JPWO2013145235A1 - 培養容器及び自動培養装置 - Google Patents
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Abstract
Description
培養期間中、培地交換時を所定の日時に実施する。上皮系細胞の場合、1−3日程度に1回の頻度で一般に実施する。培地交換は、10個の培養容器に対し、1個ずつ順次実施する。最初に、冷蔵庫内に4℃にて保管されている培地バッグ111を流体移動制御機構部108により培養容器の直前まで送液する。この時、培地バッグ111から送液された直後は4℃である培地を、ヒーター112により37℃まで温める。培養容器の周囲は、37℃に維持された恒温機の中であるため、ヒーター112により温めた培地は37℃を保持する。続いて、培養容器内の培地を培養容器から排出する。流体移動制御機構部108により、排液バッグ113へ排出する。その時、培地成分分析に必要な排液の一部は、排液回収バッグ114において回収する。本実施例では、培養容器101の上層及び下層を分けた状態で回収することが可能となっている。また培養容器から古い培地を排出する際には、回転機構110により培養容器を傾け、培養容器101内の排出口側から古い培地が排出されやすくなるようにする。続いて、事前に培地バッグ111より培養容器の直前まで送液し、37℃に保持された状態の新しい培地を、培養容器へ供給する。
図6は、データベース412に保持された、閉鎖系培養容器の上層への播種時制御用のテーブル600の一例を示す図である。図中、黒丸印が電磁弁の開(オン)及びポンプの動作状態、×印が電磁弁の閉(オフ)及びポンプの停止状態を示している(以下、同じ)。テーブル600で与えられる所定のシーケンスに従い、制御装置402により、10個の閉鎖系培養容器101(101a〜101j)の各々の上層への播種のために、二方弁106、三方弁107、流体移動制御機構部(チューブポンプ)108、第一の電磁弁130、第二の電磁弁132等が制御される。例えば、培養容器101aの上層に対する播種のために、流体の流速を4ml/秒とし、30秒かけて各弁やポンプを順次制御し培養容器101aの上層に2mlの細胞懸濁液を供給する。それに続いて、培養容器101bの上層に対する播種のために、同様に30秒かけて各弁やポンプを順次制御する一連の処理がなされ、培養容器101bの上層に2mlの細胞懸濁液を供給する。以下、同様にして、処理され、最後に、培養容器101jの上層への播種のための処理がなされる。なお、ここで示した流速等の数値はあくまでも一例であることは言うまでもない。
図8は、閉鎖系培養容器101の下層への播種時制御用のテーブル800の一例を示す図である。テーブル800で与えられる所定のシーケンスに従い、制御装置402により、10個の閉鎖系培養容器101(101a〜101j)の各々の下層への播種のために、二方弁106、三方弁107、流体移動制御機構部108、第一の電磁弁130、第二の電磁弁132が制御される。例えば、培養容器101aの下層に対する播種のために、流体の流速を4ml/秒とし、各弁やポンプを順次制御し45秒かけて培養容器101aの下層に3mlの細胞懸濁液を供給する。次の培養容器101bにも、同様に各弁やポンプを順次制御し、45秒かけて一連の処理を行い3mlの細胞懸濁液を供給する。以下、同様にして、処理され、最後に、培養容器101jの下層への播種のための処理がなされる。
図10は、閉鎖系培養容器の上層への培地交換制御用のテーブル1000の一例を示す図である。
図12は、第1の実施例における、閉鎖系培養容器の下層への培地交換制御用のテーブル1200の一例を示す図である。
まず、図5に示すように、自動培養装置を起動させる。操作者が制御装置にある操作部のスタートスイッチを押すことにより起動する。尚、この時点で流路回路等は事前に自動培養装置へ設置されている。制御部のディスプレイの操作画面において、自動培養装置の内部環境として適切な値であることを確認する。例えば、恒温機の温度が37℃であることを確認する。これらの数値は限定的なものでなく、例えば温度は、0℃から45℃の範囲より選択可能である。また装置の内部は、事前の適切な操作により、滅菌ガスによる滅菌或いはエタノールによる消毒が施され、清浄な状態となっている。また、培養に用いる流路部に対しても事前に滅菌を施してある。
培養する細胞の種類と量に合わせ、自動培養装置により実施する自動培養スケジュールを決定する。細胞播種、培地交換、顕微鏡観察、排液回収、検査用組織回収、移植用組織回収等の操作を行う日時、頻度、液量等の条件を、制御部の操作部より入力する。
適切な二方弁及び三方弁の開閉を行った後、
流体移動制御機構部を作動させ、細胞バッグより細胞懸濁液を吸引する。細胞懸濁液は、食道粘膜再生の例では口腔粘膜細胞を培養するため、KCM培地(keratinocyte culture medium)に懸濁した口腔粘膜細胞と、同じくKCM培地に懸濁した3T3−J2細胞である。流体移動制御機構部を駆動させることにより、エアフィルタを介して流路外へ流路内の空気を排出しつつ、細胞懸濁液を吸引する。そして培養容器へ播種する。細胞播種は、各培養容器のそれぞれの上層及び下層へ、順次実施する。播種後、回転機構により培養容器を複数回揺動させることにより、培養表面上の細胞分布が均一となるようにする。
培養容器を水平に静置した状態で所定時間、培養する。例として口腔粘膜細胞の場合、静置期間は播種後5日間程度とする。培養中は、恒温機により培養容器の周囲環境を37℃に維持する。また、必要に応じ培養容器の内部へ所定成分の気体を送気する。口腔粘膜細胞の培養の場合、CO2濃度は5%、湿度は100%に維持する。自動培養装置内部の空気はファンにより常に攪拌し、温度分布が常に一様となるようにする。
自動培養装置内に設置した顕微鏡を用い、細胞画像を取得する。自動培養装置内に設置した光源を適宜発光させ、顕微鏡により細胞に焦点を合わせ、撮像する。必要に応じ、培養表面に定点を任意に定め、撮影する。取得した細胞画像はデータベースに保存し、自動培養装置の外部に設置したディスプレイ上で必要に応じ閲覧できるようにする。顕微鏡観察により得た細胞の生育状態に関する情報から判断し、培地交換の頻度、時期の調整を行う。例えば細胞の接着が不十分な場合、S6の培地交換は実施せず、S4の細胞の培養を継続する。
培地交換は、一般に数日に一度の頻度で実施する。細胞の生育状況に応じ、頻度は調整を行う。適切な電磁弁の開閉を行った後、流体移動制御機構部を作動させ、流体移動制御機構部を駆動させることにより培地バッグより培地を吸引する。同時に、フィルタを介して流路外へ流路内の空気を排出する。培地バッグから送液された直後の培地は4℃であるが、ヒーター及び恒温機内の気相により、培地の温度は37℃を維持した状態で次の工程に進む。
移植予定日の前日に、培養中の培養容器のうち1枚を検査用に回収する。あらかじめ流路内に組み込まれた無菌脱着部を用い、培養容器を無菌的に取り外す。そして回収した培養容器において、中の細胞の状態が移植に適した質を有するか検査を行う。例えば口腔粘膜細胞による再生組織の場合、組織学的評価により3層程度の重層化した構造を有するか、免疫組織化学染色評価により口腔粘膜幹細胞が再生組織の基底層に存在するか、口腔粘膜細胞特異的タンパク質を発現しているか等の評価を行う。
ステップS4と同じ操作による培養を行う。そしてステップS9を実施する直前に、ステップS6と同じ操作による培地交換を行う。
ステップS7による評価の結果、移植に適した再生組織が培養できていると判断がついた場合、移植用として組織を回収して再生医療治療に用いる。S7と同様に、無菌脱着部を用い培養容器を取り外す。その後、再生医療治療を行う手術室へ、無菌性と生物学的な質を維持した状態で搬送し、治療に用いる。
培養に用いた流路部を取り外す。続いて、装置の内部へ適切な操作により、滅菌ガスによる滅菌或いはエタノールによる消毒を施し、清浄な状態にする。自動培養装置の各種ソフトを終了させ、自動培養装置の作動を終了させる。
本実施例の閉鎖系培養容器101を実施例1の培養容器に置き換え、実施例1の自動培養装置に組み込んで使用することで、実施例1と同様な効果が得られる。すなわち、細胞播種工程及び培地交換工程において、培地は常に一方向に流れるので、古い培地が新しい培地に混入せず、培養の再現性が向上する。しかも、閉鎖系培養容器に取り付けた流路チューブの一部は、送液と送気の機能を兼ねるため、全体流路回路は簡潔となる。
102…細胞バッグ
103…細胞バッグ
104…第二の流路回路(導入部)
105…第一の流路回路(導入部)
106…二方弁
107…三方弁
108…流体移動制御機構部
109…多分岐部
110…回転機構
111…培地バッグ
112…ヒーター
113…排液バッグ
114…排液回収バッグ
115…ガス供給部
116…ガス濃度調整部
117…フィルタ
118…無菌脱着部
121…第二の流路回路(分岐路)
122…第一の流路回路(分岐路)
123…第二の流路回路(分岐路)
124…第一の流路回路(分岐路)
130…第一の電磁弁
132…第二の電磁弁
200…細胞容器本体
201…第二容器
202…細胞容器蓋部
203…第一容器(セルカルチャーインサート容器)
204…弾性部材
205、207、209、211、213…接続突起構造
206…流路(第二供給ポート)
208…流路(第二排出ポート)
210…流路(第一供給ポート)
212…流路(第一排出ポート)
214…培地
215…上皮系細胞
216…フィーダー細胞
401…培養容器
402…制御装置
403…恒温機
404…温度調節部
405…ガス供給部
406…ガス濃度調節部
407…流体移動制御
408…顕微鏡
409…細胞・培地・排液・排液回収バッグ
410…表示画面
411…ガス濃度調整部
412…データベース
600…テーブル。
Claims (15)
- 細胞を保持、培養するための培養容器であって、
細胞容器本体と、該細胞容器本体に前記細胞及び培地を供給する流路回路を接続するため接続ポートとを備えており、
前記細胞容器本体は、対をなす少なくとも1組の第一容器と第二容器と、容器蓋部とを有し、
前記第一容器及び前記第二容器は、各々、培地及び細胞を、または培地のみを収容するための容器であり、前記第一容器と前記第二容器間の隔壁の一部は、液体及び気体が相互に移動可能に構成されており、
前記第一容器の上部と前記第二容器の上部との間には、相互に気体の流通を可能にするギャップが存在しており、
前記接続ポートとして、
前記第一容器には、前記培地の供給と、気体の供給及び排出をするための第一供給ポートと、前記培地を排出するための第一排出ポートとが接続され、
前記第二容器には、前記培地の供給と、前記気体の供給及び排出をするための第二供給ポートと、前記培地を排出するための第二排出ポートとが接続され、
前記第一供給ポート及び前記第二供給ポートは、前記培地を前記培養容器に対して常に一方向へ流す流路として機能する
ことを特徴とする培養容器。 - 請求項1において、
前記第一供給ポート及び前記第二供給ポートは、前記培地を前記培養容器の外側から内側への方向のみに流す流路、及び、前記気体を双方的に流す流路として機能し、
前記第一排出ポート及び前記第二排出ポートは、前記培地を前記培養容器の内側から外側への方向のみに流す流路として機能し、前記気体は流さない
ことを特徴とする培養容器。 - 請求項2において、
前記第一供給ポートの前記第一容器における開口位置は、前記第一排出ポートの前記第一容器における開口位置よりも高い位置にあり、
前記第一供給ポートの前記第二容器への開口位置は、前記第一排出ポートの前記第一容器への開口位置よりも高い位置にある
ことを特徴とする培養容器。 - 請求項3において、
前記培養容器は、細胞容器本体と、該細胞容器本体に第二の流路回路及び第一の流路回路を接続するための前記第一、前記第二供給ポート、及び、前記第一、第二排出ポートを備えており、
前記細胞容器本体は、該細胞容器本体に一体に形成された複数の前記第二容器と、前記蓋部と、前記各第二容器と前記蓋部との間に挿入される複数の前記第一容器とを備えている
ことを特徴とする培養容器。 - 請求項4において、
前記第一排出ポートの前記第一容器における開口位置は、前記第一容器の底面付近に位置し、
前記第二排出ポートの前記第二容器における開口位置は、前記第二容器の底面と前記第二排出ポートの内径最下部が、同じ高さとなる位置にある
ことを特徴とする培養容器。 - 請求項5において、
前記培養容器を略水平に保持する状態と、傾けた状態の何れかを取るよう制御する回転制御部を含むこと
を特徴とする培養容器。 - 培養容器内への細胞播種と培地交換を行い、前記培養容器内において細胞を培養する自動培養装置であって、
少なくとも1つの閉鎖系培養容器と、
前記閉鎖系培養容器の供給側に1つの細胞バッグ、培地バッグ、第一のフィルタ、及び排液回収バッグを接続する第一の流路回路と、
前記閉鎖系培養容器の供給側に他の細胞バッグ、培地バッグ、第二のフィルタ及び排液回収バッグを接続する第二の流路回路と、
前記第一の流路回路及び前記第二の流路回路に設けられた流体移動制御機構部及び電磁弁とを備え、
前記閉鎖系培養容器は、
細胞容器本体と、該細胞容器本体に前記第一の流路回路及び前記第二の流路回路を接続するため接続ポートとを備えており、
前記細胞容器本体は、対をなす少なくとも1組の第一容器と第二容器と、容器蓋部とを有し、
前記第一容器及び前記第二容器は、各々、培地及び細胞を、または培地のみを収容するための容器であり、前記第一容器と前記第二容器間の隔壁の一部は、液体及び気体が相互に移動可能に構成されており、
前記第一容器の上部と前記第二容器の上部との間には、相互に気体の流通を可能にするギャップが存在しており、
前記第一容器には、前記培地の供給と、気体の供給及び排出をするための第一供給ポートと、前記培地を排出するための第一排出ポートとに、前記第一の流路回路が接続され、
前記第二容器には、前記培地の供給と、前記気体の供給及び排出をするための第二供給ポートと、前記培地を排出するための第二排出ポートとに、前記第二の流路回路が接続され、
前記培地が、前記第一の流路回路、前記第二の流路回路、前記第一供給ポート及び前記第二供給ポートを介して、前記培養容器に対して常に一方向に供給される
ことを特徴とする自動培養装置。 - 請求項7において、
前記第一供給ポート及び前記第二供給ポートは、前記培地を、前記第一の流路回路及び前記第二の流路回路を経由して、前記培養容器の外側から内側への方向のみに流す流路、及び、前記気体を双方的に流す流路として機能し、
前記第一排出ポート及び前記第二排出ポートは、前記第一の流路回路及び前記第二の流路回路を経由して、前記培地を前記培養容器の内側から外側への方向のみに流す流路として機能し、前記気体は流さない
ことを特徴とする自動培養装置。 - 請求項8において、
前記第一の流路回路及び前記第二の流路回路に設けられた前記流体移動制御機構部及び前記電磁弁を備え制御する制御装置を備えており、
前記制御装置は、データベースに保持された情報に基づいて、前記培地及び前記気体が前記第一の流路回路及び前記第二の流路回路を流れる時期及び流れの方向を制御する
ことを特徴とする自動培養装置。 - 請求項9において、
前記制御装置は、
前記培地バッグから前記第一の流路回路を経て前記培養容器の第一供給ポートまで培地を送液した状態で、送液を一旦停止し、
この状態で、前記培養容器の古い培地を前記第一排出ポートから排出し、
さらに、前記第一の流路回路を経て流入した空気を前記第二供給ポートから前記培養容器内へ供給し、該空気を前記第一の流路回路及びフィルタを経て排気し、
さらに、前記培養容器の第一供給ポートまで培地された状態で待機していた前記培地を、前記第一容器に送液する
ことを特徴とする自動培養装置。 - 培養容器内への細胞播種と培地交換を行い、培養容器内において細胞を培養する自動培養装置であって、
細胞懸濁液が収容される細胞バッグと、
培地が収容される培地バックと、
培地を冷蔵保存する冷蔵庫と
培地を37℃に温めるヒーターと、
細胞を培養する培養容器と、
細胞懸濁液及び培地及び空気を送液/送気する流体移動制御機構部と
前記培養容器、細胞バッグ、培地バッグ、流体移動制御機構部からなる流路回路が設置される細胞培養用恒温槽と、
前記培養容器の培養環境を制御する制御装置を備え、
前記培養容器は、培地及び細胞を、または培地のみを収容する第一容器と、
当該第一容器内部に、培地及び細胞を、または培地のみを収容する第二容器と、
当該第一容器を少なくとも封止する蓋部材を有する培養容器において、
前記第一容器には、前記培地の供給と、気体の供給及び排出をするための第一供給ポートと、前記培地を排出するための第一排出ポートとが接続され、
前記第二容器には、前記培地の供給と、前記気体の供給及び排出をするための第二供給ポートと、前記培地を排出するための第二排出ポートとが接続され、
前記制御装置は、
当該第一容器への培地の排出または供給、あるいは前記第二容器からの培地の排液または供給をする場合に、前記第一供給ポート、前記第二供給ポートと、前記第一排出ポート、前記第二排出ポートを切り替え、送液を制御する
ことを特徴とする自動培養装置。 - 請求項11において、
前記細胞播種あるいは前記培地交換において、前記培地は前記第一供給ポート及び前記第二供給ポートの少なくとも一方から前記培養容器内へ供給され、
前記第一排出ポート及び前記第二排出ポートの少なくとも一方から前記培養容器外へ排出されることにより、前記培地は一方向のみに送液される
ことを特徴とする自動培養装置。 - 請求項11において、
前記第一排出ポート及び前記第二排出ポートは、
前記第一容器及び前記第二容器の底面に近接し、
前記培養容器を略水平に保持する状態と、傾けた状態の何れかを取るよう制御する回転制御部を含み、
該回転制御部により、前記第一容器及び前記第二容器の培地の排出において、全量または所定量を排出する
ことを特徴とする自動培養装置。 - 請求項13において、
細胞播種時は、前記細胞バッグ内の細胞懸濁液を送液/送気機構により、前記第一供給ポート及び前記第二供給ポートの何れか一方から前記培養容器の前記第一容器または前記第二容器へ供給し、
同時に、前記細胞懸濁液を供給していない前記第一供給ポート若しくは前記第二供給ポートから前記培養容器外へ気体を排出する
ことを特徴とする自動培養装置。 - 請求項13において、
前記培地交換時は、前記培地バッグ内の培地を前記流体移動制御機構部により、前記培養容器の第一容器または第二容器の前記第一供給ポートまたは第二供給ポートまで送液しつつ、送液されていない他の前記第一供給ポートまたは前記第二供給ポートから空気を排出し、
続いて培地交換を行う前記一容器または前記第二容器から、前記第一排出ポートまたは前記第二排出ポートより古い培地を排出しつつ、
送液されていない前記第一供給ポートまたは前記第二供給ポートから空気を排出し、
最後に送液された前記第一供給ポートまたは前記第二供給ポートから前記培地を前記第一容器または前記第二容器へ供給しつつ、送液されていない前記第一供給ポートまたは前記第二供給ポートから空気を排出する
ことを特徴とする自動培養装置。
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