WO2021112562A1 - 흑색종 모델 및 이의 제조방법 - Google Patents

흑색종 모델 및 이의 제조방법 Download PDF

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WO2021112562A1
WO2021112562A1 PCT/KR2020/017468 KR2020017468W WO2021112562A1 WO 2021112562 A1 WO2021112562 A1 WO 2021112562A1 KR 2020017468 W KR2020017468 W KR 2020017468W WO 2021112562 A1 WO2021112562 A1 WO 2021112562A1
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WO
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melanoma
cells
melanoma cells
model
fibroblasts
Prior art date
Application number
PCT/KR2020/017468
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English (en)
French (fr)
Inventor
조원우
조동우
김병수
Original Assignee
포항공과대학교 산학협력단
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Publication date
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
    • C12N2502/1323—Adult fibroblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening

Definitions

  • the present invention relates to a method for manufacturing a melanoma model using a three-dimensional printing technology, and to a melanoma model manufactured using a three-dimensional printing technology.
  • melanoma models have been developed to study malignant melanoma and develop treatments.
  • the final function of the melanoma model is to reproduce the process of actual cancer formation and development in the body in vitro, and when various treatments or drugs are applied to the melanoma model, it shows a response similar to that of the actual melanoma, thereby providing an appropriate treatment means for melanoma. It is intended to serve as a presentation.
  • melanoma models such as two-dimensional cell culture models and animal models, but the melanoma models developed so far are complex microenvironments of actual tumors, such as interactions between cells or between cells and extracellular matrix (ECM).
  • ECM extracellular matrix
  • a spheroid culture model which is a three-dimensional cell tissue that can mimic the cancer microenvironment and show a cancer-like response.
  • the hanging-drop culture method in which the cell culture medium containing cells is suspended like a droplet to induce cell-to-cell bonding, and the rotary cell culture method, which forms a cell mass while rotating the cell culture medium, are useful for making melanoma models. is the most widely used method.
  • the present invention is capable of producing a melanoma of a desired size at a specific location by printing a hydrogel including tumor cells using three-dimensional cell printing and at the same time simulating the complex microenvironment of an actual tumor.
  • a new manufacturing method was developed.
  • the formed tumor increases in size as cells proliferate.
  • oxygen delivery to cells inside the tumor is inhibited, causing a hypoxic condition.
  • This hypoxic environment allows cancer cells inside the tumor to migrate outside the tumor to avoid necrosis and proliferate more actively.
  • the hypoxic environment induces mutations in cancer cells, thereby increasing the resistance of cancer cells to anticancer drugs. Therefore, it is essential to induce a hypoxic environment in implementing the tumor microenvironment in vitro.
  • malignant melanoma actively interacts with the surrounding blood vessels.
  • Cancer cells in a hypoxic environment secrete angiogenic factors to induce vascularization from the surrounding blood vessels to the inside of the tumor for oxygen supply.
  • angiogenic factors to induce vascularization from the surrounding blood vessels to the inside of the tumor for oxygen supply.
  • fibroblasts while interacting with the surrounding fibroblasts, they reorganize the surrounding extracellular matrix for penetration into blood vessels and aggressively proliferate. Therefore, preventing the formation of blood vessels and controlling the reaction of cancer cells and fibroblasts are the main factors that can prevent metastasis of malignant melanoma, and research on new drug development focusing on this is being actively conducted.
  • the present invention intends to provide a method for manufacturing a malignant melanoma model that can be positioned in the right place by utilizing the in situ three-dimensional cell printing technique.
  • An example of the present invention comprises the steps of three-dimensional printing a bio-ink containing fibroblasts to produce a print containing fibroblasts; manufacturing a print containing melanoma cells and droplets of melanoma cells formed by three-dimensionally printing bio-ink containing melanoma cells on the inside of the print containing the fibroblasts; And it relates to a method for producing a melanoma model comprising an aggregate of melanoma cells and having a hypoxic condition, comprising the step of culturing a print containing the droplets and fibroblasts of the melanoma cells. .
  • the culturing may include culturing a print containing the droplets and fibroblasts of the melanoma cells, so that the melanoma cells aggregate and spontaneously form a hypoxic region.
  • Another example of the present invention is a melanoma model comprising fibroblasts and melanoma cells, the diameter of the melanoma model is 200 to 1,200 um, and the melanoma model is a hypoxic environment inside.
  • Eggplant relates to the melanoma model.
  • An example of the present invention comprises the steps of three-dimensional printing a bio-ink containing fibroblasts to produce a print containing fibroblasts; manufacturing a print containing melanoma cells and fibroblasts formed by three-dimensionally printing bio-ink containing melanoma cells on the inside of the print containing the fibroblasts; And it relates to a method for producing a melanoma model, comprising the step of culturing a print containing the melanoma cells and fibroblasts.
  • a bio-ink containing melanoma cells is printed in a droplet method, and a print containing droplets of melanoma cells and fibroblasts is printed.
  • the melanoma model may include an aggregate of melanoma cells and have a hypoxic condition.
  • the culturing may be one in which the melanoma cells are aggregated to spontaneously form the hypoxic region. Specifically, it may be to form a hypoxic region without artificial or physical means for blocking or limiting oxygen. More specifically, it may be one capable of forming the hypoxic region without using a device for helping to form the hypoxic region, for example, a barrier film for blocking or restricting oxygen, or a cover.
  • the bio-ink containing the fibroblasts can be used to reproduce the process of reconstructing and proliferating the surrounding extracellular matrix for penetration into blood vessels while malignant melanoma interacts with surrounding fibroblasts in the body.
  • the bio-ink including fibroblasts may include skin fibroblasts to mimic the dermal tissue of the skin.
  • the bio-ink including the fibroblasts may be printed on a substrate for manufacturing a melanoma model according to an embodiment of the present invention.
  • the substrate for preparing the melanoma model is polycaprolactone (PCL), polylactic acid (PLA), polyglycolic acid (polyglycolic acid, PGA), polylactate-co-glycolate (poly (lactate-co-glycolate), PLGA), polyurethane (polyurethane, PU), polylactate-co-caprolactone (poly(lactide-co-caprolactone), PLCL), polydioxanone (PDO), Polystyrene (PS), polyethylene glycol (poly(ethylene glycol), PEG), polyvinyl acetate (poly(vinyl acetate), PVA), polypropylene glycol (PPG), polyacrylamide (polyacrylamide, PAAm), polymethylmethacrylate (polymethylmethacrylate, PMMA), polyhydroxybutyrate (polyhydroxybutyrate, PHB), and polyvinylpyrrolidone (polyvinylpyrrolidone, PVP
  • the bio-ink including the melanoma cells is printed including melanoma cells to produce a melanoma model according to an example of the present invention, for example, to be printed on the inside of a print containing the fibroblasts
  • the bio-ink including the melanoma cells is printed by a spray nozzle, and the spray nozzle is put into the print containing the fibroblasts to print the bio-ink including the melanoma cells in situ.
  • the step of producing a print containing a droplet of melanoma cells and fibroblasts includes injecting a spray nozzle for injecting bio-ink containing melanoma cells into the print containing the fibroblasts. It may be to manufacture the printed matter.
  • the step of preparing the print containing the droplets of the melanoma cells and the fibroblasts is performed by considering the position where the droplets of the melanoma cells will be formed inside the print containing the fibroblasts. It may be to form a droplet at a desired position by adjusting the position and printing.
  • the melanoma cells may be melanoma cells isolated from an individual, melanoma cells isolated from a human, melanoma cells isolated from a patient, or a melanoma cell line, for example, melanoma cell lines SK-MEL-28, 451 -LU, Malem-3M, TXM-13, or may be A2058, but is not limited thereto.
  • the melanoma model according to an embodiment of the present invention may be one in which melanoma cells aggregate to form a cell aggregate during the culture process.
  • the three-dimensional structure of the melanoma model according to an example of the present invention can better simulate the microenvironment of the actual melanoma than the two-dimensional structure in the functional part.
  • Existing anticancer drugs have been developed without considering the tumor-specific microenvironment, which is the main cause of tumor development and metastasis, and thus it is difficult to confirm the principle of drug resistance.
  • the melanoma model according to an example of the present invention is expected to more similarly simulate the tumor-specific microenvironment by simulating the three-dimensional structure of the actual melanoma.
  • the melanoma model according to an embodiment of the present invention is cultured within 15 days, within 14 days, within 13 days, within 12 days, within 11 days, within 10 days, within 9 days, within 8 days, or 7 It may be to form a cell aggregate by aggregation within one day, for example, it may be to form a spheroid.
  • the melanoma model according to an example of the present invention may have a hypoxic environment therein.
  • a hypoxic environment In actual melanoma, as cells divide and grow rapidly, the size of the tumor increases rapidly compared to the growth rate of normal tissue. As the size of the tumor gradually increases, when the radius exceeds 200 ⁇ m, the range where oxygen or nutrients can be supplied by diffusion, a hypoxic environment is induced in which the delivery of oxygen or nutrients to the center of the tumor where blood vessels are not formed is inhibited.
  • This hypoxic environment causes cancer cells in the center of the tumor to move to the outside of the tumor, which is rich in oxygen or nutrients to avoid necrosis and to proliferate more actively, and to metastasize to other tissues suitable for the survival of cancer cells through the surrounding blood vessels or lymphatic vessels. , to induce mutations in cancer cells to have high resistance to anticancer drugs.
  • hypoxic environment can be confirmed through detection of a hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF-1 ⁇ ) antibody, which is a marker indicating a hypoxic environment (Example 5).
  • a hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF-1 ⁇ ) antibody which is a marker indicating a hypoxic environment (Example 5).
  • melanoma cells expressing Hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF-1a) antibody among 100% of all melanoma cells included in the melanoma model are It may be 5% or more, 7% or more, 10% or more, 15% or more, or 20% or more, and in this case, even if the upper limit of the proportion of melanoma cells expressing the HIF-1a antibody is not specified, to prepare the desired melanoma model
  • melanoma cells expressing hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF-1a) antibody are 100% or less, less than 100%, 99% or less, 95% or less, 90% or less
  • the melanoma model according to an embodiment of the present invention may have the hypoxic environment in the center of the melanoma model, for example, the hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF-1a) antibody-expressed melanoma cells , based on 100% of the total radius of the melanoma model, within 90%, within 80%, within 70%, within 60%, within 50%, within 40%, within 30% of the center of the melanoma model, or within 20%.
  • the hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF-1a) antibody-expressed melanoma cells based on 100% of the total radius of the melanoma model, within 90%, within 80%, within 70%, within 60%, within 50%, within 40%, within 30% of the center of the melanoma model, or within 20%.
  • hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF-1a) antibody-expressed melanoma cells % or more, 90% or more, or 95% or more, based on 100% of the total radius of the melanoma model, within a radius of 90%, within 80%, within 70%, within 60% of the center of the melanoma model; within 50%, within 40%, within 30%, or within 20%.
  • HIF-1a hypoxia-inducible factor 1-alpha
  • hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF-1a) antibody-expressed melanoma cells are located within a radius of 60% from the center of the melanoma model based on 100% of the total radius of the melanoma model. may be doing
  • a method of manufacturing a melanoma model according to an embodiment of the present invention may be to print bio-ink including melanoma cells in a droplet method.
  • the bio-ink containing the melanoma cells is printed in a droplet method
  • the melanoma cells self-aggregate to form a spherical cell aggregate, mimicking the hypoxic environment that occurs in the center of a tumor similar to actual melanoma. can do.
  • the method for preparing a melanoma model according to an example of the present invention compared with the drop culture method or the rotational culture method generally used when producing tumor spheroids, can easily produce a large number of tumor spheroids in a short time. There are advantages.
  • the step of producing a print containing the droplets and fibroblasts of the melanoma cells is to control the pneumatic pressure or the injection time during three-dimensional printing of the bio-ink containing the melanoma cells to produce melanomas of various sizes. It may be to form a droplet of a cell.
  • the bio-ink including the melanoma cells may be discontinuously printed, and per one printing 0.1 to 2 seconds, 0.1 to 1.5 seconds, 0.1 to 1 second, 0.2 to 2 seconds, 0.2 to 1.5 seconds , or may be sprayed for 0.2 to 1 second.
  • the diameter of the melanoma model according to an example of the present invention is 200 to 1,200 um, 200 to 1,100 um, 200 to 1,000 um, 200 to 900 um, 200 to 850 um, 200 to 800 um, 200 to 750 um, 200 to 700 um, 300 to 1,200 um, 300 to 1,100 um, 300 to 1,000 um, 300 to 900 um, 300 to 850 um, 300 to 800 um, 300 to 750 um, 300 to 700 um, 400 to 1,200 um, 400 to 1,100 um, 400 to 1,000 um, 400 to 900 um, 400 to 850 um, 400 to 800 um, 400 to 750 um, 400 to 700 um, 500 to 1,200 um, 500 to 1,100 um, 500 to 1,000 um, 500 to 900 um, 500 to 850 um, 500 to 800 um, 500 to 750 um, 500 to 700 um, 600 to 1,200 um, 600 to 1,100 um, 600 to 1,000 um, 600 to 900 um, 600 to 850 um, 500 to 800 um, 500 to 750 um, 500 to 700 um, 600 to 1,200 um, 600 to 1,100
  • the step of producing a print containing melanoma cells and fibroblasts by 3D printing the bio-ink containing melanoma cells is to spray the bio-ink containing the melanoma cells with a specific pneumatic pressure. It may be to adjust the size of the melanoma model by controlling the air pressure for spraying the bio-ink containing the melanoma cells. Specifically, when the bio-ink containing melanoma cells is sprayed with high air pressure, the size of the melanoma model can become large, and when the bio-ink containing melanoma cells is sprayed with low air pressure, the size of the melanoma model is small.
  • bio-ink containing melanoma cells when the bio-ink containing melanoma cells is sprayed with a pneumatic pressure of 10 to 17 kPa, a melanoma model with a radius of 200 to 600 um can be prepared, and the bio-ink containing melanoma cells is applied to 17 to 25
  • a pneumatic pressure of kPa When spraying with a pneumatic pressure of kPa, a melanoma model with a radius of 600 to 900um can be manufactured, and when Baoi Ink containing melanoma cells is sprayed with a pneumatic pressure of 25 to 30 kPa, a melanoma model with a radius of 900 to 1200um can be produced can be
  • the bio-ink containing the melanoma cells may be sprayed by a spray nozzle of an appropriate size to be sprayed under a specific desired pneumatic condition, for example, may be sprayed by a spray nozzle of 26G having an inner
  • the step of producing a printed matter including melanoma cells and fibroblasts by 3D printing the bio-ink containing melanoma cells comprises spraying the bio-ink containing the melanoma cells for a specific time. It may be one, it may be to control the size of the melanoma model by controlling the time to inject the bio-ink containing the melanoma cells.
  • Another example of the present invention comprising the steps of providing a substrate for manufacturing a melanoma model; manufacturing a print containing fibroblasts by three-dimensionally printing bio-ink containing fibroblasts on the substrate; To produce a print containing a droplet of melanoma cells and fibroblasts formed by printing a bio-ink containing melanoma cells by injecting a spray nozzle for three-dimensional printing into the print containing the fibroblasts step; And it relates to a method for producing a melanoma model, comprising the step of culturing the prepared print, aggregation of melanoma cells spontaneously forming a hypoxic region (hypoxic condition).
  • the bio-ink including the melanoma cells may be printed in a droplet method.
  • the substrate is polycaprolactone (PCL), polylactic acid (PLA), polyglycolic acid (polyglycolic acid, PGA), polylactate-co-glycolate (poly(lactate-co-glycolate) , PLGA), polyurethane (polyurethane, PU), polylactate-co-caprolactone (poly(lactide-co-caprolactone), PLCL), polydioxanone (PDO), polystyrene (PS), Polyethylene glycol (poly(ethylene glycol), PEG), polyvinyl acetate (poly(vinyl acetate), PVA), polypropylene glycol (polypropylene glycol, PPG), polyacrylamide (polyacrylamide, PAAm), polymethylmethakle It may be a substrate made of at least one selected from the group consisting of polymethylmethacrylate (PMMA), polyhydroxybutyrate (PHB), and polyvinylpyrrolidone (PVP), but is
  • a melanoma model comprising fibroblasts and melanoma cells
  • the diameter of the melanoma model is 200 to 1,200 um
  • the melanoma model is a hypoxic environment inside.
  • Eggplant relates to the melanoma model.
  • the melanoma model may have a spheroid shape.
  • the melanoma model and hypoxic environment are the same as described above.
  • the melanoma model contains at least 5% of melanoma cells expressing the hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF-1a) gene based on 100% of the total number of melanoma cells included in the melanoma model. It may include more than one.
  • HIF-1a hypoxia-inducible factor 1-alpha
  • the melanoma in the melanoma model, more than 70% of the melanoma cells expressing the hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF-1a) gene, based on 100% of the total radius of the melanoma model, the melanoma It may be located within 80% of a radius from the center of the model.
  • the melanoma cells may be cells isolated from a patient.
  • the present invention successfully simulates the complex microenvironment of real melanoma and has a structure similar to that of real melanoma, such as having a hypoxic region, so that it can be used to develop a model that can study the pathological mechanism of melanoma that is not well known. will be.
  • the existing three-dimensional spheroid production method requires considerable labor such as replacement of the cell culture medium, the know-how of a technician, and a culture period because the cells must be cultured while forming a three-dimensional mass, but the present invention is a simple method, accurate and It is expected that it will be possible to quickly produce a three-dimensional spheroid of a desired size at a desired location, replacing the existing labor-intensive spheroid fabrication method.
  • FIG. 1 is a view showing a process of producing a melanoma model using a three-dimensional cell printing technology of the extrusion (extrusion) method.
  • Figure 2a is a view showing the results of observation with a fluorescence microscope through FITC staining after culturing the melanoma model prepared according to an example of the present invention for 7 days.
  • Figure 2b is a view showing the results of observation under a microscope immediately after manufacture, 7 days after manufacture, and 14 days after manufacture of the melanoma model manufactured according to an example of the present invention.
  • Figure 2c is a view showing the results observed under a microscope after the batch manufacturing a plurality of melanoma models according to an example of the present invention.
  • FIG 3 is a view showing the results of staining the hypoxic region of the melanoma model according to an example of the present invention.
  • FIG. 4 is a view showing the results of observing whether a hypoxic region is formed in a melanoma model prepared by culturing melanoma cells in a conventional two-dimensional cell culture method.
  • FIG. 5 is a view showing the results of observing whether a hypoxic region is formed in a melanoma model manufactured using a suspension culture method.
  • FIG. 6 is a view showing the results of microscopic observation of the melanoma model prepared by setting the pneumatic pressure to 12.5 kPa to 27.5 kPa in the melanoma cell printing step according to an example of the present invention.
  • FIG. 7 is a view showing the results of HIF-a fluorescence staining of melanoma models having various particle sizes.
  • the shape of the culture substrate can be manufactured in a desired shape by a person skilled in the art using various materials depending on the purpose, and in this embodiment, a culture substrate for performing the preparation and culture of the melanoma model by way of example was prepared as follows. .
  • a SUS syringe loaded with polycaprolactone (PCL) was mounted on the dispensing head of the 3D printing equipment (Multi-Head Dispensing System (MHDS)), and the temperature was heated to 100° C. to melt the material.
  • PCL polycaprolactone
  • a culture substrate To prepare a culture substrate, an air pressure of about 500 kPa was applied and the PCL melt was sprayed to prepare a culture substrate for manufacturing a melanoma model having a width of 15 mm, a length of 15 mm, and a height of 5 mm.
  • a bio-ink was prepared using sdECM (skin-derived decellularized extracellular matrix), which is a decellularized extracellular matrix powder derived from milled pig skin.
  • sdECM skin-derived decellularized extracellular matrix
  • the freeze-dried sdECM was dissolved using pepsin and 0.5M acetic acid, and neutralized to approximately pH 7.4 by adding 10M sodium hydroxide (NaOH) thereto.
  • NaOH sodium hydroxide
  • 1*10 ⁇ 5 to 5*10 ⁇ 8 cells/ml of dermal fibroblast (Lonza) a cell representative of the dermal layer, can be grown into the dermal tissue of the skin.
  • a bio-ink first bio-printing composition
  • Example 2 (1) performed substantially the same as the manufacturing method of the composition for bioprinting containing fibroblasts, but skin malignant melanoma cells that can grow into melanoma tissues of the skin instead of skin fibroblasts (malignant melanoma, ATGC) ) was added.
  • a bio-ink was prepared using sdECM (skin-derived decellularized extracellular matrix), which is a decellularized extracellular matrix powder derived from milled pig skin.
  • sdECM skin-derived decellularized extracellular matrix
  • the freeze-dried sdECM was dissolved using pepsin and 0.5M acetic acid, and 10M sodium hydroxide (NaOH) was added thereto, followed by titration to approximately pH 7.4.
  • Bio-ink containing melanoma cells by injecting skin malignant melanoma cells (ATGC) to have a density of 1*10 ⁇ 6 to 1*10 ⁇ 10 cells/ml in sdECM bio-ink with an appropriate 1% concentration (Second composition for bioprinting) was prepared.
  • ATGC skin malignant melanoma cells
  • a raw material in which fibroblasts and bio-ink are mixed (first bio-printing composition)
  • second melanoma cells and bio-ink are mixed
  • a melanoma model was prepared through a sequential spraying process.
  • the process of producing a melanoma model using an extrusion-type three-dimensional cell printing technology is shown in FIG. 1 , and the specific manufacturing process was as follows.
  • the first composition for bioprinting prepared in Example 2 was mounted on a spray head, and the temperature was maintained at 15°C. By applying air pressure of about 80 kPa to the syringe using a spray nozzle with an inner diameter of 0.25 mm and 26G, the first composition for bioprinting containing fibroblasts was sprayed onto the culture substrate prepared in Example 1 to reproduce the surrounding environment of the melanoma model. did.
  • the second composition for bioprinting prepared in Example 2 was mounted on another head, and the temperature was maintained at 15°C.
  • the injection nozzle (nozzle) with an inner diameter of 0.25 mm and 26G loaded with bio-ink containing melanoma cells is put into the inside of the printed matter filled with bio-ink including the fibroblasts injected in Example 3 (1), and the desired position After moving the nozzle to the nozzle, it is sprayed for a short time of about 0.3 seconds at a constant pneumatic pressure of about 22.5 kPa, and hydrogel containing melanoma cells at high concentration is sprayed in situ printing method to produce a spherical print with a diameter of about 800um did.
  • the printed matter containing the melanoma cells and fibroblasts prepared in Example 3 (2) was maintained at 37° C. and 5% CO 2 in a cell growth medium (RPMI 1640 Medium, 10% FBS, 1% Penicilin-Streptomycin) 2
  • a melanoma model was prepared by culturing for 7 days while changing the medium once a day.
  • Example 4 Microscopic observation of a melanoma model
  • Example 3 A number of melanoma models prepared in Example 3 were observed with a fluorescence microscope through FITC staining, and the results are shown in FIG. 2A.
  • the melanoma model prepared by the melanoma model manufacturing method according to an example of the present invention formed a tumor form in which melanoma cells aggregated, and thus successfully simulated the three-dimensional aggregated form of the actual tumor. was able to confirm
  • the prepared melanoma model was observed under a microscope immediately after manufacture, 7 days after manufacture, and 14 days after manufacture, and the results are shown in FIG. 2b.
  • the melanoma model prepared by the method for producing a melanoma model according to an example of the present invention was able to confirm the process of forming a tumor form by further aggregating melanoma cells with each other as the incubation time increased. It was confirmed that the three-dimensional shape of the actual tumor was successfully simulated.
  • Example 5 Verification of microenvironmental implementation of melanoma model
  • Example 3 In order to verify whether the melanoma model prepared in Example 3 can implement a specific microenvironment similar to an actual melanoma tumor, it was checked whether a hypoxic region was formed in the melanoma model.
  • Example 3 the melanoma model prepared in Example 3 was further cultured under the same conditions for 7 days, and tissue analogues were washed 3 times for 5 minutes using 1x phosphate buffered saline (1x PBS).
  • HIF-1 ⁇ hypoxia-inducible factor 1-alpha
  • Tissue analogues were washed 3 times with 1x PBS every 5 minutes, and a solution containing a fluorescence secondary antibody in 1% BSA 1:300 was added to the tissue analogues, followed by incubation for one hour. Finally, to stain the nucleus, a 10 mg/ml solution of 4',6-diamidino-2-phenylindole (4',6-diamidino-2-phenylindol; DAPI) was diluted 1:1000 with 1x PBS to obtain tissue analogues. was put in for 10 minutes. The central hypoxic region was confirmed through a confocal microscope (Zeiss) of the tissue analogue that had been completed until nuclear staining.
  • FIG. 3 is a view showing the results of staining the hypoxic region of the melanoma model.
  • the compartmentalized melanoma cells formed aggregates like actual tumors through cell-to-cell bonding over time.
  • a region induced by a hypoxic condition, dyed in red was quite conspicuously observed, indicating that the actual tumor-specific microenvironment could be well implemented in the melanoma model manufactured in the present invention. it means. Therefore, it was confirmed that the melanoma model prepared by the method for preparing a melanoma model according to an example of the present invention can successfully simulate the microenvironment of the actual tumor.
  • Example 3 The degree and distribution of the hypoxic region of the melanoma model prepared in Example 3 are shown in Table 1 as numerical values using ImageJ Software. As shown in Table 1, in Example 3, the cells expressing the HIF-1a antibody were about 20% or more of the total, and most of the cells expressing the HIF-1a antibody were within a radius of 200 ⁇ m from the center (the total radius of the melanoma model). within 50%).
  • Comparative Example 1 Melanoma model prepared by two-dimensional cell culture method
  • a two-dimensional melanoma model was prepared by a conventional two-dimensional cell culture method. Specifically, the melanoma cells were dispensed in a culture dish containing a cell growth medium so as to be 5000 cells/cm 2 . The culture medium was replaced every 2 days, and it was confirmed through a microscope that the culture dish was filled with melanoma cells when cultured for about 1 week.
  • the hypoxic region was observed under a fluorescence microscope.
  • the observation result of the hypoxic region of Comparative Example 1 is shown in FIG. 4 .
  • the melanoma model prepared by the two-dimensional cell culture of Comparative Example 1 had a form in which each cell was spread flat on a flat cell culture dish, and it was possible to confirm the tumor form in which melanoma cells aggregated. there was no Likewise, a hypoxic region was not formed either.
  • the degree and distribution of the hypoxic region of the melanoma model of Comparative Example 1 are shown in Table 1 as numerical values using ImageJ Software. As shown in Table 1, the antibody expression of HIF-1a could not be confirmed in the cells of the melanoma model of Comparative Example 1. Through this, it was confirmed that the melanoma model prepared in the present invention could better simulate the microenvironment of the actual tumor when compared with the existing melanoma model production method.
  • Comparative Example 2 Melanoma spheroid model prepared by a hanging-drop culture method
  • a melanoma spheroid model was prepared using a suspension culture method known as a general spheroid production method. Specifically, melanoma cells cultured in a culture dish were washed with 1x PBS solution, and then the cells were collected through a treatment process with Trysin-EDTA (0.25%). The collected cells were centrifuged to prepare a cell pellet. Next, the cell pellet was uniformly suspended in the cell growth medium so that the concentration of cells was 1.6*10 ⁇ 6/ml. Using a pipette, 25ul of the cell suspension was dispensed into a sterile culture dish that does not adhere to cells.
  • the dish When dispensing was completed, the dish was carefully turned over so that the dispensed cells could be cultured by hanging-drop.
  • the culture medium was replaced every 2 days, and the formation of melanoma spheroids during 2-3 weeks of culture could be observed under a microscope or with the naked eye.
  • the central hypoxic region was observed through a confocal microscope (Zeiss). The results are shown in FIG. 5 .
  • the melanoma model prepared by the suspension culture method of Comparative Example 2 did not have a constant size of the produced spheroids (150-400um in diameter), and it was difficult to produce spheroids with a diameter of 400um or more.
  • a hypoxic region could not be identified in the center of the structure.
  • the degree and distribution of the hypoxic region of the melanoma model of Comparative Example 2 is shown in Table 1 as numerical values using ImageJ Software. As shown in Table 1, the antibody expression of HIF-1a could not be confirmed in the cells of the melanoma model of Comparative Example 2. Through this, it was confirmed that the melanoma model prepared in the present invention could better simulate the microenvironment of the actual tumor when compared with the existing melanoma model production method.
  • Example 6 Preparation of melanoma models having various diameters according to changes in pneumatic pressure
  • a melanoma model was prepared in substantially the same manner as in Example 3, but the air pressure was 12.5 kPa ⁇ 27.5 in the melanoma cell printing step. It was performed by setting kPa.
  • the results of microscopic observation of each of the prepared melanoma models are shown in FIG. 6 . As shown in FIG.
  • a melanoma model having a diameter (diameter) of about 400 ⁇ m was manufactured at a pneumatic pressure of 15 kPa
  • a melanoma model having a diameter (diameter) of about 700 ⁇ m at a pneumatic pressure of 20 kPa was manufactured, and at a pneumatic pressure of 22.5 kPa
  • a melanoma model with a diameter (diameter) of about 800 ⁇ m was manufactured, and a melanoma model with a diameter (diameter) of about 1,000 ⁇ m was manufactured at a pneumatic pressure of 27.5 kPa. Therefore, it was confirmed that a melanoma model similar to the microenvironment of an actual melanoma tumor could be manufactured under a pneumatic condition of 15 kPa to 27.5 kPa.
  • the melanoma model having various diameters prepared in Example 6 was stained in substantially the same manner as in Example 5 to observe a hypoxic region in the center of the melanoma model.
  • the observation results are shown in FIG. 7 (diameters around 400, 600, and 800 ⁇ m in sequence). As shown in FIG. 7 , it was found that a hypoxic region was formed in the center of the melanoma model, and that the actual melanoma was successfully simulated to have various sizes.

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Abstract

본 발명은 3차원 프린팅 기술을 이용하여 흑색종 모델을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

흑색종 모델 및 이의 제조방법
본 발명은 3차원 프린팅 기술을 이용하여 흑색종 모델을 제조하는 방법, 및 3차원 프린팅 기술을 이용하여 제조된 흑색종 모델에 관한 것이다.
악성 흑색종을 연구하고 치료법을 개발하기 위해 다양한 종류의 흑색종 모델이 개발되어왔다. 흑색종 모델의 최종적 기능은 체내에서 실제 암이 형성되어 발달하는 과정을 체외에서 재현하고, 흑색종 모델에 다양한 치료법 또는 약물을 적용했을 때 실제 흑색종과 유사한 반응을 나타내어 흑색종의 적절한 치료 수단을 제시하는 역할을 하기 위한 것이다. 흑색종 모델에는 2차원 세포 배양 모델, 동물 모델 등 다양한 종류가 있으나, 현재까지 개발된 흑색종 모델들은 세포 간 혹은 세포와 세포외기질(extracellular matrix, ECM) 간의 상호작용 등 실제 종양의 복잡한 미세환경을 모사하지 못하여 약물에 대한 저항성 또는 반응 정도가 실제와 다르게 나타나는 한계점이 있다. 또한, 동물 모델의 경우 사람과 동물의 근본적인 생리학적 구조의 차이로 인해 정확한 결과 예측이 어렵다. 따라서 최근에는 암의 미세환경을 모사하여 암과 유사한 반응을 보일 수 있는 3차원 세포 조직인 스페로이드 배양 모델이 개발되고 있다. 세포를 포함한 세포배양액을 방울처럼 매달아 세포 간의 결합을 유도하는 현적배양(hanging-drop culture) 방법과, 세포배양액을 회전시키면서 세포덩어리를 형성하는 회전배양(rotary cell culture) 방법은 흑색종 모델 제작에 있어 가장 널리 사용되는 방법이다. 하지만, 이와 같은 방법들은 주로 manual 방식을 통해 제작되기 때문에, 3D 세포프린팅 기술과 접목되어 원하는 위치에 종양 미세환경을 구현함에 있어서 어려움이 있다. 따라서 본 발명은 이러한 문제점을 해결하기 위해 3차원 세포 프린팅을 이용하여 종양 세포를 포함한 하이드로젤을 프린팅하여 특정 위치에 원하는 크기의 흑색종을 제작함과 동시에 실제 종양의 복잡한 미세환경을 모사할 수 있는 새로운 제조방법을 개발하였다.
악성 흑색종은 체내에서 증식하며 종양을 형성한다. 형성된 종양은 세포가 증식함에 따라 크기가 증가하게 된다. 이로 인해 종양 내부에 있는 세포로의 산소 전달이 저해되면서 저산소 환경(hypoxic condition)을 유발하게 된다. 이러한 저산소 환경은 종양 내부의 암세포가 괴사를 피하고 더욱 활발하게 증식하기 위해 종양 외부로 이동하는 성질을 갖도록 한다. 또한, 저산소 환경은 암세포의 돌연변이를 유발하여 암세포의 항암제에 대한 저항성을 높게 만든다. 따라서, 종양 미세환경을 생체 외에서 구현함에 있어서 저산소 환경을 유발하는 것은 필수적이다.
또한, 악성 흑색종은 주변의 혈관과 활발하게 상호작용을 한다. 저산소 환경의 암세포는 산소 공급을 위해 주변의 혈관으로부터 종양 내부로 혈관화를 유도하기 위해 혈관형성인자(angiogenic factor)들을 분비한다. 또한, 주변의 섬유아세포(fibroblast)들과 상호작용하면서 혈관으로의 침투를 위해 주변에 있는 세포외기질을 재구성하며 공격적으로 증식한다. 따라서 혈관 형성을 막고 암세포와 섬유아세포의 반응을 제어하는 것이 악성 흑색종의 전이를 막을 수 있는 주요한 요소이며 이에 중점을 둔 신약 개발 연구가 활발히 진행되고 있다.
따라서 흑색종 모델이 위와 같은 체내 환경을 모사하고, 약물 테스트에 적합한 플랫폼으로 사용되기 위해서는 종양 내부의 암세포가 서로 응집하여 구 형태를 이루고 중심부의 저산소 환경이 재현되어야 한다. 이러한 미세환경을 적절하게 구현하기 위해 본 발명에서는 in situ 3차원 세포프린팅 기법을 활용하여 적재적소에 위치 가능한 악성 흑색종 모델 제조방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 예는, 섬유아세포를 포함하는 바이오잉크를 3차원 인쇄하여 섬유아세포를 포함하는 인쇄물을 제조하는 단계; 상기 섬유아세포를 포함하는 인쇄물의 내부에, 흑색종 세포를 포함하는 바이오잉크를 3차원 인쇄하여 형성된 흑색종 세포의 액적 (droplet)과 섬유아세포를 포함하는 인쇄물을 제조하는 단계; 및 상기 흑색종 세포의 액적 (droplet)과 섬유아세포를 포함하는 인쇄물을 배양하는 단계를 포함하는, 흑색종 세포의 응집체를 포함하며 저산소 영역 (hypoxic condition)을 갖는 흑색종 모델의 제조방법에 관한 것이다. 상기 배양하는 단계는, 상기 흑색종 세포의 액적 (droplet)과 섬유아세포를 포함하는 인쇄물을 배양하여, 상기 흑색종 세포가 응집되어 자발적으로 저산소 영역을 형성하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 섬유아세포 및 흑색종 세포를 포함하는 흑색종 모델로서, 상기 흑색종 모델의 직경은 200 내지 1,200 um 이고, 상기 흑색종 모델은 내부에 저산소 환경 (hypoxic condition)을 가지는, 흑색종 모델에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 예는, 섬유아세포를 포함하는 바이오잉크를 3차원 인쇄하여 섬유아세포를 포함하는 인쇄물을 제조하는 단계; 상기 섬유아세포를 포함하는 인쇄물의 내부에, 흑색종 세포를 포함하는 바이오잉크를 3차원 인쇄하여 형성된 흑색종 세포 및 섬유아세포를 포함하는 인쇄물을 제조하는 단계; 및 상기 흑색종 세포 및 섬유아세포를 포함하는 인쇄물을 배양하는 단계를 포함하는, 흑색종 모델의 제조방법에 관한 것이다. 상기 흑색종 세포 및 섬유아세포를 포함하는 인쇄물을 제조하는 단계는, 흑색종 세포를 포함하는 바이오잉크를 액적 (droplet) 방식으로 프린팅하여, 흑색종 세포의 액적 (droplet)과 섬유아세포를 포함하는 인쇄물을 제조하는 것일 수 있다. 상기 흑색종 모델은, 흑색종 세포의 응집체를 포함하며 저산소 영역 (hypoxic condition)을 갖는 것일 수 있다. 상기 배양하는 단계는 상기 흑색종 세포가 응집되어 상기 저산소 영역을 자발적으로 형성하는 것일 수 있다. 구체적으로, 산소를 차단 또는 제한하기 위한 인위적 또는 물리적 수단 없이 저산소 영역을 형성하는 것일 수 있다. 더욱 구체적으로, 저산소 영역 형성에 도움을 주기 위한 장치, 예를 들어 산소를 차단 또는 제한하기 위한 차단막, 또는 커버 등을 사용하지 않고 저산소 영역을 형성할 수 있는 것일 수 있다
상기 섬유아세포를 포함하는 바이오잉크는, 악성 흑색종이 체내에서 주변의 섬유아세포(fibroblast)와 상호작용하면서 혈관으로의 침투를 위해 주변의 세포외기질을 재구성하며 증식하는 과정을 재현하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 섬유아세포를 포함하는 바이오잉크는 피부의 진피 조직을 모사할 수 있도록 피부 섬유아세포를 포함할 수 있다.
상기 섬유아세포를 포함하는 바이오잉크는, 섬유아세포를 1X105 내지 5X108 cells/ml, 1X105 내지 1X108 cells/ml, 1X105 내지 5X107 cells/ml, 1X105 내지 5X106 cells/ml, 1X105 내지 5X105 cells/ml, 1X106 내지 5X108 cells/ml, 1X106 내지 1X108 cells/ml, 1X106 내지 5X107 cells/ml, 1X106 내지 5X106 cells/ml, 1X107 내지 5X108 cells/ml, 1X107 내지 1X108 cells/ml, 1X107 내지 5X107 cells/ml, 또는 1X108 내지 5X108 cells/ml 의 농도로 포함하는 것일 수 있다.
상기 섬유아세포를 포함하는 바이오잉크는, 콜라겐 (collagen), 탈세포화된 세포외기질 (decellularized extracellular matrix), 히알루론산 (hyaluronic acid), 피브린 (fibrin), 혈관내피성장인자, 섬유아세포 성장인자, 혈소판유래 성장인자, 안지오포이에틴-1(angiopoietin-1), 형질전환성장인자-베타 (transforming growth factor beta, TGF-β), 에리스로포에틴(erythropoietin, EPO), 줄기세포인자(stem cell factor, SCF), 표피성장인자(epidermal growth factor, EGF), 콜로니자극인자(colony stimulating facor, CSF), 혈관성장보충물(endothelial cell growth supplement, ECGS), 바탕질단백분해효소(matrix metalloproteinase, MMP), 바탕질단백분해저해효소(tissue inhibitor matrix metalloproteinase, TIMP), 알긴산 (alginate), 젤라틴(gelatin), 콜라겐(collagen), 키토산(chitosan), 아가로오스(agarose), 실크단백질(silk protein), 헤파린(heparin), 헤파란황산(heparan sulfate), 케라탄황산(keratin sulfate), 데르마탄황산(dermatan sulfate), 콘드로이틴황산(chondroitin sulfate), 지방알코올(fatty alcohol), 및 지방산(fatty acid)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 섬유아세포를 포함하는 바이오잉크는, 본 발명의 일 예에 따른 흑색종 모델 제조를 위한 기판 위에 프린팅되는 것일 수 있다.
상기 흑색종 모델 제조를 위한 기판은, 폴리카프로락톤 (polycaprolactone, PCL), 폴리유산 (Poly Lactic Acid, PLA), 폴리글리콜산 (polyglycolic acid, PGA), 폴리락테이트-코-글라이콜레이트(poly(lactate-co-glycolate), PLGA), 폴리우레탄 (polyurethane, PU), 폴리락테이트-코-카프로락톤 (poly(lactide-co-caprolactone), PLCL), 폴리다이옥사논 (polydioxanone, PDO), 폴리스티렌 (polystyrene, PS), 폴리에틸렌글리콜 (poly(ethylene glycol), PEG), 폴리비닐아세테이트 (poly(vinyl acetate), PVA), 폴리프로필렌글라이콜 (polypropylene glycol, PPG), 폴리아크릴아마이드 (polyacrylamide, PAAm), 폴리메틸메타클릴레이트 (polymethylmethacrylate, PMMA), 폴리하이드록시부틸레이트 (polyhydroxybutyrate, PHB), 및 폴리비닐피롤리돈 (polyvinylpyrrolidone, PVP) 으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상으로 제조된 기판일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 흑색종 세포를 포함하는 바이오잉크는, 본 발명의 일 예에 따른 흑색종 모델을 제조하기 위해 흑색종 세포를 포함하여 프린팅되며, 예를 들어 상기 섬유아세포를 포함하는 인쇄물의 내부에 프린팅되는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 흑색종 세포를 포함하는 바이오잉크는 분사 노즐에 의해 프린팅되며, 상기 분사 노즐은 상기 섬유아세포를 포함하는 인쇄물 내부로 투입되어 in situ 방식으로 상기 흑색종 세포를 포함하는 바이오잉크를 프린팅하는 것일 수 있다. 이에, 상기 흑색종 세포의 액적 (droplet)과 섬유아세포를 포함하는 인쇄물을 제조하는 단계는, 흑색종 세포를 포함하는 바이오잉크를 분사하기 위한 분사 노즐을 상기 섬유아세포를 포함하는 인쇄물 내부에 투입하여 상기 인쇄물을 제조하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 흑색종 세포의 액적 (droplet)과 섬유아세포를 포함하는 인쇄물을 제조하는 단계는, 상기 섬유아세포를 포함하는 인쇄물의 내부에 흑색종 세포의 액적이 형성될 위치를 고려하여 분사노즐의 위치를 조절 및 인쇄하여 원하는 위치에 액적을 형성하는 것일 수 있다.
상기 흑색종 세포는 개체에서 분리된 흑색종 세포, 인간에서 분리된 흑색종 세포, 환자에서 분리된 흑색종 세포, 또는 흑색종 세포주일 수 있으며, 예를 들어 흑색종 세포주 SK-MEL-28, 451-LU, Malem-3M, TXM-13 또는 A2058 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예에 따른 흑색종 모델은, 배양과정에서 흑색종 세포가 상호 응집하여 세포 응집체를 형성하는 것일 수 있다. 본 발명의 일 예에 따른 흑색종 모델의 3차원 구조는 기능적인 부분에 있어 2차원 구조보다 실제 흑색종의 미세환경을 더욱 잘 모사할 수 있다. 기존의 항암제들은 종양의 발달 전이의 주요 원인인 종양 특이적 미세환경을 고려하지 않은채 개발되어 약물의 저항성에 대한 원리를 확인하기 어려운 문제점이 있다. 악성 흑색종의 발달과 전이를 막기 위한 신약 개발 연구 등을 위해서는 흑색종의 실제 미세환경을 고려하는 3차원 구조의 흑색종 모델을 제공하는 것이 필요하다. 본 발명의 일 예에 따른 흑색종 모델은 실제 흑색종의 3차원 구조를 모사하여 종양 특이적 미세환경을 더욱 유사하게 모사할 수 있을 것으로 기대된다. 예를 들어, 본 발명의 일 예에 따른 흑색종 모델은 배양 15일 이내, 14일 이내, 13일 이내, 12일 이내, 11일 이내, 10일 이내, 9일 이내, 8일 이내, 또는 7일 이내에 응집하여 세포 응집체를 형성하는 것일 수 있으며, 일예로 스페로이드 (spheroid)를 형성하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 흑색종 모델은 내부에 저산소 환경 (hypoxic condition)을 가지는 것일 수 있다. 실제 흑색종은 세포가 빠른 속도로 분열, 성장함에 따라 종양의 크기가 정상 조직의 성장 속도 비해 급속도로 증가하는 성질을 가진다. 종양의 크기가 점점 커지면서 확산에 의해 산소 또는 영양소가 공급될 수 있는 범위인 반경 200um를 넘어설 경우, 혈관이 형성되지 못한 종양 중심부로의 산소 또는 영양소의 전달이 저해되는 저산소 환경이 유발된다. 이러한 저산소 환경은 종양 중심부의 암세포가 괴사를 피하고 더욱 활발히 증식하기 위해 산소 또는 영양소가 풍부한 종양 바깥부분으로 이동하고, 주변의 혈관 혹은 림프관을 타고 암세포의 생존에 적합한 다른 조직으로 전이되려는 성질을 갖게 하며, 암세포의 돌연변이를 유발하여 항암제에 대한 높은 저항성을 갖도록 한다. 실제 흑색종의 종양 미세환경을 체외에서 성공적으로 모사하기 위해서는 위와 같은 저산소 환경을 가지도록 흑색종 모델을 구현하는 것이 필요하다.
상기 저산소 환경은 저산소 환경을 나타내는 마커인 Hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF-1α) 항체의 검출을 통해 확인할 수 있다 (실시예 5). 예를 들어, 본 발명의 일 예에 따른 흑색종 모델은, 상기 흑색종 모델에 포함된 전체 흑색종 세포 100% 중 Hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF-1a) 항체가 발현된 흑색종 세포가 5% 이상, 7% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 또는 20% 이상일 수 있으며, 이때 상기 HIF-1a 항체가 발현된 흑색종 세포 비율의 상한값이 특정되지 않더라도 목적하는 흑색종 모델을 제조하기 위해 통상의 기술자가 적절하게 선택할 수 있을 것이며, 일예로 상기 흑색종 모델에 포함된 전체 흑색종 세포 100% 중 Hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF-1a) 항체가 발현된 흑색종 세포가 100% 이하, 100% 미만, 99% 이하, 95% 이하, 90% 이하, 80% 이하, 70% 이하, 60% 이하, 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 또는 25% 이하일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예에 따른 흑색종 모델은, 상기 저산소 환경을 흑색종 모델 중심부에 가지는 것일 수 있으며, 예를 들어 상기 Hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF-1a) 항체가 발현된 흑색종 세포가, 상기 흑색종 모델의 전체 반경 100%를 기준으로, 상기 흑색종 모델의 중심으로부터 반경 90% 이내, 80% 이내, 70% 이내, 60% 이내, 50% 이내, 40% 이내, 30% 이내, 또는 20% 이내에 존재할 수 있다. 예를 들어, 상기 Hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF-1a) 항체가 발현된 흑색종 세포의 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상이, 상기 흑색종 모델의 전체 반경 100%를 기준으로, 상기 흑색종 모델의 중심으로부터 반경 90% 이내, 80% 이내, 70% 이내, 60% 이내, 50% 이내, 40% 이내, 30% 이내, 또는 20% 이내에 존재할 수 있다. 일예로, 상기 Hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF-1a) 항체가 발현된 흑색종 세포가, 상기 흑색종 모델의 전체 반경 100%를 기준으로, 상기 흑색종 모델의 중심으로부터 반경 60% 이내에 위치하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 다른 흑색종 모델의 제조방법은, 흑색종 세포를 포함하는 바이오잉크를 액적 (droplet) 방식으로 프린팅하는 것일 수 있다. 상기 흑색종 세포를 포함하는 바이오잉크가 액적 (droplet) 방식으로 프린팅됨에 따라, 흑색종 세포가 스스로 응집하여 구 형태 세포 응집체를 이루고, 실제 흑색종과 유사하게 종양의 중심부에서 발생하는 저산소 환경을 모사할 수 있다. 본 발명의 일 예에 따른 흑색종 모델의 제조방법은, 종양 스페로이드를 제작할 때 일반적으로 사용되는 현적배양 방법 또는 회전배양 방법과 비교했을 때, 빠른 시간 동안 다수의 종양 스페로이드를 간편하게 제작할 수 있다는 장점이 있다. 또한 3차원 세포프린팅 기법을 사용함으로써 수동적인 기존의 제작 방법을 자동화하여 원하는 위치에 원하는 크기의 흑색종 모델을 자유롭게 제작할 수 있다는 기술적 효과가 있다. 이에, 상기 흑색종 세포의 액적 (droplet)과 섬유아세포를 포함하는 인쇄물을 제조하는 단계는, 상기 흑색종 세포를 포함하는 바이오잉크를 3차원 인쇄 시 공압 또는 분사 시간을 조절하여 다양한 크기의 흑색종 세포의 액적 (droplet)을 형성하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 흑색종 세포를 포함하는 바이오잉크는 불연속적으로 프린팅되는 것일 수 있으며, 1회 프린팅 당 0.1 내지 2초, 0.1 내지 1.5초, 0.1 내지 1초, 0.2 내지 2초, 0.2 내지 1.5초, 또는 0.2 내지 1초 간 분사되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 흑색종 모델의 직경은 200 내지 1,200 um, 200 내지 1,100 um, 200 내지 1,000 um, 200 내지 900 um, 200 내지 850 um, 200 내지 800 um, 200 내지 750 um, 200 내지 700 um, 300 내지 1,200 um, 300 내지 1,100 um, 300 내지 1,000 um, 300 내지 900 um, 300 내지 850 um, 300 내지 800 um, 300 내지 750 um, 300 내지 700 um, 400 내지 1,200 um, 400 내지 1,100 um, 400 내지 1,000 um, 400 내지 900 um, 400 내지 850 um, 400 내지 800 um, 400 내지 750 um, 400 내지 700 um, 500 내지 1,200 um, 500 내지 1,100 um, 500 내지 1,000 um, 500 내지 900 um, 500 내지 850 um, 500 내지 800 um, 500 내지 750 um, 500 내지 700 um, 600 내지 1,200 um, 600 내지 1,100 um, 600 내지 1,000 um, 600 내지 900 um, 600 내지 850 um, 600 내지 800 um, 600 내지 750 um, 600 내지 700 um, 650 내지 1,200 um, 650 내지 1,100 um, 650 내지 1,000 um, 650 내지 900 um, 650 내지 850 um, 650 내지 800 um, 650 내지 750 um, 650 내지 700 um, 700 내지 1,200 um, 700 내지 1,100 um, 700 내지 1,000 um, 700 내지 900 um, 700 내지 850 um, 700 내지 800 um, 700 내지 750 um, 750 내지 1,200 um, 750 내지 1,100 um, 750 내지 1,000 um, 750 내지 900 um, 750 내지 850 um, 또는 750 내지 800 um 일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 흑색종 세포를 포함하는 바이오잉크를 3차원 프린팅하여 흑색종 세포와 섬유아세포를 포함하는 인쇄물을 제조하는 단계는, 상기 흑색종 세포를 포함하는 바이오잉크를 특정 공압으로 분사하는 것일 수 있으며, 상기 흑색종 세포를 포함하는 바이오잉크를 분사하는 공압을 조절하여 흑색종 모델의 크기를 조절하는 것일 수 있다. 구체적으로, 흑색종 세포를 포함하는 바이오잉크를 높은 공압으로 분사할 경우 흑색종 모델의 크기가 커질 수 있으며, 흑색종 세포를 포함하는 바이오잉크를 낮은 공압으로 분사할 경우 흑색종 모델의 크기가 작아질 수 있다. 예를 들어, 흑색종 세포를 포함하는 바이오잉크를 10 내지 17 kPa의 공압으로 분사할 경우 반지름 200 내지 600 um의 흑색종 모델이 제조될 수 있고, 흑색종 세포를 포함하는 바이오잉크를 17 내지 25 kPa의 공압으로 분사할 경우 반지름 600 내지 900um의 흑색종 모델이 제조될 수 있으며, 흑색종 세포를 포함하는 바오이잉크를 25 내지 30 kPa의 공압으로 분사할 경우 반지름 900 내지 1200um의 흑색종 모델이 제조될 수 있다. 상기 흑색종 세포를 포함하는 바이오잉크는, 목적하는 특정 공압 조건으로 분사되기 위해 적절한 크기의 분사노즐에 의해 분사될 수 있으며, 일예로 내경 0.25mm인 26G의 분사노즐에 의해 분사되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예에 따른 흑색종 세포를 포함하는 바이오잉크를 3차원 프린팅 하여 흑색종 세포와 섬유아세포를 포함하는 인쇄물을 제조하는 단계는, 상기 흑색종 세포를 포함하는 바이오잉크를 특정 시간 분사하는 것일 수 있으며, 상기 흑색종 세포를 포함하는 바이오잉크를 분사하는 시간을 조절하여 흑색종 모델의 크기를 조절하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 흑색종 모델 제조를 위한 기판을 제공하는 단계; 상기 기판 위에 섬유아세포를 포함하는 바이오잉크를 3차원 인쇄하여 섬유아세포를 포함하는 인쇄물을 제조하는 단계; 상기 섬유아세포를 포함하는 인쇄물의 내부로 3차원 인쇄를 위한 분사 노즐을 투입하여 흑색종 세포를 포함하는 바이오잉크를 인쇄하여 형성된 흑색종 세포의 액적 (droplet)과 섬유아세포를 포함하는 인쇄물을 제조하는 단계; 및 상기 제조된 인쇄물을 배양하여 흑색종 세포가 응집되어 자발적으로 저산소 영역 (hypoxic condition)을 형성하는 단계를 포함하는, 흑색종 모델의 제조방법에 관한 것이다. 상기 흑색종 세포를 포함하는 바이오잉크는 액적 (droplet) 방식으로 프린팅되는 것일 수 있다.
상기 기판은 폴리카프로락톤 (polycaprolactone, PCL), 폴리유산 (Poly Lactic Acid, PLA), 폴리글리콜산 (polyglycolic acid, PGA), 폴리락테이트-코-글라이콜레이트(poly(lactate-co-glycolate), PLGA), 폴리우레탄 (polyurethane, PU), 폴리락테이트-코-카프로락톤 (poly(lactide-co-caprolactone), PLCL), 폴리다이옥사논 (polydioxanone, PDO), 폴리스티렌 (polystyrene, PS), 폴리에틸렌글리콜 (poly(ethylene glycol), PEG), 폴리비닐아세테이트 (poly(vinyl acetate), PVA), 폴리프로필렌글라이콜 (polypropylene glycol, PPG), 폴리아크릴아마이드 (polyacrylamide, PAAm), 폴리메틸메타클릴레이트 (polymethylmethacrylate, PMMA), 폴리하이드록시부틸레이트 (polyhydroxybutyrate, PHB), 및 폴리비닐피롤리돈 (polyvinylpyrrolidone, PVP) 으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상으로 제조된 기판일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 섬유아세포 및 흑색종 세포를 포함하는 흑색종 모델로서, 상기 흑색종 모델의 직경은 200 내지 1,200 um 이고, 상기 흑색종 모델은 내부에 저산소 환경 (hypoxic condition)을 가지는, 흑색종 모델에 관한 것이다. 상기 흑색종 모델은 스페로이드 형상일 수 있다. 상기 흑색종 모델 및 저산소 환경은 전술한 바와 같다. 예를 들어, 상기 흑색종 모델은 상기 흑색종 모델에 포함된 전체 흑색종 세포 수 100%를 기준으로, Hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF-1a) 유전자가 발현된 흑색종 세포를 적어도 5% 이상 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 흑색종 모델은 Hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF-1a) 유전자가 발현된 흑색종 세포 중 70% 이상이, 상기 흑색종 모델의 전체 반경 100%를 기준으로, 상기 흑색종 모델의 중심으로부터 반경 80% 이내에 위치하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 흑색종 세포는 환자에서 분리된 세포인 것일 수 있다.
본 발명은 실제 흑색종의 복잡한 미세환경을 성공적으로 모사하여, 저산소 영역을 구비하는 등 실제 흑색종과 유사한 구조를 가져 잘 알려지지 않은 흑색종의 병리학적 메커니즘을 연구할 수 있는 모델 개발에 사용될 수 있을 것이다. 또한, 기존의 3차원 스페로이드 제작 방법은 세포를 3차원 덩이리로 형성하면서 배양해야 하기 때문에 세포 배양액의 교체, 기술자의 노하우, 배양 기간 등 상당한 노동력을 필요로 하나, 본 발명은 단순한 방법으로 정확하고 신속하게 원하는 크기의 3차원 스페로이드를 원하는 위치에 제작할 수 있어, 기존의 노동 집약적인 스페로이드 제작 방법을 대체할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 압출(extrusion) 방식의 3차원 세포 프린팅 기술을 이용하여 흑색종 모델을 제작하는 과정을 나타낸 도면이다.
도 2a는 본 발명의 일 예에 따라 제조된 흑색종 모델을 7일 간 배양한 뒤에 FITC 염색을 통해 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2b는 본 발명의 일 예에 따라 제조된 흑색종 모델을 제조 직후, 제조 7일 후, 및 제조 14일 후 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2c는 본 발명의 일 예에 따라 복수개의 흑색종 모델을 일괄 제조한 뒤 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 예에 따른 흑색종 모델의 저산소영역을 염색한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 종래에 일반적인 2차원 세포배양 방법으로 흑색종 세포를 배양하여 제조한 흑색종 모델에서 저산소 영역이 형성되는지 여부를 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 현적 배양 방법을 이용하여 제조된 흑색종 모델에서 저산소 영역이 형성되는지 여부를 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 예에 따른 흑색종 세포 프린팅 단계에서 공압을 12.5kPa 내지 27.5kPa 로 설정하여 제조된 흑색종 모델의 현미경 관찰 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 다양한 입경을 가지는 흑색종 모델의 HIF-a 형광염색 결과를 나타낸 도면이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 배양기판의 제조
배양기판의 형태는 통상의 기술자가 목적에 따라 다양한 재료를 사용하여 원하는 형상으로 제작할 수 있으며, 본 실시예에서는 예시적으로 흑색종 모델의 제조 및 배양을 수행하기 위한 배양기판을 다음과 같이 제조하였다. 3D 프린팅 장비 (Multi-Head Dispensing System (MHDS))의 분사 헤드 (dispensing head)에 폴리카프로락톤 (polycaprolactone; PCL) 을 로딩한 SUS 시린지를 탑재하여 온도를 100℃로 가열하여 재료를 용융하였다. 배양 기판을 제조하기 위해 약 500kPa의 공기압을 가하여 PCL 용융물을 분사하여 가로 15mm, 세로 15mm, 높이 5mm의 흑색종 모델 제조를 위한 배양기판을 제작하였다.
실시예 2: 바이오잉크 조성물의 제조
(1) 섬유아세포를 포함하는 바이오잉크 조성물의 제조
제분된 돼지 피부 유래의 탈세포화 세포외 기질 분말인 sdECM (skin-derived decellularized extracellular matrix)을 이용하여 바이오 잉크를 제작하였다. 펩신(pepsin)과 0.5M의 아세트 산(acetic acid)을 이용하여 동결 건조된 sdECM을 녹이고, 이에 10M의 수산화나트륨(sodium hydroxide, NaOH)을 첨가함으로써 대략 pH 7.4로 중성화시켰다. 중성화된 1% 농도의 sdECM 바이오 잉크에 이후 피부의 진피 조직으로 성장할 수 있도록 진피층을 대표하는 세포인 피부 섬유아세포 (dermal fibroblast, Lonza)를 1*10^5 내지 5*10^8 cells/ml의 밀도를 갖도록 투입하여, 섬유아세포를 포함하는 바이오잉크 (제 1 바이오 프린팅용 조성물)를 제조하였다.
(2) 흑색종 세포를 포함하는 바이오잉크 조성물의 제조
실시예 2의 (1) 섬유아세포를 포함하는 바이오 프린팅용 조성물의 제조방법과 실질적으로 동일하게 수행하되, 피부 섬유아세포 대신 피부의 흑색종 조직으로 성장할 수 있는 피부 악성 흑색종세포(malignant melanoma, ATGC)를 투입하였다.
구체적으로, 제분된 돼지 피부 유래의 탈세포화 세포외 기질 분말인 sdECM (skin-derived decellularized extracellular matrix)을 이용하여 바이오 잉크를 제작하였다. 펩신(pepsin)과 0.5M의 아세트 산(acetic acid)을 이용하여 동결 건조된 sdECM을 녹이고, 이에 10M의 수산화나트륨(sodium hydroxide, NaOH)을 첨가함으로써 대략 pH 7.4로 적정하였다. 적정된 1% 농도의 sdECM 바이오 잉크에 1*10^6 내지 1*10^10 cells/ml의 밀도를 갖도록 피부 악성 흑색종세포(malignant melanoma, ATGC)를 투입하여 흑색종 세포를 포함하는 바이오잉크 (제 2 바이오 프린팅용 조성물)를 제조하였다.
실시예 3: 흑색종 모델의 제조
여러 개의 분사 헤드(dispensing head)가 장착된 3D 프린팅 장비를 이용하여 (1) 섬유아세포와 바이오잉크가 혼합된 원료 (제 1 바이오 프린팅용 조성물), 및 (2) 흑색종 세포와 바이오잉크가 혼합된 원료 (제 2 바이오 프린팅용 조성물)를 각각 분사 헤드에 탑재하고, 순차적인 분사 공정을 통해 흑색종 모델을 제조하였다. 압출(extrusion) 방식의 3차원 세포 프린팅 기술을 이용하여 흑색종 모델을 제작하는 과정을 도 1에 나타내었으며, 구체적은 제조과정은 다음과 같았다.
(1) 섬유아세포 프린팅
실시예 2에서 제조된 제 1 바이오 프린팅용 조성물을 분사 헤드에 탑재하고, 온도를 15℃로 유지하였다. 내경 0.25mm, 26G의 분사 노즐을 이용하여 시린지에 약 80kPa의 공기압을 가하여 섬유아세포가 포함된 제 1 바이오 프린팅용 조성물을 실시예 1에서 제조된 배양기판에 분사하여 흑색종 모델의 주변환경을 재현하였다.
(2) 흑색종 세포 프린팅
실시예 2에서 제조된 제 2 바이오 프린팅용 조성물을 또 다른 헤드에 탑재하고, 온도를 15℃로 유지하였다. 흑색종 세포가 포함된 바이오 잉크가 로딩된 내경 0.25mm, 26G의 분사 노즐 (nozzle)을, 상기 실시예 3 (1)에서 분사된 섬유아세포를 포함한 바이오잉크가 채워진 인쇄물의 내부로 투입하여 원하는 위치에 노즐을 이동시킨 후, 약 22.5kPa의 일정한 공압에서 약 0.3초의 짧은 시간동안 분사하여, in situ 프린팅 방식으로 고농도로 흑색종 세포를 포함한 하이드로젤을 분사하여 약 800um 직경의 구 형태의 인쇄물을 제조하였다.
(3) 액적 (droplet) 방식으로 제조된 인쇄물의 배양
상기 실시예 3 (2)에서 제조된 흑색종 세포 및 섬유아세포를 포함하는 인쇄물을 37℃, 5% CO2를 유지하며 세포 성장 배지 (RPMI 1640 Medium, 10% FBS, 1% Penicilin-Streptomycin)에서 2일에 한 번씩 배지를 교체하면서 7일간 배양하여 흑색종 모델을 제조하였다.
실시예 4: 흑색종 모델의 현미경 관찰
실시예 3에서 제조된 다수의 흑색종 모델을 FITC 염색을 통해 형광 현미경으로 관찰하였으며, 그 결과를 도 2a에 나타내었다.
도 2a에 나타난 바와 같이, 본 발명의 일예에 따른 흑색종 모델 제조방법으로 제조된 흑색종 모델은 흑색종 세포끼리 응집한 종양 형태를 형성하였으며, 이에 실제 종양의 3차원 응집 형태를 성공적으로 모사하였음을 확인할 수 있었다.
또한, 상기 제조된 흑색종 모델을 제조 직후, 제조 7일 후, 및 제조 14일 후 현미경 관찰하여 그 결과를 도 2b에 나타내었다. 도 2b에 나타난 바와 같이, 본 발명의 일예에 따른 흑색종 모델 제조방법으로 제조된 흑색종 모델은 배양시간이 길어짐에 따라 흑색종 세포끼리 더욱 응집하여 종양 형태를 형성하는 과정을 확인할 수 있었으며, 이에 실제 종양의 3차원 형태를 성공적으로 모사하였음을 확인할 수 있었다.
또한, 복수개의 흑색종 모델을 일괄 제조하였으며, 제조된 흑색종 모델을 현미경으로 관찰한 결과를 도 2c에 나타내었다.
실시예 5: 흑색종 모델의 미세환경 구현 검증
실시예 3에서 제조된 흑색종 모델이 실제 흑색종 종양과 유사한 특이적인 미세환경을 구현 가능한지 여부를 검증하기 위해, 흑색종 모델 내의 저산소 영역 형성 여부를 확인하였다.
구체적으로, 실시예 3에서 제조된 흑색종 모델을 동일한 조건에서 7일간 추가 배양하고, 조직 유사체들을 1x 인산완충식염수(1x phosphate buffered saline; 1x PBS)를 이용하여 5분간 3회 세척하였다.
세척이 완료된 조직들에 대해 Hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF-1α) 항체의 형광염색을 진행하였다. 흑색종 모델을 상온에서 4%의 파라포름알데하이드(paraformaldehyde; PFA) 용액에 10분간 넣어 고정시켰다. 1% 소 혈청 알부민 (bovine serum albumin; BSA)을 넣어 30분 동안 blocking을 해주었다. 후에 1% BSA를 제거해준 후 1x PBS에 1:200으로 HIF-1α, MelanA 항체를 희석시킨 용액을 조직 유사체에 넣어주어 한 시간 동안 상온 혹은 4℃에서 약 하루동안 인큐베이션 했다. 1x PBS로 3번씩 5분마다 조직 유사체를 씻어주었으며, 1% BSA에 형광이 달린 2차 안티바디를 1:300으로 넣어준 용액을 조직 유사체에 넣어준 후 한 시간 동안 인큐베이션 했다. 마지막으로 핵을 염색하기 위해 10mg/ml의 4′,6′디아미노-2-페닐인돌 (4′,6-diamidino-2-phenylindol; DAPI) 용액을 1x PBS와 1:1000으로 희석하여 조직 유사체에 10분간 넣어주었다. 핵 염색까지 완료된 조직 유사체를 공초점주사현미경(confocal microscope, Zeiss)을 통해 중심부의 저산소 영역을 확인하였다.
도 3은 흑색종 모델의 저산소영역을 염색한 결과를 나타낸 도면이다. 도 3에 나타난 바와 같이, 구획화된 흑색종 세포가 시간이 지나면서 세포 간 결합을 통해 실제 종양과 같은 응집체를 형성하였다. 구조체 중심부에 빨간색으로 염색된 저산소 환경 (hypoxic condition)이 자발적으로 유발된 영역이 상당히 눈에 띄게 관찰되었고, 이는 본 발명에서 제작된 흑색종 모델에서 실제 종양 특이적인 미세환경이 잘 구현될 수 있음을 의미한다. 따라서, 본 발명의 일예에 따른 흑색종 모델의 제조방법으로 제조된 흑색종 모델이 실제 종양의 미세환경을 성공적으로 모사할 수 있음을 확인하였다.
실시예 3에서 제조된 흑색종 모델의 저산소 영역의 정도 및 분포를 ImageJ Software를 사용하여 수치값으로 표 1에 나타내었다. 표 1에 나타난 바와 같이, 실시예 3에서 HIF-1a 항체가 발현된 세포는 전체의 약 20% 이상이었고, HIF-1a 항체가 발현된 세포 대부분이 중심부로부터 반지름 200um 이내 (흑색종 모델 전체 반지름의 50% 이내)에 존재하였다.
구분 HIF-1a 발현 세포
실시예 3 20.22%
비교예 1 0%
비교예 2 0%
비교예 1: 2차원 세포배양 방법으로 제조된 흑색종 모델
비교예로서 종래에 일반적인 2차원 세포배양 방법으로 2차원 흑색종 모델을 제조하였다. 구체적으로, 멜라노마 세포를 5000 cells/cm2 이 되도록 세포 성장 배지가 담긴 배양 접시에 분주하였다. 배양액은 2일 마다 교체하였으며, 약 1주 배양시 배양 접시에 흑색종 세포가 가득 차는 것을 현미경을 통해 확인할 수 있었다.
비교예 1의 흑색종 모델을 실시예 5와 동일한 염색 과정을 거친 후, 저산소 영역을 형광현미경으로 관찰하였다. 비교예 1의 저산소 영역 관찰 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, 비교예 1의 2차원 세포 배양으로 제조된 흑색종 모델은 평면의 세포 배양 디쉬에 각각의 세포가 평평하게 뻗어있는 형태였으며, 흑색종 세포끼리 응집한 종양 형태를 확인할 수 없었다. 이와 마찬가지로 저산소 영역 또한 형성되지 않았다.
비교예 1의 흑색종 모델의 저산소 영역의 정도 및 분포를 ImageJ Software를 사용하여 수치값으로 표 1에 나타내었다. 표 1에 나타난 바와 같이, 비교예 1의 흑색종 모델의 세포에서는 HIF-1a의 항체 발현을 확인할 수 없었다. 이를 통해 기존 흑색종 모델 제작 방법과 비교했을때, 본 발명에서 제조한 흑색종 모델이 실제 종양의 미세환경을 더 잘 모사할 수 있음을 확인할 수 있었다.
비교예 2: 현적 배양 (hanging-drop culture) 방법으로 제조된 흑색종 스페로이드 모델
비교예로서 일반적인 스페로이드 제작 방법으로 알려진 현적 배양 방법을 이용하여 흑색종 스페로이드 모델을 제조하였다. 구체적으로, 배양 접시에서 배양한 멜라노마 세포를 1x PBS 용액으로 세척한 다음, Trysin-EDTA (0.25%)를 처리 과정을 통해 세포를 모았다. 모아진 세포를 원심분리 과정을 통해 세포 펠렛을 제조하였다. 다음으로, 세포 펠렛을 세포의 농도가 1.6*10^6/ml이 되도록 세포 성장 배지로 균일하게 부유시켰다. 파이펫을 이용해 세포 부유액을 세포가 붙지 않는 소독된 배양 접시에 25ul씩 분주하였다. 분주가 완료되면 접시를 조심스럽게 뒤집어 분주된 세포가 현적배양 (hanging-drop) 될 수 있도록 하였다. 배양액은 2일 마다 교체하였으며, 2-3주 배양시 흑색종 스페로이드가 형성되는 것을 현미경 또는 육안으로 관찰할 수 있었다.
제작된 스페로이드를 sdECM 바이오 잉크에 봉입한 후 배양하여 실시예 5와 동일한 염색 과정을 거친 후에 공초점주사현미경(confocal microscope, Zeiss)를 통해 중심부의 저산소 영역을 관찰하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타난 바와 같이 비교예 2의 현적 배양 방법으로 제조된 흑색종 모델은 제작된 스페로이드의 크기가 일정하지 않았으며 (직경 150~400um), 직경 400um 이상의 스페로이드를 제작하는데 어려움이 있었다. 또한, 구조체의 중심부에서 저산소 영역을 확인할 수 없었다.
비교예 2의 흑색종 모델의 저산소 영역의 정도 및 분포를 ImageJ Software를 사용하여 수치값으로 표 1에 나타내었다. 표 1에 나타난 바와 같이, 비교예 2의 흑색종 모델의 세포에서는 HIF-1a의 항체 발현을 확인할 수 없었다. 이를 통해 기존 흑색종 모델 제작 방법과 비교했을때, 본 발명에서 제조한 흑색종 모델이 실제 종양의 미세환경을 더 잘 모사할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 공압 변화에 따른 다양한 직경을 가지는 흑색종 모델의 제조
흑색종 세포 프린팅 단계에서의 공압 변화에 따른 흑색종 모델의 직경 변화를 알아보기 위해, 실시예 3과 실질적으로 동일한 방법으로 흑색종 모델을 제조하되, 흑색종 세포 프린팅 단계에서 공압을 12.5kPa ~ 27.5kPa로 설정하여 수행하였다. 상기 제조된 흑색종 모델 각각의 현미경 관찰 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타난 바와 같이, 15kPa의 공압에서는 지름 (직경) 약 400um 크기의 흑색종 모델이 제조되었고, 20kPa의 공압에서는 지름 (직경) 약 700um 크기의 흑색종 모델이 제조되었으며, 22.5kPa의 공압에서는 지름 (직경) 약 800um 크기의 흑색종 모델이 제조되었으며, 27.5kPa의 공압에서는 지름 (직경) 약 1,000um 크기의 흑색종 모델이 제조되었다. 따라서, 15kPa 내지 27.5kPa의 공압 조건에서 실제 흑색종 종양의 미세환경과 유사한 흑색종 모델을 제조할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 7: 저산소영역의 정량화
실시예 6에서 제조된 다양한 직경을 가지는 흑색종 모델을 실시예 5와 실질적으로 동일한 방법으로 염색하여 흑색종 모델 중심부의 저산소 영역을 관찰하였다. 관찰 결과를 도 7에 나타내었다 (차례대로 지름 400, 600, 800um 내외). 도 7에 나타난 바와 같이, 흑색종 모델의 중심부에 저산소 영역이 형성되어, 실제 흑색종을 다양한 크기를 가지도록 성공적으로 모사하였음을 알 수 있었다.

Claims (15)

  1. (1) 섬유아세포를 포함하는 바이오잉크를 3차원 인쇄하여 섬유아세포를 포함하는 인쇄물을 제조하는 단계;
    (2) 상기 섬유아세포를 포함하는 인쇄물의 내부에, 흑색종 세포를 포함하는 바이오잉크를 3차원 인쇄하여 형성된 흑색종 세포의 액적 (droplet)과 섬유아세포를 포함하는 인쇄물을 제조하는 단계; 및
    (3) 상기 단계 (2)에서 제조된 인쇄물을 배양하여, 상기 흑색종 세포가 응집되어 자발적으로 저산소 영역을 형성하는 단계를 포함하는,
    흑색종 세포의 응집체를 포함하며 저산소 영역 (hypoxic condition)을 갖는 흑색종 모델의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단계 (2)는 흑색종 세포를 포함하는 바이오잉크를 분사하기 위한 분사 노즐을, 상기 섬유아세포를 포함하는 인쇄물 내부에 투입하여 상기 인쇄물을 제조하는 것인, 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단계 (2)는, 상기 섬유아세포를 포함하는 인쇄물의 내부에 흑색종 세포의 액적이 형성될 위치를 고려하여 분사노즐의 위치를 조절 및 인쇄하여 원하는 위치에 액적을 형성하는 것인, 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 단계 (2)는, 상기 흑색종 세포를 포함하는 바이오잉크를 3차원 인쇄 시 공압 또는 분사 시간을 조절하여 다양한 크기의 흑색종 세포의 액적 (droplet)을 형성하는 것인, 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 단계 (2)는 상기 흑색종 세포를 포함하는 바이오잉크를 10kPa 내지 30kPa의 공압으로 회 인쇄 당 0.2초 내지 1초 간격으로 불연속적으로 분사되는 것인, 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 흑색종 모델은, 상기 흑색종 모델에 포함된 전체 흑색종 세포 수 100%를 기준으로, Hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF-1a) 유전자가 발현된 흑색종 세포 수를 적어도 5% 이상 포함하는, 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 흑색종 모델은 스페로이드 (spheroid) 형태이며, Hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF-1a) 유전자가 발현된 흑색종 세포가, 상기 흑색종 모델의 전체 반경 100%를 기준으로, 상기 흑색종 모델의 중심으로부터 반경 60% 이내에 위치하는 것인, 제조방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 흑색종 모델은 200 내지 1,200 um의 직경을 갖는 스페로이드 형태인, 제조방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 바이오잉크는 콜라젠, 탈세포화된 세포외기질, 혈관내피성장인자, 섬유아세포 성장인자, 혈소판유래 성장인자, 안지오포이에틴-1(angiopoietin-1), 형질전환성장인자-베타 (transforming growth factor beta, TGF-β), 에리스로포에틴(erythropoietin, EPO), 줄기세포인자(stem cell factor, SCF), 표피성장인자(epidermal growth factor, EGF), 콜로니자극인자(colony stimulating facor, CSF), 혈관성장보충물(endothelial cell growth supplement, ECGS), 바탕질단백분해효소(matrix metalloproteinase, MMP), 바탕질단백분해저해효소(tissue inhibitor matrix metalloproteinase, TIMP), 알긴산 (alginate), 젤라틴(gelatin), 콜라겐(collagen), 히알루론산(hyaluronic acid), 키토산(chitosan), 피브린(fibrin), 아가로오스(agarose), 실크단백질(silk protein), 헤파린(heparin), 헤파란황산(heparan sulfate), 케라탄황산(keratin sulfate), 데르마탄황산(dermatan sulfate), 콘드로이틴황산(chondroitin sulfate), 지방알코올(fatty alcohol), 및 지방산(fatty acid) 으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는, 제조방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 흑색종 세포를 포함하는 바이오잉크는 흑색종 세포를 1*106 내지 1*1010 cells/ml의 농도로 포함하거나, 상기 섬유아세포를 포함하는 바이오잉크는 섬유아세포를 1*105 내지 5*108 cells/ml의 농도로 포함하는 것인, 제조방법.
  11. 흑색종 모델 제조를 위한 기판을 제공하는 단계;
    상기 기판 위에 섬유아세포를 포함하는 바이오잉크를 3차원 인쇄하여 섬유아세포를 포함하는 인쇄물을 제조하는 단계;
    상기 섬유아세포를 포함하는 인쇄물의 내부로 3차원 인쇄를 위한 분사 노즐을 투입하여 흑색종 세포를 포함하는 바이오잉크를 인쇄하여 형성된 흑색종 세포의 액적 (droplet)과 섬유아세포를 포함하는 인쇄물을 제조하는 단계; 및
    상기 제조된 인쇄물을 배양하여 흑색종 세포가 응집되어 자발적으로 저산소 영역 (hypoxic condition)을 형성하는 단계;
    를 포함하는,
    흑색종 세포의 응집체를 포함하며 저산소 영역 (hypoxic condition)을 갖는 흑색종 모델의 제조방법.
  12. 섬유아세포 및 흑색종 세포를 포함하는 흑색종 모델로서,
    상기 흑색종 모델의 직경은 200 내지 1,200 um을 갖는 스페로이드 형상이고,
    상기 스페로이드 내부에 저산소 환경 (hypoxic condition)을 가지는,
    흑색종 모델.
  13. 제12항에 있어서, 상기 흑색종 모델은 상기 흑색종 모델에 포함된 전체 흑색종 세포 수 100%를 기준으로, Hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF-1a) 유전자가 발현된 흑색종 세포 수를 적어도 5% 이상 포함하는 것인, 흑색종 모델.
  14. 제12항에 있어서, 상기 흑색종 모델은 Hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF-1a) 유전자가 발현된 흑색종 세포가, 상기 흑색종 모델의 전체 반경 100%를 기준으로, 상기 흑색종 모델의 중심으로부터 반경 60% 이내에 위치하는 것인, 흑색종 모델.
  15. 제12항에 있어서, 상기 흑색종 세포는 환자에서 분리된 세포인, 제조방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4279093A1 (en) * 2022-05-20 2023-11-22 Bioiberica, S.A.U. Hydrogels for use in skin tissue engineering

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170013865A (ko) * 2014-04-04 2017-02-07 오가노보, 인크. 조작된 3차원 유방 조직, 지방조직, 및 종양 질병 모델
KR20170068975A (ko) * 2015-12-10 2017-06-20 포항공과대학교 산학협력단 종양 조직 배양 장치 및 종양 조직 배양 방법
KR20170113253A (ko) * 2016-03-25 2017-10-12 포항공과대학교 산학협력단 3차원 세포 프린팅 방법
KR20180015092A (ko) * 2016-08-01 2018-02-12 포항공과대학교 산학협력단 통합형 3차원 세포 프린팅 기술을 이용한 세포 배양체 및 이의 제조방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170013865A (ko) * 2014-04-04 2017-02-07 오가노보, 인크. 조작된 3차원 유방 조직, 지방조직, 및 종양 질병 모델
KR20170068975A (ko) * 2015-12-10 2017-06-20 포항공과대학교 산학협력단 종양 조직 배양 장치 및 종양 조직 배양 방법
KR20170113253A (ko) * 2016-03-25 2017-10-12 포항공과대학교 산학협력단 3차원 세포 프린팅 방법
KR20180015092A (ko) * 2016-08-01 2018-02-12 포항공과대학교 산학협력단 통합형 3차원 세포 프린팅 기술을 이용한 세포 배양체 및 이의 제조방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHANG YU SHRIKE, DUCHAMP MARGAUX, OKLU RAHMI, ELLISEN LEIF W., LANGER ROBERT, KHADEMHOSSEINI ALI: "Bioprinting the Cancer Microenvironment", ACS BIOMATERIALS SCIENCE & ENGINEERING, vol. 2, no. 10, 17 June 2016 (2016-06-17), pages 1710 - 1721, XP055817727, ISSN: 2373-9878, DOI: 10.1021/acsbiomaterials.6b00246 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4279093A1 (en) * 2022-05-20 2023-11-22 Bioiberica, S.A.U. Hydrogels for use in skin tissue engineering

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