KR20170113253A

KR20170113253A - 3차원 세포 프린팅 방법

Info

Publication number: KR20170113253A
Application number: KR1020170037844A
Authority: KR
Inventors: 조동우; 박주영; 전누리; 유현렬; 이병준; 김수룡
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단; 서울대학교산학협력단
Priority date: 2016-03-25
Filing date: 2017-03-24
Publication date: 2017-10-12

Abstract

본 발명의 실시예에 따른 3차원 세포 프린팅 방법은, 3차원 프린터를 이용해, 기판 상에 인간 혈관 내피 세포(human endothelial cells; hECs)가 포함된 제1 바이오 잉크가 프린팅될 제1 영역과, 인간 섬유아세포 (human fibroblasts; hFbs)가 포함된 제2 바이오 잉크가 프린팅될 제2 영역 및 상기 제1 영역과 상기 제2 영역의 사이에 위치하는 미디어 채널의 프레임을 프린팅 하는 단계; 상기 제1 영역 내에 상기 제1 바이오 잉크를 프린팅 하는 단계; 상기 제2 영역 내에 상기 제2 바이오 잉크를 프린팅 하는 단계 및 상기 미디어 채널 내에 미디어를 주입하는 단계를 포함한다.

Description

3차원 세포 프린팅 방법{Method for 3D printing of cell}

본 발명은 3차원 세포 프린팅 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 3차원 세포 프린터를 이용하여 기판 상에서 조직 또는 기관을 제조하는 방법에 관한 것이다.

순환계(circulating system)는 혈액 또는 림프액을 순환시켜 외부에서 섭취한 영양분이나 체내에서 생긴 호르몬 등을 몸의 각 부위로 수송하고, 가스 교환, 노폐물 배출 등을 담당한다. 이 시스템의 주요 구성 요소로, 혈관 내피 세포는 혈관벽을 통과하는 수송, 혈관 확장, 혈관 형성 및 퇴행을 조절한다. 순환계의 이러한 기능으로 인해, 그 기능 및 조절의 장애는 매우 다수의 병리적 현상을 유발할 수 있다. 그러므로 혈관의 생체 외 제작은 이러한 병리 현상의 치료를 위한 약물 및 치료법 개발에 중요한 도구가 될 수 있다.

이러한 목적을 위해, 혈관의 역학과 기능을 연구하기 위해 개발된 많은 생체 외 실험 시스템들이 보고되고 있다.

대표적으로, 유리 기판 또는 다공성 막 위에서 배양된 이차원적 혈관내피세포는 혈관의 장벽 기능 (barrier function) [J. Gavard and J. S. Gutkind, Nat. Cell Biol., 2006, 8, 1223-1234.], 기계적 자극에 대한 반응성 [E. Tzima, M. Irani-Tehrani, W. B. Kiosses, E. Dejana, D. A. Schultz, B. Engelhardt, G. Cao, H. DeLisser and M. A. Schwartz, Nature, 2005, 437, 426-431.], 백혈구 혹은 순환하는 종양 세포와 같은 혈행성 세포의 혈관벽을 통한 세포 이동 등의 연구를 위해 널리 사용되고 있다 [C. V. Carman and T. A. Springer, J. Cell Biol., 2004, 167, 377-388., P. L. Tremblay, J. Huot and F. A. Auger, Cancer Res., 2008, 68, 5167-5176.]. 하지만, 이러한 이차원적 단층 기반의 시스템들은 혈관의 원래 구조와 기능에 중요한 삼차원적 요소들이 결여되어 있으므로 실제 생명체에서 보여지는 복잡한 생물학적 특성을 반영하지 못한다.

반면, 삼차원의 세포외기질 (extracellular matrices; ECMs)은 혈관의 형성과 기능에 중요한 세포-세포 (Cell-Cell) 및 세포와 기질 (Cell-ECM)의 상호작용 (interaction)이 가능한 혈관내피세포를 포함하는 다세포 조직체 (multi-cellular organization) 제작을 위해 향상된 환경을 제공해 줄 수 있다 [D. E. Ingber and J. Folkman, Cell, 1989, 58, 803-805., D. G. Stupack and D. A. Cheresh, Science's STKE, 2002, 2002, pe7.]. 그러나 이러한 삼차원 생체 외 모델들에서는 유체가 흐를 수 있는 도관형의 혈관을 용이하게 제작할 수 있는 강력한 실험법을 제공해 주지 못하므로, 작은 분자나 단백질, 또는 세포의 혈관 내로의 선택적 전달이 필수적인 실험에서는 그 적용이 불가능하였다. 더욱이, 이러한 삼차원 모델에서는 혈관 내피 기능의 조절에 매우 중요한 유체 (luminal flow)의 흐름에 의한 기계적 신호 (mechanical cues)는 모사해 줄 수 없었다.

최근에는 삼차원 프린팅 기술을 사용하여 pluronic F127 이나 agarose와 같은 물질을 희생 주형 재료로 위치시킴으로써, 제작된 조직 체 내에 도관형 혈관 형성을 위한 마이크로 채널을 제작하는데 많이 적용되고 있지만, 기능적인 도관형 혈관을 제작하기 위해 희생 주형 재료를 바깥으로부터의 자극을 통해 녹여 제거해 준 뒤 혈관 내피 세포를 파종해 주는 추가적인 과정이 필요한 단점이 있다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 자연 유래 세포 외 기질로 구성된 바이오 잉크를 적용한 삼차원 세포 프린팅(3D cell-printing) 기술을 이용하여 기판 상에서 조직 또는 기관을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 실시예에 따른 3차원 세포 프린팅 방법은, 3차원 프린터를 이용해, 기판 상에 인간 혈관 내피 세포(human endothelial cells; hECs)가 포함된 제1 바이오 잉크가 프린팅될 제1 영역과, 인간 섬유아세포 (human fibroblasts; hFbs)가 포함된 제2 바이오 잉크가 프린팅될 제2 영역 및 상기 제1 영역과 상기 제2 영역의 사이에 위치하는 미디어 채널의 프레임을 프린팅 하는 단계; 상기 제1 영역 내에 상기 제1 바이오 잉크를 프린팅 하는 단계; 상기 제2 영역 내에 상기 제2 바이오 잉크를 프린팅 하는 단계 및 상기 미디어 채널 내에 미디어를 주입하는 단계를 포함한다.

상기 프레임 중 상기 제1 영역과 상기 미디어 채널의 경계 및 상기 제2 영역과 상기 미디어 채널의 경계 중 적어도 하나는 상기 프레임의 다른 부분에 비해 낮은 높이로 프린팅될 수 있다.

상기 프레임 중 상기 제1 영역과 상기 미디어 채널의 경계 및 상기 제2 영역과 상기 미디어 채널의 경계는 상기 프레임의 다른 부분에 비해 상기 프레임을 형성하는 재료의 적층 횟수가 적을 수 있다.

상기 프레임은, 상기 제1 영역과 상기 미디어 채널이 상호 부분적으로 연결되도록, 상기 제1 영역과 상기 미디어 채널의 경계에 상호 이격 형성된 복수의 포스트를 포함할 수 있다.

상기 제2 바이오 잉크에 포함된 상기 인간 섬유아세포로부터 분비되는 혈관 형성 유도 인자가 상기 제1 바이오 잉크에 영향을 주어 상기 제1 영역 내에서 혈관 네트워크가 생성되며, 상기 혈관 네트워크는 상기 복수의 포스트의 사이로 연장될 수 있다.

상기 프레임은 합성 고분자로 형성될 수 있다.

상기 프레임을 둘러싸며 프린팅 플랫폼의 경계를 형성하는 외곽 라인을 프린팅하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 외곽 라인과 상기 프레임 사이의 영역에 상기 외곽 라인 및 상기 프레임을 고정하기 위한 합성 고분자를 프린팅하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 제1 바이오 잉크는 혈관이 존재하는 조직으로부터 분리한 탈세포화된 세포외 기질에 상기 인간 혈관 내피 세포를 혼합하여 제조될 수 있다.

상기 제2 바이오 잉크는 혈관이 존재하는 조직으로부터 분리한 탈세포화된 세포외 기질에 상기 인간 섬유아세포를 혼합하여 제조될 수 있다.

상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 실시예에 따른 3차원 세포 프린팅 방법은, 3차원 프린터를 이용해, 기판 상에 제1 바이오 잉크가 프린팅될 제1 영역, 제2 바이오 잉크가 프린팅될 제2 영역 및 상기 제1 영역과 상기 제2 영역의 사이에 위치하는 미디어 채널의 프레임을 프린팅 하는 단계; 상기 제1 영역 내에 상기 제1 바이오 잉크를 프린팅 하는 단계; 상기 제2 영역 내에 상기 제2 바이오 잉크를 프린팅 하는 단계 및 상기 미디어 채널 내에 미디어를 주입하는 단계를 포함한다.

상기 프레임을 프린팅하는 단계에서, 상기 제1 영역과 상기 미디어 채널의 경계 및 상기 제2 영역과 상기 미디어 채널의 경계 중 적어도 하는 다른 부분에 비해 낮은 높이로 프린팅될 수 있다.

상기 프레임은 합성 고분자로 형성될 수 있다.

상기 제1 바이오 잉크와 상기 제2 바이오 잉크는 탈세포화된 세포외 기질에 서로 다른 세포를 혼합한 것일 수 있다.

상기 탈세포화된 세포 외 기질은 혈관이 존재하는 조직으로부터 분리한 탈세포화된 세포외 기질을 포함하며, 상기 제1 바이오 잉크는 상기 탈세포화된 세포외 기질에 인간 혈관 내피 세포(human endothelial cells; hECs)를 혼합하여 제조되고, 상기 제2 바이오 잉크는 상기 탈세포화된 세포외 기질에 인간 섬유아세포 (human fibroblasts; hFbs)를 혼합하여 제조될 수 있다.

본 발명의 기타 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.

본 발명의 실시예들에 의하면 적어도 다음과 같은 효과가 있다.

혈관 형성 유도에 강력한 효과를 가지는 조직 유래 세포 외 기질로 구성된 바이오잉크를 적용함으로써 도관형 혈관 형성 유도 기간을 단축하였다.

또한, 자연 조직 내부 환경에 가까운 마이크로 환경을 세포에 제공해 줌으로써 생체 내 (in vivo) 조직과 유사한 반응을 유도할 수 있다

또한, 미디어 채널을 통해 미디어를 흘려주어 도관형 혈관을 통한 유체(luminal flow)의 흐름에 의한 기계적 신호(mechanical cues)를 모사해 줌으로써 자극에 따른 내피의 기능을 연구할 수도 있다.

또한, 사용자가 원하는 디자인의 혈관 네트워크를 제작하는 것이 가능하다.

본 발명에 따른 효과는 이상에서 예시된 내용에 의해 제한되지 않으며, 더욱 다양한 효과들이 본 명세서 내에 포함되어 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 세포 프린팅 방법을 도시한 순서도이다.
도 2는 도 1의 S11 단계를 설명하기 위한 도면이다.
도 3은 도 1의 S12 단계를 설명하기 위한 도면이다.
도 4는 도 3의 AA선에 따른 단면을 개략적으로 도시한 도면이다.
도 5는 도 1의 S13 단계를 설명하기 위한 도면이다.
도 6은 도 1의 S14 및 S15 단계를 설명하기 위한 도면이다.
도 7은 도 1의 S17 단계를 설명하기 위한 도면이다.
도 8 내지 도 11은은 본 발명의 다른 실시예에 따른 프린팅 플랫폼을 도시한 도면이다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다.

또한, 본 명세서에서 기술하는 실시예들은 본 발명의 이상적인 예시도인 단면도 및/또는 개략도들을 참고하여 설명될 것이다. 따라서, 제조 기술 및/또는 허용 오차 등에 의해 예시도의 형태가 변형될 수 있다. 또한 본 발명에 도시된 각 도면에 있어서 각 구성 요소들은 설명의 편의를 고려하여 다소 확대 또는 축소되어 도시된 것일 수 있다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다.

이하, 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 세포 프린팅 방법과 3차원 세포 프린팅 방법에 사용되는 실시예들에 따른 프린팅 플랫폼을 설명하기 위한 도면들을 참고하여 본 발명에 대하여 설명하도록 한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 세포 프린팅 방법을 도시한 순서도이다.

도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 세포 프린팅 방법은, 플랫폼의 외곽 라인을 프린팅하는 단계(S11), 프레임을 프린팅 하는 단계(S12), PDMS를 프린팅 하는 단계(S13), 제1 바이오 잉크를 프린팅 하는 단계(S14), 제2 바이오 잉크를 프린팅 하는 단계(S15), 1차 배양 단계(S16), 미디어를 주입하는 단계(S17) 및 2차 배양 단계(S18)를 포함한다.

본 발명의 일 실시예예 따른 3차원 세포 프린팅 방법은 3차원 세포 프린팅 시스템을 이용해 수행된다.

본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 세포 프린팅 방법에 사용되는 3차원 세포 프린팅 시스템은 XYZ 방향으로 제어되는 복수의 프린팅 헤드가 장착된 3차원 프린터가 사용될 수 있다. 각 프린팅 헤드는 합성 고분자와 자연 유래 고분자 등을 압출 방식으로 분사할 수 있다.

도 2는 도 1의 S11 단계를 설명하기 위한 도면이다.

도 2에 도시된 바와 같이, 플랫폼의 외곽 라인을 프린팅하는 단계(S11)에서는 기판(S) 상에 프린팅 플랫폼(1, 도 3 참고)의 외곽 라인(10)을 프린팅한다. S11 단계에서 3차원 세포 프린팅 시스템은 제1 합성 고분자가 충진된 프린팅 헤드를 외곽 라인(10)을 따라 이동시키며 제1 합성 고분자를 압출하여 기판(S) 상에 외곽 라인(10)을 프린팅한다.

본 실시예에서는 외곽 라인(10)이 직사각형의 형상으로 형성되는 예를 도시하였으나, 실시예예 따라 외곽 라인(10)의 형상은 달라질 수 있다.

외곽 라인(10)을 형성하는 제1 합성 고분자로는 PCL(polycarprolactone)이 사용될 수 있다.

3차원 세포 프린팅 시스템은 제1 합성 고분자가 충진된 프린팅 헤드를 외곽 라인(10)을 따라 복수 회 이동시켜 PCL이 복수 회 적층되도록 할 수 있다. 예를 들어, 프린팅 헤드가 한번 지나가며 프린팅한 PCL이 100μm의 높이로 프린팅되는 경우, 프린팅 헤드가 3회 지나가며 프린팅한 PCL은 300μm의 높이로 적층되어 프린팅된다.

도 3은 도 1의 S12 단계를 설명하기 위한 도면이다.

S11 단계 이후 또는 S11 단계와 동시에 프레임을 프린팅 하는 단계(S12)가 수행될 수 있다. 또는 S11 단계 이전에 S12 단계가 수행될 수 있다.

도 3에 도시된 바와 같이, 프레임을 프린팅 하는 단계(S12)에서는, 제1 영역(31), 제2 영역(33), 제1 미디어 채널(32) 및 제2 미디어 채널(34)의 프레임(20)을 기판(S) 상에 프린팅 한다.

프레임(20)은 외곽 라인(10)의 안쪽에 프린팅되며, 프레임(20)은 S11 단계에서 외곽 라인(10)을 형성하는데 사용된 제1 합성 고분자를 이용해 프린팅될 수 있다.

제1 영역(31)은 프린팅 플랫폼(1)의 대략 중앙에 위치하고, 제2 영역(33)은 제1 영역(31)의 좌우 양측에 위치한다.

제1 미디어 채널(32)은 제1 영역(31) 및 제2 영역(33)과 경계가 맞닿도록 제1 영역(31)과 제2 영역(33)의 사이에 위치한다. 그리고, 제2 미디어 채널(34)은 제2 영역(33)의 외곽 측에 제2 영역(33)과 경계가 맞닿도록 위치한다. 따라서, 각 제2 영역(33)은 제1 미디어 채널(32)과 제2 미디어 채널(34)의 사이에 위치하게 된다.

도 3에 도시된 바와 같이, 프레임(20)은 제2 영역(33) 및 제2 미디어 채널(34)을 다른 영역과 구획하도록 형성된다.

그리고 제1 영역(31)과 제1 미디어 채널(32)의 프레임(20)은 상호 접하는 경계 부분을 제외한 나머지 부분이 다른 영역과 구획되도록 형성된다.

제1 영역(31)과 제1 미디어 채널(32)이 상호 접하는 경계 부분에서, 프레임(20)은 제1 영역(31)과 제1 미디어 채널(32)이 상호 부분적으로 연결되도록 형성될 수 있다. 즉, 제1 영역(31)과 제1 미디어 채널(32)의 경계에는 프레임(20)이 부분적으로 존재할 수 있다.

본 실시예에서는 3차원 세포 프린팅 방법의 일례로서 제1 영역(31)에서 혈관 네트워크가 유도되는 프린팅 방법에 대해 설명하며, 혈관 네트워크의 일례로서 복수의 직선형 혈관 네트워크를 유도하기 위해 도 3에 도시된 바와 같이, 제1 영역(31)은 평행하게 배열된 좌우 방향으로 길이가 긴 복수의 프레임(23)에 의해 평행한 복수의 직선형 유로와 유사하게 형성된다.

이 때 제1 영역(31)을 구성하는 복수의 직선형 유로의 폭(즉 복수의 프레임(23) 간의 간격)은 0.4mm 내지 0.8mm로 형성되는 것이 바람직하다.

도 4는 도 3의 AA선에 따른 단면을 개략적으로 도시한 도면이다.

도 3 및 도 4에 도시된 바와 같이, 프레임(20) 중 제2 영역(33)과 제2 미디어 채널(34)의 경계(22)는 다른 부분(21, 23)에 비해 낮은 높이로 프린팅된다. 이를 위해 프레임(20)을 프린팅하는 과정에서 제2 영역(33)과 제2 미디어 채널(34)의 경계(22)는 다른 부분(21, 23)에 비해 제1 합성 고분자의 적층 횟수가 적게 제어될 수 있다.

예를 들어, 도 4에 도시된 바와 같이, 제2 영역(33)과 제2 미디어 채널(34)의 경계(22)는 제1 합성 고분자가 1회 적층되도록 하고, 외곽 라인(10)이나 프레임(20)의 다른 부분(21, 23)은 2회 이상 적층되도록 할 수 있다.

이는 제2 미디어 채널(34)에 프린팅 될 미디어와 제2 영역(33)에 프린팅될 제2 바이오 잉크(43) 간에 교류가 가능하게 하기 위함이다.

도 4에는 제2 영역(33)과 제2 미디어 채널(34)의 경계(22)의 단면만을 도시하였으나, 제2 영역(33)과 제1 미디어 채널(32)의 경계 역시 유사한 구조로 형성되어, 제2 영역(33)과 제1 미디어 채널(32)의 경계는 제2 영역(33)과 제2 미디어 채널(34)의 경계(22)와 대략 동일한 높이로 형성될 수 있다.

실시예에 따라, 제1 영역(31)과 제1 미디어 채널(32)의 경계 역시 유사한 구조로 형성되어, 제1 영역(31)과 제1 미디어 채널(32)의 경계는 제2 영역(33)과 제2 미디어 채널(34)의 경계(22)와 대략 동일한 높이로 형성될 수 있다.

도 5는 도 1의 S13 단계를 설명하기 위한 도면이다.

도 5에 도시된 바와 같이, PDMS를 프린팅 하는 단계(S13)에서는 외곽 라인(10)과 프레임(20) 사이의 영역의 기판(S) 상에 PDMS(poly-dimethylsiloxane, 41)를 프린팅한다.

PDMS(41)는 S11 단계 및 S12 단계에서 외곽 라인(10)과 프레임(20)으로 프린팅된 제1 합성 고분자(PCL)을 고정하기 위한 합성 고분자이다. 본 실시예에서는 제1 합성 고분자(PCL)를 고정하기 위한 제2 합성 고분자로서 널리 사용되는 PDMS(41)를 일례로서 사용하였으나, 제1 합성 고분자를 고정할 수 있다면 PDMS(41) 이외에 다른 합성 고분자가 사용될 수도 있다.

제2 합성 고분자(PDMS, 41)는 제1 합성 고분자(PCL)가 충진된 프린터 헤드와는 다른 프린터 헤드에 충진되어 있을 수 있으며, 제2 합성 고분자(PDMS, 41)가 충진된 프린팅 헤드는 외곽 라인(10)과 프레임(20) 사이의 영역 내에서 이동하며 제2 합성 고분자(PDMS, 41)를 압출하여 기판(S) 상에 제2 합성 고분자(PDMS, 41)를 프린팅한다.

도 6은 도 1의 S14 및 S15 단계를 설명하기 위한 도면이다.

도 6에 도시된 바와 같이, 제1 바이오 잉크를 프린팅 하는 단계(S14)에서는 제1 영역(31)에 제1 바이오 잉크(42)를 프린팅하고, 제2 바이오 잉크를 프린팅 하는 단계(S15)에서는 제2 영역(33)에 제2 바이오 잉크(43)를 프린팅한다.

제1 바이오 잉크(42)와 제2 바이오 잉크(43)는 자연 유래 고분자에 세포를 혼합한 것이며, 제1 바이오 잉크(42)와 제2 바이오 잉크(43)는 동일한 자연 유래 고분자에 서로 다른 세포를 혼입한 것이 사용되거나, 서로 다른 자연 유래 고분자에 서로 다른 세포를 혼입한 것이 사용될 수도 있다.

제1 바이오 잉크(42)와 제2 바이오 잉크(43)의 베이스로 사용되는 자연 유래 고분자로는 탈세포화된 세포외 기질 재료이 사용될 수 있다.

본 실시예는 제1 영역(31)에서 혈관 네트워크가 유도되는 프린팅 방법에 대한 것이므로, 탈세포화된 세포외 기질 재료로서 혈관이 존재하는 조직으로부터 유래한 탈세포화된 세포외 기질 재료를 사용한다.

혈관이 존재하는 조직으로부터 유래한 탈세포화된 세포외 기질 재료의 일례로서, 돼지 호흡기 기관의 점막 조직으로부터 분리한 탈세포화된 세포외 기질로 구성된 하이드로젤(dECM 젤)을 사용하였다.

dECM 젤의 제작 방법은 아래와 같다.

돼지 호흡기 기관의 점막 조직을 증류수로 여러 번 헹구어 점액을 제거한다.

이후, 조직 내 세포를 제거하기 위해, sodium dodecyl sulfate (SDS)와 Triton X-100을 세제(detergent)로 사용하였고, 교반 자극을 추가로 수행하였다.

이후, 탈세포화 된 세포 외 기질 내 잔류 DNA 양을 핵 특수 염색 방법인 DAPI 염색으로 확인하였다. 탈세포화 조직의 소독을 위해 0.1 % peracetic acid와 4 % ethanol 의 혼합액에 조직을 담근 후 교반 자극을 추가로 수행하며 4시간 동안 소독하였다.

이후 충분한 세척과정을 통해 잔류하는 세제(detergent)를 모두 제거하였다.

이후, 세포가 제거된 조직을 동결 건조한 후 갈아 고운 파우더로 제작하였다.

일정량의 파우더를 pH 2.5~3 사이의 산성 용액 (acetic acid, HCl 등)에 넣고, 1 mg/ml에 해당하는 소화 효소인 pepsin을 넣어주어 효소 분해시킴으로써 용해시켰다. 이렇게 제작된 약산성을 띄는 dECM 용액을 세포에 사용하기 위해 10 N NaOH 용액을 이용하여 pH 7.4로 중화시킨 후, 37 ℃에서 열을 이용하여 자연 가교시켜 젤화(gelation)하였다.

1 ~ 3% 사이의 dECM 젤에 인간 혈관 내피 세포 (human endothelial cells; hECs)를 5 x 10⁶ cells/ml ~ 1 x 10⁷ cells/ml의 농도로 섞어 제1 바이오 잉크(42)로 사용하였다.

그리고, 1 ~ 3% 사이의 dECM 젤에 혈관 형성 유도를 촉진시키기 위해 사용되는 인간 섬유아세포 (human fibroblasts; hFbs)를 5 x 10⁶ cells/ml ~ 1 x 10⁷ cells/ml의 농도로 섞어 제2 바이오 잉크(43)로 사용하였다.

본 실시예에서는 dECM 젤을 베이스로 제1 바이오 잉크(42)와 제2 바이오 잉크(43)를 제조하는 예에 대해 설명하였으나, 실시예예 따라 dECM 젤 이외에 자연 유래 하이드로젤이 사용될 수 있으며, 자연 유래 하이드로젤의 다른 예로는 피브린 젤(fibrin gel), 콜라겐 젤(collagen gel) 등이 사용될 수 있다.

제1 바이오 잉크(42)와 제2 바이오 잉크(43)는 각각 서로 다른 프린터 헤드에 충진되어 있을 수 있으며, 제1 바이오 잉크(42)가 충진된 프린터 헤드는 제1 영역(31) 내에서 이동하며 제1 바이오 잉크(42)를 압출하여 기판(S) 상에 제1 바이오 잉크(42)를 프린팅하고, 제2 바이오 잉크(43)가 충진된 프린터 헤드는 제2 영역(33) 내에서 이동하며 제2 바이오 잉크(43)를 압출하여 기판(S) 상에 제2 바이오 잉크(43)를 프린팅한다.

도 1에는 S13 단계, S14 단계 및 S15 단계가 순차적으로 진행되는 예를 도시하였으나, S13 단계, S14 단계 및 S15 단계의 선후는 실시예에 따라 바뀔 수 있다.

1차 배양 단계(S16)에서는 제1 및 제2 바이오 잉크의 가교를 위해 1차 배양이 이루어진다. 본 실시예에서는 37 ℃, 5 % CO₂ 조건에서 30분간 배양하며 1차 배양을 수행하였으나, 배양 조건은 실시예에 따라 달라질 수 있다.

도 7은 도 1의 S17 단계를 설명하기 위한 도면이다.

도 7에 도시된 바와 같이, 미디어를 주입하는 단계(S17)에서는 제1 미디어 채널(32) 및 제2 미디어 채널(34)에 미디어(44)를 주입한다.

본 실시예에서는 널리 사용되는 미디어(44) 중 하나인 ECGM-MV를 사용하였으나, 실시예에 따라 다른 미디어가 사용될 수 있다.

미디어(44)는 파이펫(pipette) 등의 도구를 이용해 제1 미디어 채널(32) 및 제2 미디어 채널(34)에 도포될 수 있다.

필요에 따라 미디어(44)는 제1 미디어 채널(32)과 제2 미디어 채널(34)뿐만 아니라, 제1 영역(31)에 프린팅된 제1 바이오 잉크(42)와 제2 영역(33)에 프린팅된 제2 바이오 잉크(43) 위에도 도포될 수 있다.

2차 배양 단계(S18)에서는 제2 합성 고분자(PDMS, 41)의 경화를 위해 37 ℃, 5 % CO₂ 조건에서 16시간 동안 2차 배양을 수행하였으나, 배양 조건은 실시예에 따라 달라질 수 있다.

이후, 7일 간의 배양을 통해 제1 영역(31)의 형상을 따라 완전한 혈관 내피 세포 장벽이 형성된 직선형의 혈관이 형성이 유도된다. 7일 간의 배양 과정에서 미디어(44)는 교체 또는 추가 주입될 수 있다. 미디어(44)가 지속적으로 주입되어야 하는 경우, 미디어(44)는 시린지 펌프 등에 의해 미디어 채널(32, 34)을 통해 지속적으로 흐르며 공급될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 프린팅 플랫폼(1)은 혈관 내피 세포가 포함된 제1 바이오 잉크가(42) 프린팅되는 제1 영역(31)의 양측으로 제1 미디어 채널(32)을 사이에 두고 섬유아세포가 포함된 제2 바이오 잉크(43)가 프린팅되는 제2 영역(33)을 마련하여, 섬유아세포로부터 분비되는 혈관 형성 유도 인자가 미디어(44)를 통해 제1 영역(31) 내에서 생성되는 혈관 네트워크의 생성에 영향을 줄 수 있도록 구성되었다.

또한, 혈관 형성 유도에 강력한 효과를 가지는 조직 유래 세포 외 기질을 베이스로 한 제1 및 제2 바이오 잉크를 사용하여 혈관 형성 유도 기간을 7일로 단축하였다.

또한, 제1 및 제2 바이오 잉크는 프린팅한 구조체의 모양을 유지할 수 있을 정도의 기계적 강도를 가짐과 동시에 자연 조직 내부 환경에 가까운 마이크로 환경을 세포에 제공해 줌으로써 생체 내 (in vivo) 조직과 유사한 반응을 유도할 수 있다

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 프린팅 플랫폼(1)은 미디어 채널(32, 34)을 통해 미디어(44)를 흘려주어 도관형 혈관을 통한 유체(luminal flow)의 흐름에 의한 기계적 신호(mechanical cues)를 모사해 줌으로써 자극에 따른 내피의 기능을 연구할 수도 있다.

도 8 내지 도 11은 본 발명의 다른 실시예에 따른 프린팅 플랫폼을 도시한 도면이다. 설명의 편의를 위하여 전술한 실시예와 유사한 부분은 동일한 도면부호를 사용하고, 전술한 실시예와 공통되는 부분은 그 설명을 생략한다.

도 8에 도시된 바와 같이, 다른 실시예예 따른 프린팅 플랫폼(2)은 전술한 실시예에 따른 프린팅 플랫폼(1)과 비교하여 제1 영역(231)과 프레임(220)의 형상이 상이하다.

본 실시예에 따른 프린팅 플랫폼(2)의 프레임(220)은 제1 미디어 채널(32)과 제1 영역(231)이 상호 접하는 양측 경계를 따라 상호 이격 형성된 복수의 포스트(24)를 포함한다. 따라서, 프레임(220)의 형상이 전술한 프린팅 플랫폼(1)의 프레임(20)과 달라짐에 따라 제1 영역(231)의 형상 역시 전술한 프린팅 플랫폼(1)의 제1 영역(31)과 달라지게 된다.

그 결과, 본 실시예에 따른 프린팅 플랫폼(2)에 의해 생성되는 혈관 네트워크는 제2 바이오 잉크(43)로부터 분비되는 혈관 생성 유도 인자에 의해 형성된 농도 구배를 따라 복수의 포스트(24)의 사이로 연장되며 생성된다.

한편, 도 9에 도시된 바와 같이, 다른 실시예에 따른 프린팅 플랫폼(3) 역시 전술한 실시예에 따른 프린팅 플랫폼(1)과 비교하여 제1 영역(331)과 프레임(320)의 형상이 상이하다.

본 실시예예 따른 프린팅 플랫폼(3)은 제1 영역(331)이 지그재그의 형상이 되도록 프레임(320)이 형성된다.

이를 위해 프레임(320)은 제1 영역(331)의 일측에 위치한 제1 미디어 채널(32)과 제1 영역(331)의 경계에서 상단에 제1 게이트(325)가 형성되도록 구성되고, 제1 영역(331)의 타측에 위치한 제1 미디어 채널(32)과 제1 영역(331)의 경계에서는 하단에 제2 게이트(326)가 형성되도록 구성될 수 있다.

그리고 제1 영역(331)이 제1 게이트(325)부터 제2 게이트(326)까지 지그재그 형상의 하나의 유로로 형성되도록 프레임(320)은 도 9에 도시된 바와 같이 배치되는 복수의 포스트(324)를 포함한다.

그 결과, 본 실시예에 따른 프린팅 플랫폼(3)에 의해 생성되는 혈관 네트워크는 제1 영역(331)의 형상을 따라 복수회 절곡되는 지그재그 형상의 혈관 네트ㄹ워크로 생성된다.

한편, 도 10에 도시된 바와 같이, 다른 실시예에 따른 프린팅 플랫폼(4) 역시 전술한 실시예에 따른 프린팅 플랫폼(1)과 비교하여 제1 영역(431)과 프레임(420)의 형상이 상이하다.

본 실시예에 따른 프린팅 플랫폼(4)은 제1 영역(431)이 복수의 분기 포인트(B)를 갖도록 형성된다.

이를 위해 프레임(420)은 다각형의 포스트(424, 425)들을 포함한다. 도 10에는 제1 영역(431)이 분기 포인트(B)에서 120도 간격으로 3갈래의 분기 라인을 형성하는 예를 도시하여, 다각형의 포스트(424, 425)가 오각 기둥의 포스트(424)와 삼각 기둥의 포스트(425)로 구성되는 예를 도시하였으나, 프레임(420)의 형상 및 구성은 실시예에 따라 달라질 수 있다.

한편, 도 11에 도시된 바와 같이, 다른 실시예에 따른 프린팅 플랫폼(4) 역시 전술한 실시예에 따른 프린팅 플랫폼(1)과 비교하여 제1 영역(531)과 프레임(520)의 형상이 상이하다.

본 실시예에 따른 프린팅 플랫폼(5)은 전술한 프린팅 플랫폼(4)에 비해 제1 영역(531)에서 보다 많은 분기 포인트를 갖도록 형성되어 제1 영역(531)이 대략 그물망 구조를 갖도록 형성된다.

이를 위해 본 실시예에 따른 프린팅 플랫폼(5)의 프레임(520) 역시 다각형의 포스트(524, 525, 525)들을 포함한다. 도 11에는 다각형의 포스트(524, 525, 525)가 오각 기둥의 포스트(524), 삼각 기둥의 포스트(525)와 사각 기둥의 포스트(526)로 구성되는 예를 도시하였으나, 프레임(520)의 형상 및 구성은 실시예에 따라 달라질 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 3차원 세포 프린팅 방법 및 프린팅 플랫폼은 프레임(20, 220, 320, 420, 320)의 형상에 따라 제1 영역(31, 231, 331, 431, 531)의 형상을 다양하게 디자인 할 수 있다. 따라서, 사용자가 원하는 디자인의 혈관 네트워크를 제작하는 것이 가능하다.

설명과 이해의 편의를 위해 혈관 네트워크를 제작하는 방법을 기준으로 본 발명에 따른 3차원 세포 프린팅 방법과 프린팅 플랫폼을 설명하였으나, 본 발명은 혈관 네트워크를 제작하는 것에 한정되지 않는다.

제1 바이오 잉크와 제2 바이오 잉크의 베이스 재료 또는 베이스 재료에 혼합되는 세포의 선택에 따라 혈관 네트워크 이외에 다른 조직이나 장기의 제작이 가능한다.

본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

1, 2, 3, 4, 5: 프린팅 플랫폼 10: 외곽 라인
20, 220, 320, 420, 520: 프레임 24: 포스트
31, 231, 331, 431, 531: 제1 영역 32: 제1 미디어 채널
33: 제2 영역 34: 제2 미디어 채널
41: PDMS 42: 제1 바이오 잉크
43: 제2 바이오 잉크 44: 미디어
325: 제1 게이트 326: 제2 게이트
B: 분기 포인트 S: 기판

Claims

3차원 프린터를 이용해, 기판 상에 인간 혈관 내피 세포(human endothelial cells; hECs)가 포함된 제1 바이오 잉크가 프린팅될 제1 영역과, 인간 섬유아세포 (human fibroblasts; hFbs)가 포함된 제2 바이오 잉크가 프린팅될 제2 영역 및 상기 제1 영역과 상기 제2 영역의 사이에 위치하는 미디어 채널의 프레임을 프린팅 하는 단계;
상기 제1 영역 내에 상기 제1 바이오 잉크를 프린팅 하는 단계;
상기 제2 영역 내에 상기 제2 바이오 잉크를 프린팅 하는 단계 및
상기 미디어 채널 내에 미디어를 주입하는 단계를 포함하는, 3차원 세포 프린팅 방법.
제1항에 있어서,
상기 프레임 중 상기 제1 영역과 상기 미디어 채널의 경계 및 상기 제2 영역과 상기 미디어 채널의 경계 중 적어도 하나는 상기 프레임의 다른 부분에 비해 낮은 높이로 프린팅되는, 3차원 세포 프린팅 방법.
제2항에 있어서,
상기 프레임 중 상기 제1 영역과 상기 미디어 채널의 경계 및 상기 제2 영역과 상기 미디어 채널의 경계는 상기 프레임의 다른 부분에 비해 상기 프레임을 형성하는 재료의 적층 횟수가 적은, 3차원 세포 프린팅 방법.
제1항에 있어서,
상기 프레임은,
상기 제1 영역과 상기 미디어 채널이 상호 부분적으로 연결되도록, 상기 제1 영역과 상기 미디어 채널의 경계에 상호 이격 형성된 복수의 포스트를 포함하는, 3차원 세포 프린팅 방법.
제4항에 있어서,
상기 제2 바이오 잉크에 포함된 상기 인간 섬유아세포로부터 분비되는 혈관 형성 유도 인자가 상기 제1 바이오 잉크에 영향을 주어 상기 제1 영역 내에서 혈관 네트워크가 생성되며, 상기 혈관 네트워크는 상기 복수의 포스트의 사이로 연장되는, 3차원 세포 프린팅 방법.
제1항에 있어서,
상기 프레임은 합성 고분자로 형성되는, 3차원 세포 프린팅 방법.
제1항에 있어서,
상기 프레임을 둘러싸며 프린팅 플랫폼의 경계를 형성하는 외곽 라인을 프린팅하는 단계를 더 포함하는, 3차원 세포 프린팅 방법.
제7항에 있어서,
상기 외곽 라인과 상기 프레임 사이의 영역에 상기 외곽 라인 및 상기 프레임을 고정하기 위한 합성 고분자를 프린팅하는 단계를 더 포함하는, 3차원 세포 프린팅 방법.
제1항에 있어서,
상기 제1 바이오 잉크는 혈관이 존재하는 조직으로부터 분리한 탈세포화된 세포외 기질에 상기 인간 혈관 내피 세포를 혼합하여 제조되는, 3차원 세포 프린팅 방법.
제1항에 있어서,
상기 제2 바이오 잉크는 혈관이 존재하는 조직으로부터 분리한 탈세포화된 세포외 기질에 상기 인간 섬유아세포를 혼합하여 제조되는, 3차원 세포 프린팅 방법.
3차원 프린터를 이용해, 기판 상에 제1 바이오 잉크가 프린팅될 제1 영역, 제2 바이오 잉크가 프린팅될 제2 영역 및 상기 제1 영역과 상기 제2 영역의 사이에 위치하는 미디어 채널의 프레임을 프린팅 하는 단계;
상기 제1 영역 내에 상기 제1 바이오 잉크를 프린팅 하는 단계;
상기 제2 영역 내에 상기 제2 바이오 잉크를 프린팅 하는 단계 및
상기 미디어 채널 내에 미디어를 주입하는 단계를 포함하는, 3차원 세포 프린팅 방법.
제11항에 있어서,
상기 프레임을 프린팅하는 단계에서, 상기 제1 영역과 상기 미디어 채널의 경계 및 상기 제2 영역과 상기 미디어 채널의 경계 중 적어도 하는 다른 부분에 비해 낮은 높이로 프린팅되는, 3차원 세포 프린팅 방법.
제12항에 있어서,
상기 프레임 중 상기 제1 영역과 상기 미디어 채널의 경계 및 상기 제2 영역과 상기 미디어 채널의 경계는 상기 프레임의 다른 부분에 비해 상기 프레임을 형성하는 재료의 적층 횟수가 적은, 3차원 세포 프린팅 방법.
제11항에 있어서,
상기 프레임은,
상기 제1 영역과 상기 미디어 채널이 상호 부분적으로 연결되도록, 상기 제1 영역과 상기 미디어 채널의 경계에 상호 이격 형성된 복수의 포스트를 포함하는, 3차원 세포 프린팅 방법.
제11항에 있어서,
상기 프레임은 합성 고분자로 형성되는, 3차원 세포 프린팅 방법.
제11항에 있어서,
상기 프레임을 둘러싸며 프린팅 플랫폼의 경계를 형성하는 외곽 라인을 프린팅하는 단계를 더 포함하는, 3차원 세포 프린팅 방법.
제16항에 있어서,
상기 외곽 라인과 상기 프레임 사이의 영역에 상기 외곽 라인 및 상기 프레임을 고정하기 위한 합성 고분자를 프린팅하는 단계를 더 포함하는, 3차원 세포 프린팅 방법.
제11항에 있어서,
상기 제1 바이오 잉크와 상기 제2 바이오 잉크는 탈세포화된 세포외 기질에 서로 다른 세포를 혼합한 것인, 3차원 세포 프린팅 방법.
제18항에 있어서,
상기 탈세포화된 세포 외 기질은 혈관이 존재하는 조직으로부터 분리한 탈세포화된 세포외 기질을 포함하며,
상기 제1 바이오 잉크는 상기 탈세포화된 세포외 기질에 인간 혈관 내피 세포(human endothelial cells; hECs)를 혼합하여 제조되고,
상기 제2 바이오 잉크는 상기 탈세포화된 세포외 기질에 인간 섬유아세포 (human fibroblasts; hFbs)를 혼합하여 제조되는, 3차원 세포 프린팅 방법.