて適宜変更することができる。第２実施形態によると、各指定角度ごとに生ずる画像データの撮影条件等のばらつきを複数回の撮像により排除でき、シャーレ内のコロニー数をさらに安定して計数できる。

（第３の実施形態）
第３実施形態は、第１実施形態のように指定角度回転させるごとのシャーレの一旦停止を行わず、シャーレを連続回転させながら順次、各指定角度の回転ごとにシャーレの撮像を実施して、取得された画像データのデータ処理からコロニー数が計数、記録される。そして、これらコロニー計数値に基づいて対象とするシャーレのコロニー数が算定される。コロニー計数方法やデータ処理、数値処理は第１実施形態に準ずる。このようにすると、シャーレの一旦停止がなくなるため、単位時間当たりのシャーレ計測数を増やすことができる。ただし、シャーレが回転状態での撮像となるため、コロニー計数方法の画像処理精度を勘案する必要もある。

（第４の実施形態）
第４実施形態は計数対象となるシャーレを回転させるのではなく、撮像手段を回転させて撮像、計数する形態である。図５の構造断面図からも理解されるように、計数装置６０は、シャーレ載置装置６５、撮像手段（ＣＣＤカメラ７）、回転撮像部６６、データ処理装置９を有して構成されている。

シャーレ載置装置６５では、架台１７の上部に支え板５が配置され、同支え板５上には拡散板４が備えられる。架台１７の内部には、下方から順に照明装置６、平行板１８が備えられる。支え板５には脚部５ｈが設けられ、その上部に保持板５ｂが接続される。

回転撮像部６６は保持板５ｂ上に設けられ、回転撮像部６６には回転台１６、回転板２２ｒ、及び駆動モーター１９が備えられる。円盤状の回転板２２ｒは回転台１６の上にねじ等の図示省略の手段で固定され、さらに回転台１６は支持ローラー２３により保持板５ｂ上で回転可能に支持される。回転台１６には駆動ベルト２１が張設され、保持板５ｂ上の駆動モーター１９に固定された駆動プーリー２０の駆動が駆動ベルト２１に伝達されて駆動される。円盤状の回転板２２ｒの中心位置に撮像手段であるＣＣＤカメラ７が組み込まれている。

ＣＣＤカメラ７（撮像手段）は、計数対象となるシャーレ２（シャーレの培地面１ｆ）の中心付近を回転軸Ｃ１とするときの回転軸Ｃ１の延長線方向に配置される。この実施形態において、撮像手段側の回転軸Ｃ２は回転板２２ｒの中心位置に直交して設定され、シャーレの培地面の中心付近に設定される回転軸Ｃ１とほぼ一致する配置である。むろん、シャーレの回転軸Ｃ１とＣＣＤカメラ側（その回転軸Ｃ２）との位置関係は、前述の第１実施形態と同様の理由により、シャーレ全体の撮像が可能な位置であれば良く、厳密な延長線上ではなく、多少の軸の位置ずれも許容される。また同様に、シャーレ（培地面）に設定される回転軸Ｃ１の位置も、必ずしも厳密ではなくシャーレの大きさ（直径）、図５の拡散板４にシャーレを載せるときの位置のずれ等により影響される。このため、シャーレの回転軸Ｃ１はシャーレ全体の撮像、シャーレの回転に支障を来さない範囲で概ねシャーレの中心に設定される。第４実施形態の撮像手段、データ処理装置９の詳細は第１実施形態と同様であるため、その説明を省略する。また、図１等と共通する箇所は同一符号として示す。

第４実施形態として図５に開示する計数装置６０を用いたコロニー数の計数方法であっても、図４のフローチャートに示す第１実施形態等とほぼ同様である。この場合、Ｓ１１のシャーレ回転が「カメラ回転」と変更される。また、当該実施形態である計数装置６０を用いたコロニー数の計数方法においても、既述の一の指定角度につき撮像手段による複数回撮像する第２実施形態、シャーレに代えて撮像手段を連続回転させながら撮像する第３実施形態、その他、数値の取捨、平均値の求め方等を組み合わせることは可能である。

第４実施形態によると、シャーレ等の被撮像物品側は固定されて撮像手段側が回転できる。このため、大きさや重さ、壊れやすさ等から容易に回転できない被撮像物品の撮像、計測に都合よい。例えば、液体培地等で培養した場合にこの上から撮像する状況が想定される。なお、図示において、シャーレは蓋を外してひっくり返した状態で拡散板に載置されているが、シャーレは蓋をしたままで載置しても良く、いずれでも適宜である。

上記の第１ないし第４の各実施形態では、シャーレの撮像位置を均等な角度に分割して撮像条件を均等化している。その結果として、シャーレ撮像位置は最初に撮像する位置により決定されるという偶然に頼っている。そこで、まずシャーレを回転させながら各指定角度におけるコロニー数を試験的に計数して、例えば、このうち多くのコロニー数を計数した角度の近傍の角度において、別途指定する数の撮像及びコロニー数計数を実施して、このコロニー数計数データをデータ処理して検査対象のシャーレのコロニー数として設定すれば、実態に近付いた多くのコロニー数を計数できる可能性がある。このように、コロニー数に関する計数データの使用目的に応じて、望ましい条件の複数の撮影画像を撮影及びコロニー数計数を行って、これら複数の計数値をデータ処理してコロニー数を計数することができる。

なお、本件発明におけるコロニー数の計数手段として、図４の説明において、それぞれ検査領域を外周画像領域１１、中心画像領域１０に分割して、撮影画像のコロニー計数のデータ処理を行う実施例を説明したが、本件発明は前記撮影画像のコロニー計数のデータ処理に限定されることなく各種の撮影画像データ処理手段を利用してコロニーを計数することもできる。

すなわち、計数対象とするシャーレあるいは撮像手段を回転させて、当該撮像手段で撮影した複数の撮影画像の画像データをデータ処理して安定したコロニー計数値を取得する点に本件発明の主眼がある。例示のコロニーの計数方法に留まらず本発明の主旨の範囲で各種のデータ処理手段や計数方法を採用することができる。

また、本件発明はシャーレを利用した培地におけるコロニーＫの計数方法を説明したが、シャーレに替えてプラスチックシートを利用した培地に生成させたコロニー等他の方式の培地にも適用することができる。

発明者らはこれまでに詳述した実施形態のコロニー数の計数方法を用い、Ａ，Ｂ，Ｃの３種類の菌種を培養したシャーレにおけるコロニー数の計測を試みた。菌種Ａについては試料番号１，２，３，４のシャーレであり、菌種Ｂについては試料番号５，６，７，８のシャーレであり、菌種Ｃについては試料番号９，１０，１１，１２のシャーレである。詳細な計測結果は表１である。

表１の最上段に示される１分割、２分割、４分割、６分割、８分割、１２分割、１５分割は、シャーレを１回転（３６０°）させる際に撮像した分割数、つまり所定数を示す。１分割の場合、計測対象のシャーレをひとつの位置のみでシャーレを回転させずに撮像した。例えば６分割の場合、３６０°を分割数（所定数）である６で除した６０°を指定角度とし、この６０°の指定角度ずつシャーレを回転させて６回の異なる条件で同じシャーレを撮像してコロニー数を計数した。他の分割数も同様である。表中の分割数に付された括弧の度数は分割数に対応した指定角度である。

なお、表１に示したコロニー数の計数方法では、個々の指定角度ずつの回転において一旦停止して４回の撮像を行い、その指定角度あたり４の培地面全体の画像データを取得した。得られた画像データより計測対象のシャーレ内のコロニー数を平均して計数した。ちなみに、分割数が６、指定角度が６０°ならば、２４の画像データの取得となる。各試料番号のシャーレについてそれぞれの分割数ごと計数の結果が表１中の個数である。試料番号のシャーレの下段に記載した％の数値は、「各コロニー計数個数」の「１５等分したときのコロニー計数個数」に対する割合のパーセントによる表示である。

例えば、試料番号１において、１５分割として指定角度２４°ずつシャーレを回転及び停止させてそれぞれの回転位置で４回ずつ撮像して計数したコロニー数の平均値は「１７７．２個」である。これに対して、シャーレを回転させない１分割のときのコロニー数は「１７９．５個」を示した。このため、その割合は「１０１．３％」となる。同様に、６分割のときのコロニー数は「１７６．３個」であるため、その割合は「９９．５％」となる。そして、表１の下方３段は、各試料番号ごとの１分割ないし１２分割のコロニー計数値における１５分割のコロニー計数値に対する割合のパーセント表示の最大値、最小値、及びその標準偏差である。

上記の結果より、シャーレを回転させない１分割のときに示すパーセント表示の値は、最大値「１０２．２％」、最小値「９８．３％」と大きな振れ幅を示す。また、各分割数における試料番号１ないし１２のパーセント表示の値から標準偏差を求めると、シャーレを回転させない１分割の場合が最大値を示す。

コロニー数のパーセント表示による振れ幅及び標準偏差は、シャーレを回転させずに計数した場合のコロニー計数値がシャーレを回転させて数多くの条件で撮像してコロニー数を計数した計数値と比較してばらつきが大きいことを示す。このことはコロニー計数対象のシャーレを回転させないで撮像してコロニー計数を実施する従来のコロニー方法に対して、シャーレを回転させてコロニーを計数する本件発明のコロニーの計数方法が、より安定した計数データを提供できることを示している。

また、分割数を変更したときのコロニー計数の計測精度を比較すると、４分割あるいは６分割で振れ幅、及び標準偏差が少なく略均等な値を示し、８分割以上では撮像や画像データ処理等の手間の増大に比して計数精度の向上が少ない。このため、計数対象の微生物や培養条件、及びコロニー計数データの利用目的によるものの、４分割または６分割程度がコロニー計数の効率として好適な分割数である。

本発明に係るコロニー計数を実施する装置の構造断面図である。図１の装置の上面図である。シャーレ内の培地で生成されたコロニーを例示する撮像画像の模式図である。本発明に係るコロニー計数の工程を示すフローチャートである。他の実施形態に係るコロニー計数を実施する装置の構造断面図である。

符号の説明

１培地
２シャーレ
２ａシャーレ側壁
３シャーレ開口部
４拡散板
５支え板
６照明装置
７ＣＣＤカメラ（撮像手段）
８ｃ，８ｍ信号ケーブル
９データ処理装置
１０中心画像領域
１１外周画像領域
１２画像モニター
１３計数領域
１４撮影画像
１６回転台
１７架台
１８平行板
１９駆動モーター
２０駆動プーリー
２１駆動ベルト
２２透明回転板
２３支持ローラー
５０，６０計数装置
５５シャーレ回転載置装置
６５シャーレ載置装置
６６回転撮像部
Ｃ１シャーレの回転軸
Ｃ２撮像手段の回転軸
Ｋコロニー
Ｊ０角度分割数設定
Ｊｉシャーレ撮像
Ｓ１撮像画像データ入力
Ｓ２計数画像生成
Ｓ３計数領域自動抽出
Ｓ４計数領域分割
Ｓ５外周画像領域の計数
Ｓ６中心画像領域の計数
Ｓ７計数値の統合
Ｓ８指定角度のコロニー計数
Ｓ９指定角度のコロニー数記録
Ｓ１０分割数との比較
Ｓ１１シャーレ回転
Ｓ１２最終値算出

Claims

シャーレ内の培地で生成された微生物のコロニーを、前記シャーレの培地面の中心付近を回転軸とし該回転軸の延長線方向に配置した撮像手段により撮像してデータ処理することによりコロニー数を計数するに際して、
前記シャーレの１回転を所定数に分割して得た指定角度ずつ前記回転軸を中心にして前記シャーレを回転させると共に、前記指定角度ずつのシャーレの回転ごとに前記シャーレの培地面全体を撮像して前記指定角度における前記シャーレの培地面全体の画像データを取得し、
前記指定角度における前記シャーレの培地面全体の画像データをデータ処理して前記指定角度ごとの培地面全体のコロニー数を個別に計数し、
前記各指定角度ごとに個別に計数したコロニー数を数値処理して前記シャーレ内のコロニー数を算定する
ことを特徴とするコロニー数の計数方法。
シャーレ内の培地で生成された微生物のコロニーを、前記シャーレの培地面の中心付近を回転軸とし該回転軸の延長線方向に配置した撮像手段により撮像してデータ処理することによりコロニー数を計数するに際して、
前記シャーレの１回転を所定数に分割して得た指定角度ずつ前記撮像手段を回転させると共に、前記指定角度ずつの前記撮像手段の回転ごとに前記シャーレの培地面全体を撮像して前記指定角度における前記シャーレの培地面全体の画像データを取得し、
前記指定角度における前記シャーレの培地面全体の画像データをデータ処理して前記指定角度ごとの培地面全体のコロニー数を個別に計数し、
前記各指定角度ごとに個別に計数したコロニー数を数値処理して前記シャーレ内のコロニー数を算定する
ことを特徴とするコロニー数の計数方法。
前記各指定角度における前記シャーレの培地面全体の撮像に際して、
前記撮像手段は一の指定角度につき複数回ずつ撮像して前記一の指定角度における複数の画像データを取得し、
前記取得した画像データをそれぞれデータ処理して前記一の指定角度におけるコロニー数を複数回計数し、
前記各指定角度ごとにそれぞれ個別に計数されたコロニー数を数値処理して前記シャーレ内のコロニー数を算定する
ことを特徴とする請求項１又は２に記載のコロニー数の計数方法。
前記シャーレを前記指定角度回転させるごとに一旦停止して前記撮像手段により前記シャーレの培地面全体を撮像する請求項１又は３に記載のコロニー数の計数方法。
前記撮像手段を前記指定角度回転させるごとに一旦停止して前記撮像手段により前記シャーレの培地面全体を撮像する請求項２又は３に記載のコロニー数の計数方法。