KR102327638B1 - 장내 환경 모사를 이용한 혐-호기성 세포 공배양장치 및 방법 - Google Patents

장내 환경 모사를 이용한 혐-호기성 세포 공배양장치 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 각각 상하로 관통되는 제1포트홀과 제2포트홀을 포함하고, 상기 제1포트홀과 제2포트홀은 각각 제1기밀덮개와 제2기밀덮개로 밀폐되는 제1블록, 상기 제1포트홀 및 제2포트홀과 각각 연통되는 제1홀 및 제2홀이 상하로 관통되며, 상기 제1블록의 하부에 결합되는 제2블록, 상기 제2블록의 하부에 결합되며, 상기 제1홀 하부와 제2홀의 하부를 서로 연결하는 연결홈을 포함하는 제3블록, 및 상기 제1포트홀 또는 상기 제1홀 내부에 위치하는 동물세포가 접종된 다공성 멤브레인을 포함하고, 상기 다공성 멤브레인의 상부는 혐기 분위기이고, 하부는 호기 분위기인 것을 특징으로 한다.

Description

장내 환경 모사를 이용한 혐-호기성 세포 공배양장치 및 방법{Apparatus and method for co-culturing anaerobic and aerobic cells using intestinal environment simulation}
본 발명은 장내 환경 모사를 이용한 혐-호기성 세포 공배양장치 및 방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 다공성 멤브레인 상부면에 숙주인 동물세포를 배양하고 이를 기준으로 혐기균과 숙주의 면역세포 등을 구분하여 배양, 분석하거나, 동물의 장 내외부의 혐기성 또는 호기성 환경을 모사, 구현하여 장내 혐기성과 호기성 미생물 각각의 생육 및 생리학적 활동과 장내 미생물의 생리학적 상호 작용을 분석하거나, 의약제 등의 생리적 변화 예측에 활용할 수 있는 세포 공배양장치 및 방법에 관한 것이다.
전통적으로 숙주-혐기성 장내 미생물의 생리학적 상호작용을 분석하기 위해서는 마우스 등을 이용한 동물 실험 모델을 사용하였다.
하지만, 동물 실험 모델의 활용이 고비용 및 고강도의 노동력이 요구되며, 원하는 결과를 얻기 위해 많은 시간을 투자해야 하는 문제점이 있었다.
또한, 동물 실험 모델은 유전적으로 인간과 상이하기 때문에 결과에 대한 신뢰성이 저하되는 문제점이 있었다.
따라서, 이러한 동물 실험 모델을 사용하지 않고 인간의 장세포를 체외에서 배양하여, 장내 미생물의 생리학적 상호작용을 분석하는 방법이 요구되고 있다.
관련 선행기술로서 등록특허 10-1618018B(미생물 복합 배양장치, 2016년 4월 27일 등록)에는 다양한 농축산용 혐기성 또는 호기성 미생물을 대량으로 배양할 수 있는 장치가 기재되어 있으나, 장 세포 환경과 유사하도록 모사한 환경 하에서 혐기성 또는 호기성 미생물을 공배양한 것이 아니며, 그러한 환경 하에서 혐기성과 호기성 미생물의 생리학적 활동과 생육 특성을 분석할 수 있도록 동시에 배양하는 기술에 대해서는 전혀 개시되거나 암시되고 있지 않다.
다른 방법으로서, 일반적인 트랜스웰(transwell) 타입의 배양기를 이용하여 호기성 환경에서 장내 미생물과 장 상피세포와의 상호 작용을 연구하는 방법이 제안되었으나, 이러한 방법으로는 혐-호기성 공배양이 불가능하여, 장내 극소수의 호기성 또는 통성혐기성 미생물을 제외하고는 숙주세포 환경에서 생육하지 못할 뿐만 아니라, 장내 기체 환경을 모사하지 못하기 때문에 실제 인체 내 표현형과 상이한 분석 결과가 도출될 수 있는 문제점이 있었다.
본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는, 혐기성과 호기성 세포의 공배양이 가능한 공배양장치를 제공함으로써, 장 상피 세포를 기준으로 혐기균과 숙주의 면역세포 등을 구분하여 배양, 분석할 수 있다. 아울러 혐-호기성 장내 미생물을 장내 환경을 모사하여 저비용으로 효율적이고 용이하게 공배양함으로써, 다양한 생리활성 분석과 의약제 등의 장내 생리적 활성 변화를 예측, 분석할 수 있는 시스템을 제공함에 있다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 기술적 과제는, 장내 기체 환경을 그대로 모사하여 실제 인체 내 표현형과 일치하는 정확한 분석결과를 얻을 수 있는 혐기성 및 호기성 세포의 공배양 방법을 제공함에 있다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일측면에 따른 세포 공배양장치는, 각각 상하로 관통되는 제1포트홀과 제2포트홀을 포함하고, 상기 제1포트홀과 제2포트홀은 각각 제1기밀덮개와 제2기밀덮개로 밀폐되는 제1블록, 상기 제1포트홀 및 제2포트홀과 각각 연통되는 제1홀 및 제2홀이 상하로 관통되며, 상기 제1블록의 하부에 결합되는 제2블록, 상기 제2블록의 하부에 결합되며, 상기 제1홀 하부와 제2홀의 하부를 서로 연결하는 연결홈을 포함하는 제3블록, 및 상기 제1포트홀 또는 상기 제1홀 내부에 위치하는 동물세포가 접종된 다공성 멤브레인을 포함하고, 상기 다공성 멤브레인의 상부는 혐기 분위기이고, 하부는 호기 분위기인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 실시예에서, 상기 다공성 멤브레인은 상기 제1포트홀과 상기 제1홀 사이에 위치할 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 상기 제1기밀덮개와 제2기밀덮개가 밀폐되는 둘레, 상기 제1블록의 제1포트홀과 제2포트홀의 하부 둘레, 상기 제2블록의 제1홀과 제2홀의 상부 둘레, 및 상기 제3블록이 상기 제2블록과 결합하는 상부 둘레에 위치하는 기밀유지부를 더 포함하는 할 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 상기 제1블록, 제2블록 및 제3블록은, 폴리카보네이트 재질일 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 상기 다공성 멤브레인은, 니트로셀룰로오스(Nitrocellulose), 폴리카보네이트 또는 폴리에스터일 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 상기 다공성 멤브레인의 평균 기공크기는 0.3~0.5㎛인 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 상기 동물세포는 장 상피세포일 수 있지만 이에 반드시 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 실시예에서, 상기 다공성 멤브레인의 상부 공간은 혐기성 세포가 접종되고, 하부 공간은 호기성 세포가 접종되되, 상기 상부 공간과 상기 하부 공간은 각각 혐기성 세포 배양액과 호기성 세포 배양액이 추가로 더 구비될 수 있다.
이를 위하여 일 실시예로서 상기 세포 공배양장치는 상기 제1포트홀과 연통되는 혐기 챔버 외부의 제1 연동 펌프 및 상기 제2포트홀과 연통되는 혐기 챔버 외부의 제2 연동 펌프를 더 포함할 수 있는데, 상기 세포 공배양장치를 이용하는 세포 공배양 시간은 상기 제1 연동 펌프를 통해 혐기성 세포 배양액을 추가하거나, 또는 상기 제2 연동 펌프를 통해 호기성 세포 배양액을 추가하여 증가시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 측면에 따른 세포 공배양방법은, 상하로 관통되는 제1포트홀과 제2포트홀을 포함하는 제1블록, 상기 제1포트홀 및 제2포트홀과 각각 연통되는 제1홀 및 제2홀이 상하로 관통되며, 상기 제1블록의 하부에 결합되는 제2블록, 상기 제2블록의 하부에 결합되며, 상기 제1홀 하부와 제2홀의 하부를 서로 연결하는 연결홈을 포함하는 제3블록, 및 상기 제1포트홀 또는 상기 제1홀 내부에 위치하는 다공성 멤브레인을 포함하는 세포 공배양장치를 이용하는 세포 공배양방법으로서, a) 상기 제1블록, 제2블록, 제3블록, 및 다공성 멤브레인을 각각 결합하는 단계, b) 상기 다공성 멤브레인 상부에 동물세포를 접종하여 배양하는 단계, c) 호기성 세포 배양액을 상기 제2포트홀을 통해 상기 다공성 멤브레인의 하부 공간에 주입하고, 혐기성 세포 배양액을 상기 제1포트홀을 통해 상기 다공성 멤브레인의 상부 공간에 주입하는 단계, d) 상기 제2포트홀을 제2기밀덮개로 밀폐하고, 혐기 챔버 내에서 상기 다공성 멤브레인 상부 공간이 혐기로 된 때에 상기 제1포트홀을 제1기밀덮개로 밀폐한 후 세포를 공배양하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 상기 a)단계와 b)단계 이후에 각각 상기 세포 공배양장치를 멸균처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
특히 b) 단계를 수행한 후, 상기 세포 공배양장치를 멸균처리하는 과정은 세포 공배양장치의 내부를 멸균된 인산 완충용액으로 세척하는 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 상기 호기성 세포 배양액과 혐기성 세포 배양액의 부피비는 6 내지 7 : 1일수 있으나 이에 반드시 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 실시예에서, 상기 b)의 배양 단계는, CO2 배양기의 온도를 35 내지 38℃로 하고, 4 내지 6% CO2 환경에서 7일간 배양할 수 있으며, 바람직하게는 상기 CO2 배양기의 온도를 37℃로 하고, 5% CO2 환경에서 7일간 배양할 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 상기 d)의 공배양 단계는, 혐기 챔버의 온도를 35 내지 38℃로 하고, 90% N2, 5% CO2, 5% H2 환경에서 10 내지 13시간 배양할 수 있으며, 바람직하게는 상기 혐기 챔버의 온도를 37℃로 하고, 90% N2, 5% CO2, 5% H2 환경에서 12시간 배양할 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 상기 세포 공배양장치는 상기 제1포트홀과 연통되는 혐기 챔버 외부의 제1 연동 펌프 및 상기 제2포트홀과 연통되는 혐기 챔버 외부의 제2 연동 펌프를 더 포함하고, 상기 세포 공배양장치를 이용하는 세포 공배양 시간은, 상기 제1 연동 펌프를 통해 혐기성 세포 배양액을 추가하거나, 또는 상기 제2 연동 펌프를 통해 호기성 세포 배양액을 추가하여 증가시킬 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 상기 c) 단계에서 상기 다공성 멤브레인의 하부 공간에는 면역세포, 대식세포, 유산균, 의약제를 추가로 주입할 수 있다.
본 발명은 혐기성 및 호기성 세포의 공배양을 수행할 수 있는 장치를 제공하여, 장내 기체 환경을 그대로 모사하여, 숙주-혐기성 장내 미생물의 생리학적 상호 작용 분석의 신뢰성을 높일 수 있는 효과가 있다.
좀 더 구체적으로, 본 발명은 호기성인 장 상피세포를 배양함과 아울러 장 상피 세포에 접하도록 혐기성 미생물과 숙주 면역세포 등을 공배양하여, 인체의 장내 미생물의 생리학적 상호 작용에 대한 실제 인체 내 표현형과 일치하는 분석 결과를 얻을 수 있는 효과가 있다.
아울러 본 발명은 혐기성 및 호기성 세포 공배양장치는 구조를 단순화하면서도 혐기성 및 호기성 세포의 공배양을 수행할 수 있어, 저가격으로 높은 신뢰성을 가지는 분석 결과를 얻을 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 공배양장치의 사시도이다.
도 2는 도 1의 분해 사시도이다.
도 3은 도 1의 결합상태 A-A 단면도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 공배양방법의 구체적인 순서도이다.
도 5는 장 상피세포와 혐기성의 균을 배양한 상태의 모식도이다.
이하, 본 발명 장내 환경 모사를 이용한 혐-호기성 세포 공배양장치 및 방법에 대하여 첨부한 도면을 참조하여 상세히 설명한다.
본 발명의 실시 예들은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이며, 아래에 설명되는 실시 예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래의 실시 예들로 한정되는 것은 아니다. 오히려, 이들 실시 예는 본 발명을 더욱 충실하고 완전하게 하며 당업자에게 본 발명의 사상을 완전하게 전달하기 위하여 제공되는 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시 예를 설명하기 위하여 사용되며, 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 단수 형태는 문맥상 다른 경우를 분명히 지적하는 것이 아니라면, 복수의 형태를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 경우 "포함한다(comprise)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급한 형상들, 숫자, 단계, 동작, 부재, 요소 및/또는 이들 그룹의 존재를 특정하는 것이며, 하나 이상의 다른 형상, 숫자, 동작, 부재, 요소 및/또는 그룹들의 존재 또는 부가를 배제하는 것이 아니다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "및/또는"은 해당 열거된 항목 중 어느 하나 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다.　
본 명세서에서 제1, 제2 등의 용어가 다양한 부재, 영역 및/또는 부위들을 설명하기 위하여 사용되지만, 이들 부재, 부품, 영역, 층들 및/또는 부위들은 이들 용어에 의해 한정되지 않음은 자명하다. 이들 용어는 특정 순서나 상하, 또는 우열을 의미하지 않으며, 하나의 부재, 영역 또는 부위를 다른 부재, 영역 또는 부위와 구별하기 위하여만 사용된다. 따라서, 이하 상술할 제1 부재, 영역 또는 부위는 본 발명의 가르침으로부터 벗어나지 않고서도 제2 부재, 영역 또는 부위를 지칭할 수 있다.
이하, 본 발명의 실시 예들은 본 발명의 실시 예들을 개략적으로 도시하는 도면들을 참조하여 설명한다. 도면들에 있어서, 예를 들면, 제조 기술 및/또는 공차에 따라, 도시된 형상의 변형들이 예상될 수 있다. 따라서, 본 발명의 실시 예는 본 명세서에 도시된 영역의 특정 형상에 제한된 것으로 해석되어서는 아니 되며, 예를 들면 제조상 초래되는 형상의 변화를 포함하여야 한다.
도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 장내 환경 모사를 이용한 혐-호기성 세포 공배양장치의 일부 분해 사시도이고, 도 2는 도 1의 분해 사시도이며, 도 3은 도 1의 결합상태 단면 구성도이다.
도 1 내지 도 3을 각각 참조하면, 본 발명 세포 공배양장치(1)는, 상하로 적층되는 세개의 블록을 포함한다. 제일 상층의 제1블록(10)은 상호 이격되며 상하로 마련된 제1포트홀(11) 및 제2포트홀(12)을 포함한다.
상기 제1포트홀(11) 및 제2포트홀(12)은 제1블록(10)을 상하로 완전히 관통하여 형성된다.
상기 제1블록(10)의 둘레를 따라서는 체결공(70)이 다수로 마련되어 있으며, 이 체결공(70)은 이후에 설명할 제2블록(20)과 제3블록(30)에도 대응하는 위치에 마련되어 체결 수단을 이용하여 제1블록(10), 제2블록(20) 및 제3블록(30)이 적층된 상태에서 견고하게 결합할 수 있다.
상기 체결공(70)은 탭이 형성된 것일 수 있으며, 이때의 체결 수단은 볼트가 될 수 있다.
위의 예에서는 체결 수단으로 볼트를 예시하였으나, 제1블록(10), 제2블록(20) 및 제3블록(30)을 열거 순으로 하향 적층한 상태로 견고하게 고정할 수 있는 수단이면 무관하게 사용할 수 있다.
상기 제1블록(10)의 저면에는 제1저면실링부(13)와 제2저면실링부(14)가 삽입되는 삽입홀이 형성된 것으로 한다.
상기 제1저면실링부(13)는 제1포트홀(11)의 저면 둘레에 설치되는 O형 링일 수 있으며, 제2저면실링부(14)는 제2포트홀(12)의 저면 둘레에 설치되는 O형 링일 수 있다.
이와 같이 구성되는 제1블록(10)의 하부에 위치하는 제2블록(20)은 상기 제1포트홀(11)과 연통되는 제1홀(21)과, 제2포트홀(12)에 연통되는 제2홀(22)이 형성되어 있다.
제1홀(21)과 제2홀(22)은 모두 제2블록(20)을 상하로 관통하는 홀이다.
제2블록(20)의 상면에서 제1홀(21)과 제2홀(22)의 둘레를 따라 제1삽입홈(25)과 제2삽입홈(26)이 형성되어 있으며, 제1삽입홈(25)과 제2삽입홈(26)에는 각각 제1상면실링부(23)와 제2상면실링부(24)가 삽입 고정된다.
제1블록(10)과 제2블록(20)의 결합상태에서 상기 제1상면실링부(23)는 제1저면실링부(13)와 접하게 되며, 제2상면실링부(24)는 제2저면실링부(14)와 접하게 된다.
상기와 같은 본 발명의 실링 구조는 이후 설명할 배양액의 누설을 방지할 목적 및 배양액의 성질 변화를 방지할 목적으로 사용된다.
즉, 본 발명은 호기성과 혐기성의 성질을 가지는 배양액을 사용하며, 그 배양액의 성질이 변화되는 것을 막기 위해 산소의 출입을 차단하도록 구성된다.
상기 제1홀(21)과 제1포트홀(11)의 사이에는 다공성 멤브레인(60)을 설치한다. 다공성 멤브레인(60)은 니트로셀룰로오스(Nitrocellulose)를 사용할 수 있다.
특히 다공성의 소재를 사용함으로써, 이후 상세히 설명할 호기성과 혐기성 세포의 배양이 가능하게 된다.
다공성 멤브레인(60)의 소재로는 폴리카보네이트 또는 폴리에스터를 사용할 수도 있다.
다공성 멤브레인(60)의 다른 요구 조건으로, 세포의 부착력 강화 및 단백질 분석의 방해 요소가 발생하지 않는 것을 꼽을 수 있다. 여러 가지 조건들을 고려할 때 가장 적합한 소재는 니트로셀룰로오스이다.
또한, 다공성 멤브레인(60)은 기공의 크기에 따라 본 발명에 적용하였을 때 적합도가 결정된다. 다공성 멤브레인(60)의 상부에는 숙주세포로서 장 상피세포 등과 같은 동물세포가 배양되어 위치하게 된다. 다공성 멤브레인(60)의 상부측은 혐기성 배양액이 위치하게 된다.
이때 다공성 멤브레인(60)의 기공 크기에 의해 멤브레인 상에 배양된 동물 세포 내에 존재하는 호기성 세포에도 적절하게 산소의 공급이 조절될 수 있다. 이를 위하여 다공성 멤브레인(60)의 평균 기공의 크기는 0.2~10㎛인 것이 바람직하다.
구체적으로 다공성 멤브레인(60)의 상부면의 숙주 상피세포의 상부 공간에 장내 혐기성 미생물 세포를 배양하고, 하부 공간에 대식세포 등과 같은 면역세포를 공동 배양하는 경우, 다공성 멤브레인(60)의 평균 기공의 크기는 0.2~10㎛일 수 있으나, 숙주 상피세포를 기준으로 상하부 공간에 각각 혐기성 미생물과 호기성 미생물을 접종하여 공동 배양할 경우에는 다공성 멤브레인(60)의 평균 기공의 크기는 0.2~0.5㎛로 조정할 수 있다.
상기 다공성 멤브레인(60)의 안정적인 장착을 위하여 상기 제2블록(20)의 제1홀(21)의 상부측 둘레에는 제2블록(20)의 상면 높이보다 낮은 단차면인 안착면(27)이 형성될 수 있다.
도면에 도시되어 있지 않으나, 다른 실시예로서 상기 다공성 멤브레인은 제1홀(21)과 제1포트홀(11)의 사이 외에 제1홀(21) 내부의 소정의 위치 또는 제1포트홀(11) 내부의 소정의 위치에 소정의 내부 둘레 홈을 설치하고 이에 위치될 수 있다.
상기 다공성 멤브레인의 위치에 따라 세포 공배양장치에 있어서 혐기적 공간과 호기적 공간의 크기가 조절될 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 다공성 멤브레인의 상부 공간이 혐기 공간이고, 하부 공간이 호기 공간으로 구성될 수 있는데, 상기 다공성 멤브레인이 제1홀(21)과 제1포트홀(11)의 내부 중 어느 위치에 구비되는가에 따라서 공간의 크기를 제어할 수 있다.
상기 상부의 혐기 공간의 혐기 분위기와 하부의 호기 공간의 호기 분위기의 기준은 산소(O2)의 유무이다. 즉, 혐기 분위기 하에서는 산소가 없으며, 호기 분위기 하에서는 산소가 있다.
상기 제2블록(20)의 하부에 결합되는 제3블록(30)의 상면에는 연결홈(31)이 형성된다.
도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이 상기 연결홈(31)은 제2블록(20)의 제1홀(21)과 제2홀(22)의 하부측을 서로 연결하는 것으로, 상기 다공성 멤브레인(60)을 기준으로 제1블록(10)의 제1포트홀(11)측과 제2포트홀(12)측을 구분하여, 각각 혐기성과 호기성의 배양액을 공급할 수 있다.
즉, 제2포트홀(12), 제2홀(22), 연결홈(31) 및 제1홀(21)이 연통되어 상기 다공성 멤브레인(60)의 저면을 노출시키고, 제1포트홀(11)을 통해 다공성 멤브레인(60)의 상면을 노출시킬 수 있다.
상기 제2포트홀(12), 제2홀(22), 연결홈(31) 및 제1홀(21)은 호기성 배양액, 제1포트홀(11)에는 혐기성 배양액이 주입되게 된다.
즉, 다공성 멤브레인(60)의 위치를 기준으로 볼 때, 상부 공간에는 혐기성 배양액이, 하부 공간에는 호기성 배양액이 주입되게 된다.
제3블록(30)의 연결홈(31) 주변 둘레에는 기밀유지부(33)가 결합되는 결합홈(32)이 형성된다.
상기 제1포트홀(11)에는 제1기밀덮개(40)를, 제2포트홀(12)에는 제2기밀덮개(50)를 결합하여 각각의 내부 공간의 공기 성질(혐기 또는 호기)과 각각에 담긴 배양액의 성질이 유지되도록 한다.
즉, 제1포트홀(11) 내부에 혐기성 배양액이 주입된 상태에서 세포 공배양장치 전체를 혐기 챔버에 두면 제1포트홀(11) 내부의 산소는 확산되어 없어지기 때문에 혐기 상태가 되는데, 이때 제1기밀덮개(40)를 결합하여 내부의 혐기 공간이 유지되게 된다.
또한, 제2포트홀(12)에 호기성 배양액이 주입된 상태에서 바로 제2기밀덮개(50)를 결합시키면, 그 내부 공간은 산소가 그대로 있어 호기 상태가 되는 바, 이후 세포 공배양장치를 혐기 챔버에 두더라도 제2포트홀(12) 내부는 호기 상태가 유지될 수 있다.
제1기밀덮개(40)와 제2기밀덮개(50) 각각에는 오링(41,51)이 마련되어 기밀을 유지할 수 있다.
상기 제1블록(10), 제2블록(20), 제3블록(30), 제1기밀덮개(40) 및 제2기밀덮개(50)는 폴리카보네이트 재질을 사용할 수 있다. 폴리카보네이트는 고압멸균이 가능하며, 비용이 저렴하고 내구성이 강한 특징이 있다.
이하에서는 상기와 같이 구성되는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 세포 공배양장치를 이용하여 하나의 장치에서 혐기성 미생물과 호기성 미생물을 공배양하는 방법에 대하여 구체적으로 설명한다.
먼저, 제1블록(10), 제2블록(20) 및 제3블록(30)을 상호 적층 결합하되, 제2블록(20)의 안착면(27)에 다공성 멤브레인(60)이 안착된 상태로 결합한다.
본 발명의 바람직한 일 실시예로서 다공성 멤브레인(60)이 제2블록(20)의 안착면(27)에 위치하고 있으나, 다른 실시예에서는 제1블록(10)과 제2블록(20)의 내부 공간 중 어느 하나에 위치하도록 구성될 수 있다.
도 4는 본 발명의 일 실시예로서의 세포 공배양방법의 순서도이다.
도 4를 참조하면, 세포 공배양장치(1)를 고온, 고압에서 멸균하는 단계(S41)와, 다공성 멤브레인(60)의 상부에 장 상피세포를 접종하는 단계(S42)와, 세포 공배양장치(1)를 배양기에 투입하고 장 상피세포를 배양하는 단계(S43)와, 세포 공배양장치(1)를 세척하는 단계(S44)와, 호기성 세포 배지와 혐기균 배양액을 각각 투입하는 단계(S45)와, 혐기 챔버 내에서 세포 공배양장치(1)에 각각 특성이 다른 혐/호기성 세포를 공배양하는 단계(S46)와, 장세포와 혐기성 균 등의 생리학적 상호 작용을 분석하는 단계(S47)를 포함한다.
특히 도 4에 구체적으로 도시하지 않았으나, 호기성 세포 배지와 혐기균 배양액을 각각 투입하는 단계(S45)는, 먼저 호기성 세포 배지를 상기 제2포트홀을 통해 상기 다공성 멤브레인의 하부 공간에 주입하는 단계와, 상기 제2포트홀을 제2기밀덮개로 밀폐하여 산소가 빠져나가지 못하도록 기밀(氣密)하는 단계와, 세포 공배양장치(1)를 혐기 챔버로 이동하여 거치하는 단계와, 상기 혐기 챔버 내에서 상기 다공성 멤브레인 상부 공간이 혐기로 된 때에 혐기성 세포 배양액을 상기 제1포트홀을 통해 상기 다공성 멤브레인의 상부 공간에 주입하는 단계와, 상기 제1포트홀을 제1기밀덮개로 밀폐하여 산소가 빠져나가지 못하도록 기밀(氣密)하는 단계를 포함한다.
도 4의 다른 실시예에 따르면, 세포 공배양기의 세척(S44) 이후에 호기성 환경의 클린벤치에서 호기성 세포 배지를 제1포트홀과 제2포트홀 각각을 통해 주입할 수 있다. 그럴 경우 제2포트홀 밀폐 후 혐기 챔버 내에서 다공성 멤브레인의 상부에 주입된 상기 호기성 세포 배지는 제거하고, 혐기 조건이 된 상태에서 혐기성 세포 배양액을 다공성 멤브레인의 상부 공간에 주입하게 된다. 이때 다공성 멤브레인의 상부 공간이 혐기 조건이 되기 위해 적어도 하루 이상 거치할 수 있으나 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
이러한 본 발명 세포 공배양방법을 이하에서 좀 더 구체적으로 설명하기로 한다.
먼저, S41단계에서 제1블록(10), 제2블록(20), 제3블록(30) 및 다공성 멤브레인(60)이 결합된 본 발명 세포 공배양장치(1)를 고온 고압에서 멸균한다.
고압, 고온 멸균의 일례로 121℃의 온도와 15lb psi 압력에서 15분 정도 처리한다.
그 다음, S42단계에서 멸균이 완료된 세포 공배양장치(1)의 다공성 멤브레인(60)의 상부에 장 상피세포를 접종한다. 이때 장 상피세포는 200만 개체 수 정도가 적당하다.
그런 다음, S43단계에서 장 상피세포가 접종된 다공성 멤브레인(60)을 포함하는 세포 공배양장치(1)를 CO2 배양기에 투입하여 장 상피세포를 배양한다.
이때 CO2 배양기의 온도는 37℃, 5% CO2 환경에서 7일간 배양하지만 이에 반드시 제한되는 것은 아니다.
다공성 멤브레인(60) 상부에 접종되는 동물세포의 특성에 따라 상기 배양기의 온도, 내부가스, 기간 등의 배양 조건은 달라질 수 있음을 물론이다.
그 다음, S44단계와 같이 장 상피세포가 배양된 세포 공배양장치(1)를 CO2 배양기에서 꺼내고 내부를 멸균된 인산 완충용액(Phosphate buffer saline)으로 세척한다. 이때의 세척은 2회 정도 하는 것이 바람직하다.
그 다음, S45단계와 같이, 호기성 세포 배지와 혐기균 배양액을 투입한다.
호기성 세포 배지는 제2포트홀(12)로 주입되어, 제2포트홀(12)과 상호 연통되는 제2홀(22), 연결홈(31), 제1홀(21)로 이동된다. 그러면 다공성 멤브레인(60)을 기준으로 그 하부 공간에 호기성 세포 배양액이 충진된다.
실시예에 따라서, 상기 호기성 세포 배지는 제1블록(10)의 제1포트홀(11)로 주입되어 다공성 멤브레인(60)의 상부 공간에 충진될 수 있다.
제2포트홀(12)을 밀폐하여 산소가 빠져나오지 못하도록 기밀(氣密)하고 나서 혐기 챔버로 이동하여 세포 공배양장치의 다공성 멤브레인 상부 공간을 혐기 조건으로 거치하게 된다. 그런 다음, 혐기 상태가 되면 혐기균 배양액이 제1블록(10)의 제1포트홀(11)로 주입되어 다공성 멤브레인(60)의 상부 공간에 충진된다. 호기성 세포 배지가 다공성 멤브레인(60)의 상부 공간에도 충진되는 실시예에서는 이때 주입되는 혐기균 배양액이 호기성 세포 배지를 교체하게 된다.
즉, 상기 제1포트홀(11)인 장 상피세포가 배양된 다공성 멤브레인(60)의 상부측에는 혐기균 배양액을 투입하고, 제2포트홀(12)을 통해 호기성 세포 배지를 투입하여 다공성 멤브레인(60)의 저면은 호기성 세포 배지가 접하도록 한다.
제2포트홀(12)을 통해 호기성 세포 배지를 주입한 후, 제2기밀덮개(50)로 제2포트홀(12)을 덮는다. 이는 연통된 제2포트홀(12), 제2홀(22), 연결홈(31), 제1홀(21)의 내부 가스를 산소가 있는 호기 분위기로 유지하기 위함이다.
한편, 혐기 챔버에 세포 공배양장치(1)를 두어 소정의 시간이 경과하면 제1포트홀(11) 내부 공간, 즉 다공성 멤브레인(60)의 상부 공간에서 산소가 혐기 챔버로 확산되어 산소가 없는 혐기 조건이 된다. 이때 제1기밀덮개(40)로 제1포트홀(11)을 덮어 제1포트홀(11) 내부 공간을 혐기 분위기로 유지한다.
본 발명의 일 실시예에서, 제1블록(10)의 제1포트홀(11)은 혐기 분위기이고, 상호 연통되는 제2포트홀(12), 제2홀(22), 연결홈(31), 제1홀(21)은 호기 분위기로 유지되어, 호기성 및 혐기성 세포를 공배양할 수 있다. 그러나 이러한 실시예에 반드시 제한되는 것은 아니며 다공성 멤브레인(60)의 위치에 따라 혐기 분위기의 공간과 호기 분위기의 공간 배치의 다양한 실시예가 가능하다.
이때 상기 혐기균 배양액은 5ml, 호기성 세포 배지는 33ml를 주입할 수 있으나 이에 반드시 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 혐기균 배양액과 호기균 배양액의 부피비가 1:6 내지 1:7의 범위 내로 주입될 수 있다.
그러한 상태로 S46단계와 같이 본 발명 세포 공배양장치(1)를 혐기 챔버에서 배양한다.
혐기 챔버의 조건은 37℃ 온도에서, 90% N2, 5% CO2, 5% H2 환경이 바람직하나 이에 반드시 제한되는 것은 아니다.
상기 혐기 챔버의 조건 하에서 12시간 동안 배양할 수 있으나, 배양되는 미생물의 종류와 그에 따른 성질 특성에 따라 배양 조건은 달리 설정될 수 있다.
혐기 챔버 내에서 배양되는 시간은 세포 공배양장치(1) 내에서 혐기적 공간과 호기적 공간이 유지되는 시간이다.
다공성 멤브레인(60)의 하부 공간에서 산소가 부족해진다면 호기균이 더 이상 생육할 수 없는 환경이 되는 바, 호기균의 특성에 따라 호기 분위기 유지를 위한 산소 주입의 다양한 방법을 활용할 수 있다.
도면에 도시되지 않았으나, 일 실시예에 따르면 배양 중 혐기 챔버 외부와 연통되는 적어도 하나 이상의 연동 펌프를 이용하여 배양 시간을 증가하거나 조정할 수 있다.
바람직하게는 세포 공배양장치(1)의 제1포트홀(11)과 연통되는 혐기 챔버 외부의 제1 연동 펌프를 통해 혐기성 세포 배양액을 추가할 수 있으며, 세포 공배양장치(1)의 제2포트홀(12)과 연통되는 혐기 챔버 외부의 제2 연동 펌프를 통해 호기성 세포 배양액을 추가할 수 있다.
그럴 경우 제1 연동 펌프를 통해 지속적으로 혐기성 세포 배양액이 다공성 멤브레인(60)의 상부 공간에 추가적으로 충진되어 혐기성 균의 활성을 위한 영양성분을 공급할 수 있다.
또한 제2 연동 펌프를 통해 지속적으로 호기성 세포 배양액이 다공성 멤브레인(60)의 하부 공간에 추가적으로 충진되어 호기성 세포 배지를 교환하여 호기성 세포의 배양 시간을 증가시킬 수 있다.
이와 같이 장 상피세포의 혐기성 균을 배양한 상태의 모식도를 도 5에 도시하였다.
도 5를 참고하면 상기 다공성 멤브레인(60)의 상면에는 장 상피세포(2)가 배양되어 있으며, 장 상피세포(2)의 상부 공간에는 장 상피세포 내 혐기성 균을 배양할 수 있는 혐기균 배양액(3)이 충진된다.
또한, 다공성 멤브레인(60)의 하부 공간에는 호기성 세포 배양액(4)이 충진된다.
도 5에 도시되지 않았으나, 본 발명의 세포 공배양장치의 각 포트홀을 기밀덮개로 각각 밀봉하여 배양하는 동안, 장 상피세포(2)의 하부 접촉 저면으로 상기 다공성 멤브레인(60)을 통해 산소가 일부 공급되는 조건이 되어 장 상피세포의 호기성 균이 배양될 수 있으며, 장 상피세포(2)의 상부 공간의 혐기성 배양액(3)에는 산소가 공급되지 않아 혐기성 균이 배양된다.
상기 다공성 멤브레인(60)은 세포 성장의 지지체의 역할을 할 뿐만 아니라 혐-호기성 배양액을 분리할 수 있다.
그 다음, S47단계와 같이 분석을 수행한다. 분석의 방법은 배양액 자체를 분석하거나, 세포 공배양장치(1)를 인산 완충용액으로 세척 후 장 상피세포와 미생물 세포의 단백질체 또는 대사체를 추출하여 숙주와 혐기성 미생물의 생리학적 상호작용을 분석할 수 있다.
즉, S46단계에서 배양된 혐기성 균과 호기성 균 각각은 장 상피세포(2)를 기준으로 상부 및 하부 공간에서 생육하면서 각종 단백질 등의 대사 결과물을 생성하게 된다. 특히 호기성 균 및 숙주 면역세포의 대사체는 다공성 멤브레인(6)을 통해 하부 공간으로 빠져나올 수 있어 제2포트홀(12)을 통해 시료를 채집하여 분석할 수 있다.
혐기성 균의 대사체는 제1포트홀(11)을 통해 시료를 채집하여 분석할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예로서, 상기 호기성 세포 배지(4)에 대식세포 등의 숙주 면역세포를 추가로 주입하여 배양, 분석할 수 있는데, 이는 본 발명의 세포 공배양장치(1)가 동물의 장기 환경을 그대로 모사한 것이어서, 장 상피세포를 중심으로 혐기성 장내 미생물-장 상피세포-면역세포간의 상호작용도 분석할 수 있다. 장 상피세포는 인간에서 유래된 것을 사용함이 바람직하다.
본 발명의 다양한 실시예로서, 장 상피세포(2)의 하부 공간에 면역세포, 대식세포를 주입하거나, 또는 장 상피세포(2)의 상부 공간에 유산균 또는 의약제를 추가로 주입하여 생리 활성 분석을 수행할 수 있다.
구체적으로 본 발명은 인체를 모사하여, 비피도박테리움(Bifidobacteirum) 종이나 락토바실러스(Lactobacillus) 종과 같은 프로바이오틱스를 처리하여 상호작용 관찰할 수 있다.
또한, 공배양장치를 사용하여 동물 실험모델에서의 연구 결과를 예측하는 용도로도 사용할 수 있다.
아울러 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile)와 장 상피세포 및 대식 세포(macrophage)를 공동 배양함으로써 병원균에 의한 생리적 변화 관찰 실험. 클로스트리디움 디피실레가 생성하는 세포 독소(cytotoxin)에 대한 장 상피세포와 대식 세포의 면역 시스템 프로세스를 관찰 할 수 있다.
그리고 혐기 미생물 배양 공간에 장내 미생물을 배양하며, 프락토올리고당(fructooligosaccharide)이나 이눌린(inulin)과 같은 프리바이오틱스를 처리함으로써 장내 미생물의 군집 변화를 확인할 수 있으며, 장내 미생물 군집의 변화에서 기인한 장 상피세포의 활성 변화 분석을 통해 프리바이오틱스의 효능을 연구할 수 있다.
본 발명은 상기 실시예에 한정되지 않고 본 발명의 기술적 요지를 벗어나지 아니하는 범위 내에서 다양하게 수정, 변형되어 실시될 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명한 것이다.

Claims (18)

  1. 각각 상하로 관통되는 제1포트홀과 제2포트홀을 포함하고, 상기 제1포트홀과 제2포트홀은 각각 제1기밀덮개와 제2기밀덮개로 밀폐되는 제1블록;
    상기 제1포트홀 및 제2포트홀과 각각 연통되는 제1홀 및 제2홀이 상하로 관통되며, 상기 제1블록의 하부에 결합되는 제2블록;
    상기 제2블록의 하부에 결합되며, 상기 제1홀 하부와 제2홀의 하부를 서로 연결하는 연결홈을 포함하는 제3블록; 및
    상기 제1포트홀 또는 상기 제1홀 내부에 위치하는 동물세포가 접종된 다공성 멤브레인을 포함하고,
    상기 다공성 멤브레인의 상부는 혐기 분위기 하에서 혐기성 미생물이 배양되고, 하부는 호기 분위기 하에서 호기성 미생물이 배양된 후,
    상기 혐기성 미생물의 대사체는 상기 제1포트홀을 통해 채집되고, 상기 호기성 미생물의 대사체는 상기 제2포트홀을 통해 채집되는 것을 특징으로 하는 세포 공배양장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 다공성 멤브레인은 상기 제1포트홀과 상기 제1홀 사이에 위치하는 것을 특징으로 하는 세포 공배양장치.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제1기밀덮개와 제2기밀덮개가 밀폐되는 둘레,
    상기 제1블록의 제1포트홀과 제2포트홀의 하부 둘레,
    상기 제2블록의 제1홀과 제2홀의 상부 둘레, 및
    상기 제3블록이 상기 제2블록과 결합하는 상부 둘레에 위치하는 기밀유지부를 더 포함하는 세포 공배양장치.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 제1블록, 제2블록 및 제3블록은,
    폴리카보네이트 재질인 것을 특징으로 하는 세포 공배양장치.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 다공성 멤브레인은,
    니트로셀룰로오스(Nitrocellulose), 폴리카보네이트 또는 폴리에스터인 것을 특징으로 하는 세포 공배양장치.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 다공성 멤브레인의 평균 기공크기는 0.2~10㎛인 것을 특징으로 하는 세포 공배양장치.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 동물세포는 장 상피세포인 것을 특징으로 하는 세포 공배양장치.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 다공성 멤브레인의 하부 공간에 면역세포가 배양되는 것을 특징으로 하는 세포 공배양장치.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 하부 공간에 면역세포 배양액이 추가로 더 구비되는 것을 특징으로 하는 세포 공배양장치.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 다공성 멤브레인의 상부 공간은 혐기성 세포가 접종되고, 하부 공간은 호기성 세포가 접종되되,
    상기 상부 공간과 상기 하부 공간은 각각 혐기성 세포 배양액과 호기성 세포 배양액이 추가로 더 구비되는 것을 특징으로 하는 세포 공배양장치.
  11. 상하로 관통되는 제1포트홀과 제2포트홀을 포함하는 제1블록;
    상기 제1포트홀 및 제2포트홀과 각각 연통되는 제1홀 및 제2홀이 상하로 관통되며, 상기 제1블록의 하부에 결합되는 제2블록;
    상기 제2블록의 하부에 결합되며, 상기 제1홀 하부와 제2홀의 하부를 서로 연결하는 연결홈을 포함하는 제3블록; 및
    상기 제1포트홀 또는 상기 제1홀 내부에 위치하는 다공성 멤브레인을 포함하는 세포 공배양장치를 이용하는 세포 공배양방법으로서,
    a) 상기 제1블록, 제2블록, 제3블록, 및 다공성 멤브레인을 각각 결합하는 단계;
    b) 상기 다공성 멤브레인 상부에 동물세포를 접종하여 배양하는 단계;
    c) 호기성 세포 배양액을 상기 제2포트홀을 통해 상기 다공성 멤브레인의 하부 공간에 주입하고, 상기 제2포트홀을 제2기밀덮개로 밀폐한 후 혐기 챔버에 거치하는 단계;
    d) 상기 혐기 챔버 내에서 상기 다공성 멤브레인 상부 공간이 혐기로 된 때에 혐기성 세포 배양액을 상기 제1포트홀을 통해 상기 다공성 멤브레인의 상부 공간에 주입하고, 상기 제1포트홀을 제1기밀덮개로 밀폐한 후 세포를 공배양하는 단계를 포함하고,
    상기 다공성 멤브레인 상부 공간의 혐기 분위기 하에서 혐기성 미생물을 배양하고, 하부 공간의 호기 분위기 하에서 호기성 미생물을 배양한 후,
    상기 혐기성 미생물의 대사체는 상기 제1포트홀을 통해 채집하고, 상기 호기성 미생물의 대사체는 상기 제2포트홀을 통해 채집하는 것을 특징으로 하는 세포 공배양방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 a)단계 이후에 상기 세포 공배양장치를 멸균처리하는 단계를 더 포함하는 세포 공배양방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 b)단계 이후에 세포 공배양장치의 내부를 멸균된 인산 완충용액으로 세척하는 단계를 더 포함하는 세포 공배양방법.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 호기성 세포 배양액과 혐기성 세포 배양액의 부피비는 6 내지 7 : 1인 것을 특징으로 하는 세포 공배양방법.
  15. 제11항에 있어서,
    상기 b)의 배양 단계는,
    CO2 배양기의 온도를 35 내지 38℃로 하고, 4 내지 6% CO2 환경에서 7일간 배양하는 것을 특징으로 하는 세포 공배양방법.
  16. 제11항에 있어서,
    상기 d)의 공배양 단계는,
    혐기 챔버의 온도를 35 내지 38℃로 하고, 90% N2, 5% CO2, 5% H2 환경에서 10 내지 13시간 배양하는 것을 특징으로 하는 세포 공배양방법.
  17. 제11항에 있어서,
    상기 세포 공배양장치는 상기 제1포트홀과 연통되는 혐기 챔버 외부의 제1 연동 펌프 및 상기 제2포트홀과 연통되는 혐기 챔버 외부의 제2 연동 펌프를 더 포함하고,
    상기 세포 공배양장치를 이용하는 세포 공배양 시간은,
    상기 제1 연동 펌프를 통해 혐기성 세포 배양액을 추가하거나, 또는 상기 제2 연동 펌프를 통해 호기성 세포 배양액을 추가하여 증가시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 세포 공배양방법.
  18. 제11항에 있어서,
    상기 c) 단계에서 상기 다공성 멤브레인의 하부 공간에 면역세포 또는 대식세포를 추가로 주입하거나, 상기 d) 단계에서 상기 다공성 멤브레인의 상부 공간에 유산균 또는 의약제를 추가로 주입하는 것을 특징으로 하는 세포 공배양방법.
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