WO2024090832A1 - 3차원 신경근접합부 모델, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 스크리닝 방법 - Google Patents

3차원 신경근접합부 모델, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 스크리닝 방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2024090832A1
WO2024090832A1 PCT/KR2023/015209 KR2023015209W WO2024090832A1 WO 2024090832 A1 WO2024090832 A1 WO 2024090832A1 KR 2023015209 W KR2023015209 W KR 2023015209W WO 2024090832 A1 WO2024090832 A1 WO 2024090832A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nano
biohybrid
muscle
actuator
motor neuron
Prior art date
Application number
PCT/KR2023/015209
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
최정우
하태형
신민규
Original Assignee
서강대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 서강대학교 산학협력단 filed Critical 서강대학교 산학협력단
Publication of WO2024090832A1 publication Critical patent/WO2024090832A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Definitions

  • this invention was made under the support of the Ministry of Science and ICT under the project identification number 1711108724 and detailed project number 2019R1A2C3002300.
  • the research management agency for the project was the National Research Foundation of Korea, and the research project name was "Individual Basic Research (Ministry of Science and ICT) (R&D). )", the research project name is "Brain assembly-based biohybrid robot with life-like sensing function", the host institution is Sogang University, and the research period is 2022.03.01 ⁇ 2023.02.28.
  • this invention was made under the support of the Ministry of Education under project number 1345312114 and detailed project number 2016R1A6A1A03012845.
  • the research management agency for the project was the National Research Foundation of Korea, and the research project name was "Building a Science and Engineering Academic Research Base (R&D)".
  • the title of the project is "Development of a nanobiochip with brain disease drug evaluation function", the host institution is Sogang University, and the research period is 2022.01.01 ⁇ 2022.12.31.
  • the present invention relates to a three-dimensional (3D) neuromuscular junction (NMJ) model co-cultured with muscle bundles derived from skeletal muscle cells (C2C12), specifically, carboxylated carbon nanotubes (CNT-COOH) and A 3D nano-biohybrid hydrogel was fabricated using human neural stem cell (hNSC)-derived multi-neuron spheroids (multi-MNSs), and then co-cultured with muscle bundles composed of skeletal muscle cell-derived muscle bundles. It relates to a 3D neuromuscular junction model, a manufacturing method thereof, and a drug screening method using the same.
  • hNSC human neural stem cell
  • multi-MNSs multi-neuron spheroids
  • animal testing is performed for non-clinical/clinical testing and initial screening, and animal testing for one new drug development costs more than hundreds of billions of won.
  • animal testing is opposed for ethical reasons and regulations are being imposed on the use of laboratory animals around the world, attempts are being made to replace animal testing through in vitro testing using animal or human cells, especially human cells.
  • the importance of evaluating the safety and effectiveness of medicines using cardiomyocytes, brain, and liver cells derived from stem cells is increasing.
  • spheroids are 3D spherical cell aggregates with a structure similar to the inside of a living body.
  • Spheroids are three-dimensional tissue analogs in which cells are aggregated and combined, and have the property of maintaining cell-cell interactions similar to those in the body even in in vitro culture, and have the advantage of increasing clinical efficiency in drug screening. Therefore, cell spheroids are attracting attention in research on cells constituting general tissues, cells constituting organs, cancer cells, and stem cells, and are also used in the development of new drugs including cell therapy, development of drug screening systems, and differentiation using stem cells. It also plays an important role in research.
  • Skeletal muscle known as the most abundant tissue in the human body, has a complex network structure in which the three-dimensional organization of muscle fibers is combined with the extracellular matrix.
  • an anisotropic structure with well-aligned root canals within the tissue is essential.
  • the anisotropic environment within these skeletal muscle tissues can promote the alignment of cells within the muscle tissue and promote myogenesis and maturation.
  • muscle cells are connected to motor nerves and move by receiving external signals in the form of electrical signals by forming a neuromuscular junction.
  • most neuromuscular junction models used in the laboratory have difficulty in efficient connection and signal transmission between motor nerves and muscle cells. Therefore, it is necessary to introduce methods to maximize neuromuscular junction formation and signal transmission efficiency.
  • the present inventors developed a method of increasing the efficiency of neuromuscular junction formation using hydrogel, a material containing extracellular matrix (ECM) such as Matrigel and collagen. Efforts were made to devise it.
  • ECM extracellular matrix
  • the result is a 3D cultured muscle bundle of myoblasts; And by using an actuator containing 3D cultured motor neuron spheroids of nerve-derived multipotent stem cells, muscle bundles and motor neuron spheroids are efficiently joined, resulting in excellent signal transmission ability. was confirmed.
  • the purpose of the present invention is to provide a 3D nano-biohybrid actuator.
  • Another object of the present invention is to provide a method for manufacturing a 3D nano-biohybrid actuator.
  • Another object of the present invention is to provide a drug screening method using a 3D nano-biohybrid actuator.
  • the present invention relates to a three-dimensional (3D) neuromuscular junction (NMJ) model co-cultured with muscle bundles derived from skeletal muscle cells (C2C12), specifically, carboxylated carbon nanotubes (CNT-COOH) and A 3D nano-biohybrid hydrogel was fabricated using human neural stem cell (hNSC)-derived multi-neuron spheroids (multi-MNSs), and then co-cultured with muscle bundles composed of skeletal muscle cell-derived muscle bundles. It relates to a 3D neuromuscular junction model, a manufacturing method thereof, and a drug screening method using the same.
  • hNSC human neural stem cell
  • multi-MNSs multi-neuron spheroids
  • One example of the present invention relates to a 3D nano-biohybrid actuator.
  • the 3D nano-biohybrid actuator includes a muscle bundle in which myoblasts are 3D cultured; And it may include a motor neuron spheroid in which nerve-derived multipotent stem cells are 3D cultured.
  • the muscle bundle may be a 3D culture of myoblasts.
  • the motor neuron spheroid may be co-cultured while being applied to one side of the muscle bundle.
  • motor neuron spheroids may be co-cultured on one side of a muscle bundle to form a neuromuscular junction (NMJ).
  • NMJ neuromuscular junction
  • motor neuron spheroid may refer to a spheroid formed after differentiation of neuron spheroid.
  • 'spheroid' may refer to a three-dimensional tissue analog in which cells are aggregated and combined.
  • signal transmission between motor neuron spheroids and muscle bundles at the neuromuscular junction may be achieved by chemical methods such as neurotransmitters or physical methods such as ion channels.
  • myoblasts may be one or more types selected from the group consisting of C2C12, C2, Sol8, and L6, for example, C2C12, but are not limited thereto.
  • the C2C12 cell line may be a mouse myoblast cell line that expresses various proteins during myogenesis that differentiates into myotubes.
  • the actuator may additionally include a support member.
  • the support member may be used to fix both ends of the muscle bundle in the longitudinal direction.
  • the support member may be made of polydimethylsiloxane (PDMS), but is not limited thereto.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • the support member is a PDMS mold and may include fixing members spaced apart from each other.
  • the muscle bundle may be located between spaced apart fixing members, and both longitudinal ends of the muscle bundle may be fixed by the fixing members.
  • the motor neuron spheroid may be a 3D culture of nerve-derived multipotent stem cells.
  • stem cell refers to undifferentiated cells that have the ability to differentiate into various types of body tissues, and may be passage 1 to passage 100 stem cells.
  • stem cells may be extracted from nerves, bone marrow, umbilical cord blood, bone marrow, blood, or fat, for example, nerves, but are not limited thereto.
  • the neural-derived multipotent stem cells may be obtained from a normal person.
  • the neural-derived multipotent stem cells may be obtained from somatic cells isolated from a normal person.
  • nerve-derived multipotent stem cells may be obtained from patients with neuromuscular disease.
  • nerve-derived multipotent stem cells may be obtained from somatic cells isolated from patients with neuromuscular diseases.
  • neuromuscular diseases include Spinal Muscular Atrophy (SMA), Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), Duchenne Muscular Dystrophy, and Muscle Tension Atrophy ( It may be one or more types selected from the group consisting of mytonic dystrophy, for example, amyotrophic lateral sclerosis, but is not limited thereto.
  • SMA Spinal Muscular Atrophy
  • ALS Amyotrophic Lateral Sclerosis
  • Duchenne Muscular Dystrophy Duchenne Muscular Dystrophy
  • Muscle Tension Atrophy It may be one or more types selected from the group consisting of mytonic dystrophy, for example, amyotrophic lateral sclerosis, but is not limited thereto.
  • Another example of the present invention relates to a method for manufacturing a 3D nano-biohybrid actuator comprising the following steps:
  • the first differentiation step may be 3D culture and differentiation of myoblast cells to form muscle bundles.
  • 3D culture is a method for culturing cells in a form similar to actual cells in a living body, considering that cells in a living body do not grow attached to the floor, but exist in a three-dimensional space surrounded by surrounding cells and liquid.
  • a method of fixing an extracellular matrix to a specific part of the channel using a microfluidic device and culturing cells, or a method of culturing cells on a 3D scaffold made of biocompatible materials can be used.
  • the first differentiation step may be differentiating myoblasts into muscle cells.
  • the second differentiation step may be 3D culture and differentiation of multipotent stem cell-derived neural stem cells to form motor neuron spheroids.
  • the second differentiation step may be performed after the first differentiation step, but is not necessarily limited thereto, and may be performed before or simultaneously with the first differentiation step.
  • motor neuron may refer to a motor neuron, which is one of nerve cells.
  • spheroids are three-dimensional aggregates of cells that prevent natural differentiation and facilitate differentiation into a desired lineage. In particular, it may be easy to induce differentiation into nerve cells in three dimensions.
  • the first differentiation step may be 3D culture and differentiation of myoblasts to form muscle bundles using a first hydrogel containing myoblasts, fibronectin, and thrombin. there is.
  • the first differentiation step may include a dispensing step, a first supply step, and a second supply step.
  • the first hydrogel may include myoblast cells, fibronectin, and thrombin.
  • the first hydrogel may include myoblasts, Matrigel, fibronectin, thrombin, and DMEM (Dulbeccos Modified Eagles Media).
  • the first hydrogel may be myoblast cells homogeneously dispersed in Matrigel, fibronectin, thrombin, and DMEM (Dulbeccos Modified Eagles Media).
  • the dispensing step may be dispensing myoblast cells into a PDMS mold, which is a support member of the present invention.
  • the first supply step may be supplying a growth culture medium to myoblast cells.
  • the growth culture medium may be supplied to the myoblasts for 3 to 5 days, for example, may be supplied for 4 days, but is not limited thereto.
  • the second supply step may be replacing the growth medium with a differentiation medium and supplying the differentiation medium to the myoblasts in culture.
  • the differentiation culture medium may be supplied to the myoblasts in culture for at least 9 days, 10 days, 11 days, 12 days, or 13 days, for example, 10 days or more. It may be supplied, but is not limited to this.
  • the growth culture medium and differentiation culture medium used in the present invention may be commercially known products.
  • the second differentiation step includes a seeding step, a first culture step, a second culture step, and a third culture step to form multipotent stem cell-derived neural stem cells to form motor neuron spheroids. It may be differentiated through 3D culture.
  • the seeding step may be seeding nerve-derived pluripotent stem cells on a plate.
  • the neural-derived multipotent stem cells may be pre-treated to grow in advance on a plate containing a medium containing basic fibroblast growth factor (bFGF) and epidermal growth factor (EGF) prior to the seeding step. , but is not limited to this.
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • EGF epidermal growth factor
  • the seeding step may be performed for 42 to 54 hours, for example, may be performed for 48 hours, but is not limited thereto.
  • the first culturing step may be culturing stem cells in a culture medium.
  • the culture medium may contain bFGF and EGF, but is not limited thereto.
  • the second culture step may be replacing the culture medium with the first motor neuron differentiation medium and continuing to culture the stem cells.
  • the first motor neuron differentiation medium may contain bFGF, sonic hedgehog (shh), activin A, and retinoic acid, but is not limited thereto.
  • the second culture step may be performed for 18 to 22 days or 20 days, for example, may be performed for 20 days, but is not limited thereto.
  • the third culture step may be replacing the first motor neuron differentiation medium with the second motor neuron differentiation medium and continuing to culture the stem cells.
  • the second motor neuron differentiation medium may contain bFGF, sonic hedgehog (shh), activin A, and retinoic acid, but is not limited thereto.
  • the second motor neuron differentiation medium contains at least one selected from the group consisting of neurotrophic factors, BDNF (brain-derived neurotrophic factor) and GDNF (Glial cell-derived neurotrophic factor). It may include, for example, BDNF and GDNF, but is not limited thereto.
  • the third culture step may be performed for 6 to 10 hours or 8 hours, for example, 8 hours, but is not limited thereto.
  • the co-cultivation step may additionally include a nutritional supplementation step of supplying neurotrophic factors to the complex.
  • the complex may be formed by co-culturing a motor neuron spheroid on one side of a muscle bundle to form a neuromuscular junction, but is not limited thereto.
  • the second differentiation step may further include a gel formation step of preparing a second hydrogel.
  • the gel formation step may be preparing a second hydrogel using the motor neuron spheroids, carboxylated carbon nanotubes (CNT-COOH), and ECM proteins formed in the second differentiation step.
  • CNT-COOH carboxylated carbon nanotubes
  • the ECM protein may include Metrigel, fibronectin, and thrombin.
  • the second hydrogel may be one in which motor neuron spheroids and carboxylated carbon nanotubes are homogeneously dispersed in ECM proteins.
  • the co-cultivation step may be co-culturing the complex in which the second hydrogel is dispensed into the muscle bundle.
  • the co-cultivation step may further include a nutritional treatment step of treating the complex with neurotrophic factors.
  • Another example of the present invention relates to a drug screening method using a 3D nano-biohybrid actuator comprising the following steps:
  • Drug processing step of processing the target drug into the 3D nano-biohybrid actuator is
  • the drug treatment step may be processing or dispensing the target drug into the 3D nano-biohybrid actuator according to the present invention.
  • the target drug may be a therapeutic agent for treating or improving neuromuscular diseases, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a muscle bundle in which myoblasts are 3D cultured; And a 3D nano-biohybrid actuator including a motor neuron spheroid in which nerve-derived multipotent stem cells are 3D cultured.
  • muscle bundles and motor neuron spheroids are formed.
  • the efficient conjugation of roid improves signal transmission ability, making it useful for screening target drugs related to neuromuscular diseases.
  • Figure 1 is a schematic diagram showing the muscle bundle manufacturing process according to a manufacturing example of the present invention.
  • Figure 2 is a fluorescence image confirming the differentiation of muscle bundles using immunostaining, according to an experimental example of the present invention.
  • Figure 3 is a schematic diagram showing the process of producing normal and ALS motor neuron spheroids according to a production example of the present invention.
  • Figure 4 is a fluorescence image confirming islet1 and Tuj1, differentiation markers of normal and ALS motor neuron spheroids, using immunostaining, according to an experimental example of the present invention.
  • Figure 5 is a fluorescence image analyzing the TDP-43 aggregation phenomenon in normal and ALS motor neuron spheroids using immunostaining, according to an experimental example of the present invention.
  • Figure 6 shows the three-dimensional neuromuscular junction (NMJ) manufacturing process using a nano-biohybrid hydrogel embedded with normal and ALS multi-MNSs based on carboxylated carbon nanotubes (CNT-COOH) according to a preparation example of the present invention. This is a schematic diagram shown.
  • NMJ neuromuscular junction
  • Figure 7 is a fluorescence image of a three-dimensional NMJ using a nano-biohybrid hydrogel embedded with CNT-COOH-based normal multi-MNSs using immunostaining, according to an experimental example of the present invention.
  • Figure 8 is a fluorescence image of a three-dimensional ALS-NMJ using a nano-biohybrid hydrogel embedded with CNT-COOH-based ALS multi-MNSs using immunostaining, according to an experimental example of the present invention.
  • Figure 9 is a fluorescence image analyzing three-dimensional ALS-NMJ after treatment with bosutinib for 7 days using immunostaining, according to an experimental example of the present invention.
  • Figure 10 is speed comparison data that confirms the effect of improving muscle bundle movement by electrical stimulation with and without CNT-COOH, according to an experimental example of the present invention.
  • Figure 11 is muscle bundle speed comparison data that can confirm the effect of improving muscle movement by glutamate stimulation depending on the presence or absence of single and multi-MNSs, or the presence or absence of CNT-COOH, according to an experimental example of the present invention.
  • Figure 12 is a muscle bundle showing the effect of improving muscle movement in nano-biohybrid hydrogel containing CNT-COOH and ALS-multi-MNSs according to drug treatment time for NMJ, according to an experimental example of the present invention. This is speed comparison data.
  • the present invention provides a muscle bundle in which myoblasts are 3D cultured; And a motor neuron spheroid in which nerve-derived multipotent stem cells are 3D cultured, wherein the motor neuron spheroid is co-cultured while being applied to one side of the muscle bundle.
  • 3D nano-biohybrid actuator In, 3D nano-biohybrid actuator.
  • first, second, etc. may be used to describe various components, but the components should not be limited by the terms. The above terms are used only for the purpose of distinguishing one component from another. For example, a first component may be referred to as a second component, and similarly, the second component may also be referred to as a first component without departing from the scope of the present invention.
  • 3D muscle bundles were produced using C2C12, one of the skeletal muscle cells.
  • C2C12 one of the skeletal muscle cells.
  • To fabricate a 3D muscle bundle 340 uL of C2C12, 300 uL of Matrigel, 250 uL of fibronectin (16 mg/ml), 10 uL of thrombin (0.5 U/1 mg Fibrinogen), and DMEM (Dulbeccos) were used.
  • the first hydrogel containing 100 uL (Modified Eagles Media) was used.
  • the above-described first hydrogel was sprinkled into a pre-made PDMS mold, and DMEM, 10% fetal bovine serum, 1% p/s (penicillin/streptomycin), 1 mg /mL Muscle cell growth culture medium consisting of aminocaproic acid (ACA) was added. After culturing the muscle cells for 4 days, the muscle cell growth medium was added with DEME 2% horse serum, 1% p/s, 1 mg/mL. It was replaced with muscle cell differentiation culture medium consisting of ACA and 50 ng/mL IGF-1 (insulin-like growth factor). The muscle cell differentiation culture medium was replaced every two days, and differentiation was carried out for more than 14 days.
  • DMEM 10% fetal bovine serum
  • 1% p/s penicillin/streptomycin
  • ACA aminocaproic acid
  • ALS- hNSCs human neural stem cells derived from multipotent stem cells derived from ALS patients
  • RHB-A medium culture medium
  • hNSCs and ALS-hNSCs ( 7.0 48 hours after cell seeding, the culture medium was replaced with first motor neuron differentiation medium containing 8 ng/mL bFGF, 200 ng/mL sonic hedgehog (shh), 10 ng/mL activin A, and 50 uM retinoic acid. has been replaced After 20 days of differentiating motor neurons, the first motor neuron differentiation medium was replaced with the second motor neuron differentiation medium containing 10 ng/mL BDNF and 10 ng/mL GDNF for maturation of motor neuron spheroids. Cultured for one day. The schematic process of forming motor neuron spheroids is shown in Figure 3, and the entire process can usually take about 28 days.
  • Preparation Example 3 Fabrication of a 3D neuromuscular junction (NMJ) using a second nano-biohybrid hydrogel based on carboxylated carbon nanotubes (CNT-COOH) embedded with normal and ALS multi-MNSs
  • NMJ 3D neuromuscular junction
  • CNT-COOH carboxylated carbon nanotubes
  • muscle bundles were formed by creating mature root canals through the formation and differentiation of muscle bundles in a polydimethylsiloxane (PDMS) mold.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • multi-neuron spheroids derived from pre-differentiated human neural stem cells (hNSC) from normal people (normal multi-MNSs) or hNSC-derived multi-motor neuron spheroids from ALS patients (ALS- multi-MNSs), carboxylated carbon nanotubes (CNT-COOH) at 0.1 mg/mL and ECM proteins (30% Matrigel, 4 mg/mL fibronectin, 0.5 U/1 mg thrombin), normal multi-MNSs. And after producing a second hydrogel (3D nano-biohybrid hydrogel) embedded with ALS-multi-MNSs, it was sprinkled on top of the previously formed muscle bundle and co-cultured.
  • hNSC pre-differentiated human neural stem cells
  • CNT-COOH carboxylated carbon nanotubes
  • Co-culture differentiation medium was supplemented with brain-derived and glial cell line-derived neurotrophic factors (10 ng/mL BDNF and 10 ng/mL GDNF) to support the viability of multi-motor neuron spheroids along with muscle differentiation medium. Differentiation medium was changed every 2 days for 2 weeks.
  • Figure 7 is a fluorescence image of a three-dimensional NMJ using a nano-biohybrid hydrogel embedded with CNT-COOH-based normal multi-MNSs, analyzed by immunostaining.
  • Figure 8 is a fluorescence image of a three-dimensional ALS-NMJ using a nano-biohybrid hydrogel embedded with CNT-COOH-based ALS multi-MNSs, analyzed by immunostaining. Referring to Figure 8, it can be seen that in the NMJ produced using ALS-multi-MNSs, the nerve axons were unable to extend and the expression of a-BTX was significantly reduced compared to normal.
  • muscles formed at the NMJ produced using the 3D nano-biohybrid second hydrogel containing CNT-COOH and multi-MNSs under the same electrical stimulation conditions of 1 Hz and 10 V.
  • the muscle contraction of the bundle was found to be the largest at 7.538 um/sec.
  • NMJ was manufactured using a 3D nano-biohybrid second hydrogel containing CNT-COOH and ALS-multi-MNSs, and after treatment with the drug bosutinib, muscle movement was measured over time, as shown in Figures 12 and 12. It is shown in Table 3.
  • the present invention relates to a three-dimensional (3D) neuromuscular junction (NMJ) model co-cultured with muscle bundles derived from skeletal muscle cells (C2C12), specifically, carboxylated carbon nanotubes (CNT-COOH) and A 3D nano-biohybrid hydrogel was fabricated using human neural stem cell (hNSC)-derived multi-neuron spheroids (multi-MNSs), and then co-cultured with muscle bundles composed of skeletal muscle cell-derived muscle bundles. It relates to a 3D neuromuscular junction model, its manufacturing method, and drug screening method using the same.
  • hNSC human neural stem cell
  • multi-MNSs multi-neuron spheroids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

본 발명은 골격근세포(C2C12)에서 유래한 근육 번들과 공동 배양된 3차원(3D) 신경근접합부(NMJ) 모델에 관한 것으로, 구체적으로, 카르복실화 탄소나노튜브(CNT-COOH)와 인간신경줄기세포(hNSC) 유래 다중 모터 뉴런 스페로이드(multi-neuron spheroids, multi-MNSs)를 이용하여 3D 나노-바이오하이브리드 하이드로겔을 제작한 후, 골격근세포 유래 근육다발로 구성된 근육 번들과 공동 배양된 3D 신경근접합부 모델, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 스크리닝 방법에 관한 것이다.

Description

3차원 신경근접합부 모델, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 스크리닝 방법
본 발명은 과학기술정보통신부의 지원 하에서 과제고유번호 1711156887, 세부과제번호 2022M3H4A1A01005271에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리전문기관은 한국연구재단, 연구사업명은 "나노소재기술개발", 연구과제명은 "오가노이드 기반 약물 스크리닝용 나노바이오하이브리드 엑츄에이터 칩", 주관기관은 서강대학교, 연구기간은 2022.01.01 ~ 2022.12.31이다.
또한 본 발명은 과학기술정보통신부의 지원 하에서 과제고유번호 1711108724, 세부과제번호 2019R1A2C3002300에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리전문기관은 한국연구재단, 연구사업명은 "개인기초연구(과기정통부)(R＆D)", 연구과제명은 "뇌어셈블로이드 기반 생명체 모방 센싱 기능 바이오하이브리드 로봇", 주관기관은 서강대학교, 연구기간은 2022.03.01 ~ 2023.02.28이다.
또한 본 발명은 교육부의 지원 하에서 과제고유번호 1345312114, 세부과제번호 2016R1A6A1A03012845에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리전문기관은 한국연구재단, 연구사업명은 "이공학학술연구기반구축(R＆D)", 연구과제명은 "뇌질환 약물 평가 기능 나노바이오칩 개발", 주관기관은 서강대학교, 연구기간은 2022.01.01 ~ 2022.12.31이다.
본 특허출원은 2022년 10월 26일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2022-0139173호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 골격근세포(C2C12)에서 유래한 근육 번들과 공동 배양된 3차원(3D) 신경근접합부(Neuromuscular Junction; NMJ) 모델에 관한 것으로, 구체적으로, 카르복실화 탄소나노튜브(CNT-COOH)와 인간신경줄기세포(hNSC) 유래 다중 모터 뉴런 스페로이드(multi-neuron spheroids, multi-MNSs)를 이용하여 3D 나노-바이오하이브리드 하이드로겔을 제작한 후, 골격근세포 유래 근육다발로 구성된 근육 번들과 공동 배양된 3D 신경근접합부 모델, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 스크리닝 방법에 관한 것이다.
신약개발에서 동물실험은 비임상/임상실험 및 초기 스크리닝에 수행되는데 한 건의 신약개발에 수행되는 동물실험은 수천억 원이 넘는 비용이 소요된다. 또한, 전세계적으로 윤리적인 이유를 들어 동물실험을 반대하고 실험동물 사용에 대한 규제가 가해지고 있으므로, 동물 또는 인간의 세포를 이용한 체외 실험을 통해 동물실험을 대체하려는 시도가 이루어지고 있는데, 특히 인간 줄기세포에서 유래하는 심근세포, 뇌, 간세포를 활용한 의약품의 안전성, 유효성 평가의 중요성이 크게 대두되고 있다.
하지만, 기존의 체외 실험기술로 실제 임상 반응을 예측하기에는 많은 어려움이 있는 실정이다. 세포는 배양 환경에 따라 세포의 접착력, 성장, 이동, 분화 등이 변하므로, 3차원적으로 주변세포 및 세포 외 기질 등과 상호작용할 수 있는 생체 내 환경과 유사한 배양 시스템을 제공하여 세포의 본래 기능을 유지하는 것이 중요한데, 2차원(2D) 단층배양 기판은 실제 생체 내에서와는 매우 다른 환경에 처하기 때문에 세포가 빠르게 고유 특성을 상실하는 탈분화 현상이 있고 줄기세포 분화 조절이 어려운 문제점이 있다. 따라서, 기존 2D 배양법 및 일반적인 세포배양 용기를 사용한 단층 세포 배양 방법으로는 심근세포 및 생체 기관의 생리학적 특성을 정확히 모사하는데 한계가 있다.
이에 생체 내부 환경을 모델링하기 위해 3차원(3D) 세포 배양 기술이 개발되고 있으며, 대표적으로 생체 내부와 유사한 구조를 가진 3D 구형 세포 응집체인 스페로이드(spheroid) 형태로 세포를 배양하는 기술을 들 수 있다. 스페로이드는 세포들이 응집·결합된 3차원 조직 유사체로서, 체외 배양에서도 체내와 유사한 세포 간 상호작용을 유지하는 특성이 있고, 약물스크리닝에서 임상효율을 높이는 장점이 있다. 그러므로 세포 스페로이드는 일반조직을 구성하는 세포나 장기를 이루는 세포, 암세포 및 줄기세포에 대한 연구에서 주목받고 있으며, 또한 세포치료제를 포함하는 신약개발, 약물 스크리닝 시스템 개발, 줄기세포를 이용한 분화에 대한 연구에서도 중요한 역할을 담당하고 있다.
인체에서 가장 풍부한 조직으로 알려진 골격근은 근섬유의 3차원 조직이 세포외기질과 결합하여 복잡한 네트워크 구조를 가지고 있다. 인간의 골격근 조직과 유사한 모델을 개발하기 위해서는 조직 내에 잘 정렬된 근관을 갖춘 이방성 구조가 필수적이다. 이러한 골격근 조직 내에서 이방성 환경은 근육조직 내부 세포의　정렬을 촉진하고 근 신생 및 성숙을 촉진시킬 수 있다.
최근에는 나노 섬유, 고정재 및 하이드로겔 압축, 화학적 표면 패턴, 기계적 자극, 전기장 또는 자기장이 인간과 유사한 골격근 배양을 위한 이방성 환경을 생성하는데 사용되고 있다. 이러한 인간 골격근 3차원 체외　모델의 개발은 기본적인 생물학적 연구와 재생 의학 전략 개발, 근육 질환에 대한 약물 스크리닝을 위한 중요한 도구를 제공할 수 있다. 이에, 기존의 3차원 골격근 조직이 가지고 있는 한계점을 극복하기 위하여 보다 복잡한 구조로 인간 근육과 유사한 기능을 하는 3차원 골격근 조직 모델에 대한 연구가 지속되고 있다.
다만, 근육세포는 운동신경과 연결되어 신경근접합부 형성에 의해 외부 신호를 전기신호 형태로 전달받아 움직이게 되나, 실험실에서 사용되는 대부분의 신경근접합부 모델은 운동신경과 근육세포의 효율적인 접합 및 신호 전달이 어렵기 때문에 신경근접합부 형성 및 신호전달 효율을 극대화하기 위한 방법들의 도입이 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 신경근접합부 형성 및 신호전달 효율을 극대화하기 위하여, 메트리겔(Matrigel), 콜라겐 등 세포외기질(Extracellular Matrix, ECM)을 포함한 물질인 하이드로겔을 이용하여 신경근접합부 형성 효율을 높이는 방법을 고안하기 위하여 노력하였다.
그 결과, 근아 세포(myoblast)가 3D 배양된 근육 번들; 및 신경 유래 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)가 3D 배양된 모터 뉴런 스페로이드(motor neuron spheroid);를 포함한 액츄에이터를 이용하면, 근육 번들 및 모터 뉴런 스페로이드가 효율적으로 접합하여 신호 전달능이 우수해짐을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 3D 나노-바이오하이브리드 액츄에이터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 3D 나노-바이오하이브리드 액츄에이터의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 3D 나노-바이오하이브리드 액츄에이터를 이용한 약물 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 골격근세포(C2C12)에서 유래한 근육 번들과 공동 배양된 3차원(3D) 신경근접합부(Neuromuscular Junction; NMJ) 모델에 관한 것으로, 구체적으로, 카르복실화 탄소나노튜브(CNT-COOH)와 인간신경줄기세포(hNSC) 유래 다중 모터 뉴런 스페로이드(multi-neuron spheroids, multi-MNSs)를 이용하여 3D 나노-바이오하이브리드 하이드로겔을 제작한 후, 골격근세포 유래 근육다발로 구성된 근육 번들과 공동 배양된 3D 신경근접합부 모델, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 스크리닝 방법에 관한 것이다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 예는 3D 나노-바이오하이브리드 액츄에이터에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 3D 나노-바이오하이브리드 액츄에이터는 근아 세포(myoblast)가 3D 배양된 근육 번들; 및 신경 유래 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)가 3D 배양된 모터 뉴런 스페로이드(motor neuron spheroid);를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 근육 번들은 근아 세포(myoblast)가 3D 배양된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 모터 뉴런 스페로이드는 근육 번들의 일 측에 도포된 채로 공동 배양된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 모터 뉴런 스페로이드는 근육 번들의 일 측에서 공동 배양됨으로써 신경근접합부(Neuromuscular Junction; NMJ)를 형성하게 된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 모터 뉴런 스페로이드는 뉴런 스페로이드가 분화한 후 형성되는 스페로이드를 의미하는 것일 수 있다.
본 명세서에서, 용어 '스페로이드'는 세포들이 응집·결합된 3차원 조직 유사체를 의미하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 신경근접합부에서 이루어지는 모터 뉴런 스페로이드와 근육 번들간 신호 전달은, 신경전달물질과 같은 화학적인 방법과 이온통로와 같은 물리적인 방법에 의해 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 근아세포는 C2C12, C2, Sol8 및 L6로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 예를 들어, C2C12일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 C2C12 세포주(cell line)는 근관세포(myotubes)로 분화하는 근육분화(myogenesis) 동안 다양한 단백질을 발현하는 마우스 근아세포(myoblast) 세포주일 수 있다.
본 발명에 있어서 액츄에이터는 지지 부재를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 지지 부재는 근육 번들의 길이 방향 양 말단을 고정하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 지지 부재는 폴리디메틸실록산(Polydimethylsiloxane; PDMS)으로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서, 지지 부재는 PDMS 몰드로서 서로 이격된 고정 부재를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 근육 번들은 서로 이격된 고정 부재 사이에 위치할 수 있으며, 근육 번들의 길이 방향 양 말단은 고정 부재에 의하여 고정되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 모터 뉴런 스페로이드(motor neuron spheroid)는 신경 유래 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)가 3D 배양된 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "줄기세포(stem cell)"는 여러 종류의 신체 조직으로 분화할 수 있는 능력을 가진 미분화 세포로서, 계대 1(passage 1) 내지 계대 100의 줄기세포일 수 있다.
본 발명에 있어서 줄기세포는 신경, 골수, 제대혈, 골수, 혈액 또는 지방에서 추출해낸 것일 수 있으며, 예를 들어, 신경일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서, 신경 유래 다분화능 줄기세포는 정상인으로부터 수득한 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 신경 유래 다분화능 줄기세포는 정상인으로부터 분리된 체세포에서 수득한 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 신경 유래 다분화능 줄기세포는 신경근육질환자로부터 수득한 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 신경 유래 다분화능 줄기세포는 신경근육질환자으로부터 분리된 체세포에서 수득한 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 신경근육질환은 척수성 근위축증(Spinal Muscular Atrophy, SMA), 근위축성 측색 경화증(루게릭병)(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS), 뒤시엔느 근위축증(Duchenne Muscular Dystrophy), 및 근긴장성 위축증(Mytonic Dystrophy)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으며, 예를 들어, 근위축성 측색 경화증일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 예는 다음의 단계를 포함하는 3D 나노-바이오하이브리드 액츄에이터의 제조 방법에 관한 것이다:
근육 번들이 형성되도록 근아 세포를 3D 배양하여 분화시키는 제1분화 단계; 모터 뉴런 스페로이드가 형성되도록 다분화능 줄기세포 유래 신경줄기세포를 3D 배양하여 분화시키는 제2분화 단계; 및 상기 근육 번들에 상기 모터 뉴런 스페로이드를 분주한 복합체를 공동으로 배양하는 공동배양 단계.
본 발명에 있어서 제1분화 단계는 근육 번들이 형성되도록 근아 세포를 3D 배양하여 분화시키는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 3D 배양은 실제로 생체 내의 세포는 바닥에 붙어 자라는 것이 아니라, 주변의 세포 및 액체에 둘러싸인 3차원 공간에 존재하는 점을 고려하여, 실제 생체 내 세포와 유사한 형태로 배양하기 위한 방법일 수 있다. 예를 들면, 미세유체소자를 이용하여 채널의 특정 부분에 세포외 기질을 고정하고 세포를 배양하는 방법, 또는 생체친화성 물질로 구성한 3D 스캐폴드(scaffold)에 세포를 배양하는 방법 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 제1분화 단계는 근아 세포를 근육 세포로 분화시키는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 제2분화 단계는 모터 뉴런 스페로이드가 형성되도록 다분화능 줄기세포 유래 신경줄기세포를 3D 배양하여 분화시키는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 제2분화 단계는 반드시 제1분화 단계 이후에 수행되는 것일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 제1분화 단계 이전에 수행되거나 동시에 수행될 수도 있다.
본 발명에 있어서 모터 뉴런은 신경세포 중 하나인 운동 뉴런을 의미하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 스페로이드는 세포의 3차원 집합체로, 자연 분화를 방지하고 원하는 계열의 분화를 용이하도록 한다. 특히 3차원상에서 신경세포로의 분화유도가 용이한 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 제1분화 단계는 근아 세포, 피브로넥틴(fibronectin) 및 트롬빈(thrombin)을 포함한 제1하이드로겔을 이용하여, 근육 번들이 형성되도록 근아 세포를 3D 배양하여 분화시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 제1분화 단계는 분주 단계, 제1공급 단계 및 제2공급 단계를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 제1하이드로겔은 근아 세포, 피브로넥틴 및 트롬빈을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 제1하이드로겔은 근아 세포, 메트리겔(Materigel), 피브로넥틴, 트롬빈 및 DMEM(Dulbeccos Modified Eagles Media)을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 제1하이드로겔은 근아 세포가 메트리겔(Materigel), 피브로넥틴, 트롬빈 및 DMEM(Dulbeccos Modified Eagles Media)에 균질하게 분산된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 분주 단계는 근아 세포를 본 발명의 지지 부재인 PDMS 몰드에 분주하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 제1공급 단계는 근아 세포에 성장 배양액을 공급하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 성장 배양액은 근아 세포에 대하여 3 내지 5일 동안 공급되는 것일 수 있으며, 예를 들어, 4일 동안 공급되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서, 제2공급 단계는 성장 배양액을 분화 배양액으로 교체하고, 배양 중인 근아 세포에 분화 배양액을 공급하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 분화 배양액은 배양 중인 근아 세포에 대하여 적어도 9일 이상, 10일 이상, 11일 이상, 12일 이상 또는 13일 이상 공급되는 것일 수 있으며, 예를 들어, 10일 이상 공급되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 이용하는 성장 배양액 및 분화 배양액은 시판중인 공지의 제품일 수 있다.
본 발명의 다른 일 구체예에서, 제2분화 단계는 시딩 단계, 제1배양 단계, 제2배양 단계, 및 제3배양 단계를 포함하여 모터 뉴런 스페로이드가 형성되도록 다분화능 줄기세포 유래 신경줄기세포를 3D 배양하여 분화시키는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 구체예에서, 시딩 단계는 플레이트에 신경 유래 다분화능 줄기세포를 시딩하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 신경 유래 다분화능 줄기세포는 시딩 단계에 앞서 bFGF(basic fibroblast growth factor) 및 EGF(Epidermal growth factor)를 함유 배지를 포함하는 플레이트에서 미리 성장하도록 전처리(pre-treatment)된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 시딩 단계는 42시간 내지 54시간 수행되는 것일 수 있으며, 예를 들어, 48시간 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 구체예에서, 제1배양 단계는 배양 배지에서 줄기세포를 배양하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 배양 배지는 bFGF 및 EGF를 함유하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 구체예에서, 제2배양 단계는 배양 배지를 제1모터 뉴런 분화 배지로 교체하고, 줄기세포를 계속 배양하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 제1모터 뉴런 분화 배지는 bFGF, shh(sonic hedgehog), activin A 및 레티노산(retinoic acid)을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 제2배양 단계는 18 내지 22일 또는 20일 동안 수행되는 것일 수 있으며, 예를 들어, 20일 동안 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 구체예에서, 제3배양 단계는 제1모터 뉴런 분화 배지를 제2모터 뉴런 분화 배지로 교체하고, 줄기세포를 계속 배양하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 제2모터 뉴런 분화 배지는 bFGF, shh(sonic hedgehog), activin A 및 레티노산(retinoic acid)을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 제2모터 뉴런 분화 배지는 신경영양 인자(Neurotrophic Factors)인 BDNF(brain-derived neurotrophic factor) 및 GDNF(Glial cell-derived neurotrophic factor)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, BDNF 및 GDNF를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 제3배양 단계는 6 내지 10시간 또는 8시간 수행되는 것일 수 있으며, 예를 들어, 8시간 동안 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 공동배양 단계는 신경영양 인자를 복합체에 공급하는 영양보충 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 복합체는 근육 번들의 일측에 모터 뉴런 스페로이드가 도포된 채 공동배양(co-cultrue)됨으로써 신경근접합부를 이룬 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서, 제2분화 단계는 제2하이드로겔을 준비하는 겔형성 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 겔형성 단계는 제2분화 단계에서 형성된 모터 뉴런 스페로이드와 카르복실화 탄소나노튜브(CNT-COOH) 및 ECM 단백질을 이용하여 제2하이드로겔을 준비하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, ECM 단백질은 메트리겔, 피브로넥틴 및 트롬빈을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 제2하이드로겔은 모터 뉴런 스페로이드 및 카르복실화 탄소나노튜브가 ECM 단백질들에 균질하게 분산된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 공동배양 단계는 근육 번들에 제2하이드로겔을 분주한 복합체를 공동으로 배양하는 것일 수도 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 공동배양 단계는 복합체에 신경영양 인자를 처리하는 영양처리 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는 다음의 단계를 포함하는 3D 나노-바이오하이브리드 액츄에이터를 이용한 약물 스크리닝 방법에 관한 것이다:
3D 나노-바이오하이브리드 액츄에이터에 타겟 약물을 처리하는 약물처리 단계.
본 발명에 있어서 약물처리 단계는 본 발명에 따른 3D 나노-바이오하이브리드 액츄에이터에 타겟 약물을 처리하거나 분주하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 타겟 약물은 신경근육질환을 치료하거나 개선하기 위한 치료제일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 근아 세포(myoblast)가 3D 배양된 근육 번들; 및 신경 유래 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)가 3D 배양된 모터 뉴런 스페로이드(motor neuron spheroid);를 포함한 3D 나노-바이오하이브리드 액츄에이터에 관한 것으로, 본 발명을 이용하면, 근육 번들 및 모터 뉴런 스페로이드가 효율적으로 접합하여 신호 전달능이 우수해져, 신경근육질환과 관련된 타겟 약물의 스크리닝시 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 제조예에 따른 근육 번들 제작 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실험예에 따라, 면역 염색법을 이용하여 근육 번들의 분화를 확인한 형광 이미지이다.
도 3은 본 발명의 일 제조예에 따른 정상 및 ALS 모터 뉴런 스페로이드 제작 과정을 나타낸 모식도이다.
도 4는 본 발명의 일 실험예에 따라, 면역 염색법을 이용하여 정상 및 ALS 모터 뉴런 스페로이드의 분화 마커인 islet1 및 Tuj1을 확인한 형광 이미지이다.
도 5는 본 발명의 일 실험예에 따라, 면역 염색법을 이용하여 정상 및 ALS 모터 뉴런 스페로이드의 TDP-43 응집 현상을 분석한 형광 이미지이다.
도 6은 본 발명의 일 제조예에 따른 카르복실화 탄소나노튜브 (CNT-COOH) 기반 정상 및 ALS multi-MNSs가 매립된 나노-바이오하이브리드 하이드로젤을 이용한 3차원 신경근접합부 (NMJ) 제작 과정을 나타낸 모식도이다.
도 7은 본 발명의 일 실험예에 따라, 면역 염색법을 이용하여 CNT-COOH 기반 정상 multi-MNSs가 매립된 나노-바이오하이브리드 하이드로젤을 이용한 3차원 NMJ를 분석한 형광 이미지이다.
도 8은 본 발명의 일 실험예에 따라, 면역 염색법을 이용하여 CNT-COOH 기반 ALS multi-MNSs가 매립된 나노-바이오하이브리드 하이드로젤을 이용한 3차원 ALS-NMJ를 분석한 형광 이미지이다.
도 9는 본 발명의 일 실험예에 따라, 면역 염색법을 이용하여 보수티닙을 7일 처리한 후의 3차원 ALS-NMJ를 분석한 형광 이미지이다.
도 10은 본 발명의 일 실험예에 따라, CNT-COOH 유무별 전기자극에 의한 근육 번들의 움직임 향상 효과를 확인할 수 있는 속도 비교 데이터이다.
도 11은 본 발명의 일 실험예에 따라, single 및 multi-MNSs 유무, 또는 CNT-COOH 유무에 따른 글루타메이트(glutamate) 자극에 의한 근육 움직임 향상 효과를 확인할 수 있는 근육 번들의 속도 비교 데이터이다.
도 12는 본 발명의 일 실험예에 따라, NMJ에 대한 약물 처리 시간에 따른 CNT-COOH 및 ALS-multi-MNSs가 포함된 나노-바이오하이브리드 하이드로젤에서 근육 움직임 향상 효과를 확인할 수 있는 근육 번들의 속도 비교 데이터이다.
본 발명은 근아 세포(myoblast)가 3D 배양된 근육 번들; 및 신경 유래 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)가 3D 배양된 모터 뉴런 스페로이드(motor neuron spheroid);를 포함하고, 상기 모터 뉴런 스페로이드는 상기 근육 번들의 일 측에 도포된 채로 공동 배양된 것인, 3D 나노-바이오하이브리드 액츄에이터에 관한 것이다.
본 발명에서 사용하는 용어는 단지 특정한 실시예들을 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 발명의 설명에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성 요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성 요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성 요소를 다른 구성 요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성 요소는 제2 구성 요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성 요소도 제1 구성 요소로 명명될 수 있다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 본 발명에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
구성 요소를 해석함에 있어서, 별도의 명시적 기재가 없더라도 오차 범위를 포함하는 것으로 해석한다. 시간 관계에 대한 설명일 경우, 예를 들어, '~후에', '~에 이어서', '~다음에', '~전에' 등으로 시간 적 선후관계가 설명되는 경우, '바로' 또는 '직접'이 사용되지 않는 이상 연속적이지 않은 경우도 포함한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
제조예 1. 3차원 근육 번들 제작
인간 골격근 구조를 모방하기 위해서 골격근세포 중 하나인 C2C12를 사용하여 3차원 근육 번들을 제작하였다. 3차원 근육 번들 제작에는 C2C12 340 uL, 메트리겔(Matrigel) 300 uL, 피브로넥틴(fibronectin) 250 uL(16 mg/ml), 트롬빈(thrombin) 10 uL(0.5 U/1 mg Fibrinogen), 및 DMEM(Dulbeccos Modified Eagles Media) 100 uL를 포함하는 제1하이드로겔을 이용하였다.
도 1의 모식도에서 확인할 수 있듯이, 미리 만들어진 PDMS 몰드안에 전술한 제1하이드로겔을 뿌려주고, DMEM, 10% 소태아혈청(fetal bovine serum), 1% p/s (penicillin/streptomycin), 1 mg/mL 아미노카프론산(aminocaproic acid; ACA)으로 구성된 근육세포 성장 배양액을 넣어주었다. 4일 동안 근육세포를 배양한 후, 근육세포 성장 배양액을 DEME 2% horse serum, 1% p/s, 1 mg/mL ACA와 50 ng/mL IGF-1(insulin-like growth factor)로 구성된 근육세포 분화 배양액으로 교체하였다. 2일에 한 번씩 근육세포 분화 배양액을 교체하고, 14일 이상 분화를 진행하였다.
실험예 1. 근육 번들의 분화 확인
제조예 1의 3차원 근육 번들 내 근육세포의 분화를 확인하고자 분화 마커인 알파-액티닌(a-actinin)을 이용하여 면역 염색을 실시하여, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 확인할 수 있듯이, 근육 번들 내 근섬유가 분화된 것을 뚜렷하게 구분할 수 있었다.
제조예 2. 정상 및 ALS 모터 뉴런 스페로이드 제작
정상 및 근위축성 측색 경화증(amyotrophic lateral sclerosis; ALS) 모델의 모터 뉴런 스페로이드를 제작하기 위하여, 먼저 인간 신경 줄기 세포 (hNSC), 및 ALS 환자에서 유도된 다분화능 줄기세포 유래 신경 줄기 세포 (ALS-hNSC, ALS 진단을 받은 55세 백인 여성)를 bFGF 20 ng/mL 및 EGF 20 ng/mL 함유 RHB-A 배지(배양 배지)를 포함하는 라미닌 코팅 조직배양 플레이트에서 성장시켰다.
hNSC 및 ALS-hNSC (웰당 7.0 X 104개 세포)를 96웰 플레이트에 시딩하여 뉴런 스페로이드를 형성시켰다. 세포 시딩 48시간 후, 배양 배지는 8 ng/mL bFGF, 200 ng/mL shh(sonic hedgehog), 10 ng/mL activin A 및 50 uM 레티노산(retinoic acid)을 포함하는 제1모터 뉴런 분화 배지로 교체되었다. 모터 뉴런을 분화시킨지 20일 경과 후, 모터 뉴런 스페로이드의 성숙을 위해 제1모터 뉴런 분화 배지를 BDNF 10 ng/mL 및 GDNF 10 ng/mL가 포함된 제2모터 뉴런 분화 배지로 교체하고 8일 동안 배양하였다. 개략적인 모터 뉴런 스페로이드의 형성 과정은 도 3에 나타내었으며, 전체 과정을 수행하는 데에는 통상 약 28일이 소요될 수 있다.
실험예 2. 분화된 모터 뉴런 스페로이드 확인
제조예 2의 정상 및 ALS 모터 뉴런 스페로이드에 대한 분화를 확인하고자 분화 마커인 islet1 및 Tuj1을 이용하여 면역 염색을 실시한 결과를 도 4에 나타내었고, 도 4에서 확인할 수 있듯이, 모터 뉴런 유전자는 뚜렷하게 발현하였다. 여기서, 정상 모터 뉴런 스페로이드는 hNSCs-MNSs를, ALS 모터 뉴런 스페로이드는 ALS-MNSs로 표시하였다.
아울러, 정상 모터 뉴런에서 발견되지 않는 비정상적인 TDP-43 단백질 응집 현상이 나타났고, 이에 약물인 보수티닙(bosutinib)을 7일 동안 처리하고 난 후, 다시 면역 염색을 통해 확인한 결과를 도 5에 나타내었으며, 도 5에서 확인할 수 있듯이, TDP-43 단백질 응집 양은 보수티닙 처리 후 감소되었다.
제조예 3: 정상 및 ALS multi-MNSs가 매립된 카르복실화 탄소나노튜브 (CNT-COOH) 기반의 나노-바이오하이브리드 제2하이드로겔을 이용한 3차원 신경근접합부 (NMJ) 제작
먼저, 제조예 1과 같이 폴리디메틸실록산(Polydimethylsiloxane; PDMS) 몰드에서 근육 다발의 형성 및 분화를 통해 성숙한 근관을 생성함으로써 근육 번들을 형성시켰다.
다음으로, 미리 분화된 정상인의 인간신경줄기세포(hNSC) 유래 다중 모터 뉴런 스페로이드(multi-neuron spheroids, multi-MNSs)(정상 multi-MNSs) 또는 ALS 환자의 hNSC 유래 다중 모터 뉴런 스페로이드(ALS-multi-MNSs)와, 카르복실화 탄소나노튜브(CNT-COOH) 0.1 mg/mL 및 ECM 단백질 (30% Matrigel, 4 mg/mL 피브로넥틴, 0.5 U/1 mg 트롬빈)을 이용하여, 정상 multi-MNSs 및 ALS-multi-MNSs가 매립된 제2하이드로겔(3D nano-biohybrid hydrogel)을 제작한 후, 앞서 형성된 근육 번들 상부에 뿌려주고 공동배양 하였다.
공동배양 분화 배지는 근육 분화 배지와 함께 다중 모터 뉴런 스페로이드의 생존력을 지원하기 위해 뇌 유래 및 신경교 세포주 유래 신경영양 인자 (10 ng/mL BDNF 및 10 ng/mL GDNF)로 보충되었다. 분화 배지는 2주 동안 2일마다 교체하였다.
실험예 3. 3차원 신경근접합부의 분석
3-1. 축삭 성장 확인
공동 배양 10일 후, 면역 염색을 통해 신경근접합부(Neuromuscular Junction; NMJ) 마커인 a-BTX를 통해 NMJ 형성을 확인하여, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7은 CNT-COOH 기반 정상 multi-MNSs가 매립된 나노-바이오하이브리드 하이드로젤을 이용한 3차원 NMJ를 면역 염색법으로 분석한 형광 이미지에 관한 것이다.
아울러, 도 8은 CNT-COOH 기반 ALS multi-MNSs가 매립된 나노-바이오하이브리드 하이드로젤을 이용한 3차원 ALS-NMJ를 면역 염색법으로 분석한 형광 이미지이다. 도 8을 참조하면, ALS-multi-MNSs를 이용하여 제작한 NMJ는 정상에 비해 신경의 축삭들이 뻗어 나가지 못하고 a-BTX의 발현이 현저히 낮아진 것을 확인할 수 있다.
또한, 보수티닙을 7일 동안 처리한 후 3차원 ALS-NMJ를 면역 염색법으로 분석한 형광 이미지를 도 9에 나타내었으며, 도 9를 참조하면, NMJ에 약물인 보수티닙을 7일 동안 처리하면, 약물처리 전보다 신경의 축삭들이 잘 뻗어 나가 근육과 연결됨으로써 NMJ 형성이 증가된 것을 확인할 수 있다.
3-2. 근육 움직임 확인
1 Hz, 10 V 전기자극 처리를 통하여 근육의 움직임을 관찰한 결과를 도 10, 표 1(3D hydrogel + multi-MNSs, 3D nano-biohybrid hydrogel + multi-MNSs)에 나타내었고, 신경전달물질인 글루타메이트 100 uM 화학자극 처리를 통하여 근육의 움직임을 관찰한 결과를 도 11, 표 2(3D hydrogel + multi-MNSs, 3D nano-biohybrid hydrogel + single MNSs 및 3D nano-biohybrid hydrogel + multi-MNSs)에 나타내었다.
3D hydrogel + multi-MNSs 3D nano-biohybrid hydrogel + multi-MNSs
Muscle contraction(um/sec) 3.955 7.538
3D hydrogel + multi-MNSs 3D nano-biohybrid hydrogel + single MNSs 3D nano-biohybrid hydrogel + multi-MNSs
Muscle contraction(um/sec) 2.61 4.06 5.25
도 10 및 표 1에서 확인할 수 있듯이, 1 Hz, 10 V의 동일한 전기자극 조건하에서, CNT-COOH 및 multi-MNSs가 포함된 3D 나노-바이오하이브리드 제2하이드로겔을 이용하여 제작된 NMJ에서 형성된 근육 번들의 근육 움직임(muscle contraction)이 7.538 um/sec로 가장 큰 것으로 나타났다.
도 11 및 표 2에서 확인할 수 있듯이, 100 uM 글루타메이트의 동일한 화학자극 조건하에서, CNT-COOH 및 multi-MNSs가 포함된 3D 나노-바이오하이브리드 제2하이드로겔을 이용하여 제작된 NMJ에서 형성된 근육 번들의 근육 움직임(muscle contraction)이 5.25 um/sec로 가장 큰 것으로 나타났다.
또한, CNT-COOH 및 ALS-multi-MNSs가 포함된 3D 나노-바이오하이브리드 제2하이드로겔을 이용하여 NMJ를 제작하였고 약물인 보수티닙 처리 후, 시간의 경과에 따른 근육 움직임을 측정하여 도 12 및 표 3에 나타내었다.
H-NMJ Day 1 Day 3 Day 7
Muscle contraction(um/sec) 7.9 1.974 7.5021 7.025
도 12 및 표 3에서 확인할 수 있듯이, CNT-COOH 및 ALS-multi-MNSs가 포함된 제2하이드로겔을 이용하여 제작한 NMJ는 약물 처리 후, 시간의 경과에 따라 근육 움직임이 증가하였으며, 약물 처리 3일 차에 이르러서 근육 움직임은 정상 NMJ (H-NMJ)와 비교하여 약 98.7% 수준까지 회복되었다.
본 발명은 골격근세포(C2C12)에서 유래한 근육 번들과 공동 배양된 3차원(3D) 신경근접합부(Neuromuscular Junction; NMJ) 모델에 관한 것으로, 구체적으로, 카르복실화 탄소나노튜브(CNT-COOH)와 인간신경줄기세포(hNSC) 유래 다중 모터 뉴런 스페로이드(multi-neuron spheroids, multi-MNSs)를 이용하여 3D 나노-바이오하이브리드 하이드로겔을 제작한 후, 골격근세포 유래 근육다발로 구성된 근육 번들과 공동 배양된 3D 신경근접합부 모델, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 스크리닝 방법에 관한 것이다.

Claims (14)

  1. 근아 세포(myoblast)가 3D 배양된 근육 번들; 및
    신경 유래 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)가 3D 배양된 모터 뉴런 스페로이드(motor neuron spheroid);를 포함하고,
    상기 모터 뉴런 스페로이드는 상기 근육 번들의 일 측에 도포된 채로 공동 배양된 것인, 3D 나노-바이오하이브리드 액츄에이터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 근아 세포는 C2C12, C2, Sol8 및 L6로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 3D 나노-바이오하이브리드 액츄에이터.
  3. 제1항에 있어서, 상기 액츄에이터는 지지 부재를 추가로 포함하고,
    상기 지지 부재는 상기 근육 번들의 길이 방향 양 말단을 고정하는 것인, 3D 나노-바이오하이브리드 액츄에이터.
  4. 제1항에 있어서, 상기 지지 부재는 폴리디메틸실록산(Polydimethylsiloxane; PDMS)으로 이루어진 것인, 3D 나노-바이오하이브리드 액츄에이터.
  5. 제1항에 있어서, 상기 신경 유래 다분화능 줄기세포는 신경근육질환자로부터 수득한 것인, 3D 나노-바이오하이브리드 액츄에이터.
  6. 제1항에 있어서, 상기 신경근육질환은 척수성 근위축증(Spinal Muscular Atrophy, SMA), 근위축성 측색 경화증(루게릭병)(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS), 뒤시엔느 근위축증(Duchenne Muscular Dystrophy), 및 근긴장성 위축증(Mytonic Dystrophy)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 3D 나노-바이오하이브리드 액츄에이터.
  7. 다음의 단계를 포함하는 3D 나노-바이오하이브리드 액츄에이터의 제조 방법:
    근육 번들이 형성되도록 근아 세포를 3D 배양하여 분화시키는 제1분화 단계;
    모터 뉴런 스페로이드가 형성되도록 다분화능 줄기세포 유래 신경줄기세포를 3D 배양하여 분화시키는 제2분화 단계; 및
    상기 근육 번들에 상기 모터 뉴런 스페로이드를 분주한 복합체를 공동으로 배양하는 공동배양 단계.
  8. 제7항에 있어서, 상기 제1분화 단계는 근아 세포, 피브로넥틴(fibronectin) 및 트롬빈(thrombin)을 포함한 제1하이드로겔을 이용하여 수행되는 것인, 3D 나노-바이오하이브리드 액츄에이터의 제조 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 제1분화 단계는,
    근아 세포를 지지 부재에 분주하는 분주 단계;
    근아 세포에 성장 배양액을 공급하는 제1공급 단계; 및
    성장 배양액을 분화 배양액으로 교체하고, 배양 중인 근아 세포에 분화 배양액을 공급하는 제2공급 단계;를 포함하는 것인, 3D 나노-바이오하이브리드 액츄에이터의 제조 방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 제2분화 단계는,
    뉴런 스페로이드가 형성되도록 플레이트에 신경 유래 다분화능 줄기세포를 시딩하는 시딩 단계;
    배양 배지에서 상기 줄기세포를 배양하는 제1배양 단계;
    배양 배지를 제1모터 뉴런 분화 배지로 교체하고, 줄기세포를 계속 배양하는 제2배양 단계; 및
    제1모터 뉴런 분화 배지를 제2모터 뉴런 분화 배지로 교체하고, 모터 뉴런 스페로이드가 형성되도록 줄기세포를 계속 배양하는 제3배양 단계;를 포함하는 것인, 3D 나노-바이오하이브리드 액츄에이터의 제조 방법.
  11. 제7항에 있어서, 상기 공동배양 단계는 신경영양 인자를 복합체에 공급하는 영양보충 단계를 추가로 포함하는 것인, 3D 나노-바이오하이브리드 액츄에이터의 제조 방법.
  12. 제7항에 있어서, 상기 신경 유래 다분화능 줄기세포는 신경근육질환자로부터 수득한 것인, 3D 나노-바이오하이브리드 액츄에이터의 제조 방법.
  13. 3D 나노-바이오하이브리드 액츄에이터에 타겟 약물을 처리하는 약물처리 단계;를 포함하는 3D 나노-바이오하이브리드 액츄에이터를 이용한 약물 스크리닝 방법에 있어서,
    상기 3D 나노-바이오하이브리드 액츄에이터는,
    근아 세포(myoblast)가 3D 배양된 근육 번들; 및 신경 유래 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)가 3D 배양된 모터 뉴런 스페로이드(motor neuron spheroid);를 포함하고,
    상기 모터 뉴런 스페로이드는 상기 근육 번들의 일 측에 도포된 채로 공동 배양된 것인, 3D 나노-바이오하이브리드 액츄에이터를 이용한 약물 스크리닝 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 신경 유래 다분화능 줄기세포는 신경근육질환자로부터 수득한 것인, 3D 나노-바이오하이브리드 액츄에이터를 이용한 약물 스크리닝 방법.
PCT/KR2023/015209 2022-10-26 2023-10-04 3차원 신경근접합부 모델, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 스크리닝 방법 WO2024090832A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020220139173A KR20240058439A (ko) 2022-10-26 2022-10-26 3차원 신경근접합부 모델, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 스크리닝 방법
KR10-2022-0139173 2022-10-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2024090832A1 true WO2024090832A1 (ko) 2024-05-02

Family

ID=90831124

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2023/015209 WO2024090832A1 (ko) 2022-10-26 2023-10-04 3차원 신경근접합부 모델, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 스크리닝 방법

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR20240058439A (ko)
WO (1) WO2024090832A1 (ko)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180053484A (ko) * 2016-11-11 2018-05-23 서강대학교산학협력단 패터닝된 하이드로젤을 이용한 신경줄기세포의 분화 방법
US20210380913A1 (en) * 2019-02-20 2021-12-09 National University Corporation Tokai National Higher Education And Research System Co-culturing device, motor neuron culturing device, multi-well plate, fabrication method of in vitro evaluation model of neuromuscular disease, and screening method of therapeutic agent against neuromuscular disease
KR20220067388A (ko) * 2020-11-17 2022-05-24 서강대학교산학협력단 대뇌 오가노이드-모터뉴런 스페로이드 구조체 및 이의 제조방법
US20220169965A1 (en) * 2019-04-09 2022-06-02 Massachusetts Institute Of Technology A micro physiological model for neuronal and muscular diseases and disorders

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180053484A (ko) * 2016-11-11 2018-05-23 서강대학교산학협력단 패터닝된 하이드로젤을 이용한 신경줄기세포의 분화 방법
US20210380913A1 (en) * 2019-02-20 2021-12-09 National University Corporation Tokai National Higher Education And Research System Co-culturing device, motor neuron culturing device, multi-well plate, fabrication method of in vitro evaluation model of neuromuscular disease, and screening method of therapeutic agent against neuromuscular disease
US20220169965A1 (en) * 2019-04-09 2022-06-02 Massachusetts Institute Of Technology A micro physiological model for neuronal and muscular diseases and disorders
KR20220067388A (ko) * 2020-11-17 2022-05-24 서강대학교산학협력단 대뇌 오가노이드-모터뉴런 스페로이드 구조체 및 이의 제조방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HA, TAEHYEONG ET AL.: "S578: 3D nano-biohybrid hydrogel composed of motor neuron spheroids and carbon nanotube to enhance neuromuscular junction for evaluation of drug effects. ", KSBB FALL MEETING AND INTERNATIONAL SYMPOSIUM, KOREA, 28 September 2022 (2022-09-28) - 30 September 2022 (2022-09-30), Korea, pages 213, XP009554173 *
TAEHYEONG HA: "Biosensing system for drug evaluation of amyotrophic lateral sclerosis based on muscle bundle and nano-biohybrid hydrogel composed of multiple motor neuron spheroids and carbon nanotubes", CHEMICAL ENGENEERING JOURNAL, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 463, 1 May 2023 (2023-05-01), AMSTERDAM, NL , pages 142284, XP093163982, ISSN: 1385-8947, DOI: 10.1016/j.cej.2023.142284 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20240058439A (ko) 2024-05-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Dixon et al. Bioinspired three-dimensional human neuromuscular junction development in suspended hydrogel arrays
US6638763B1 (en) Isolated mammalian neural stem cells, methods of making such cells
US20080026462A1 (en) Meningeal-derived stem cells
US20050014255A1 (en) Stem cells for clinical and commercial uses
Naskar et al. Neurogenesis-on-Chip: Electric field modulated transdifferentiation of human mesenchymal stem cell and mouse muscle precursor cell coculture
WO2021187758A1 (ko) 심장 오가노이드, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 독성 평가 방법
WO2015105357A1 (ko) 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포 및 이를 포함하는 세포치료제
EP1278529B1 (en) Therapeutic uses for mesenchymal stromal cells
WO2020101461A1 (ko) 세포 배양용 캐리어를 이용하여 제조된 오가노이드 및 이를 이용한 약물 독성 평가방법
WO2022108117A1 (ko) 대뇌 오가노이드-모터뉴런 스페로이드 구조체 및 이의 제조방법
WO2024090832A1 (ko) 3차원 신경근접합부 모델, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 스크리닝 방법
CN111849770B (zh) 一种建立体外神经网络的方法、体外神经网络及其应用
WO2013119045A1 (ko) 온도감응성 하이드로젤 내에서의 중간엽 줄기세포의 신경분화 및 신경분화용 조성물
WO2017073910A1 (ko) 전자기가 유도된 금속 나노입자를 이용한 신경세포로의 직접교차분화 리프로그래밍 방법
WO2020111503A1 (ko) 정상 및 암 오가노이드 미세환경 구현을 위한 코어-쉘 구조체 및 그의 제조방법
WO2022260389A1 (ko) 말초신경양 미세조직 제조방법 및 이의 용도
WO2021112562A1 (ko) 흑색종 모델 및 이의 제조방법
Kang et al. Effectiveness of muscle basal lamina carrying neural stem cells and olfactory ensheathing cells in spinal cord repair
WO2020130312A1 (ko) 지방줄기세포 시트를 함유하는 심장조직 모사 심장이식용 시트 및 이의 제조방법
US8252279B2 (en) Methods for cell therapy
Bu Investigating the Impact of Biochemical and Mechanical Stimuli on Motor Neuron Growth
WO2024117655A1 (ko) 암 오가노이드 제조용 배지 조성물
Lee In vitro microfluidic platform for co-culture of myocytes with mouse embryonic stem cell-derived interneurons and motor neurons
WO2024025193A1 (ko) 기계적 강도가 조절된 기질을 포함하는 줄기세포 배양용 조성물 및 이의 용도
WO2023244053A1 (ko) 코 점막 오가노이드 제조용 배지 조성물