WO2021091095A1 - 장내 환경 모사를 이용한 혐-호기성 세포 공배양장치 및 방법 - Google Patents

장내 환경 모사를 이용한 혐-호기성 세포 공배양장치 및 방법 Download PDF

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WO2021091095A1
WO2021091095A1 PCT/KR2020/013757 KR2020013757W WO2021091095A1 WO 2021091095 A1 WO2021091095 A1 WO 2021091095A1 KR 2020013757 W KR2020013757 W KR 2020013757W WO 2021091095 A1 WO2021091095 A1 WO 2021091095A1
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culture
hole
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anaerobic
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PCT/KR2020/013757
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김윤곤
송원석
김성민
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숭실대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to an apparatus and method for co-culture of anaerobic-aerobic cells using intestinal environment simulation, and in more detail, by culturing animal cells as a host on the upper surface of a porous membrane, and distinguishing between anaerobic bacteria and host immune cells, etc. And cultivate, analyze, or simulate and implement the anaerobic or aerobic environment inside and outside the intestine of animals to analyze the growth and physiological activity of each of the anaerobic and aerobic microorganisms in the intestine and the physiological interactions of the intestinal microorganisms, or physiological changes in pharmaceuticals, etc. It relates to a cell co-culture apparatus and method that can be used for prediction.
  • Korean Patent Registration 10-1618018B microbial complex culture device, registered on April 27, 2016
  • Korean Patent Registration 10-1618018B describes a device capable of culturing various microorganisms such as anaerobic or aerobic, but co-culture with intestinal cells is not possible. And, it does not describe the simultaneous cultivation of anaerobic and aerobic microorganisms.
  • the technical problem to be solved by the present invention is to provide a co-culture device capable of co-culture of anaerobic and aerobic cells, so that anaerobic bacteria and immune cells of a host can be classified and cultured and analyzed based on intestinal epithelial cells.
  • it is intended to provide a system capable of predicting and analyzing changes in intestinal physiological activity such as various physiological activity assays and pharmaceuticals by efficiently and easily co-culture at low cost by simulating the intestinal environment of anaerobic intestinal microorganisms.
  • another technical problem to be solved by the present invention is to provide a method for co-culture of anaerobic and aerobic cells capable of obtaining accurate analysis results consistent with the actual human phenotype by simulating the gaseous environment in the intestine as it is.
  • the cell co-cultivation apparatus for solving the above-described problems includes a first port hole and a second port hole respectively penetrating vertically, and the first port hole and the second port hole are each first gas tight.
  • a third block coupled to a lower portion of the second block and including a connection groove connecting a lower portion of the first hole and a lower portion of the second hole to each other, and an animal cell located inside the first port hole or the first hole It comprises a porous membrane inoculated, and the upper portion of the porous membrane is characterized in that the anaerobic atmosphere, the lower portion is an aerobic atmosphere.
  • the porous membrane may be positioned between the first port hole and the first hole.
  • the perimeter of the first airtight cover and the second airtight cover, the lower circumference of the first port hole and the second port hole of the first block, and the first hole and the second hole of the second block may further include an airtight holding unit positioned around an upper circumference and an upper circumference where the third block is coupled to the second block.
  • the first block, the second block, and the third block may be made of polycarbonate.
  • the porous membrane may be nitrocellulose, polycarbonate, or polyester.
  • the average pore size of the porous membrane may be 0.3 ⁇ 0.5 ⁇ m.
  • the animal cell may be an intestinal epithelial cell, but is not limited thereto.
  • anaerobic cells are inoculated in the upper space of the porous membrane, and aerobic cells are inoculated in the lower space, and the upper space and the lower space are further provided with anaerobic cell culture solutions and aerobic cell culture solutions, respectively.
  • anaerobic cell culture solutions and aerobic cell culture solutions respectively.
  • the cell co-culture device may further include a first peristaltic pump outside the anaerobic chamber communicating with the first port hole and a second peristaltic pump outside the anaerobic chamber communicating with the second port hole,
  • the cell co-culture time using the cell co-culture device may be increased by adding an anaerobic cell culture solution through the first peristaltic pump or by adding an aerobic cell culture solution through the second peristaltic pump.
  • a cell co-culture method includes a first block including a first port hole and a second port hole penetrating vertically, a first hole and a first hole communicating with the first port hole and the second port hole, respectively.
  • a second block having two holes penetrating up and down, coupled to a lower portion of the first block, coupled to a lower portion of the second block, and including a connection groove connecting the lower portion of the first hole and the lower portion of the second hole to each other.
  • a cell co-culture method using a cell co-culture device comprising a third block and a porous membrane positioned inside the first port hole or the first hole, a) the first block, the second block, the third block, And binding each of the porous membranes, b) inoculating and culturing animal cells on the porous membrane, c) injecting an aerobic cell culture solution into the lower space of the porous membrane through the second port hole, and anaerobic cell culture solution.
  • the first It may include the step of co-culturing the cells after sealing the porthole with the first hermetic cover.
  • it may further include a step of sterilizing the cell co-culture device, respectively, after steps a) and b).
  • the process of sterilizing the cell co-culture device may be washing the inside of the cell co-culture device with a sterilized phosphate buffer solution.
  • the volume ratio of the aerobic cell culture medium and the anaerobic cell culture medium may be 6 to 7: 1, but is not limited thereto.
  • the temperature of the CO 2 incubator is set to 35 to 38°C, and can be cultured for 7 days in a 4 to 6% CO 2 environment, preferably the CO 2 incubator The temperature of 37 °C, it can be cultured for 7 days in a 5% CO 2 environment.
  • the temperature of the anaerobic chamber in the co-culture step of d), is set to 35 to 38°C, and incubated for 10 to 13 hours in an environment of 90% N 2 , 5% CO 2 , 5% H 2 It can be, and preferably, the temperature of the anaerobic chamber is 37 °C, 90% N 2 , 5% CO 2 , It can be cultured for 12 hours in an environment of 5% H 2.
  • the cell co-culture device further comprises a first peristaltic pump outside the anaerobic chamber in communication with the first port hole and a second peristaltic pump outside the anaerobic chamber in communication with the second port hole, the The cell co-culture time using the cell co-culture device may be increased by adding an anaerobic cell culture solution through the first peristaltic pump or by adding an aerobic cell culture solution through the second peristaltic pump.
  • immune cells, macrophages, lactic acid bacteria, and pharmaceuticals may be additionally injected into the lower space of the porous membrane.
  • the present invention provides an apparatus capable of performing co-culture of anaerobic and aerobic cells, and by simulating the gaseous environment in the intestine as it is, there is an effect of increasing the reliability of analysis of physiological interactions of host-anaerobic intestinal microorganisms.
  • the present invention co-cultures anaerobic microorganisms and host immune cells to contact intestinal epithelial cells while culturing aerobic intestinal epithelial cells. There is an effect of obtaining an analysis result consistent with the phenotype.
  • the anaerobic and aerobic cell co-culture apparatus can perform co-culture of anaerobic and aerobic cells while simplifying the structure, thereby obtaining an analysis result with high reliability at a low price.
  • FIG. 1 is a perspective view of a cell co-culture apparatus according to a preferred embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 is an exploded perspective view of FIG. 1.
  • FIG. 3 is a cross-sectional view of A-A in a combined state of FIG. 1.
  • Figure 4 is a flow chart of the cell co-culture method of the present invention.
  • FIG. 5 is a schematic diagram of intestinal epithelial cells and anaerobic bacteria cultured.
  • first upper surface sealing portion 24 second upper surface sealing portion
  • first and second are used to describe various members, regions, and/or parts, but it is obvious that these members, parts, regions, layers and/or parts are not limited by these terms. . These terms do not imply any particular order, top or bottom, or superiority, and are only used to distinguish one member, region, or region from another member, region, or region. Accordingly, the first member, region, or region to be described below may refer to the second member, region, or region without departing from the teachings of the present invention.
  • FIG. 1 is a partial exploded perspective view of an anaerobic-aerobic cell co-culture apparatus using a simulation of an intestinal environment according to a preferred embodiment of the present invention
  • FIG. 2 is an exploded perspective view of FIG. 1
  • FIG. 3 is a cross-sectional view of a combined state of FIG. to be.
  • the cell co-culture apparatus 1 of the present invention includes three blocks stacked up and down.
  • the first block 10 on the uppermost layer includes a first port hole 11 and a second port hole 12 that are spaced apart from each other and provided vertically.
  • the first port hole 11 and the second port hole 12 are formed to completely penetrate the first block 10 vertically.
  • a plurality of fastening holes 70 are provided along the circumference of the first block 10, and the fastening holes 70 correspond to the second block 20 and the third block 30 to be described later.
  • the first block 10, the second block 20, and the third block 30 can be firmly coupled in a stacked state by using a fastening means provided at a position.
  • the fastening hole 70 may be formed with a tab, and the fastening means at this time may be a bolt.
  • the bolt is illustrated as a fastening means, but any means that can firmly fix the first block 10, the second block 20, and the third block 30 in a downward stacked state in the order of enumeration are irrelevant. Can be used.
  • the first bottom sealing part 13 may be an O-shaped ring installed around the bottom surface of the first port hole 11, and the second bottom sealing part 14 is an O-type ring installed around the bottom surface of the second port hole 12. It can be a type ring.
  • the second block 20 positioned below the first block 10 configured as described above includes a first hole 21 communicating with the first port hole 11 and a first hole 21 communicating with the second port hole 12. Two holes 22 are formed.
  • Both the first hole 21 and the second hole 22 are holes penetrating the second block 20 vertically.
  • a first insertion groove 25 and a second insertion groove 26 are formed along the circumference of the first hole 21 and the second hole 22 on the upper surface of the second block 20, and the first insertion groove The first upper surface sealing part 23 and the second upper surface sealing part 24 are inserted and fixed in the 25 and the second insertion groove 26, respectively.
  • the sealing structure of the present invention as described above is used for the purpose of preventing leakage of the culture medium and the purpose of preventing changes in properties of the culture medium, which will be described later.
  • the present invention uses a culture solution having aerobic and anaerobic properties, and is configured to block the entrance of oxygen to prevent the properties of the culture solution from being changed.
  • a porous membrane 60 is installed between the first hole 21 and the first port hole 11.
  • the porous membrane 60 may be made of nitrocellulose.
  • Polycarbonate or polyester may be used as the material of the porous membrane 60.
  • porous membrane 60 As another requirement of the porous membrane 60, it may be mentioned that the adhesion of cells is strengthened and that an element that interferes with protein analysis does not occur. Considering various conditions, the most suitable material is nitrocellulose.
  • the suitability of the porous membrane 60 when applied to the present invention is determined according to the size of the pores.
  • Animal cells such as intestinal epithelial cells as host cells are cultured and located above the porous membrane 60.
  • the anaerobic culture medium is located on the upper side of the porous membrane 60.
  • the supply of oxygen may be appropriately adjusted to aerobic cells existing in animal cells cultured on the membrane by the pore size of the porous membrane 60.
  • the average pore size of the porous membrane 60 is preferably 0.2 to 10 ⁇ m.
  • the average pore size of the porous membrane 60 when culturing intestinal anaerobic microbial cells in the upper space of host epithelial cells on the upper surface of the porous membrane 60 and co-culturing immune cells such as macrophages in the lower space, the average pore size of the porous membrane 60 The size may be 0.2 to 10 ⁇ m, but when co-culturing by inoculating anaerobic and aerobic microorganisms in the upper and lower spaces based on the host epithelial cells, the average pore size of the porous membrane 60 is adjusted to 0.2 to 0.5 ⁇ m. I can.
  • the porous membrane is provided at a predetermined position inside the first hole 21 or inside the first port hole 11 in addition to between the first hole 21 and the first port hole 11.
  • a predetermined inner circumferential groove may be installed in a predetermined position of and positioned therein.
  • the size of the anaerobic space and the aerobic space in the cell co-culture apparatus may be adjusted.
  • the upper space of the porous membrane is an anaerobic space
  • the lower space may be composed of an aerobic space
  • the porous membrane is formed of the first hole 21 and the first port hole 11.
  • the size of the space can be controlled depending on where it is provided.
  • the standard of the anaerobic atmosphere in the upper anaerobic space and the aerobic atmosphere in the lower aerobic space is the presence or absence of oxygen (O 2 ). That is, there is no oxygen under an anaerobic atmosphere, and there is oxygen under an aerobic atmosphere.
  • a connection groove 31 is formed on the upper surface of the third block 30 coupled to the lower portion of the second block 20.
  • connection groove 31 connects the lower side of the first hole 21 and the second hole 22 of the second block 20 to each other, and the porous membrane 60 By dividing the first port hole 11 side and the second port hole 12 side of the first block 10 on the basis of, it is possible to supply anaerobic and aerobic culture solutions, respectively.
  • the second port hole 12, the second hole 22, the connection groove 31, and the first hole 21 are in communication to expose the bottom surface of the porous membrane 60, and the first port hole 11 Through it, the upper surface of the porous membrane 60 may be exposed.
  • the second port hole 12, the second hole 22, the connection groove 31, and the first hole 21 are an aerobic culture solution, and the first port hole 11 is injected with an anaerobic culture solution.
  • an anaerobic culture solution is injected into the upper space and an aerobic culture solution is injected into the lower space.
  • a coupling groove 32 to which the airtight holding portion 33 is coupled is formed around the connection groove 31 of the third block 30.
  • the first airtight cover 40 is attached to the first port hole 11 and the second airtight cover 50 is coupled to the second port hole 12 to provide the air quality (anaerobic or exhaled) of each internal space and contained in each. Make sure that the properties of the culture medium are maintained.
  • the second airtight cover 50 is connected to the second port hole 12 in the state where the aerobic culture solution is injected, the inner space remains in an aerobic state, and the cell co-culture device is then used in the anaerobic chamber. Even if placed in the second port hole 12, the inside of the second port hole 12 may be maintained in an exhaled state.
  • O-rings 41 and 51 are provided in each of the first airtight cover 40 and the second airtight cover 50 to maintain airtightness.
  • the first block 10, the second block 20, the third block 30, the first hermetic cover 40 and the second hermetic cover 50 may be made of polycarbonate.
  • Polycarbonate can be autoclaved, has low cost and strong durability.
  • the first block 10, the second block 20, and the third block 30 are stacked and bonded to each other, but the porous membrane 60 is seated on the seating surface 27 of the second block 20 Combine with
  • the porous membrane 60 is located on the seating surface 27 of the second block 20, but in another embodiment, the inner space of the first block 10 and the second block 20 It can be configured to be located in any one of.
  • Figure 4 is a flow chart of a cell co-culture method as an embodiment of the present invention.
  • the step of sterilizing the cell co-culture device 1 at high temperature and high pressure (S41), the step of inoculating intestinal epithelial cells on the top of the porous membrane 60 (S42), and the cell co-culture device Injecting (1) into the incubator and culturing the intestinal epithelial cells (S43), washing the cell co-culture device (1) (S44), and adding an aerobic cell medium and an anaerobic bacteria culture medium (S45) ), and co-culturing anaerobic/aerobic cells having different characteristics in the cell co-culture device 1 in the anaerobic chamber (S46), and analyzing physiological interactions between intestinal cells and anaerobic bacteria (S47) ).
  • the step of adding an aerobic cell medium and an anaerobic bacteria culture medium includes first injecting an aerobic cell medium into the lower space of the porous membrane through the second port hole, The step of sealing the second port hole with a second gas tight cover to prevent oxygen from escaping, the step of moving and mounting the cell co-culture device (1) to the anaerobic chamber, and in the anaerobic chamber, the When the space above the porous membrane becomes anaerobic, injecting an anaerobic cell culture solution into the upper space of the porous membrane through the first port hole, and sealing the first port hole with a first gas tight cover so that oxygen cannot escape. It includes the step of ⁇ ).
  • an aerobic cell medium may be injected through each of the first port hole and the second port hole in a clean bench in an aerobic environment.
  • the aerobic cell medium injected on the upper portion of the porous membrane in the anaerobic chamber is removed, and the anaerobic cell culture solution is injected into the upper space of the porous membrane under anaerobic conditions.
  • the upper space of the porous membrane may be placed at least one day or longer to become anaerobic, but is not particularly limited thereto.
  • step S41 the cell co-culture apparatus 1 of the present invention in which the first block 10, the second block 20, the third block 30, and the porous membrane 60 are combined is sterilized at high temperature and high pressure.
  • high-pressure sterilization As an example of high-pressure, high-temperature sterilization, it is treated at 121°C and 15lb psi pressure for about 15 minutes.
  • intestinal epithelial cells are inoculated on the top of the porous membrane 60 of the cell co-culture device 1, which has been sterilized in step S42. At this time, about 2 million intestinal epithelial cells are adequate.
  • step S43 the cell co-culture apparatus 1 including the porous membrane 60 inoculated with the intestinal epithelial cells is introduced into a CO 2 incubator to culture the intestinal epithelial cells.
  • the temperature of the CO 2 incubator is 37°C and 5% CO 2 for 7 days, but is not limited thereto.
  • culture conditions such as temperature, internal gas, and period of the incubator may vary according to the characteristics of the animal cells inoculated on the porous membrane 60.
  • step S44 the cell co-culture device 1 in which the intestinal epithelial cells are cultured is taken out from the CO 2 incubator, and the inside is washed with a sterilized phosphate buffer saline. At this time, it is preferable to wash twice.
  • step S45 the aerobic cell medium and the anaerobic culture medium are added.
  • the aerobic cell medium is injected into the second port hole 12 and moves to the second hole 22, the connection groove 31, and the first hole 21, which are mutually communicated with the second port hole 12. Then, the aerobic cell culture solution is filled in the lower space based on the porous membrane 60.
  • the aerobic cell medium may be injected into the first port hole 11 of the first block 10 and filled in the upper space of the porous membrane 60.
  • the second port hole 12 is sealed so that oxygen cannot escape, and then it is moved to the anaerobic chamber to mount the space above the porous membrane of the cell co-culture device under anaerobic conditions. Then, when the anaerobic state is reached, the anaerobic bacteria culture solution is injected into the first port hole 11 of the first block 10 and filled in the upper space of the porous membrane 60. In the embodiment in which the aerobic cell medium is also filled in the upper space of the porous membrane 60, the anaerobic culture medium injected at this time replaces the aerobic cell medium.
  • an anaerobic culture solution is added to the upper side of the porous membrane 60 in which the intestinal epithelial cells, which are the first port holes 11, are cultured, and an aerobic cell medium is introduced through the second port hole 12 to form the porous membrane 60.
  • the bottom of the aerobic cell medium is in contact.
  • the second port hole 12 After injecting the aerobic cell medium through the second port hole 12, the second port hole 12 is covered with a second hermetic cover 50. This is to maintain the internal gas of the second port hole 12, the second hole 22, the connection groove 31, and the first hole 21 communicated in an exhaled atmosphere with oxygen.
  • oxygen diffuses into the anaerobic chamber from the inner space of the first port hole 11, that is, the upper space of the porous membrane 60, and is anaerobic without oxygen. It becomes a condition.
  • the first port hole 11 is covered with the first gas tight cover 40 to maintain the inner space of the first port hole 11 in an anaerobic atmosphere.
  • the first port hole 11 of the first block 10 is an anaerobic atmosphere
  • the second port hole 12, the second hole 22, the connection groove 31, and the first One hole 21 is maintained in an aerobic atmosphere, and aerobic and anaerobic cells can be co-cultured.
  • it is not necessarily limited to this embodiment, and various embodiments of the space arrangement of an anaerobic atmosphere and an aerobic atmosphere are possible according to the position of the porous membrane 60.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the volume ratio of the anaerobic bacteria culture medium and the aerobic bacteria culture medium may be injected in the range of 1:6 to 1:7.
  • the cell co-culture apparatus 1 of the present invention is cultured in an anaerobic chamber as in step S46.
  • Conditions of the anaerobic chamber are preferably 90% N 2 , 5% CO 2 , and 5% H 2 environments at 37° C., but are not necessarily limited thereto.
  • the time to be cultured in the anaerobic chamber is the time during which the anaerobic and aerobic spaces are maintained in the cell co-culture device (1).
  • oxygen is insufficient in the lower space of the porous membrane 60, an environment in which aerobic bacteria can no longer grow, and various methods of oxygen injection for maintaining an aerobic atmosphere can be used depending on the characteristics of the aerobic bacteria.
  • the culture time may be increased or adjusted using at least one peristaltic pump that communicates with the outside of the anaerobic chamber during culture.
  • the anaerobic cell culture solution can be added through the first peristaltic pump outside the anaerobic chamber communicating with the first port hole 11 of the cell co-culture device 1, and the second port hole of the cell co-culture device 1 (12)
  • the aerobic cell culture solution may be added through a second peristaltic pump outside the anaerobic chamber which is communicated with.
  • the anaerobic cell culture solution is continuously filled in the upper space of the porous membrane 60 through the first peristaltic pump to supply nutrients for the activity of anaerobic bacteria.
  • the aerobic cell culture medium is continuously filled in the lower space of the porous membrane 60 through the second peristaltic pump to exchange the aerobic cell medium, thereby increasing the culture time of the aerobic cells.
  • FIG. 5 A schematic diagram of a state in which anaerobic bacteria of intestinal epithelial cells are cultured is shown in FIG. 5.
  • intestinal epithelial cells 2 are cultured on the upper surface of the porous membrane 60, and anaerobic bacteria culture solution capable of culturing anaerobic bacteria in intestinal epithelial cells ( 3) is filled.
  • the aerobic cell culture solution 4 is filled in the lower space of the porous membrane 60.
  • the porous membrane 60 not only serves as a support for cell growth, but also can separate the anaerobic-aerobic culture medium.
  • the method of analysis is to analyze the culture medium itself, or wash the cell co-culture device (1) with a phosphate buffer solution, and then extract protein bodies or metabolites of intestinal epithelial cells and microbial cells to analyze the physiological interaction of the host and anaerobic microorganisms I can.
  • each of the anaerobic bacteria and aerobic bacteria cultured in step S46 grows in the upper and lower spaces based on the intestinal epithelial cells (2) to generate metabolic products such as various proteins.
  • aerobic bacteria and metabolites of host immune cells can escape to the lower space through the porous membrane 6, and thus samples can be collected and analyzed through the second port hole 12.
  • Metabolites of anaerobic bacteria can be analyzed by collecting a sample through the first port hole 11.
  • host immune cells such as macrophages may be additionally injected into the aerobic cell medium 4 to be cultured and analyzed. Since the environment is simulated as it is, the interaction between anaerobic intestinal microbes-intestinal epithelial cells-immune cells can also be analyzed, centering on intestinal epithelial cells. It is preferable to use human-derived intestinal epithelial cells.
  • immune cells and macrophages are injected into the lower space of the intestinal epithelial cells (2), or lactic acid bacteria or pharmaceuticals are additionally injected into the upper space of the intestinal epithelial cells (2) to analyze physiological activity. You can do it.
  • the present invention simulates the human body, and the interaction can be observed by treating probiotics such as Bifidobacteirum species or Lactobacillus species.
  • prebiotics such as fructooligosaccharide or inulin
  • the present invention provides an apparatus capable of performing anaerobic and aerobic co-culture by providing a mechanical structure using natural laws, and by simulating the gaseous environment in the intestine as it is, the reliability of the analysis of the physiological interaction of the host-anaerobic intestinal microorganisms As something that can be improved, there is a possibility of industrial use.

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Abstract

본 발명은 세포 공배양장치 및 방법에 관한 것으로, 본 발명은 각각 상하로 관통되는 제1포트홀과 제2포트홀을 포함하고, 상기 제1포트홀과 제2포트홀은 각각 제1기밀덮개와 제2기밀덮개로 밀폐되는 제1블록, 상기 제1포트홀 및 제2포트홀과 각각 연통되는 제1홀 및 제2홀이 상하로 관통되며, 상기 제1블록의 하부에 결합되는 제2블록, 상기 제2블록의 하부에 결합되며, 상기 제1홀 하부와 제2홀의 하부를 서로 연결하는 연결홈을 포함하는 제3블록, 및 상기 제1포트홀 또는 상기 제1홀 내부에 위치하는 동물세포가 접종된 다공성 멤브레인을 포함하고, 상기 다공성 멤브레인의 상부는 혐기 분위기이고, 하부는 호기 분위기인 것을 특징으로 한다.

Description

장내 환경 모사를 이용한 혐-호기성 세포 공배양장치 및 방법
본 발명은 장내 환경 모사를 이용한 혐-호기성 세포 공배양장치 및 방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 다공성 멤브레인 상부면에 숙주인 동물세포를 배양하고 이를 기준으로 혐기균과 숙주의 면역세포 등을 구분하여 배양, 분석하거나, 동물의 장 내외부의 혐기성 또는 호기성 환경을 모사, 구현하여 장내 혐기성과 호기성 미생물 각각의 생육 및 생리학적 활동과 장내 미생물의 생리학적 상호 작용을 분석하거나, 의약제 등의 생리적 변화 예측에 활용할 수 있는 세포 공배양장치 및 방법에 관한 것이다.
전통적으로 숙주-혐기성 장내 미생물의 생리학적 상호작용을 분석하기 위해서는 마우스 등을 이용한 동물 실험모델을 사용하였다.
하지만, 동물 실험모델의 활용이 고비용 및 고강도의 노동력이 요구되며, 원하는 결과를 얻기 위해 많은 시간을 투자해야 하는 문제점이 있었다.
또한, 동물 실험모델은 유전적으로 인간과 상이하기 때문에 결과에 대한 신뢰성이 저하되는 문제점이 있었다.
따라서, 이러한 동물 실험모델을 사용하지 않고 인간의 장세포를 체외에서 배양하여, 장내 미생물의 생리학적 상호작용을 분석하는 방법이 요구되고 있다.
관련 선행기술로서 대한민국 등록특허 10-1618018B(미생물 복합 배양장치, 2016년 4월 27일 등록)에는 혐기성 또는 호기성 등 다양한 미생물을 배양할 수 있는 장치가 기재되어 있으나, 장 세포와의 공배양은 불가능하며, 혐기성과 호기성 미생물을 동시에 배양하는 것에 대해서는 기재하지 않고 있다.
다른 방법으로, 트랜스웰(transwell) 타입의 배양기를 이용하여 호기성 환경에서 장내 미생물과 장 상피세포와의 상호 작용을 연구하는 방법이 제안되었으나, 혐-호기 공배양이 불가능하여 장내 극소수의 호기성 또는 통성혐기성 미생물을 제외하고는 숙주세포와 공배양하지 못할 뿐만 아니라 장내 기체 환경을 모사하지 못하기 때문에 실제 인체 내 표현형과 상이한 분석 결과가 도출될 수 있는 문제점이 있었다.
본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는, 혐기성과 호기성 세포의 공배양이 가능한 공배양장치를 제공함으로써, 장 상피 세포를 기준으로 혐기균과 숙주의 면역세포 등을 구분하여 배양, 분석할 수 있다. 아울러 혐-호기성 장내 미생물을 장내 환경을 모사하여 저비용으로 효율적이고 용이하게 공배양함으로써, 다양한 생리활성 분석과 의약제 등의 장내 생리적 활성 변화를 예측, 분석할 수 있는 시스템을 제공함에 있다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 기술적 과제는, 장내 기체 환경을 그대로 모사하여 실제 인체 내 표현형과 일치하는 정확한 분석결과를 얻을 수 있는 혐기성 및 호기성 세포의 공배양 방법을 제공함에 있다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일측면에 따른 세포 공배양장치는, 각각 상하로 관통되는 제1포트홀과 제2포트홀을 포함하고, 상기 제1포트홀과 제2포트홀은 각각 제1기밀덮개와 제2기밀덮개로 밀폐되는 제1블록, 상기 제1포트홀 및 제2포트홀과 각각 연통되는 제1홀 및 제2홀이 상하로 관통되며, 상기 제1블록의 하부에 결합되는 제2블록, 상기 제2블록의 하부에 결합되며, 상기 제1홀 하부와 제2홀의 하부를 서로 연결하는 연결홈을 포함하는 제3블록, 및 상기 제1포트홀 또는 상기 제1홀 내부에 위치하는 동물세포가 접종된 다공성 멤브레인을 포함하고, 상기 다공성 멤브레인의 상부는 혐기 분위기이고, 하부는 호기 분위기인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 실시예에서, 상기 다공성 멤브레인은 상기 제1포트홀과 상기 제1홀 사이에 위치할 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 상기 제1기밀덮개와 제2기밀덮개가 밀폐되는 둘레, 상기 제1블록의 제1포트홀과 제2포트홀의 하부 둘레, 상기 제2블록의 제1홀과 제2홀의 상부 둘레, 및 상기 제3블록이 상기 제2블록과 결합하는 상부 둘레에 위치하는 기밀유지부를 더 포함하는 할 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 상기 제1블록, 제2블록 및 제3블록은, 폴리카보네이트 재질일 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 상기 다공성 멤브레인은, 니트로셀룰로오스(Nitrocellulose), 폴리카보네이트 또는 폴리에스터일 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 상기 다공성 멤브레인의 평균 기공크기는 0.3~0.5㎛인 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 상기 동물세포는 장 상피세포일 수 있지만 이에 반드시 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 실시예에서, 상기 다공성 멤브레인의 상부 공간은 혐기성 세포가 접종되고, 하부 공간은 호기성 세포가 접종되되, 상기 상부 공간과 상기 하부 공간은 각각 혐기성 세포 배양액과 호기성 세포 배양액이 추가로 더 구비될 수 있다.
이를 위하여 일 실시예로서 상기 세포 공배양장치는 상기 제1포트홀과 연통되는 혐기 챔버 외부의 제1 연동 펌프 및 상기 제2포트홀과 연통되는 혐기 챔버 외부의 제2 연동 펌프를 더 포함할 수 있는데, 상기 세포 공배양장치를 이용하는 세포 공배양 시간은 상기 제1 연동 펌프를 통해 혐기성 세포 배양액을 추가하거나, 또는 상기 제2 연동 펌프를 통해 호기성 세포 배양액을 추가하여 증가시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 측면에 따른 세포 공배양방법은, 상하로 관통되는 제1포트홀과 제2포트홀을 포함하는 제1블록, 상기 제1포트홀 및 제2포트홀과 각각 연통되는 제1홀 및 제2홀이 상하로 관통되며, 상기 제1블록의 하부에 결합되는 제2블록, 상기 제2블록의 하부에 결합되며, 상기 제1홀 하부와 제2홀의 하부를 서로 연결하는 연결홈을 포함하는 제3블록, 및 상기 제1포트홀 또는 상기 제1홀 내부에 위치하는 다공성 멤브레인을 포함하는 세포 공배양장치를 이용하는 세포 공배양방법으로서, a) 상기 제1블록, 제2블록, 제3블록, 및 다공성 멤브레인을 각각 결합하는 단계, b) 상기 다공성 멤브레인 상부에 동물세포를 접종하여 배양하는 단계, c) 호기성 세포 배양액을 상기 제2포트홀을 통해 상기 다공성 멤브레인의 하부 공간에 주입하고, 혐기성 세포 배양액을 상기 제1포트홀을 통해 상기 다공성 멤브레인의 상부 공간에 주입하는 단계, d) 상기 제2포트홀을 제2기밀덮개로 밀폐하고, 혐기 챔버 내에서 상기 다공성 멤브레인 상부 공간이 혐기로 된 때에 상기 제1포트홀을 제1기밀덮개로 밀폐한 후 세포를 공배양하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 상기 a)단계와 b)단계 이후에 각각 상기 세포 공배양장치를 멸균처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
특히 b) 단계를 수행한 후, 상기 세포 공배양장치를 멸균처리하는 과정은 세포 공배양장치의 내부를 멸균된 인산 완충용액으로 세척하는 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 상기 호기성 세포 배양액과 혐기성 세포 배양액의 부피비는 6 내지 7 : 1일수 있으나 이에 반드시 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 실시예에서, 상기 b)의 배양 단계는, CO2 배양기의 온도를 35 내지 38℃로 하고, 4 내지 6% CO2 환경에서 7일간 배양할 수 있으며, 바람직하게는 상기 CO2 배양기의 온도를 37℃로 하고, 5% CO2 환경에서 7일간 배양할 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 상기 d)의 공배양 단계는, 혐기 챔버의 온도를 35 내지 38℃로 하고, 90% N2, 5% CO2, 5% H2 환경에서 10 내지 13시간 배양할 수 있으며, 바람직하게는 상기 혐기 챔버의 온도를 37℃로 하고, 90% N2, 5% CO2, 5% H2 환경에서 12시간 배양할 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 상기 세포 공배양장치는 상기 제1포트홀과 연통되는 혐기 챔버 외부의 제1 연동 펌프 및 상기 제2포트홀과 연통되는 혐기 챔버 외부의 제2 연동 펌프를 더 포함하고, 상기 세포 공배양장치를 이용하는 세포 공배양 시간은, 상기 제1 연동 펌프를 통해 혐기성 세포 배양액을 추가하거나, 또는 상기 제2 연동 펌프를 통해 호기성 세포 배양액을 추가하여 증가시킬 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 상기 c) 단계에서 상기 다공성 멤브레인의 하부 공간에는 면역세포, 대식세포, 유산균, 의약제를 추가로 주입할 수 있다.
본 발명은 혐기성 및 호기성 세포의 공배양을 수행할 수 있는 장치를 제공하여, 장내 기체 환경을 그대로 모사하여, 숙주-혐기성 장내 미생물의 생리학적 상호 작용 분석의 신뢰성을 높일 수 있는 효과가 있다.
좀 더 구체적으로, 본 발명은 호기성인 장 상피세포를 배양함과 아울러 장 상피 세포에 접하도록 혐기성 미생물과 숙주 면역세포 등을 공배양하여, 인체의 장내 미생물의 생리학적 상호 작용에 대한 실제 인체 내 표현형과 일치하는 분석 결과를 얻을 수 있는 효과가 있다.
아울러 본 발명은 혐기성 및 호기성 세포 공배양장치는 구조를 단순화하면서도 혐기성 및 호기성 세포의 공배양을 수행할 수 있어, 저가격으로 높은 신뢰성을 가지는 분석 결과를 얻을 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 세포 공배양장치의 사시도이다.
도 2는 도 1의 분해 사시도이다.
도 3은 도 1의 결합상태 A-A 단면도이다.
도 4는 본 발명 세포 공배양방법의 순서도이다.
도 5는 장 상피세포와 혐기성의 균을 배양한 상태의 모식도이다.
- 도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명 -
10:제1블록 11:제1포트홀
12:제2포트홀 13:제1저면실링부
14:제2저면실링부 20:제2블록
21:제1홀 22:제2홀
23:제1상면실링부 24:제2상면실링부
25:제1삽입홈 26:제2삽입홈
30:제3블록 40:제1기밀덮개
50:제2기밀덮개 60:다공성 멤브레인
70:체결공
이하, 본 발명 장내 환경 모사를 이용한 혐-호기성 세포 공배양장치 및 방법에 대하여 첨부한 도면을 참조하여 상세히 설명한다.
본 발명의 실시 예들은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이며, 아래에 설명되는 실시 예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래의 실시 예들로 한정되는 것은 아니다. 오히려, 이들 실시 예는 본 발명을 더욱 충실하고 완전하게 하며 당업자에게 본 발명의 사상을 완전하게 전달하기 위하여 제공되는 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시 예를 설명하기 위하여 사용되며, 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 단수 형태는 문맥상 다른 경우를 분명히 지적하는 것이 아니라면, 복수의 형태를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 경우 "포함한다(comprise)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급한 형상들, 숫자, 단계, 동작, 부재, 요소 및/또는 이들 그룹의 존재를 특정하는 것이며, 하나 이상의 다른 형상, 숫자, 동작, 부재, 요소 및/또는 그룹들의 존재 또는 부가를 배제하는 것이 아니다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "및/또는"은 해당 열거된 항목 중 어느 하나 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다.　
본 명세서에서 제1, 제2 등의 용어가 다양한 부재, 영역 및/또는 부위들을 설명하기 위하여 사용되지만, 이들 부재, 부품, 영역, 층들 및/또는 부위들은 이들 용어에 의해 한정되지 않음은 자명하다. 이들 용어는 특정 순서나 상하, 또는 우열을 의미하지 않으며, 하나의 부재, 영역 또는 부위를 다른 부재, 영역 또는 부위와 구별하기 위하여만 사용된다. 따라서, 이하 상술할 제1 부재, 영역 또는 부위는 본 발명의 가르침으로부터 벗어나지 않고서도 제2 부재, 영역 또는 부위를 지칭할 수 있다.
이하, 본 발명의 실시 예들은 본 발명의 실시 예들을 개략적으로 도시하는 도면들을 참조하여 설명한다. 도면들에 있어서, 예를 들면, 제조 기술 및/또는 공차에 따라, 도시된 형상의 변형들이 예상될 수 있다. 따라서, 본 발명의 실시 예는 본 명세서에 도시된 영역의 특정 형상에 제한된 것으로 해석되어서는 아니 되며, 예를 들면 제조상 초래되는 형상의 변화를 포함하여야 한다.
도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 장내 환경 모사를 이용한 혐-호기성 세포 공배양장치의 일부 분해 사시도이고, 도 2는 도 1의 분해 사시도이며, 도 3은 도 1의 결합상태 단면 구성도이다.
도 1 내지 도 3을 각각 참조하면, 본 발명 세포 공배양장치(1)는, 상하로 적층되는 세개의 블록을 포함한다. 제일 상층의 제1블록(10)은 상호 이격되며 상하로 마련된 제1포트홀(11) 및 제2포트홀(12)을 포함한다.
상기 제1포트홀(11) 및 제2포트홀(12)은 제1블록(10)을 상하로 완전히 관통하여 형성된다.
상기 제1블록(10)의 둘레를 따라서는 체결공(70)이 다수로 마련되어 있으며, 이 체결공(70)은 이후에 설명할 제2블록(20)과 제3블록(30)에도 대응하는 위치에 마련되어 체결 수단을 이용하여 제1블록(10), 제2블록(20) 및 제3블록(30)이 적층된 상태에서 견고하게 결합할 수 있다.
상기 체결공(70)은 탭이 형성된 것일 수 있으며, 이때의 체결 수단은 볼트가 될 수 있다.
위의 예에서는 체결 수단으로 볼트를 예시하였으나, 제1블록(10), 제2블록(20) 및 제3블록(30)을 열거 순으로 하향 적층한 상태로 견고하게 고정할 수 있는 수단이면 무관하게 사용할 수 있다.
상기 제1블록(10)의 저면에는 제1저면실링부(13)와 제2저면실링부(14)가 삽입되는 삽입홀이 형성된 것으로 한다.
상기 제1저면실링부(13)는 제1포트홀(11)의 저면 둘레에 설치되는 O형 링일 수 있으며, 제2저면실링부(14)는 제2포트홀(12)의 저면 둘레에 설치되는 O형 링일 수 있다.
이와 같이 구성되는 제1블록(10)의 하부에 위치하는 제2블록(20)은 상기 제1포트홀(11)과 연통되는 제1홀(21)과, 제2포트홀(12)에 연통되는 제2홀(22)이 형성되어 있다.
제1홀(21)과 제2홀(22)은 모두 제2블록(20)을 상하로 관통하는 홀이다.
제2블록(20)의 상면에서 제1홀(21)과 제2홀(22)의 둘레를 따라 제1삽입홈(25)과 제2삽입홈(26)이 형성되어 있으며, 제1삽입홈(25)과 제2삽입홈(26)에는 각각 제1상면실링부(23)와 제2상면실링부(24)가 삽입 고정된다.
제1블록(10)과 제2블록(20)의 결합상태에서 상기 제1상면실링부(23)는 제1저면실링부(13)와 접하게 되며, 제2상면실링부(24)는 제2저면실링부(14)와 접하게 된다.
상기와 같은 본 발명의 실링 구조는 이후 설명할 배양액의 누설을 방지할 목적 및 배양액의 성질 변화를 방지할 목적으로 사용된다.
즉, 본 발명은 호기성과 혐기성의 성질을 가지는 배양액을 사용하며, 그 배양액의 성질이 변화되는 것을 막기 위해 산소의 출입을 차단하도록 구성된다.
상기 제1홀(21)과 제1포트홀(11)의 사이에는 다공성 멤브레인(60)을 설치한다. 다공성 멤브레인(60)은 니트로셀룰로오스(Nitrocellulose)를 사용할 수 있다.
특히 다공성의 소재를 사용함으로써, 이후 상세히 설명할 호기성과 혐기성 세포의 배양이 가능하게 된다.
다공성 멤브레인(60)의 소재로는 폴리카보네이트 또는 폴리에스터를 사용할 수도 있다.
다공성 멤브레인(60)의 다른 요구 조건으로, 세포의 부착력 강화 및 단백질 분석의 방해 요소가 발생하지 않는 것을 꼽을 수 있다. 여러 가지 조건들을 고려할 때 가장 적합한 소재는 니트로셀룰로오스이다.
또한, 다공성 멤브레인(60)은 기공의 크기에 따라 본 발명에 적용하였을 때 적합도가 결정된다. 다공성 멤브레인(60)의 상부에는 숙주세포로서 장 상피세포 등과 같은 동물세포가 배양되어 위치하게 된다. 다공성 멤브레인(60)의 상부측은 혐기성 배양액이 위치하게 된다.
이때 다공성 멤브레인(60)의 기공 크기에 의해 멤브레인 상에 배양된 동물 세포 내에 존재하는 호기성 세포에도 적절하게 산소의 공급이 조절될 수 있다. 이를 위하여 다공성 멤브레인(60)의 평균 기공의 크기는 0.2~10㎛인 것이 바람직하다.
구체적으로 다공성 멤브레인(60)의 상부면의 숙주 상피세포의 상부 공간에 장내 혐기성 미생물 세포를 배양하고, 하부 공간에 대식세포 등과 같은 면역세포를 공동 배양하는 경우, 다공성 멤브레인(60)의 평균 기공의 크기는 0.2~10㎛일 수 있으나, 숙주 상피세포를 기준으로 상하부 공간에 각각 혐기성 미생물과 호기성 미생물을 접종하여 공동 배양할 경우에는 다공성 멤브레인(60)의 평균 기공의 크기는 0.2~0.5㎛로 조정할 수 있다.
상기 다공성 멤브레인(60)의 안정적인 장착을 위하여 상기 제2블록(20)의 제1홀(21)의 상부측 둘레에는 제2블록(20)의 상면 높이보다 낮은 단차면인 안착면(27)이 형성될 수 있다.
도면에 도시되어 있지 않으나, 다른 실시예로서 상기 다공성 멤브레인은 제1홀(21)과 제1포트홀(11)의 사이 외에 제1홀(21) 내부의 소정의 위치 또는 제1포트홀(11) 내부의 소정의 위치에 소정의 내부 둘레 홈을 설치하고 이에 위치될 수 있다.
상기 다공성 멤브레인의 위치에 따라 세포 공배양장치에 있어서 혐기적 공간과 호기적 공간의 크기가 조절될 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 다공성 멤브레인의 상부 공간이 혐기 공간이고, 하부 공간이 호기 공간으로 구성될 수 있는데, 상기 다공성 멤브레인이 제1홀(21)과 제1포트홀(11)의 내부 중 어느 위치에 구비되는가에 따라서 공간의 크기를 제어할 수 있다.
상기 상부의 혐기 공간의 혐기 분위기와 하부의 호기 공간의 호기 분위기의 기준은 산소(O2)의 유무이다. 즉, 혐기 분위기 하에서는 산소가 없으며, 호기 분위기 하에서는 산소가 있다.
상기 제2블록(20)의 하부에 결합되는 제3블록(30)의 상면에는 연결홈(31)이 형성된다.
도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이 상기 연결홈(31)은 제2블록(20)의 제1홀(21)과 제2홀(22)의 하부측을 서로 연결하는 것으로, 상기 다공성 멤브레인(60)을 기준으로 제1블록(10)의 제1포트홀(11)측과 제2포트홀(12)측을 구분하여, 각각 혐기성과 호기성의 배양액을 공급할 수 있다.
즉, 제2포트홀(12), 제2홀(22), 연결홈(31) 및 제1홀(21)이 연통되어 상기 다공성 멤브레인(60)의 저면을 노출시키고, 제1포트홀(11)을 통해 다공성 멤브레인(60)의 상면을 노출시킬 수 있다.
상기 제2포트홀(12), 제2홀(22), 연결홈(31) 및 제1홀(21)은 호기성 배양액, 제1포트홀(11)에는 혐기성 배양액이 주입되게 된다.
즉, 다공성 멤브레인(60)의 위치를 기준으로 볼 때, 상부 공간에는 혐기성 배양액이, 하부 공간에는 호기성 배양액이 주입되게 된다.
제3블록(30)의 연결홈(31) 주변 둘레에는 기밀유지부(33)가 결합되는 결합홈(32)이 형성된다.
상기 제1포트홀(11)에는 제1기밀덮개(40)를, 제2포트홀(12)에는 제2기밀덮개(50)를 결합하여 각각의 내부 공간의 공기 성질(혐기 또는 호기)과 각각에 담긴 배양액의 성질이 유지되도록 한다.
즉, 제1포트홀(11) 내부에 혐기성 배양액이 주입된 상태에서 세포 공배양장치 전체를 혐기 챔버에 두면 제1포트홀(11) 내부의 산소는 확산되어 없어지기 때문에 혐기 상태가 되는데, 이때 제1기밀덮개(40)를 결합하여 내부의 혐기 공간이 유지되게 된다.
또한, 제2포트홀(12)에 호기성 배양액이 주입된 상태에서 바로 제2기밀덮개(50)를 결합시키면, 그 내부 공간은 산소가 그대로 있어 호기 상태가 되는 바, 이후 세포 공배양장치를 혐기 챔버에 두더라도 제2포트홀(12) 내부는 호기 상태가 유지될 수 있다.
제1기밀덮개(40)와 제2기밀덮개(50) 각각에는 오링(41,51)이 마련되어 기밀을 유지할 수 있다.
상기 제1블록(10), 제2블록(20), 제3블록(30), 제1기밀덮개(40) 및 제2기밀덮개(50)는 폴리카보네이트 재질을 사용할 수 있다. 폴리카보네이트는 고압멸균이 가능하며, 비용이 저렴하고 내구성이 강한 특징이 있다.
이하에서는 상기와 같이 구성되는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 세포 공배양장치를 이용하여 하나의 장치에서 혐기성 미생물과 호기성 미생물을 공배양하는 방법에 대하여 구체적으로 설명한다.
먼저, 제1블록(10), 제2블록(20) 및 제3블록(30)을 상호 적층 결합하되, 제2블록(20)의 안착면(27)에 다공성 멤브레인(60)이 안착된 상태로 결합한다.
본 발명의 바람직한 일 실시예로서 다공성 멤브레인(60)이 제2블록(20)의 안착면(27)에 위치하고 있으나, 다른 실시예에서는 제1블록(10)과 제2블록(20)의 내부 공간 중 어느 하나에 위치하도록 구성될 수 있다.
도 4는 본 발명의 일 실시예로서의 세포 공배양방법의 순서도이다.
도 4를 참조하면, 세포 공배양장치(1)를 고온, 고압에서 멸균하는 단계(S41)와, 다공성 멤브레인(60)의 상부에 장 상피세포를 접종하는 단계(S42)와, 세포 공배양장치(1)를 배양기에 투입하고 장 상피세포를 배양하는 단계(S43)와, 세포 공배양장치(1)를 세척하는 단계(S44)와, 호기성 세포 배지와 혐기균 배양액을 각각 투입하는 단계(S45)와, 혐기 챔버 내에서 세포 공배양장치(1)에 각각 특성이 다른 혐/호기성 세포를 공배양하는 단계(S46)와, 장세포와 혐기성 균 등의 생리학적 상호 작용을 분석하는 단계(S47)를 포함한다.
특히 도 4에 구체적으로 도시하지 않았으나, 호기성 세포 배지와 혐기균 배양액을 각각 투입하는 단계(S45)는, 먼저 호기성 세포 배지를 상기 제2포트홀을 통해 상기 다공성 멤브레인의 하부 공간에 주입하는 단계와, 상기 제2포트홀을 제2기밀덮개로 밀폐하여 산소가 빠져나가지 못하도록 기밀(氣密)하는 단계와, 세포 공배양장치(1)를 혐기 챔버로 이동하여 거치하는 단계와, 상기 혐기 챔버 내에서 상기 다공성 멤브레인 상부 공간이 혐기로 된 때에 혐기성 세포 배양액을 상기 제1포트홀을 통해 상기 다공성 멤브레인의 상부 공간에 주입하는 단계와, 상기 제1포트홀을 제1기밀덮개로 밀폐하여 산소가 빠져나가지 못하도록 기밀(氣密)하는 단계를 포함한다.
도 4의 다른 실시예에 따르면, 세포 공배양기의 세척(S44) 이후에 호기성 환경의 클린벤치에서 호기성 세포 배지를 제1포트홀과 제2포트홀 각각을 통해 주입할 수 있다. 그럴 경우 제2포트홀 밀폐 후 혐기 챔버 내에서 다공성 멤브레인의 상부에 주입된 상기 호기성 세포 배지는 제거하고, 혐기 조건이 된 상태에서 혐기성 세포 배양액을 다공성 멤브레인의 상부 공간에 주입하게 된다. 이때 다공성 멤브레인의 상부 공간이 혐기 조건이 되기 위해 적어도 하루 이상 거치할 수 있으나 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
이러한 본 발명 세포 공배양방법을 이하에서 좀 더 구체적으로 설명하기로 한다.
먼저, S41단계에서 제1블록(10), 제2블록(20), 제3블록(30) 및 다공성 멤브레인(60)이 결합된 본 발명 세포 공배양장치(1)를 고온 고압에서 멸균한다.
고압, 고온 멸균의 일례로 121℃의 온도와 15lb psi 압력에서 15분 정도 처리한다.
그 다음, S42단계에서 멸균이 완료된 세포 공배양장치(1)의 다공성 멤브레인(60)의 상부에 장 상피세포를 접종한다. 이때 장 상피세포는 200만 개체 수 정도가 적당하다.
그런 다음, S43단계에서 장 상피세포가 접종된 다공성 멤브레인(60)을 포함하는 세포 공배양장치(1)를 CO2 배양기에 투입하여 장 상피세포를 배양한다.
이때 CO2 배양기의 온도는 37℃, 5% CO2 환경에서 7일간 배양하지만 이에 반드시 제한되는 것은 아니다.
다공성 멤브레인(60) 상부에 접종되는 동물세포의 특성에 따라 상기 배양기의 온도, 내부가스, 기간 등의 배양 조건은 달라질 수 있음을 물론이다.
그 다음, S44단계와 같이 장 상피세포가 배양된 세포 공배양장치(1)를 CO2 배양기에서 꺼내고 내부를 멸균된 인산 완충용액(Phosphate buffer saline)으로 세척한다. 이때의 세척은 2회 정도 하는 것이 바람직하다.
그 다음, S45단계와 같이, 호기성 세포 배지와 혐기균 배양액을 투입한다.
호기성 세포 배지는 제2포트홀(12)로 주입되어, 제2포트홀(12)과 상호 연통되는 제2홀(22), 연결홈(31), 제1홀(21)로 이동된다. 그러면 다공성 멤브레인(60)을 기준으로 그 하부 공간에 호기성 세포 배양액이 충진된다.
실시예에 따라서, 상기 호기성 세포 배지는 제1블록(10)의 제1포트홀(11)로 주입되어 다공성 멤브레인(60)의 상부 공간에 충진될 수 있다.
제2포트홀(12)을 밀폐하여 산소가 빠져나오지 못하도록 기밀(氣密)하고 나서 혐기 챔버로 이동하여 세포 공배양장치의 다공성 멤브레인 상부 공간을 혐기 조건으로 거치하게 된다. 그런 다음, 혐기 상태가 되면 혐기균 배양액이 제1블록(10)의 제1포트홀(11)로 주입되어 다공성 멤브레인(60)의 상부 공간에 충진된다. 호기성 세포 배지가 다공성 멤브레인(60)의 상부 공간에도 충진되는 실시예에서는 이때 주입되는 혐기균 배양액이 호기성 세포 배지를 교체하게 된다.
즉, 상기 제1포트홀(11)인 장 상피세포가 배양된 다공성 멤브레인(60)의 상부측에는 혐기균 배양액을 투입하고, 제2포트홀(12)을 통해 호기성 세포 배지를 투입하여 다공성 멤브레인(60)의 저면은 호기성 세포 배지가 접하도록 한다.
제2포트홀(12)을 통해 호기성 세포 배지를 주입한 후, 제2기밀덮개(50)로 제2포트홀(12)을 덮는다. 이는 연통된 제2포트홀(12), 제2홀(22), 연결홈(31), 제1홀(21)의 내부 가스를 산소가 있는 호기 분위기로 유지하기 위함이다.
한편, 혐기 챔버에 세포 공배양장치(1)를 두어 소정의 시간이 경과하면 제1포트홀(11) 내부 공간, 즉 다공성 멤브레인(60)의 상부 공간에서 산소가 혐기 챔버로 확산되어 산소가 없는 혐기 조건이 된다. 이때 제1기밀덮개(40)로 제1포트홀(11)을 덮어 제1포트홀(11) 내부 공간을 혐기 분위기로 유지한다.
본 발명의 일 실시예에서, 제1블록(10)의 제1포트홀(11)은 혐기 분위기이고, 상호 연통되는 제2포트홀(12), 제2홀(22), 연결홈(31), 제1홀(21)은 호기 분위기로 유지되어, 호기성 및 혐기성 세포를 공배양할 수 있다. 그러나 이러한 실시예에 반드시 제한되는 것은 아니며 다공성 멤브레인(60)의 위치에 따라 혐기 분위기의 공간과 호기 분위기의 공간 배치의 다양한 실시예가 가능하다.
이때 상기 혐기균 배양액은 5ml, 호기성 세포 배지는 33ml를 주입할 수 있으나 이에 반드시 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 혐기균 배양액과 호기균 배양액의 부피비가 1:6 내지 1:7의 범위 내로 주입될 수 있다.
그러한 상태로 S46단계와 같이 본 발명 세포 공배양장치(1)를 혐기 챔버에서 배양한다.
혐기 챔버의 조건은 37℃ 온도에서, 90% N2, 5% CO2, 5% H2 환경이 바람직하나 이에 반드시 제한되는 것은 아니다.
상기 혐기 챔버의 조건 하에서 12시간 동안 배양할 수 있으나, 배양되는 미생물의 종류와 그에 따른 성질 특성에 따라 배양 조건은 달리 설정될 수 있다.
혐기 챔버 내에서 배양되는 시간은 세포 공배양장치(1) 내에서 혐기적 공간과 호기적 공간이 유지되는 시간이다.
다공성 멤브레인(60)의 하부 공간에서 산소가 부족해진다면 호기균이 더 이상 생육할 수 없는 환경이 되는 바, 호기균의 특성에 따라 호기 분위기 유지를 위한 산소 주입의 다양한 방법을 활용할 수 있다.
도면에 도시되지 않았으나, 일 실시예에 따르면 배양 중 혐기 챔버 외부와 연통되는 적어도 하나 이상의 연동 펌프를 이용하여 배양 시간을 증가하거나 조정할 수 있다.
바람직하게는 세포 공배양장치(1)의 제1포트홀(11)과 연통되는 혐기 챔버 외부의 제1 연동 펌프를 통해 혐기성 세포 배양액을 추가할 수 있으며, 세포 공배양장치(1)의 제2포트홀(12)과 연통되는 혐기 챔버 외부의 제2 연동 펌프를 통해 호기성 세포 배양액을 추가할 수 있다.
그럴 경우 제1 연동 펌프를 통해 지속적으로 혐기성 세포 배양액이 다공성 멤브레인(60)의 상부 공간에 추가적으로 충진되어 혐기성 균의 활성을 위한 영양성분을 공급할 수 있다.
또한 제2 연동 펌프를 통해 지속적으로 호기성 세포 배양액이 다공성 멤브레인(60)의 하부 공간에 추가적으로 충진되어 호기성 세포 배지를 교환하여 호기성 세포의 배양 시간을 증가시킬 수 있다.
이와 같이 장 상피세포의 혐기성 균을 배양한 상태의 모식도를 도 5에 도시하였다.
도 5를 참고하면 상기 다공성 멤브레인(60)의 상면에는 장 상피세포(2)가 배양되어 있으며, 장 상피세포(2)의 상부 공간에는 장 상피세포 내 혐기성 균을 배양할 수 있는 혐기균 배양액(3)이 충진된다.
또한, 다공성 멤브레인(60)의 하부 공간에는 호기성 세포 배양액(4)이 충진된다.
도 5에 도시되지 않았으나, 본 발명의 세포 공배양장치의 각 포트홀을 기밀덮개로 각각 밀봉하여 배양하는 동안, 장 상피세포(2)의 하부 접촉 저면으로 상기 다공성 멤브레인(60)을 통해 산소가 일부 공급되는 조건이 되어 장 상피세포의 호기성 균이 배양될 수 있으며, 장 상피세포(2)의 상부 공간의 혐기성 배양액(3)에는 산소가 공급되지 않아 혐기성 균이 배양된다.
상기 다공성 멤브레인(60)은 세포 성장의 지지체의 역할을 할 뿐만 아니라 혐-호기성 배양액을 분리할 수 있다.
그 다음, S47단계와 같이 분석을 수행한다. 분석의 방법은 배양액 자체를 분석하거나, 세포 공배양장치(1)를 인산 완충용액으로 세척 후 장 상피세포와 미생물 세포의 단백질체 또는 대사체를 추출하여 숙주와 혐기성 미생물의 생리학적 상호작용을 분석할 수 있다.
즉, S46단계에서 배양된 혐기성 균과 호기성 균 각각은 장 상피세포(2)를 기준으로 상부 및 하부 공간에서 생육하면서 각종 단백질 등의 대사 결과물을 생성하게 된다. 특히 호기성 균 및 숙주 면역세포의 대사체는 다공성 멤브레인(6)을 통해 하부 공간으로 빠져나올 수 있어 제2포트홀(12)을 통해 시료를 채집하여 분석할 수 있다.
혐기성 균의 대사체는 제1포트홀(11)을 통해 시료를 채집하여 분석할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예로서, 상기 호기성 세포 배지(4)에 대식세포 등의 숙주 면역세포를 추가로 주입하여 배양, 분석할 수 있는데, 이는 본 발명의 세포 공배양장치(1)가 동물의 장기 환경을 그대로 모사한 것이어서, 장 상피세포를 중심으로 혐기성 장내 미생물-장 상피세포-면역세포간의 상호작용도 분석할 수 있다. 장 상피세포는 인간에서 유래된 것을 사용함이 바람직하다.
본 발명의 다양한 실시예로서, 장 상피세포(2)의 하부 공간에 면역세포, 대식세포를 주입하거나, 또는 장 상피세포(2)의 상부 공간에 유산균 또는 의약제를 추가로 주입하여 생리 활성 분석을 수행할 수 있다.
구체적으로 본 발명은 인체를 모사하여, 비피도박테리움(Bifidobacteirum) 종이나 락토바실러스(Lactobacillus) 종과 같은 프로바이오틱스를 처리하여 상호작용 관찰할 수 있다.
또한, 공배양장치를 사용하여 동물 실험모델에서의 연구 결과를 예측하는 용도로도 사용할 수 있다.
아울러 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile)와 장 상피세포 및 대식 세포(macrophage)를 공동 배양함으로써 병원균에 의한 생리적 변화 관찰 실험. 클로스트리디움 디피실레가 생성하는 세포 독소(cytotoxin)에 대한 장 상피세포와 대식 세포의 면역 시스템 프로세스를 관찰 할 수 있다.
그리고 혐기 미생물 배양 공간에 장내 미생물을 배양하며, 프락토올리고당(fructooligosaccharide)이나 이눌린(inulin)과 같은 프리바이오틱스를 처리함으로써 장내 미생물의 군집 변화를 확인할 수 있으며, 장내 미생물 군집의 변화에서 기인한 장 상피세포의 활성 변화 분석을 통해 프리바이오틱스의 효능을 연구할 수 있다.
본 발명은 상기 실시예에 한정되지 않고 본 발명의 기술적 요지를 벗어나지 아니하는 범위 내에서 다양하게 수정, 변형되어 실시될 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명한 것이다.
본 발명은 자연법칙을 이용한 기구적인 구조를 제공하여 혐기성 및 호기성 공배양을 수행할 수 있는 장치를 제공하여, 장내 기체 환경을 그대로 모사하여, 숙주-혐기성 장내 미생물의 생리학적 상호 작용 분석의 신뢰성을 높일 수 있는 것으로서, 산업상 이용 가능성이 있다.

Claims (18)

  1. 각각 상하로 관통되는 제1포트홀과 제2포트홀을 포함하고, 상기 제1포트홀과 제2포트홀은 각각 제1기밀덮개와 제2기밀덮개로 밀폐되는 제1블록;
    상기 제1포트홀 및 제2포트홀과 각각 연통되는 제1홀 및 제2홀이 상하로 관통되며, 상기 제1블록의 하부에 결합되는 제2블록;
    상기 제2블록의 하부에 결합되며, 상기 제1홀 하부와 제2홀의 하부를 서로 연결하는 연결홈을 포함하는 제3블록; 및
    상기 제1포트홀 또는 상기 제1홀 내부에 위치하는 동물세포가 접종된 다공성 멤브레인을 포함하고,
    상기 다공성 멤브레인의 상부는 혐기 분위기이고, 하부는 호기 분위기인 것을 특징으로 하는 세포 공배양장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 다공성 멤브레인은 상기 제1포트홀과 상기 제1홀 사이에 위치하는 것을 특징으로 하는 세포 공배양장치.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제1기밀덮개와 제2기밀덮개가 밀폐되는 둘레,
    상기 제1블록의 제1포트홀과 제2포트홀의 하부 둘레,
    상기 제2블록의 제1홀과 제2홀의 상부 둘레, 및
    상기 제3블록이 상기 제2블록과 결합하는 상부 둘레에 위치하는 기밀유지부를 더 포함하는 세포 공배양장치.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 제1블록, 제2블록 및 제3블록은,
    폴리카보네이트 재질인 것을 특징으로 하는 세포 공배양장치.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 다공성 멤브레인은,
    니트로셀룰로오스(Nitrocellulose), 폴리카보네이트 또는 폴리에스터인 것을 특징으로 하는 세포 공배양장치.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 다공성 멤브레인의 평균 기공크기는 0.2~10㎛인 것을 특징으로 하는 세포 공배양장치.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 동물세포는 장 상피세포인 것을 특징으로 하는 세포 공배양장치.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 다공성 멤브레인의 상부 공간에 혐기성 미생물이 배양되고, 하부 공간에 면역세포가 배양되는 것을 특징으로 하는 세포 공배양장치.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 상부 공간과 상기 하부 공간 각각에 혐기성 미생물 배양액과 면역세포 배양액이 추가로 더 구비되는 것을 특징으로 하는 세포 공배양장치.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 다공성 멤브레인의 상부 공간은 혐기성 세포가 접종되고, 하부 공간은 호기성 세포가 접종되되,
    상기 상부 공간과 상기 하부 공간은 각각 혐기성 세포 배양액과 호기성 세포 배양액이 추가로 더 구비되는 것을 특징으로 하는 세포 공배양장치.
  11. 상하로 관통되는 제1포트홀과 제2포트홀을 포함하는 제1블록;
    상기 제1포트홀 및 제2포트홀과 각각 연통되는 제1홀 및 제2홀이 상하로 관통되며, 상기 제1블록의 하부에 결합되는 제2블록;
    상기 제2블록의 하부에 결합되며, 상기 제1홀 하부와 제2홀의 하부를 서로 연결하는 연결홈을 포함하는 제3블록; 및
    상기 제1포트홀 또는 상기 제1홀 내부에 위치하는 다공성 멤브레인을 포함하는 세포 공배양장치를 이용하는 세포 공배양방법으로서,
    a) 상기 제1블록, 제2블록, 제3블록, 및 다공성 멤브레인을 각각 결합하는 단계;
    b) 상기 다공성 멤브레인 상부에 동물세포를 접종하여 배양하는 단계;
    c) 호기성 세포 배양액을 상기 제2포트홀을 통해 상기 다공성 멤브레인의 하부 공간에 주입하고, 상기 제2포트홀을 제2기밀덮개로 밀폐한 후 혐기 챔버에 거치하는 단계;
    d) 상기 혐기 챔버 내에서 상기 다공성 멤브레인 상부 공간이 혐기로 된 때에 혐기성 세포 배양액을 상기 제1포트홀을 통해 상기 다공성 멤브레인의 상부 공간에 주입하고, 상기 제1포트홀을 제1기밀덮개로 밀폐한 후 세포를 공배양하는 단계를 포함하는 세포 공배양방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 a)단계 이후에 상기 세포 공배양장치를 멸균처리하는 단계를 더 포함하는 세포 공배양방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 b)단계 이후에 세포 공배양장치의 내부를 멸균된 인산 완충용액으로 세척하는 단계를 더 포함하는 세포 공배양방법.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 호기성 세포 배양액과 혐기성 세포 배양액의 부피비는 6 내지 7 : 1인 것을 특징으로 하는 세포 공배양방법.
  15. 제11항에 있어서,
    상기 b)의 배양 단계는,
    CO2 배양기의 온도를 35 내지 38℃로 하고, 4 내지 6% CO2 환경에서 7일간 배양하는 것을 특징으로 하는 세포 공배양방법.
  16. 제11항에 있어서,
    상기 d)의 공배양 단계는,
    혐기 챔버의 온도를 35 내지 38℃로 하고, 90% N2, 5% CO2, 5% H2 환경에서 10 내지 13시간 배양하는 것을 특징으로 하는 세포 공배양방법.
  17. 제11항에 있어서,
    상기 세포 공배양장치는 상기 제1포트홀과 연통되는 혐기 챔버 외부의 제1 연동 펌프 및 상기 제2포트홀과 연통되는 혐기 챔버 외부의 제2 연동 펌프를 더 포함하고,
    상기 세포 공배양장치를 이용하는 세포 공배양 시간은,
    상기 제1 연동 펌프를 통해 혐기성 세포 배양액을 추가하거나, 또는 상기 제2 연동 펌프를 통해 호기성 세포 배양액을 추가하여 증가시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 세포 공배양방법.
  18. 제11항에 있어서,
    상기 c) 단계에서 상기 다공성 멤브레인의 하부 공간에 면역세포 또는 대식세포를 추가로 주입하거나, 상기 d) 단계에서 상기 다공성 멤브레인의 상부 공간에 유산균 또는 의약제를 추가로 주입하는 것을 특징으로 하는 세포 공배양방법.
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