JPWO2016157322A1 - 閉鎖系培養容器、輸送方法、及び自動培養装置 - Google Patents

Abstract

培養時において無菌性を維持した培養を実現すると共に、製造後の輸送時において発生しうるシアストレスの低減を可能とする閉鎖系培養容器を提供する。閉鎖系培養容器２０１は、第１容器３０１の内部にインサート容器からなる第２容器３０２を保持し、閉鎖系培養容器２０１の蓋部３０３は、第１容器３０１と共に閉鎖された空間を形成し、且つ、第２容器３０２の全外周と接触する凸部３０５を有する。輸送中は第２容器３０２内に輸送用培地を充填した状態で輸送する。

Description

本発明は、自動培養装置により細胞又は組織を自動操作により培養し、培養後に輸送する閉鎖系培養容器に関する。

細胞を原料とし製造した再生組織を用い臓器等の機能を回復させる再生医療は、従来治療法のなかった疾病に対する根治療法として期待される。治療対象は皮膚、角膜、食道、心臓、骨、軟骨等と多岐に渡り、その臨床応用例も急増している。再生組織の製造工程では、細胞処理施設(CPC：Cell Processing Center)において患者自身又は他者から採取した生体試料を分離・精製し、増幅・組織化等の加工を行う。CPCの運用には多大なコストと専門の培養技術を有した人材を必要とし、加えて製造工程は手作業を中心とするため、製造量の増加には限界がある。低生産性と製造コスト高が再生医療の普及の妨げとなっており、製造工程の中で特に労力とコストを要する培養作業の自動化が求められている。培養作業の自動化により省力化、コストダウン、大量生産が可能となる。

自動培養装置の例として、閉鎖空間を有した閉鎖系培養容器を自動で取り扱う装置がある。閉鎖系培養容器は培養時において流路チューブ等が常時接続された状態であり、培養空間の閉鎖性を維持した状態のまま細胞播種、培地交換、顕微鏡観察等を自動で実施する。これにより生物学的汚染リスクが低減する利点を得る。製造後の再生組織は、移植を行う手術室まで輸送する。この時、再生組織の品質を維持した状態で輸送する必要がある。

自動培養装置に用いる閉鎖系培養容器の一例が特許文献１に開示されている。ここでの閉鎖系培養容器は二層の培養槽を有し、培地等を供給または排出する流路チューブ等が常時連結している。また特許文献２においては、製造後の再生組織をキャリア内に収容し、キャリアを包装容器内に固定することで、輸送中に再生組織が包装容器内を移動しないようにし、結果として再生組織に対する輸送中のダメージの回避が可能である。

ＷＯ１２／００８３６８ 特開２００７−１１９０３３号公報

特許文献１が示す通り、自動培養装置内で閉鎖系培養容器を用いた再生組織の製造が既に実現されている。細胞種に応じ培養槽の層数を選択することにより、種々の再生組織を製造可能である。また閉鎖系の培養容器を使用しているため、培養時における無菌性の維持が可能である。一方、特許文献２が示す通り、製造した再生組織を輸送用容器内に収容し、再生組織を輸送用培地に満たした状態で輸送することが既に実現されている。輸送用培地に満たされた状態で、かつ、輸送中の温度を最適な値に維持することにより、再生組織の品質を維持可能である。

しかしながら自動培養装置による製造後、再生組織を製造時と異なる容器内へ移し替える作業を実施することは、再生組織が製造時に有していた清浄性が失われる危険性を有する。加えて輸送時において、再生組織を収容した輸送用容器は振動及び衝撃を受けることとなるが、内部において輸送用培地が撹拌され再生組織に対しシアストレスが生じ、輸送後の再生組織の品質が低下する危険性がある。

一方、輸送用培地を満たし液相のみとし輸送した場合、シアストレスの低減は可能であるが、輸送後に輸送用容器から再生組織を取り出す際、輸送用容器外に輸送用培地が漏出する可能性がある。製造はCPC内でなされるため清浄な環境下で取り扱われるが、輸送時は清浄性の管理されていない環境を通過する。よって輸送後の輸送用容器の外側は非清浄である。前述のように仮に再生組織の取り出し時に輸送用培地が漏出すると、輸送用培地を介した非清浄な輸送用容器の外側との接触により、再生組織が生物学的に汚染される危険性を有する。

本発明の目的は、このような課題を解決し、清浄性を維持し、輸送中に発生しうるシアストレスの抑制を可能とする閉鎖系培養容器、その輸送方法、及び自動培養装置を提供することにある。

上記の目的を達成するため、本発明においては、細胞を保持する閉鎖系培養容器であって、第１容器と、第１容器内に設置され、開口と第１容器側と連結する多孔性膜を有する第２容器と、第１容器を封止する蓋部とを備え、蓋部は、第１容器と共に閉鎖された空間を形成し、且つ、蓋部は第２容器の開口と全周で接触しており、第２容器内に保持される液体が第１容器内へ移動することを抑制して、第２容器内に液体の保持を可能とする閉鎖系培養容器を構成する。

また、上記の目的を達成するため、本発明においては、細胞を保持する閉鎖系培養容器であって、第１の半開放空間と、第１の半開放空間に囲われるように配置された第２の半開放空間と、第１の半開放空間を封止する蓋部とを備え、蓋部は第１の半開放空間と閉鎖された空間を形成し、蓋部は第２の半開放空間の開口と全周において接触し、第２の半開放空間内に保持した液体は、第２の半開放空間を囲む第１の半開放空間内へ移動することが、蓋部と第２の半開放空間の開口との接触により抑制され、第２の半開放空間内に液体の保持を可能とする閉鎖系培養容器を構成する。

更に、上記の目的を達成するため、本発明においては、細胞を保持する閉鎖系培養容器の輸送方法であって、閉鎖系培養容器は、第１容器と、第１容器内に設置され、開口と第１容器側と連結する多孔性膜を有する第２容器と、第１容器を封止する蓋部とを備え、蓋部は、液体或いは気体の送液或いは送気を第１容器及び第２容器に行うコネクタ部と、第２容器の開口と接触する凸部を有し、凸部は第１容器と第２容器との間の微小な孔を備え、蓋部は第１容器と共に閉鎖された空間を形成し、蓋部は第２容器の開口と全周で接触しており、第２容器内に保持される液体が第１容器内へ移動することを抑制して、第２容器内に液体の保持を可能とし、第２容器内に微小な孔の高さまで輸送用培地を供給し、コネクタ部に連結した流路チューブを閉鎖後に輸送を行う閉鎖系培養容器の輸送方法を構成する。

また更に、上記の目的を達成するため、本発明においては、細胞を培養する自動培養装置であって、培養に必要な液体或いは気体を保持する保持部と、保持部から供給される液体或いは気体を保持する閉鎖系培養容器と、保持部と閉鎖系培養容器とを接続する複数の流路を備える流路部と、流路部を制御し、液体或いは気体を保持部から閉鎖系培養容器に供給又は排出するよう制御する制御部と、を備え、閉鎖系培養容器は、第１容器と、第１容器内に設置され、開口と第１容器側と連結する多孔性膜を有する第２容器と、第１容器を封止する蓋部とを備え、蓋部は、液体或いは気体の供給或いは排出を第１容器及び第２容器に行うコネクタ部を有し、蓋部は第１容器と共に閉鎖された空間を形成し、且つ、蓋部は第２容器の開口と全周で接触しており、第２容器内に供給、保持される液体が第１容器内へ移動することを抑制して、第２容器内に液体の保持を可能とする、
ことを特徴とする自動培養装置を構成する。

本発明によれば、清浄性を維持し、輸送中に発生しうるシアストレスの抑制を可能とする閉鎖系培養容器、その輸送方法、及び自動培養装置を提供することができる。

実施例１に係る、自動培養装置の一構成例を示す図。 実施例１に係る、閉鎖系培養容器を含む流路回路の一例を示す図。 実施例１に係る、閉鎖系培養容器の一構成例を示す図。 実施例１に係る、閉鎖系培養容器の一構成例を示す図。 実施例１に係る、培養時、輸送時、再生組織取り出し時の閉鎖系培養容器を示す図。 実施例１に係る、培養時、輸送時、再生組織取り出し時の閉鎖系培養容器を示す図。 実施例１に係る、培養時、輸送時、再生組織取り出し時の閉鎖系培養容器を示す図。 実施例１に係る、培養時、輸送時、再生組織取り出し時の閉鎖系培養容器を示す図。 実施例１に係る、培養時、輸送時、再生組織取り出し時の閉鎖系培養容器を示す図。 実施例１に係る、培養時、輸送時、再生組織取り出し時の閉鎖系培養容器を示す図。 実施例１に係る、自動培養装置の制御機構の一例を示す図。 実施例１に係る、自動培養装置の稼働時の処理フローを示す図。 実施例２に係る、閉鎖系培養容器の一構成例を示す図。 実施例２に係る、閉鎖系培養容器の他の構成例を示す図。 実施例２に係る、閉鎖系培養容器の他の構成例を示す図。 実施例２に係る、閉鎖系培養容器の他の構成例を示す図。 実施例３に係る、手培養後にインサート容器を移動させ輸送するための一構成例を示す図。 実施例３に係る、手培養後にインサート容器を移動させ輸送するための他の構成例を示す図。 実施例４に係る、手培養後にインサート容器を移動させずに輸送する構成例を示す図。 実施例６に係る、被覆部材を用いる閉鎖系培養容器の一構成例を示す図。 実施例６に係る、被覆部材を用いる閉鎖系培養容器の他の構成例を示す図。 実施例７に係る、培養皿を用いる閉鎖系培養容器の一構成例を示す図。

以下、図面に従い本発明の種々の実施例を説明する。

実施例１は、培養時に無菌性を維持し、輸送時にシアストレス低減、清浄性維持が可能な閉鎖系培養容器、輸送方法、並びに自動培養装置の実施例である。本実施例の閉鎖系培養容器は、第１容器と、第１容器内に設置され、開口と第１容器側と連結する多孔性膜を有する第２容器と、第１容器を封止する蓋部とを備え、蓋部は第１容器と共に閉鎖された空間を形成し、且つ蓋部は第２容器の開口と全周で接触しており、また、蓋部は培養に必要な液体或いは気体の送液或いは送気を第１容器及び第２容器に行うコネクタ部と、第２容器の開口と接触する凸部を有し、更に凸部は、第１容器と第２容器との間の微小な孔を備えており、第２容器内に保持される液体が第１容器内へ移動することを抑制して、第２容器内に液体の保持を可能とすることができる。

まず、図１を用い、閉鎖系培養容器を用い自動で培養を行う本実施例の自動培養装置の構成要素を説明する。自動培養装置は、培養温度である３７℃にて細胞を培養する空間であるインキュベータ１０３、インキュベータ１０３に設置された培養容器部１００、顕微鏡１０８、細胞ボトル１１２、細胞や培地を送液する送液機構１１７を有する流路部１１６、内部に培地の入った培地ボトル１１３及び培養上清を回収する培養上清バッグ１１４を保管する冷蔵庫１１５、培養容器部１００内の閉鎖系培養容器１０１へ５％Ｃ２を含む空気等を供給する気体供給部１０５、電源ボックスを含み、自動培養装置を制御する制御部１０２、制御用端末１１０等から成る。

培養容器部１００内の閉鎖系培養容器１０１の個数は１個でも複数個でも良い。また閉鎖系培養容器１０１は、流路部１１６中の流路チューブ等を介し、細胞ボトル１１２、培地ボトル１１３、培養上清バッグ１１４等と常時連結している。なお、本明細書において、細胞ボトル１１２、培地ボトル１１３、更には培養上清バッグ１１４を総称して保持部と呼ぶ場合がある。閉鎖系培養容器１０１内の細胞は顕微鏡１０８により適宜観察する。流路部１１６の送液機構１１７は、閉鎖系培養容器１０１に対し、培地等を送液する電磁弁、チューブポンプ等の駆動系を構成する。

この自動培養装置は、閉鎖系培養容器１０１への細胞懸濁液の送液による細胞播種、温度及び気体環境等を維持する培養、古い培地を排出し新しい培地を供給する培地交換、顕微鏡による細胞観察等を実施する。自動培養装置の実施する工程を本例では細胞播種、培地交換、培養、顕微鏡観察としたが、一部の工程を手作業により代替しても適用可能であることは云うまでもない。

図２により、本実施例の閉鎖系培養容器を用い自動培養装置にて再生組織を製造する場合の流路回路の一例を示す。この流路回路は、図１の閉鎖系培養容器１０１に対応し、後で詳述される閉鎖系培養容器２０１への培地の供給または排出に関する送液を制御する送液制御手段を備える。閉鎖系培養容器２０１内へ直接送気する場合は、送気制御手段も備える。閉鎖系培養容器２０１の一部を気体透過膜とする等の構成とする場合、気体透過膜を介し気体を送気することとなるが、その場合はインキュベータが送気手段となる。本例では前者を示している。また本例では図１の細胞ボトル１１２に対応する細胞ボトル２０５を２個使用するが、これはフィーダーレイヤー法による上皮系細胞の培養を例としているためである。また本図では閉鎖系培養容器２０１が１個の場合を示しているが、図１に示したように閉鎖系培養容器を並列的に配置することにより同時に複数個の閉鎖系培養容器に対する自動培養が可能である。

図２に示すように、閉鎖系培養容器２０１は二層構造であり、また各層において供給及び排出がなされるため、1個の閉鎖系培養容器につき４本の流路チューブ２１５が接続されている。流路チューブ２１５の開閉は、流路チューブの外部から作用する電磁弁２０２の稼働により制御される。また流路チューブ内の液体及び気体の駆動は、ポンプ２０３の稼働により制御される。使用するポンプは、例えばローラポンプである。また流路回路にはフィルタ２０４が設置され、流路外から気体を取り込み流路内の気圧を調整する。フィルタ２０４は、例えば０．２２μｍ以上の粒子を通さない品質のものを使用する。

本実施例では細胞ボトル２０５を２本使用し、片方には例えば培養目的とする上皮系細胞、もう片方には例えばフィーダー細胞が培地に懸濁された状態で保持されている。図１の冷蔵庫１１５に対応する冷蔵庫２０６内には、同じく培地ボトル１１３に対応する、培地を保持した培地ボトル２０７が設置され、細胞培養時には培地は予熱機構２０８にて予熱した後、閉鎖系培養容器２０１へ送液する。

気体供給部２０９は、例えば最適濃度で加圧された炭酸気体が充填されたガスボンベである。気体供給部２０９の下流には、気体供給部２０９から送気した気体を最適湿度まで加湿する加湿ボトル２１０を設置する。気体供給部２０９及び加湿ボトル２１０は、培養中の培地のpH値が変化することを回避する定期的な気体交換の実施と、その際における培地からの水分の蒸発による培地成分の濃縮防止を目的としている。

閉鎖系培養容器２０１の下流には、培地交換後の培養上清を回収するための培養上清バッグ２１１が設置される。この培養上清バッグ２１１は、図１の培養上清バッグ１１４同様、冷蔵庫２０６内に設置することができる。また、本図では示していないが、培養上清バッグ２１１と並行した位置に培養上清回収バッグを設置し、培養途中において培養上清を無菌的に回収し、培地成分分析により培養状況の正常性を確認しても良い。

閉鎖系培養容器２０１を設置したステージ２１２の下方には、顕微観察ユニット２１３が配置されている。閉鎖系培養容器の上方には顕微観察ユニット２１３の一部である照射光部２１４が配置されている。この顕微観察ユニット２１３、照射光部２１４が図１の顕微鏡１０８に対応している。また、ステージ２１２は顕微観察ユニット２１３の有する上下駆動装置により、閉鎖系培養容器２０１内における観察場所を変更することが可能である。

以上の構成を用い、細胞ボトルから閉鎖系培養容器の各層まで細胞懸濁液の送液を行い、細胞を播種する。その後、細胞種に応じた適切な頻度で培地交換、気体交換を実施する。培養途中、あらかじめ定めたスケジュールに従い顕微鏡観察を行い、細胞の生育状況を確認する。必要に応じ、培地交換後に回収した培養上清を用い、代謝等の評価を行う。以上のプロセスを経て、最終的に再生組織を得る。

図３を用い、本実施例の閉鎖系培養容器の基本的な構成要素を説明する。閉鎖系培養容器は内部に生体試料である細胞、再生組織を保持する。よって培養前に滅菌処理により無菌化する。例えば素材をポリスチレンとする場合、使用前にγ線照射またはエチレンオキシダイドガス処理による滅菌操作を施すことによる無菌化が可能である。上記ではポリスチレンを例としたが、生体試料にとって有害ではない素材で滅菌が可能であれば適用可能であることは云うまでもない。また有害物質等を発することのない医療用途の品質のものが好ましい。

図３Ａの模式図が示すように閉鎖系培養容器２０１は二層構造であり、主に第１容器３０１、第２容器３０２、蓋部３０３から成る。第１容器３０１の上部の周囲には、蓋部３０３によって密封するためのパッキング部３０９が形成されている。第２容器３０２は開口部を有した容器であり、例えば手培養での細胞培養において一般に使用されるインサート容器である。閉鎖系培養容器２０１は、流路チューブ２１５と接続可能なコネクタ部３０４を除き閉鎖空間を形成する。これにより、例えばフィーダー細胞を用いた上皮系細胞に対する二層培養を可能とする。自動培養時、閉鎖系培養容器２０１は流路チューブ２１５を介し、図２で説明した流路回路に常時接続している。流路チューブ２１５はコネクタ部３０４に取り付ける。先に述べたように二層培養であるため、片方の層につき供給用及び排出用のコネクタ部を設置し、よって計４個のコネクタ部３０４を有する。

図３Ｂは蓋部３０３の裏側を示している。蓋部３０３の凸部３０５と４個のコネクタ部３０４を示している。凸部３０５の一部は、第１容器３０１と第２容器３０２の一部を挟み込むことにより、第1容器３０１の培養表面３０６と、第２容器３０２の培養表面３０７を平行に維持可能である。尚、本実施例の構成において、培養表面３０７は、第１容器側と第２容器側を連結する孔を有する多孔性膜である。例えば、培養表面３０６で培養するフィーダー細胞が放出する成長因子は、多孔性膜である培養表面３０７の孔を通り、培養表面３０７上で培養する上皮系細胞まで到達し、それを用い上皮系細胞は増殖等の生育をする。

また凸部３０５は、閉鎖系培養容器２０１を組み上げた状態において、第１容器３０１と第２容器３０２の間で気体の移動を可能とする微小な孔３０８を有する。この凸部３０５に形成される微小な孔３０８は、常圧下での気体移動において圧力損失が生じない程度の大きさであればよく、例えば凸部３０５に形成された幅1μm、深さ1μmのものが一例として挙げられる。径が略１μmから数１０μm程度で圧力損失を生じることをなくすることができる。

さらに、凸部３０５の一部は、第２容器３０２の開口部の全外周と接触する。これにより第２容器３０２と蓋部３０３とにより、多孔性膜である培養表面３０７の孔と、凸部３０５が有する微小な孔３０８以外を除き、気体等の移動を不可とする空間を形成する。詳細は後述するが、この空間内に輸送用培地等の液体を保持した場合、第２容器３０２内に長時間にわたり液体の保持を可能とする。

図４Ａ〜図４Ｆを用い本実施例の閉鎖系培養容器２０１の各工程における運用形態を説明する。図４Ａは自動培養装置に閉鎖系培養容器が設置され、細胞を自動培養する際の状態を示している。なお、４０１は上皮系細胞を、４０２はフィーダー細胞を示している。図２で示した流路回路により、細胞播種、培地交換、気体交換を実施する。また適宜、閉鎖系培養容器の外部から顕微鏡等の光学的手段により細胞を観察する。よって閉鎖系培養容器、特に第1容器３０１は、観察の支障とならない光学的性質、例えば透明性、円滑性等を有する。

図４Ｂは自動培養後、輸送前の準備としてインサート容器である第２容器３０２内に輸送用培地４０３を充填した状態を示している。輸送用培地４０３は、培養時と同じ培地、PBS溶液、生理食塩水等である。再生組織の種類、輸送時間等に応じ選択する。また輸送用培地の量について、まずインサート容器である第２容器３０２内の充填量に関しては、図３Ａ、図３Ｂにおいて説明した孔３０８の下端が、充填可能な最大の高さとなる。それ以上輸送用培地を充填しようとしても、孔３０８から第1容器３０１内に輸送用培地が漏出することとなる。インサート容器内の充填量は、多ければ多い程、インサート容器と閉鎖系培養容器２０１の蓋部３０３が形成する空間における液相の割合が高くなる。輸送時、細胞に対し発生しうるシアストレスは、輸送用培地の撹拌の程度により決定される。前述した充填量が多い程、輸送用培地の撹拌の程度は下がり、結果として細胞に対し発生するシアストレスも低下する。インサート容器外、つまり第1容器３０１内の充填量に関しては、原則として第1容器３０１内に気相があることが必要である。それを踏まえ、再生組織の種類、輸送時間等に応じ選択する。輸送用培地が多い程、再生組織を構成する細胞に対する栄養分が豊富となるため好ましい。また、後述するように、輸送時間が長くなると液面が移動しシアストレスの低減効果が下がるため、移動後の液面高さも考慮し決定する。シアストレスの低減効果の低下は、第1容器３０１内の輸送用培地が多い程、低下幅は小さくなる。

以下、逆に、第１容器３０１内に充填する培地の量が、少ない程に利点が得られる点について説明する。自動培養装置の稼働により輸送用培地を充填することとなるが、図２の流路回路にて示した通り、輸送用培地の充填には細胞に適した気体を用いることとなる。結果として、輸送時の閉鎖系培養容器２０１の内部には、その気体が充填されている。この気体は例えば５％のＣＯ２を含む空気である。或いは、輸送用培地を充填する時のみ、酸素濃度をより高くした気体を用いても良い。これにより、輸送時において、輸送用培地のpHの維持と、細胞が代謝活動に用いる酸素の確保が可能となる。この利点は、自動培養装置を用いずに閉鎖系培養容器２０１を安全キャビネット等にて開封し輸送用培地を充填する場合と比較すると、この場合は気相が大気となりpHがアルカリ側へ変動しうる点、酸素濃度は約20%である点において、優れるものである。よって第１容器３０１内に充填する培地の量は、少ない程、充填時に使用する気体の量も増え、結果として輸送中の輸送用培地のpH維持、酸素供給に利点を得る。以上を踏まえ、第1容器内の充填量は決定する。

本実施例の閉鎖系培養容器を輸送する際、第２容器に接続されたコネクタ部３０４に連結した流路チューブ２１５を切断により閉鎖後に、第１容器３１０に接続されたコネクタ部３０４より細胞に適した気体を常圧以上に送気した後、第１容器に接続されたコネクタ部３０４に連結した流路チューブ２１５を切断により閉鎖後、加圧状態で封入した細胞に適した気体により長時間にわたり細胞の状態を良好に維持することができる。すなわち、培養後、自動培養装置により閉鎖系培養容器の第２容器内に培地を充填し、且つ第1容器内は気相を有した状態とする。その状態で流路から流路チューブを無菌切断し、輸送する。輸送後の移植時は、インサート容器外の気相により閉鎖系培養容器外への培地漏出を回避しつつ、再生組織を取り出すことが可能となる。

図４Ｃは輸送する前の状態、図４Ｄは、十分に長時間にわたり輸送した後、閉鎖系培養容器２０１内で輸送用培地が移動した状態を示している。両者とも、図４Ａ及び図４Ｂにおいては流路チューブを介し自動培養装置に設置されているのに対し、図４Ｃ及び図４Ｄでは前述の流路チューブ２１５に対し、熱溶着等の手段により無菌的に切断された切断部４０４となっている。

上述の通り、インサート容器である第２容器３０２は、培養表面３０７全体の多孔性膜上に孔を有している。またインサート容器である第２容器３０２と蓋部３０３の間にも微小な孔３０８を有している。輸送中、輸送用培地への重力の作用、閉鎖系培養容器に付与される傾き、振動及び衝撃による輸送用培地の閉鎖系培養容器内での移動により、図４Ｃにおいてインサート容器内に充填した輸送用培地４０３は、インサート容器外である第1容器３０１へ徐々に移動する。具体的には、図４Ｃにおいて、インサート容器である第２容器３０２内の輸送用培地４０３の液面は、第1容器３０１内の液面よりも高いが、図４Ｄにおいては、インサート容器内及び第1容器内の液面は等しくなる。これは、特に輸送用培地４０３に対する重力の作用が原因であり、図４Ｄの状態は液面が等しくなることによりインサート容器である第２容器３０２内及び第1容器３０１内での重力の作用の大きさが等しくなったものである。但し図４Ｄは、あくまで十分に長時間にわたり輸送したと仮定した場合のものである。

現実的な輸送時間は、短時間である場合、例えば再生組織の製造を行うCPCと、再生医療治療を行う医療機関の手術室が、同一敷地内にある場合である。これは1時間以内の輸送時間である。また日本国内間で輸送を行う場合は、CPC及び医療機関が主要都市内にある場合であれば、輸送時間は半日程度である。輸送時間が長時間である場合は、海外を含めた輸送を想定することは可能だが、現実的に再生組織は細胞から構成された製品であり代謝活動等を行っているため、輸送時間がかかる程に活性が落ちる。よって輸送時間は長くとも数日程度と想定される。

よって、前述したように十分に長時間にわたり輸送した場合は図４Ｄが示す状態となりうるが、現実的な輸送時間においてはそこまでの距離を液面が移動するわけではない。理由は、輸送用培地は培養表面３０７の孔を介し移動するためである。加えて、再生組織がインサート容器内の培養表面上に接着している場合は、その培養表面３０７の孔は細胞により塞がれた状態となっているため、輸送用培地の移動を妨げることとなるためである。さらに、図４Ｃの状態から液面が移動した場合においても、輸送時間の大半の時間においてインサート容器である第２容器３０２内には輸送用培地が充填された状態であり、シアストレスの低減効果は徐々に低下するものの、シアストレスは低減していることには変わりない。取り出し時においては、図４Ｄにおいても第1容器３０１内に気相は必ず存在している状態であるため、この点の効果は変化ない。

図４Ｅは、現実的な時間で輸送後、閉鎖系培養容器２０１の蓋部３０３を取り外した状態である。図４Ｆは、閉鎖系培養容器の第1容器３０１内からインサート容器である第２容器３０２を取り出した状態である。仮に輸送後の状態が図４Ｄのようになったとしても、図４Ｅが示す通り、第1容器３０１内の輸送用培地の液面は、第1容器３０１の上端より低い。よって図４Ｆが示すようにインサート容器である第２容器３０２を取り出す際、仮にインサート容器から輸送用培地がこぼれ出ても、第1容器３０１内に、こぼれた分の輸送用培地４０３は収容されるため、非清浄な閉鎖系培養容器２０１の外周と輸送用培地が接することを回避可能である。結果として清浄性を維持したままインサート容器である第２容器３０２を取り出すことが可能である。またインサート容器を取り出す際、インサート容器内の輸送用培地の一部を、インサート容器を傾ける等の操作により移動させても良い。これにより、取り出したインサート容器は、内部に保持する輸送用培地が少ない状態でハンドリングできるため、ハンドリング時に輸送用培地がこぼれ出る危険性の回避も可能である。別の運用として、インサート容器を取り出さず、再生組織のみを取り出しても良い。

尚、輸送後において、受入検査を実施しても良い。前述した通り、自動培養時において閉鎖系培養容器２０１の外部から顕微鏡等の光学的手段により細胞の観察が可能である。よって輸送後、同様の手段により細胞を観察し、輸送後の状態を確認する。閉鎖系培養容器が閉鎖性を維持したまま観察することが可能であるため、再生組織が生物学的に汚染される危険性を排除可能である。

図５は本実施例の閉鎖系培養容器５０１を含む自動培養装置の機能構成例を説明するブロック図である。制御装置５０２により制御される各構成要素が、インキュベータ１０３に対応するインキュベータ５０３の内部に配置された閉鎖系培養容器５０１に接続された全体構成図である。尚、インキュベータ５０３内に配置されるものは、前述の閉鎖系培養容器１０１、２０１、或いは自動培養装置内に設置された当該培養容器であることは言うまでもない。

図５において、制御装置５０２には、インキュベータ５０３の温度を制御するための温度調節部５０４と、閉鎖系培養容器内の気体濃度を制御するための、気体供給部５０５を有する気体濃度調節部５０６と、閉鎖系培養容器２０１内の培地を自動で交換するための流路回路に設置されたポンプ５０７と、それぞれの構成要素の動作を制御することを目的とした細胞観察用の顕微鏡１０８に対応する顕微鏡５０８、ＣＯ２・Ｏ２センサ５０９が接続されている。

制御部１０２に対応する制御装置５０２と、制御用端末１１０の表示画面５１０は、ＣＰＵ（Central Processing Unit；中央処理部）から成る処理部、記憶部や、ディスプレイ、キーボードから成る入出力部等を備えた通常のコンピュータの、処理部および記憶部とディスプレイの表示部にそれぞれ対応している。制御装置５０２は、記憶部で記憶された各種プログラムを、処理部としてのＣＰＵ上で動作させる。これにより、温度調整部５０４、気体供給部５０５、ポンプ５０７、顕微鏡５０８、ＣＯ２・Ｏ２センサ５０９、気体濃度調整部５０６、細胞ボトル・培地ボトル・培養上清バッグ５１２により、インキュベータ５０３中の培養環境を制御し、閉鎖系培養容器５０１中での所定の培養工程の実施を可能とする。

気体濃度調節部５０６は、閉鎖系培養容器５０１に直接接続されている必要はない。温度調節部５０４、気体濃度調節部５０６と、ＣＯ２・Ｏ２センサ５０９がインキュベータ５０３に接続された構成でも構わない。この構成の場合、閉鎖系培養容器５０１へは容器外から気体を供給する必要があるため、閉鎖系培養容器５０１の蓋部の一部に、ＰＣ、ＰＳ、ポリメチルペンテン等の気体透過性を有した透明な薄膜を溶着し、閉鎖系培養容器５０１内部の気体交換を可能とすることで細胞培養を可能とすることができる。

次に図６を用いて、以上の機能を有する閉鎖系培養容器を含む自動培養装置を用い、再生組織を製造し、製造後に輸送する時の一連の手順を示す。

＜ステップＳ１：スタート＞
事前に閉鎖系培養容器を含む流路を自動培養装置に設置する。流路は閉鎖系培養容器、細胞懸濁液の入った細胞ボトル、培地の入った培地ボトル、培養上清を回収する培養上清バッグ等と、それらをつなぐ流路チューブから成る。流路を設置後、設置正常性を確認する。

続いて自動培養装置を起動させる。作業者が制御装置にある操作部のスタートスイッチを押し起動する。尚、装置内はあらかじめ消毒或いは除菌の実施により清浄な環境となっている。続いて制御部のディスプレイの操作画面にて自動培養装置の内部環境が適切であることを確認する。例えばインキュベータの温度が３７℃であることを確認する。これらの数値は限定的なものでなく、例えば温度は０℃から４５℃の範囲より選択可能である。

＜ステップＳ２：スケジュール決定＞
自動培養装置の実施する自動培養スケジュールを決定する。細胞播種、培地交換、培養上清回収、気体交換、顕微鏡観察、検査用組織回収、移植用組織回収等の操作を行う日時、液量等の条件を制御部の操作部より入力する。

＜ステップＳ３：細胞播種＞
適切な電磁弁を開閉後、ポンプを作動させ細胞ボトルより細胞懸濁液を吸引する。細胞懸濁液を閉鎖系培養容器まで送液する。全ての閉鎖系培養容器に対し播種終了後、閉鎖系培養容器を設置する培養容器ベースに取り付けたアクチュエータを作動させ培養容器ベースへ傾きを与え揺動し細胞分布を一様化する。

＜ステップＳ４：細胞の培養＞
細胞播種直後、各培養容器の内部へ所定量の気体を送気する気体交換を行う。気体交換は培養期間中、１日に数回程度の頻度でも実施する。供給する気体は例としてＣＯ２濃度５％を含む空気を用いる。気体は各閉鎖系培養容器へガスボンベから気体フロメータにより流量を制御し加湿ボトルを通し、水分子を飽和させた状態で供給する。閉鎖系培養容器へ送気後の不要な気体はフィルタを介し流路外へ排出する。フィルタは必要に応じ流路内の圧力を調整する。フィルタは、例えば０．２２μｍ以上の粒子を通さない品質のものを使用する。

その後は閉鎖系培養容器を水平に静置した状態で所定時間、培養する。培養中はインキュベータにより３７℃に維持する。装置内の空気はファンにより常に攪拌し、温度分布が常に一様となるようにする。尚、装置にパーティクルカウンタや生菌数計測装置を取り付け、清浄度のモニタリングにより製造安全性の向上が可能である。

＜ステップＳ５：顕微鏡による観察＞
自動培養装置内に設置した顕微鏡を用い細胞画像を取得する。自動培養装置内に設置した光源を適宜発光させ、細胞に焦点を合わせ撮像する。取得した細胞画像は制御部内のデータベースに保存し、自動培養装置の制御用端末上で閲覧し細胞の状態を作業者が適宜確認する。また自動細胞撮影時以外は作業者が必要に応じ顕微鏡を手作業で操作し、細胞の観察、撮影を行う。

＜ステップＳ６：培地交換＞
培地交換は培養期間中、数日に一度の頻度で実施する。冷蔵庫内で４℃にて保管されている培地を予熱ボトルまで送液し予熱する。最初に閉鎖系培養容器から古い培地を排出する。この時、アクチュエータにより閉鎖系培養容器を傾け排出効率を向上させる。排出後、速やかに新しい培地を閉鎖系培養容器内へ供給する。古い培地は最終的に培養上清バッグへ排出する。必要に応じ培養上清バッグ内の培養上清を回収し、培地成分分析により細胞の生育状態を評価する。尚、培地交換は古い培地が入った状態で新しい培地を押し出す方式により実施しても構わない。

＜ステップＳ７：検査用組織の回収＞
移植予定日の前日、複数個の閉鎖系培養容器を同時培養している場合は、閉鎖系培養容器の一部を検査用に回収する。自動培養装置の扉を開け、検査用の閉鎖系培養容器の流路チューブを熱溶着等の手段により無菌切断し取り出す。取り外した閉鎖系培養容器は安全キャビネット又はCPC外へ輸送し、速やかに検査を実施する。例えば生体試料の細胞数、生存率、特定タンパク質の発現等を評価する。

＜ステップＳ８：移植直前の培養及び培地交換＞
ステップＳ４と同じ操作による培養を行う。そしてステップＳ９を実施する直前に、ステップＳ６と同じ操作による培地交換を行う。必要に応じステップＳ５と同じ操作による顕微鏡観察も実施する。

＜ステップＳ９：移植用組織の回収及び輸送＞
ステップＳ７による評価の結果、移植に適した状態と判定した場合、生体試料を回収し再生医療治療に用いる。ステップＳ６と同じ操作により、輸送用培地への培地交換を行う。この時、インサート容器内に十分量の輸送用培地が充填されるようにする。輸送用培地の量は図４Ｂに示した通りである。続いてＳ７同様、閉鎖系培養容器を流路から無菌的に分離させインキュベータから取り出す。そして出荷室にて輸送容器内へ閉鎖系培養容器を収容する。輸送容器は蓄熱材または蓄冷材、気密容器、包装等から成り、輸送ルート、要する時間に応じ仕様を選択する。これにより輸送中の全行程にわたり温度、圧力、衝撃等の影響を回避する。輸送容器に閉鎖系培養容器を梱包後、CPC外へ運び出す。必要に応じ車両、鉄道、航空機、手運び等の手段により手術室まで輸送する。

手術室での治療前には、必要に応じ受入検査として顕微鏡による細胞観察を行う。閉鎖系培養容器は、自動培養時に顕微虚観察が可能な透明性を有するため、閉鎖系培養容器内に再生組織を収容したまま、つまり清浄性を維持したまま、受入検査として再生組織の顕微鏡観察が可能である。尚、短距離輸送の場合は輸送直前と状態はほとんど変わらないことが想定されるため、作業者の判断により実施しなくともよい。

＜ステップＳ１０：移植＞
手術室へ到着後、再生組織を閉鎖系培養容器から取り出す。開封時、閉鎖系培養容器の外側は菌等の生物や粒子が付着している可能性があるため、閉鎖系培養容器内が清浄性を維持するよう無菌的に開封する。最初に閉鎖系培養容器の蓋部を取り外す。この時点において、第1容器内は気相を有した状態である。よって閉鎖系培養容器を水平状態にし蓋部を取り外せば、閉鎖系培養容器外へ輸送用培地が漏出することを回避できる。また第1容器内からインサート容器を取り出す場合、インサート容器の外側である第1容器内の気相により、同じく閉鎖系培養容器外への輸送用培地の漏出を回避できる。或いは、インサート容器内に満たされた輸送用培地を、インサート容器を取り出す際に、事前にインサート容器から第1培養容器へインサート容器を傾けることで移動させる。これによりインサート容器内の輸送用培地量が少ない状態で閉鎖系培養容器外でハンドリングすることが可能となる。その後、インサート容器から再生組織を取り出す。別の方法として、閉鎖系培養容器内にインサート容器が収容されたまま、インサート容器から直接再生組織を取り出す。

＜ステップＳ１１：終了＞
再生組織を取り出した後の閉鎖系培養容器は、医療用廃棄物として適切に廃棄する。自動培養装置は、培養に用いた流路を取り外し、装置内部への適切な操作により、滅菌ガスによる滅菌或いはエタノールによる消毒を施し清浄状態にする。自動培養装置の各種ソフトを終了させ、自動培養装置の作動を終了させる。
以上のように構成された閉鎖系培養容器を含む自動培養装置の好適な実施形態によれば、培養時において無菌性を維持した培養を実現すると共に、製造後の輸送時においてシアストレスによる細胞への影響の回避と、閉鎖系培養容器の内部の清浄性維持が可能となる。結果として再生医療治療を安全に実施することができる。

図７Ａ〜図７Ｄに実施例１とは異なる閉鎖系培養容器の蓋部の実施例を示す。本実施例においては、図示の都合上、微小な孔７０６を備える凸部７０５を、実施例１の図３Ａ、図３Ｂ等に対し左右反転した位置に示すとともに、コネクタ部の図示は省略してある。図７Ａは蓋部の凸部７０５に対し飛沫防止壁７０１を設けたものである。輸送後の再生組織の取り出し時において、蓋部を取り外す際、インサート容器の内部から輸送用培地の飛沫が飛散することを回避する目的のものである。これにより輸送後の再生組織の取り出し時における清浄性の確保をより向上させることが可能である。

図７Ｂは蓋部に対し移動抑制凸部７０２を設けたものである。再生組織の種類によっては、自動培養装置による製造後において、培養表面に接着していないもの、或いは強固に接着していないものがある。例として軟骨再生が挙げられる。こういったものを輸送する場合、再生組織への重力の作用、閉鎖系培養容器に付与される傾き、振動、衝撃により、インサート容器及び蓋部が形成する空間内で再生組織が移動し、インサート容器或いは蓋部の内壁に衝突し、結果として再生組織が損傷を受け品質が低下する危険性がある。それを回避するため、移動抑制凸部７０２を設け、輸送時に再生組織が移動することを抑制することが目的である。本図では移動抑制凸部７０２は細長い形状の凸部を複数設置した例を示したが、他の例としてこれらを束ねたような太い形状の凸部を１つ設置する等も含まれる。

図７Ｃは、凸部７０５に設置する微小な孔の代わりに、蓋部に対し微小な貫通孔７０３を設けたものである。実施例１にて前述した通り、インサート容器である第２容器内に充填可能な最大の高さは、図３Ａ、図３Ｂにおいて示した微小な孔３０８の下端である。それ以上輸送用培地を充填しようとしても、微小な孔３０８から第1容器３０１内に輸送用培地が漏出することとなる。よって図７Ｃが示すように、蓋部の内部を通る微小な貫通孔７０３を設ける。これによりインサート容器内に充填可能な最大の高さは、蓋部のインサート容器内の部分の下端となる。後述する図７Ｄは、閉鎖系培養容器自体の高さを大きくすることにより輸送用培地の充填量を増やすこととなるが、図７Ｃで示した実施例は、閉鎖系培養容器自体の高さを実施例１と同じくしたまま、輸送用培地の充填量を増やすものである。よって輸送容器内への収容において、閉鎖系培養容器自体の高さは変わらないため、積載率も同じとなる利点を得る。

図７Ｄは蓋部に対し培地追加充填部７０４を設けたものである。図７Ｃと同じく、輸送用培地の充填量を増やすことを目的としている。さらに、輸送用培地を充填後の液面は、インサート容器である第２容器及び蓋部が形成する空間内において上方に位置し、再生組織が設置されているインサート容器の培養表面からの距離は、他の実施例と比べ、大きい。輸送時における輸送用培地の撹拌は小さくなるため、結果として再生組織に対し生じうるシアストレスもより小さくなる。一方、図７Ｃで説明したように他の実施例にくらべ閉鎖系培養容器自体の高さが大きくなるため、輸送容器への積載率が低下することとなる。

図８Ａ、図８Ｂに、実施例１、２とは異なる、閉鎖系培養容器の他の実施例を示す。本実施例３は、細胞を保持する閉鎖系培養容器であって、第１容器と、第１容器内に設置され、開口と第１容器側と連結する多孔性膜を有する第２容器と、第１容器を封止する蓋部とを備え、蓋部は、第１容器と共に閉鎖された空間を形成し、且つ、蓋部は第２容器の開口と全周で接触しており、第２容器内に保持される液体が第１容器内へ移動することを抑制して、第２容器内に液体の保持を可能とする閉鎖系培養容器の実施例である。実施例１、２の図３Ａ、図３Ｂ等で示したものに比べ、コネクタ部３０４と孔３０８、７０３、７０６を有さない点のみが異なり、他は同一である。手作業での培養において一般に使用される６wellプレート及びインサート容器を用いた手作業による培養において、培養後、再生組織を内部に有したインサート容器である。

すなわち、第２容器３０２のみを、本閉鎖系培養容器内へ手作業で移動させ輸送する場合での使用を想定している。コネクタ部３０４と孔３０８は、自動培養装置による自動培養に必要な構成であるため、それらを有さないものとなっている。

６wellプレート及びインサート容器を用いた手作業による培養後、これらを安全キャビネット内へ移動させる。最初に、安全キャビネット内にて閉鎖系培養容器の蓋部３０３を外す。次に、６wellプレート内のインサート容器、すなわち第２容器３０２を、閉鎖系培養容器の第1容器３０１内に収容する。そして第２容器３０２内に、手作業で輸送用培地を満たす。最後に蓋部３０３により閉鎖系培養容器を閉鎖状態にする。この状態で実施例1と同じように輸送し、輸送後に再生組織の取り出しを行う。

実施例1と比べ異なる点は、微小な孔３０８がないため、輸送時に第２容器３０２から輸送用培地が、多孔性膜である培養表面３０７の孔を通り移動する速度は低下する。理由は、本実施例の構成にあっては、微小な孔３０８がないため、第２容器３０２内の液面が低下するにつれ第２容器３０２内に生じる気相の体積が増加し減圧状態となり、第２容器３０２内の輸送用培地に作用する重力の作用に抗うこととなるためである。別の異なる点として、コネクタ部３０４を有さないため、閉鎖系培養容器はより平坦となる。結果として、輸送時に閉鎖系培養容器をより集積した状態で運ぶことが可能となる。また、輸送容器内において蓄熱材または蓄冷材との接触効率を上げることが容易となり、閉鎖系培養容器内の温度維持がより良好となる。尚、本実施例において、実施例２において示した蓋部の他の実施例を組み合わせることも可能である。

前述した、手作業での培養において一般に使用される６wellプレート及びインサート容器を用いた手作業後に、インサート容器のみを移動させる場合以外の使用方法について以下に述べる。インサート容器である第２培養容器３０２は、あらかじめ閉鎖系培養容器内に入れた状態としておく。手作業での培養により再生組織を製造し、再生組織のみを、あらかじめ蓋部を取り外しておいた閉鎖系培養容器内に移動させる。その後の操作は前述と同じである。さらなる別の使用方法では、再生組織の原料となる生体試料片、例えば皮膚片、口腔粘膜片等、或いは角膜移植用の角膜等を、同じくインサート容器である第2培養容器３０２があらかじめ収容された閉鎖系培養容器内に移動させる。その後の操作は前述と同じである。ここで説明した使用方法は、再生組織または生体試料のみを、閉鎖系培養容器内に移動させた後に輸送する方法となる。

図９に、実施例１とは異なる、閉鎖系培養容器の他の構成例を示す。本実施例は細胞を保持する閉鎖系培養容器であって、第１の半開放空間と、第１の半開放空間に囲まれるように配置された第２の半開放空間と、第１の半開放空間を封止して閉鎖された空間を形成する蓋部とを備え、蓋部は第２の半開放空間の開口と全周において接触し、第２の半開放空間内に保持された液体は、第２の半開放空間を囲む第１の半開放空間内へ移動することが、蓋部と第２の半開放空間の開口との接触により抑制して、第２の半開放空間内に液体の保持を可能とする構成の閉鎖系培養容器の実施例である。半開放空間とは、その上部に開口を有する閉鎖された空間を形成する構造を意味し、第１、第２の半開放空間、蓋部は、上述した実施例の第１容器、第２容器、蓋部にそれぞれ対応する。

本実施例の閉鎖系培養用域の用途は、手作業での培養により再生組織を製造し、再生組織のみを、あらかじめ蓋部を取り外しておいた閉鎖系培養容器内に移動させ輸送する場合、または、再生組織の原料となる生体試料片、例えば皮膚片、口腔粘膜片等、或いは角膜移植用の角膜等を、あらかじめ蓋部を取り外しておいた閉鎖系培養容器内に移動させ輸送する場合である。再生組織または生体試料のみを、閉鎖系培養容器内に移動させた後に輸送する方法は、他の実施例と同一である。

図９に示す通り、閉鎖系培養容器は第１の半開放空間９０１と第２の半開放空間９０２、及び蓋部３０３を有する。実施例１において示した、第1容器３０１、インサート容器である第２容器３０２が、それぞれ第1の半開放空間９０１と第２の半開放空間に対応し、蓋部３０３が本実施例の蓋部に対応している。輸送時は第２の半開放空間９０２に培地を満たした状態で輸送する。

手作業による培養後、培養に使用した培養容器等を安全キャビネット内へ移動させる。最初に、安全キャビネット内にて閉鎖系培養容器の蓋部を外す。次に、培養容器の中から再生組織を第2の半開放空間９０２に移動する。そして第2の半開放空間９０２内に、手作業で輸送用培地を満たす。最後に蓋部により閉鎖系培養容器を閉鎖状態にする。この時、輸送用培地がこぼれ出て第1の半開放空間９０１内に移動しても、蓋をした時点で第1の半開放空間９０１内に気相があれば、問題はない。蓋を取り付けた後、この状態で実施例1と同じように輸送し、輸送後に再生組織の取り出しを行う。

実施例１と比べ異なる点は、第１の半開放空間９０１と第２の半開放空間９０２を結ぶ孔等を有さない点である。よって輸送前に第２の半開放空間９０２に満たした輸送用培地は、輸送後も同じ液量を維持し続けることとなる。つまり実施例１と比べ、輸送時間を経るにつれシアストレスの低減効果が低下することはなく、一定のままである。またこの実施例の閉鎖系培養容器は、実施例１と比べ部品点数が少ない利点も得る。つまり射出成型による製造等により、製造コストの低減が可能である。尚、本実施例において、実施例２において示した蓋部の他の実施例を組み合わせることも可能である。すなわち、第１の半開放空間９０１に面する蓋部に、図７Ａに示した飛沫防止部７０１を形成したり、第２の半開放空間に面する蓋部に、図７Ｂ、図７Ｄに示す移動抑制凸部７０２や培地追加充填部７０４を形成しても良い。

本実施例の構成により、第２の半開放空間９０２内に保持した液体は、第２の半開放空間外にある第１の半開放空間９０１内へ移動することが、蓋部と第２の半開放空間９０２の開口の接触により抑制され、第２の半開放空間内に長時間にわたる液体の保持を可能とし、第２の半開放空間内に再生組織を収容し、第２の半開放空間内に培地を満たした状態で輸送し、結果として、輸送中に発生しうる振動及び衝撃による輸送用培地が撹拌されることにより再生組織に対し生じうるシアストレスを、低減することを可能とすることができる。

実施例１とは異なる、閉鎖系培養容器の運用方法を説明する。実施例１では、自動培養装置による培養後、自動培養装置の稼働により輸送用培地への置換と同時に、閉鎖系培養容器内の気相には、細胞に適した気体を充填し、最後に、流路チューブを熱溶着等の手段により無菌的に切断し、自動培養装置から取り外す。本実施例では、自動培養装置の稼働により輸送用培地への置換と同時に、閉鎖系培養容器内の気相には、細胞に適した気体を充填後、一部の流路チューブを無菌切断し、再度、細胞に適した気体を充填し、最後に残りの流路チューブを熱溶着等の手段により無菌的に切断する。先に切断する流路チューブは、細胞に適した気体の充填において、気体が供給される流路チューブ以外のものである。それらを無菌的に切断してから、その時点において無菌切断されていない流路チューブより気体を供給する。実施例１と比べ、供給側以外は閉鎖されているため、常圧以上に加圧した状態で気体を充填することが可能である。その後、残りの流路チューブを無菌切断する。これにより、実施例１に比べpH維持、酸素供給の点は良好となる。但し再生組織に対しても圧力が加わることとなり、その圧力が再生組織の品質に対し問題がない範囲において、本実施例は有効である。

図１０Ａ、図１０Ｂに実施例１とは異なる、閉鎖系培養容器の構成を示す。閉鎖系培養容器は、事前に組み立て滅菌を実施する。その製造工程において、被覆部材１００１を設置する。被覆部材１００１は、第1容器３０１と閉鎖系培養容器の蓋部３０３の境界部全周を覆うように設置する。

図３に示した通り、そもそも第1容器３０１と閉鎖系培養容器の蓋部３０３の間にはOリング等が設置され、ねじ構造等により圧着した状態で封止しているが、本実施例ではさらに、Oリングと被覆部材１００１の間に空間１００２を設ける。この空間は、自動培養装置に閉鎖系培養容器を設置する前に設けられたものであり、被覆部材１００１を取り外さない限り、空間１００２は清浄性を維持する。輸送後、手術室等の清浄な空間で被覆部材１００１を取り外すことにより、取り外した後の空間１００２は清浄なままとなる。

輸送中、閉鎖系培養容器は非清浄な空間を移動する。よって閉鎖系培養容器の外周は、製造時までは清浄であったのに対し、非清浄な状態となる。輸送後、再生組織を取り出す際、実施例１にて示したように、第1容器内に設けた気相により、第2容器内に充填した輸送用培地が、第1容器外にこぼれ出ることを回避した。本実施例では、この工程において万一第1容器外にこぼれ出たとしても、第1容器外の空間１００２は、輸送後において清浄なままであるため、再生組織が生物学的に汚染されることは回避可能となる。

図１０Ａは、第1容器３０１と閉鎖系培養容器の蓋部３０３の間に設置する被覆部材１００１が第1容器３０１の側面までを覆っている場合を示している。図１０Ｂは、コネクタ部３０４を除き閉鎖系培養容器全体を覆っている場合を示している。後者は、空間１００２を輸送後も清浄に維持するだけでなく、第1容器３０１の全面を輸送後も清浄に維持することとなる。よって前述した、輸送後の再生組織を取り出す工程において万一第1容器外にこぼれ出たとしても、第1容器外の外周全てが輸送後においても清浄なままであるため、再生組織が生物学的に汚染されることの回避はより容易となる。但しこの場合の被覆部材１００１は閉鎖系培養容器の全面を覆っているため、自動培養時において閉鎖系培養容器の外部から顕微鏡等の光学的手段により細胞を観察する際、支障とならない光学的性質、例えば透明性、円滑性等を有することが必要である。

図１１に実施例１とは異なる、閉鎖系培養容器の他の実施例の構成を示す。以上の各実施例で説明した閉鎖系培養容器の構成にあっては、例えば図３Ａ、図３Ｂに示すように、閉鎖系培養容器の第１容器は外部容器と一体的に構成されていたが、第１容器として培養皿を利用することにより、外部容器とは別構成とすることができる。図１１において、実施例７の閉鎖系培養容器１１０１は、実施例１と異なり、培養皿３１１を第１容器として用いている。そして、この第１容器である培養皿３１１は、保持部材３１３を介して外部容器３１０に保持され、補助部材３１２を介して蓋部３０３によって固定される。その他は実施例１で説明した構成と同じであり、説明を省略する。本実施例の場合、第１容器として市販の培養皿、第２容器としてインサート容器をそのまま利用することができる。本実施例の形態は、実施例１のみに係らず上述した各種の他の実施例の閉鎖系培養容器にも適用することができる。

以上説明した本発明により、無菌性を維持した自動培養を実現すると共に、自動培養後の再生組織において、培養時と同じ閉鎖性を維持したまま輸送することが可能となり、輸送時において、輸送用培地の攪拌により生じうるシアストレスの低減が可能となり、さらに移植時、清浄性を維持したまま再生組織を閉鎖系培養容器から取り出すことが可能となる。

なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明のより良い理解のために詳細に説明したのであり、必ずしも説明の全ての構成を備えるものに限定されものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることが可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。

更に、上述した各構成、機能、処理部等は、それらの一部又は全部をＣＰＵでのプログラム動作で実現する例を説明したが、それらの一部又は全部を例えば集積回路で設計する等によりハードウェアで実現しても良いことは言うまでもない。

以上本発明を詳述したが、上記の記載中には、特許請求の範囲に記載した事項のみならず、種々の発明が開示されている。その一部を列記すると次の通りである。

＜列記１＞
細胞が保持される閉鎖系培養容器であって、
第１容器と、前記第１容器内に設置され第１容器側と連結した孔を有した第２容器と、前記第１容器を封止する蓋部を有し、
前記蓋部は前記第１容器と閉鎖された空間を形成し、
前記蓋部は前記第２容器の開口と全周において接触し、
前記第２容器内に保持した液体は、前記第２容器外にある前記第１容器内へ移動することが、前記蓋部と前記第２容器の開口の接触により抑制され、
結果として前記第２容器内に長時間にわたる液体の保持を可能とすることを特徴とした閉鎖系培養容器。

＜列記２＞
細胞が保持される閉鎖系培養容器と、閉鎖系培養容器を保持する保持部材から成る閉鎖系培養容器を用いる自動培養装置であって、
閉鎖系培養容器は、第１容器と、前記第１容器内に設置され第１容器側と連結した培養表面の孔を有した第２容器と、前記第１容器を封止する蓋部と、閉鎖系培養容器と保持部材は培養に必要な液体或いは気体の送液或いは送気を行うコネクタ部を有し、
自動培養装置は、閉鎖系培養容器と、前記コネクタ部を介して液体或いは気体の送液或いは送気を制御する制御部を有し、前記蓋部は前記第１容器と閉鎖された空間を形成し、
前記蓋部は前記第２容器の開口と、第１容器側と連結した微小な孔を除き全周において接触し、
前記第２容器内に保持した液体は、前記第２容器外にある前記第１容器内へ移動することが、前記蓋部と前記第２容器の開口の接触により抑制され、
結果として前記第２容器内に長時間にわたる液体の保持を可能とし、
前記第１容器内に気相を残存させ、前記第２容器内を液体で満たすように制御することを特徴とした自動培養装置。

＜列記３＞
細胞が保持される閉鎖系培養容器と、閉鎖系培養容器を保持する保持部材から成る閉鎖系培養容器を用いる自動培養装置であって、
閉鎖系培養容器は、第１容器と、前記第１容器内に設置され第１容器側と連結した培養表面の孔を有した第２容器と、前記第１容器を封止する蓋部と、閉鎖系培養容器と保持部材は培養に必要な液体或いは気体の送液或いは送気を行うコネクタ部を有し、
自動培養装置は、閉鎖系培養容器と、前記コネクタ部を介して液体或いは気体の送液或いは送気を制御する制御部を有し、前記蓋部は前記第１容器と閉鎖された空間を形成し、
前記蓋部は前記第２容器の開口と、第１容器側と連結した微小な孔を除き全周において接触し、
前記制御部により、第１容器に接続されたコネクタ部より細胞懸濁液または培地を供給または排出されると同時に、前記第２容器内に設置された第１容器側と連結した微小な孔より、第１容器内の気体は第２容器内へ内部の圧が均等となるよう移動され、第２容器内の気体は第２容器に接続されたコネクタ部より閉鎖系培養容器の外へ移動、または、内へ移動され、結果として閉鎖系培養容器内を常圧に維持することを特徴とした自動培養装置。

＜列記４＞
細胞が保持される閉鎖系培養容器と、閉鎖系培養容器を保持する保持部材から成る閉鎖系培養容器を用いる自動培養装置であって、
閉鎖系培養容器は、第１容器と、前記第１容器内に設置され第１容器側と連結した孔を有した第２容器と、前記第１容器を封止する蓋部と、閉鎖系培養容器と保持部材は培養に必要な液体或いは気体の送液或いは送気を行うコネクタ部を有し、
自動培養装置は、閉鎖系培養容器と、前記コネクタ部を介して液体或いは気体の送液或いは送気を制御する制御部を有し、前記蓋部は前記第１容器と閉鎖された空間を形成し、
前記蓋部は前記第２容器の開口と、第１容器側と連結した微小な孔を除き全周において接触し、
前記制御部により、第２容器に接続されたコネクタ部より細胞懸濁液または培地を供給または排出されると同時に、前記第２容器内に設置された第１容器側と連結した微小な孔より、第１容器内の気体は第２容器内へ内部の圧が均等となるよう移動され、第１容器内の気体は第１容器に接続されたコネクタ部より閉鎖系培養容器の外へ移動、または、内へ移動され、結果として閉鎖系培養容器内を常圧に維持することを特徴とした自動培養装置。

＜列記５＞
細胞が保持される閉鎖系培養容器と、閉鎖系培養容器を保持する保持部材から成る閉鎖系培養容器を用いる自動培養装置であって、
閉鎖系培養容器は、第１容器と、前記第１容器内に設置され第１容器側と連結した孔を有した第２容器と、前記第１容器を封止する蓋部と、閉鎖系培養容器と保持部材は培養に必要な液体或いは気体の送液或いは送気を行うコネクタ部を有し、
自動培養装置は、閉鎖系培養容器と、前記コネクタ部を介して液体或いは気体の送液或いは送気を制御する制御部を有し、前記蓋部は前記第１容器と閉鎖された空間を形成し、
前記蓋部は前記第２容器の開口と、第１容器側と連結した微小な孔を除き全周において接触し、
前記制御部により、第２容器に接続されたコネクタ部より、前記第２容器内に設置された第１容器側と連結した微小な孔の高さまで輸送用培地を供給すると同時に、前記第２容器内に設置された第１容器側と連結した微小な孔より、第１容器内の気体は第２容器内へ内部の圧が均等となるよう移動され、第１容器内の気体は第１容器に接続されたコネクタ部より閉鎖系培養容器の外へ移動され、
結果として培養に使用する自動培養装置を用い、閉鎖系培養容器を開封することなく内部の清浄性を維持したまま、輸送用培地を満たすことを可能とすることを特徴とした自動培養装置。

＜列記６＞
細胞が保持される閉鎖系培養容器であって、
第１容器と、前記第１容器内に設置され第１容器側と連結した孔を有した第２容器と、前記第１容器を封止する蓋部を有し、
前記蓋部は前記第１容器と閉鎖された空間を形成し、
前記蓋部は前記第２容器の開口と全周において接触し、かつ、前記第２容器の開口の上端よりも下方が下端となる凸部を有し
前記第２容器内に保持した液体は、前記第２容器外にある前記第１容器内へ移動することが、前記蓋部と前記第２容器の開口の接触により抑制され、
結果として前記第１容器内に長時間にわたる液体の保持を可能とし、
前記蓋部が有する凸部により、輸送後の再生組織の取り出し時において前記第２容器から輸送用培地が流路外へ漏出せず前記第１容器内のみへ移動させることを特徴とする閉鎖系培養容器。

＜列記７＞
細胞が保持される閉鎖系培養容器であって、
第１容器と、前記第１容器内に設置され第１容器側と連結した孔を有した第２容器と、前記第１容器を封止する蓋部を有し、
前記蓋部は前記第１容器と閉鎖された空間を形成し、
前記蓋部は前記第２容器の開口と全周において接触し、かつ、前記第２容器の開口と全周において接触する部分より内周側に凸部を有し、前記凸部は再生組織の輸送時において、最大で再生組織の上端まで達する長さを有し、
前記第２容器内に保持した液体は、前記第２容器外にある前記第１容器内へ移動することが、前記蓋部と前記第２容器の開口の接触により抑制され、
結果として前記第２容器内に長時間にわたる液体の保持を可能とし、
前記蓋部が有する凸部により輸送時に再生組織が輸送中の振動、衝撃、輸送容器の傾きにより移動し、前記第２容器内の内壁に衝突し損傷することを回避することを特徴とした閉鎖系培養容器。

＜列記８＞
細胞が保持される閉鎖系培養容器であって、
第１容器と、前記第１容器内に設置され第１容器側と連結した孔を有した第２容器と、前記第１容器を封止する蓋部を有し、
前記蓋部は前記第１容器と閉鎖された空間を形成し、
前記蓋部は前記第２容器の開口と全周において接触し、かつ、前記蓋部は前記蓋部の内部を貫通する気体が通過可能な微小な孔を有し、
前記第２容器内に保持した液体は、前記第２容器外にある前記第１容器内へ移動することが、前記蓋部と前記第１容器の開口の接触により抑制され、
結果として前記第２容器内に長時間にわたる液体の保持を可能とし、
前記蓋部が有する前記微小な孔の位置を鉛直方向上方へ配置することにより前記第２容器内に充填可能な輸送用培地の量を増やすことを可能とすることを特徴とした閉鎖系培養容器。

＜列記９＞
細胞が保持される閉鎖系培養容器であって、
第１容器と、前記第１容器内に設置され第１容器側と連結した孔を有した第２容器と、前記第１容器を封止する蓋部を有し、
前記蓋部は前記第１容器と閉鎖された空間を形成し、
前記蓋部は前記第２容器の開口と全周において接触し、かつ、前記蓋部が第２容器と形成する空間内の、前記蓋部の面において、前記第２容器と接触している部分の近傍は、中心に近い部分よりも鉛直方向上方へ長く、またその領域の上方に気体が通過可能な微小な孔を有し、
前記第２容器内に保持した液体は、前記第２容器外にある前記第１容器内へ移動することが、前記蓋部と前記第２容器の開口の接触により抑制され、
結果として前記第２容器内に長時間にわたる液体の保持を可能とし、
前記蓋部が有する領域まで輸送用培地を満たすことによりシアストレスの低減効果を、有さない場合に比べ高めることを可能とすることを特徴とした閉鎖系培養容器。

＜列記１０＞
細胞が保持される閉鎖系培養容器と、閉鎖系培養容器を保持する保持部材から成る閉鎖系培養容器を用いる自動培養装置であって、
閉鎖系培養容器は、第１容器と、前記第１容器内に設置され第１容器側と連結した孔を有した第２容器と、前記第１容器を封止する蓋部と、閉鎖系培養容器と保持部材は培養に必要な液体或いは気体の送液或いは送気を行うコネクタ部を有し、
自動培養装置は、閉鎖系培養容器と、前記コネクタ部を介して液体或いは気体の送液或いは送気を制御する制御部を有し、前記蓋部は前記第１容器と閉鎖された空間を形成し、
前記蓋部は前記第２容器の開口と、第１容器側と連結した微小な孔を除き全周において接触し、
前記コネクタ部に連結した流路チューブは熱溶着等の手段により、液体或いは気体の送液或いは送気を不可とする閉鎖が可能であり、
前記制御部により、第２容器に接続されたコネクタ部より、前記第２容器内に設置された第１容器側と連結した微小な孔の高さまで輸送用培地を供給すると同時に、前記第２容器内に設置された第１容器側と連結した微小な孔より、第１容器内の気体は第２容器内へ内部の圧が均等となるよう移動され、第１容器内の気体は第１容器に接続されたコネクタ部より閉鎖系培養容器の外へ移動され、
前記第２容器に接続されたコネクタ部に連結した流路チューブを閉鎖後に、前記第１容器に接続されたコネクタ部より細胞に適した気体を常圧以上に送気し、
結果として培養に使用する自動培養装置を用い、閉鎖系培養容器を開封することなく内部の清浄性を維持したまま、輸送用培地を満たすことを可能とし、
加圧状態で封入した細胞に適した気体により長時間にわたり細胞の状態を良好に維持することを特徴とした自動培養装置。

＜列記１１＞
細胞が保持される閉鎖系培養容器であって、
第１容器と、前記第１容器内に設置され第１容器側と連結した孔を有した第２容器と、前記第１容器を封止する蓋部を有し、
前記蓋部は前記第１容器と閉鎖された空間を形成し、
前記蓋部は前記第２容器の開口と全周において接触し、
前記第２容器内に保持した液体は、前記第２容器外にある前記第１容器内へ移動することが、前記蓋部と前記第２容器の開口の接触により抑制され、前記第２容器内に長時間にわたる液体の保持を可能とし、
前記第１容器と前記蓋部が連結する部分の外側に空間を形成する被覆部材を有し、被覆部材は製造前に設置しあらかじめ滅菌することで、前記空間内も滅菌状態であり、
被覆部材は輸送後の再生組織の取り出し時において取り外すこととすることで輸送後においても滅菌状態を維持し、結果として再生組織の取り出し時において、第２容器等から輸送用培地が外部へ漏出したとしても、被覆部材により輸送後も清浄性を維持されていた空間のみへ輸送用培地が漏出している限りにおいて、再生組織の清浄性の維持を可能とすることを特徴とした閉鎖系培養容器。

１００ 培養容器部
１０１、２０１、５０１、１１０１ 閉鎖系培養容器
１０２ 制御部
１０３、５０３ インキュベータ
１０５、２０９、５０５ 気体供給部
１０８、５０８ 顕微鏡
１１０ 制御用端末
１１２、２０５ 細胞ボトル
１１３、２０７ 培地ボトル
１１４、２１１ 培養上清バッグ
１１５、２０６ 冷蔵庫
１１６ 流路部
１１７ 送液機構
２０２ 電磁弁
２０３ ポンプ
２０４ フィルタ
２０８ 予熱機構
２１０ 加湿ボトル
２１２ ステージ
２１３ 顕微観察ユニット
２１４ 照射光部
２１５ 流路チューブ
３０１ 第１容器
３０２ 第２容器
３０３ 蓋部
３０４ コネクタ部
３０５、７０５ 凸部
３０６、３０７ 培養表面
３０８、７０６ 微小な孔
３０９ パッキング部
３１０ 外部容器
３１１ 培養皿
３１２ 補助部材
３１３ 支持部材
４０１ 上皮系細胞
４０２ フィーダー細胞
４０３ 輸送用培地
４０４ 切断部
５０２ 制御装置
５０４ 温度調節部
５０６ 気体濃度調節部
５０７ ポンプ
５０９ ＣＯ２・Ｏ２センサ
５１０ 表示画面
５１１ 温度センサ
５１２ 細胞ボトル・培地ボトル・培養上清バッグ
７０１ 飛沫防止壁
７０２ 移動抑制凸部
７０３ 微小な貫通孔
７０４ 培地追加充填部
９０１ 第１の半開放空間
９０２ 第２の半開放空間
１００１ 被覆部材
１００２ 空間。

Claims (15)

1. 細胞を保持する閉鎖系培養容器であって、
   第１容器と、前記第１容器内に設置され、開口と前記第１容器側と連結する多孔性膜を有する第２容器と、前記第１容器を封止する蓋部とを備え、
   前記蓋部は、前記第１容器と共に閉鎖された空間を形成し、且つ、前記蓋部は前記第２容器の前記開口と全周で接触しており、前記第２容器内に保持される液体が前記第１容器内へ移動することを抑制して、前記第２容器内に前記液体の保持を可能とする、
   ことを特徴とする閉鎖系培養容器。
2. 請求項１に記載の閉鎖系培養容器であって、
   前記蓋部は、
   液体或いは気体の送液或いは送気を前記第１容器及び前記第２容器に行うコネクタ部と、
   前記第２容器の前記開口と接触する凸部を有する、
   ことを特徴とする閉鎖系培養容器。
3. 請求項２に記載の閉鎖系培養容器であって、
   前記凸部は、前記第１容器と前記第２容器との間の微小な孔を備える、
   ことを特徴とする閉鎖系培養容器。
4. 請求項３に記載の閉鎖系培養容器であって、
   前記第１容器は、その底面に培養表面を有し、前記凸部は、前記第１容器の前記培養表面に向かって伸びる飛沫防止壁を備える、
   ことを特徴とする閉鎖系培養容器。
5. 請求項３に記載の閉鎖系培養容器であって、
   前記蓋部は、前記第２容器の前記多孔性膜に向かって延びる移動抑制凸部を備える、
   ことを特徴とする閉鎖系培養容器。
6. 請求項３に記載の閉鎖系培養容器であって、
   前記蓋部は、培地追加充填部を備える、
   ことを特徴とする閉鎖系培養容器。
7. 請求項３に記載の閉鎖系培養容器であって、
   前記第１容器と前記蓋部が連結する部分の外側に空間を形成する被覆部材を備える、
   ことを特徴とする閉鎖系培養容器。
8. 細胞を保持する閉鎖系培養容器であって、
   第１の半開放空間と、前記第１の半開放空間に囲われるように配置された第２の半開放空間と、前記第１の半開放空間を封止する蓋部とを備え、
   前記蓋部は前記第１の半開放空間と閉鎖された空間を形成し、
   前記蓋部は前記第２の半開放空間の開口と全周において接触し、
   前記第２の半開放空間内に保持した液体は、前記第２の半開放空間を囲む前記第１の半開放空間内へ移動することが、前記蓋部と前記第２の半開放空間の開口との接触により抑制され、前記第２の半開放空間内に前記液体の保持を可能とする、
   ことを特徴とした閉鎖系培養容器。
9. 請求項８に記載の閉鎖系培養容器であって、
   前記第１の半開放空間に面する前記蓋部に飛沫防止部、又は前記第２の半開放空間に面する前記蓋部に、移動抑制凸部或いは培地追加充填部を形成した、
   ことを特徴とする閉鎖系培養容器。
10. 請求項３に記載の閉鎖系培養容器の輸送方法であって、
    前記第２容器内に前記微小な孔の高さまで輸送用培地を供給し、
    前記コネクタ部に連結した流路チューブを閉鎖後に輸送を行う、
    ことを特徴とした閉鎖系培養容器の輸送方法。
11. 請求項１０に記載の閉鎖系培養容器の輸送方法であって、
    前記第２容器内に前記微小な孔の高さまで輸送用培地を供給し、
    前記第２容器に接続された前記コネクタ部に連結した前記流路チューブを閉鎖後に、前記第１容器に接続された前記コネクタ部より細胞に適した気体を常圧以上に送気し、前記第２容器に接続された前記コネクタ部に連結した前記流路チューブを閉鎖後、輸送を行う、
    ことを特徴とした閉鎖系培養容器の輸送方法。
12. 細胞を培養する自動培養装置であって、
    培養に必要な液体或いは気体を保持する保持部と、
    前記保持部から供給される前記液体或いは気体を保持する閉鎖系培養容器と、
    前記保持部と前記閉鎖系培養容器とを接続する複数の流路を備える流路部と、
    前記流路部を制御し、前記液体或いは気体を前記保持部から前記閉鎖系培養容器に供給又は排出するよう制御する制御部と、を備え、
    前記閉鎖系培養容器は、
    第１容器と、前記第１容器内に設置され、開口と前記第１容器側と連結する多孔性膜を有する第２容器と、前記第１容器を封止する蓋部とを備え、
    前記蓋部は、前記液体或いは気体の供給或いは排出を前記第１容器及び前記第２容器に行うコネクタ部を有し、
    前記蓋部は前記第１容器と共に閉鎖された空間を形成し、且つ、前記蓋部は前記第２容器の前記開口と全周で接触しており、前記第２容器内に供給、保持される前記液体が前記第１容器内へ移動することを抑制して、前記第２容器内に前記液体の保持を可能とする、
    ことを特徴とする自動培養装置。
13. 請求項１２に記載の自動培養装置であって、
    前記蓋部は、前記第２容器の前記開口と接触する凸部を有し、前記第２容器は前記凸部において前記開口と全周で接触する、
    ことを特徴とする自動培養装置。
14. 請求項１３に記載の自動培養装置であって、
    前記凸部は、前記第１容器と前記第２容器との間の微小な孔を有し、
    前記微小な孔により、前記第１容器内の供給される気体は前記第２容器内部の圧が均等となるよう移動する、
    ことを特徴とする自動培養装置。
15. 請求項１４に記載の自動培養装置であって、
    前記第１容器と前記蓋部が連結する部分の外側に空間を形成する被覆部材を備える、
    ことを特徴とする自動培養装置。

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