WO2017073910A1 - 전자기가 유도된 금속 나노입자를 이용한 신경세포로의 직접교차분화 리프로그래밍 방법 - Google Patents

전자기가 유도된 금속 나노입자를 이용한 신경세포로의 직접교차분화 리프로그래밍 방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2017073910A1
WO2017073910A1 PCT/KR2016/010537 KR2016010537W WO2017073910A1 WO 2017073910 A1 WO2017073910 A1 WO 2017073910A1 KR 2016010537 W KR2016010537 W KR 2016010537W WO 2017073910 A1 WO2017073910 A1 WO 2017073910A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
neurons
differentiation
electromagnetic field
disease
direct cross
Prior art date
Application number
PCT/KR2016/010537
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김종필
유준상
Original Assignee
동국대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 동국대학교 산학협력단 filed Critical 동국대학교 산학협력단
Priority to US15/770,550 priority Critical patent/US11118161B2/en
Publication of WO2017073910A1 publication Critical patent/WO2017073910A1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1307—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from adult fibroblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2529/00—Culture process characterised by the use of electromagnetic stimulation

Definitions

  • the present invention relates to a direct cross-differentiation reprogramming method to various neurons using electromagnetically induced metal nanoparticles, and to a cell therapeutic agent for treating cranial nerve disease, including various neurons differentiated by the method.
  • cerebral neurological diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, cerebral infarction, cerebral hemorrhage, and spinal cord injury
  • new therapeutic candidates have been introduced through the regeneration of nerve cells, and such solutions include embryonic stem cells and pluripotent stem cells.
  • Various methods for treating cerebral neurological diseases have emerged by making and administering patient-specific therapeutic cells.
  • these undifferentiated pluripotent stem cells are transplanted, there is a risk of causing cancer, so there is a limit to use as a therapeutic agent.
  • the present invention has been made to solve the above problems, the present inventors using a metal nanoparticles electromagnetically induced into the electromagnetic field in or outside the body Direct cross-differentiation into neurons can not only significantly improve the efficiency of reprogramming, but also to confirm the natural differentiation into neurons and specific neuronal protective effects through them, and to complete the present invention.
  • an object of the present invention is to provide a direct cross-differentiation method from adult cells to neurons, comprising applying an electromagnetic field to metal nanoparticles in contact with adult cells into which transcription factors have been introduced.
  • Another object of the present invention is to provide a method for spontaneous differentiation into nerve cells, comprising applying an electromagnetic field to metal nanoparticles in contact with neural stem cells or neural progenitor cells.
  • Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for treating cranial nerve disease, comprising neurons differentiated by the above method.
  • Another object of the present invention is to provide a cell therapy agent for treating cranial nerve disease, including neurons differentiated by the above method.
  • the present invention comprises a method of direct cross-differentiation from adult cells to neurons, comprising applying an electromagnetic field to the metal nanoparticles in contact with the adult cells introduced transcription factors. to provide.
  • the metal nanoparticles may be any one selected from the group consisting of gold nanoparticles, silver nanoparticles, and magnetic nanoparticles.
  • the adult cells may be all somatic cells except fibroblasts and other neurons.
  • the electromagnetic field is It can be applied in an intensity of 5 Gauss to 100 Gauss.
  • the electromagnetic field may be applied at a frequency of 10Hz to 500Hz.
  • the cells differentiated by the above method may be all kinds of neurons, such as dopamine neurons, Gava neurons, and glutam neurons.
  • the present invention also provides a method for spontaneous differentiation into neurons, comprising applying an electromagnetic field to metal nanoparticles in contact with neural stem cells or neural progenitor cells.
  • the present invention provides a method for treating a neurological disorder, comprising administering the cell therapy agent to a subject.
  • the present invention also provides a use for the preparation of a therapeutic agent for cerebral nerve disease of neurons differentiated by the above method.
  • the reprogramming method is to induce reprogramming into neurons using electromagnetic-induced metal nanoparticles.
  • Reprogramming efficiency can be remarkably improved, and when this technique is applied to the brain in vivo, it was confirmed that nerve regeneration can effectively alleviate the symptoms of neurological diseases such as Alzheimer's, Parkinson's disease, stroke and hemorrhage. Bar is expected to be useful as a technique for the treatment of cranial nerve disease.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing a method of directly cross-differentiating reprogramming into neurons by using the electromagnetic nano-induced metal nanoparticles (gold nanoparticles, silver nanoparticles, magnetic nanoparticles) of the present invention.
  • Figure 2a is a result of confirming the change in expression of the nerve marker genes TH, and Tuj1 according to various intensities (10G, 20G, and 30G) of the electromagnetic field through immunostaining and fluorescence microscopy.
  • FIG. 2B is a result of comparing the expression levels of Tuj1, MAP1, Gad67, and Synnapsin, which are neural marker genes according to various intensities (10G, 20G, and 30G) of electromagnetic fields, by RT-PCR.
  • 3 is a result of comparing the change in the number of TH + neurons according to the change in intensity (10G, 20G, 30G, 50G, 100G) and wavelength (50Hz, 150Hz, and 250Hz) of the electromagnetic field.
  • Figure 4b is a result of confirming the change of AADC through the RT-PCR when using the electromagnetic nano-induced magnetic nanoparticles.
  • FIG. 5 is a diagram schematically showing a direct cross-differentiation reprogramming method to neurons of the present invention in an in vivo animal model.
  • FIG. 6 shows the results obtained by immunostaining and fluorescence microscopy when the transcription factor and gold nanoparticles are injected into the mouse brain and an electromagnetic field is applied to the animal.
  • FIG 8a in the animal model treated with a neuron destroying substance MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine), the transcription factor and gold nanoparticles are treated in the brain of the mouse and the electromagnetic field In this case, the change of Tuj1 and Map2, which are nerve marker genes, was stained using immunostaining, and then confirmed by fluorescence microscopy.
  • MPTP neuron destroying substance
  • FIG. 8B shows the results of quantifying changes in Tuj1, a nerve marker gene, in an animal model treated with MPTP, a neuronal cell destroying substance, when a transcription factor and gold nanoparticles are treated in a mouse brain and an electromagnetic field is applied.
  • FIG. 9 shows that in the MPTP-induced cerebral neurological disease mouse animal model, when the transcription factor and gold nanoparticles are injected into the brain of the mouse and an external electromagnetic field is applied, bending, bending, and tape self-renewal effects of the mouse This is the result of the check.
  • FIG. 10 is a result of confirming the neural nerve recovery effect of the mouse through bending, bending, and tape self-release when a transcription factor and gold nanoparticles are injected into the brain of a mouse and an electromagnetic field is applied from the outside in a stroke animal model.
  • FIG. 11C illustrates the expression level of neuronal marker genes Map2, Tuj1, Vmat2, Nestin, TH, DAT, and Pitx3 when inducing spontaneous differentiation from embryonic stem cells to neurons using electromagnetically induced gold nanoparticles. The change was analyzed by RT-PCR and confirmed in heat map form.
  • the present invention not only provides a direct cross-differentiation method from adult cells to neurons but also neural stem cells or neural progenitor cells, comprising applying an electromagnetic field to metal nanoparticles in contact with adult cells into which transcription factors have been introduced. It provides a method for spontaneous differentiation into nerve cells, comprising applying an electromagnetic field to the metal nanoparticles in contact with.
  • adult cell refers to a cell that has undergone differentiation, a cell that completely or completely loses its multipotency, which refers to its ability to differentiate into various cell types, and is known to have fibroblasts and other It can be any somatic cell except nerve cells.
  • the term “nerve stem cell” refers to a multipotent stem cell capable of differentiating into neurons such as neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. ), Preferably embryonic stem cells or dedifferentiated stem cells, but is not limited thereto.
  • neuroneuronal cell refers to dopamine neurons, Gava neurons, glutamic neurons, spinal nerve cells, and all kinds of neurons, which are located in the brain and spinal cord Make up the nervous system. These neurons play a role in regulating all kinds of brain functions such as memory, thinking, postural reflexes, exercise, and reward-related behavior in vivo, and play an important role in the treatment of brain neurological diseases.
  • direct lineage reprogramming, direct conversion, trans differentiation used in the present invention is a technique for inducing the conversion between adult cells having a completely different cell type, without the step of preparing induced pluripotent stem cells It differs from the prior art in that it induces the conversion to the cells of interest.
  • Direct cross-differentiation technology is currently recognized for its application in the fields of disease modeling, drug discovery, gene therapy, and regenerative medicine, and research on the treatment of brain neurological diseases using it is being actively conducted. I am having a hard time applying it.
  • the application of cross-differentiation in vivo through direct cross-differentiation reprogramming has significant clinical significance, but there is a problem in commercialization due to the absence of an appropriate induction method.
  • the present invention is to improve the efficiency of direct cross-differentiation from adult cells to neurons and spontaneous differentiation into neurons by using electromagnetic nano-induced metal nanoparticles, in vivo and outside.
  • transcription factors are introduced on metal nanoparticles. After placing the adult cells, an electromagnetic field was applied to induce electromagnetic radiation to the metal nanoparticles. After injecting metal nanoparticles and related transcription factors into the brain, we applied an electromagnetic field directly to the animal.
  • the electromagnetic nano-induced metal nanoparticles promote direct cross-differentiation from adult cells to neurons, preferably gold, silver, or magnetic nanoparticles, but is not limited thereto.
  • the electromagnetic field may be applied at an intensity of 5 Gauss to 50 Gauss and / or a frequency of 10 Hz to 500 Hz, but is not limited thereto.
  • the direct cross-differentiation efficiency into neurons by controlling the intensity and wavelength of the electromagnetic field applied to the metal nanoparticles, it is possible to improve the direct cross-differentiation efficiency into neurons, and when using silver or magnetic nanoparticles as well as gold nanoparticles It was confirmed that excellent effects can be obtained even (see Examples 1 to 2).
  • the direct cross-differentiation efficiency to neurons was improved as described above, and it was confirmed that the symptoms related to neurological diseases were significantly alleviated (see Examples 3 to 4). Through the natural differentiation efficiency to neurons is also enhanced through experimentally confirmed that the neurons can be usefully used to treat neurological diseases (see Examples 5 to 6).
  • treatment refers to any action that improves or advantageously alters the symptoms for cranial nerve disease by administration of a cell therapeutic agent according to the invention.
  • the "cell therapeutic agent” is a cell and tissue prepared by isolation, culture and special chewing from humans, and is used as a medicine for the purpose of treatment, diagnosis and prevention.
  • a medicament used for the purpose of treatment, diagnosis, and prevention through a series of actions such as proliferating, selecting, or otherwise altering the biological properties of a cell, allogeneic, or heterologous cells in vitro.
  • a method for the treatment of cerebral nerve disease comprising administering the cell therapy agent to an individual.
  • “individual” means a subject in need of treatment of a disease, and more specifically, human or non-human primates, mice, rats, dogs, cats, horses and cattle, etc. Means mammals.
  • the present invention is a technique for inducing direct lineage reprogramming from adult cells to neurons using metal nanoparticles induced electromagnetic with electromagnetic field, as an example, as shown in FIG.
  • the platelets coated with gold nanoparticles, which are electromagnetically induced, were used to directly cross-differentiate the fibroblasts pretreated with transcription factors into neurons. More specifically, in the present embodiment, the direct cross-differentiation activity change to the neurons according to the intensity and wavelength of the external electromagnetic field was to be confirmed.
  • the nerve marker gene TH Tyrosine hydroxylase
  • Tuj1 Class III ⁇ -tubulin
  • Tuj1, MAP1 Microtubule associated protein 2
  • Gad67 Glutamic acid decarboxylase 67
  • Synnapsin expression levels were compared quantitatively by RT-PCR (Realtime PCR).
  • the control group was used a group that does not apply the electromagnetic field.
  • Example 1 direct cross-differentiation into neurons was induced by using gold nanoparticles and electromagnetic fields among metal nanoparticles, whereas in the present embodiment, direct cross-differentiation efficiency into neurons even when various metal nanoparticles were used.
  • silver nanoparticles and magnetic nanoparticles were used among the metal nanoparticles, and quantitative change of AADC (Aromatic amino acid decarboxylase), which is a neuronal gene marker by electromagnetic-induced silver or magnetic nanoparticles, was quantitatively determined through RT-PCR. Compared to.
  • an animal model was used to confirm the direct cross-differentiation induction effect to the neuron of the present invention in vivo.
  • transcription factors Ascl1, Nurr1, Pitx3, and Lmx1 and gold nanoparticles were injected into the brain of the mouse and the electromagnetic field was applied, and at this time, changes in the neuronal marker genes TH and Tuj1 It was confirmed by immunostaining and fluorescence microscopy.
  • As a control group a group administered with a transcription factor and gold nanoparticles and without applying an electromagnetic field (Auptl) was used.
  • Parkinson's disease-inducing drug 6OHDA (6-hydroxydopamine) was injected into the brain of mice to necrosis dopamine neurons. Then, when the conductive nanomaterials such as gold nanoparticles or silver nanoparticles are treated in the brain of the mouse and an electromagnetic field is applied, the protective effect of the neurons was confirmed through the change in the rotational speed of the mouse. As a control, a group in which no metal nanoparticles and an electromagnetic field were treated was used.
  • the rotational speed of the mouse was increased by 6OHDA injection, whereas the mouse was infused with a transcription factor and gold nanoparticles (see FIG. 7A) or silver nanoparticles (see FIG. 7B) and the electromagnetic field was injected.
  • a transcription factor and gold nanoparticles see FIG. 7A
  • silver nanoparticles see FIG. 7B
  • the electromagnetic field was injected.
  • direct cross-differentiation into neurons was induced, resulting in a significant reduction in the number of rotations of mice by external drugs.
  • metal nanoparticles such as gold nanoparticles or silver nanoparticles induce the treatment of Parkinson's disease, and it was confirmed that the rotational behavior of the mouse due to damage to dopamine neurons is significantly alleviated.
  • nerve cells were artificially destroyed by treating MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine), a nerve cell destruction substance. Subsequently, when the transcription factor and gold nanoparticles were treated in the brain of the mouse and an electromagnetic field was applied, the protective effect of neurons was confirmed through immunostaining.
  • an animal model of neuropathic mouse induced by MPTP was prepared, and changes in mouse behavior according to transcription factor, gold nanoparticles, and electromagnetic field treatment were observed through a cylindrical test, a suspension test, or a movement test.
  • a group Cont, No AuEMF
  • Tuj1 and Map2 which are nerve index genes, were significantly reduced by MPTP treatment, when the transcription factor and gold nanoparticles were injected into the mouse and an electromagnetic field was applied, the nerves were detected. Since the index genes Tuj1 and Map2 were hardly reduced, significant neuroprotective effects were confirmed.
  • the abnormal behavior of the rat was increased by the stroke, whereas when the transcription factor and the metal nanoparticle were injected into the mouse and the electromagnetic field was applied, direct cross-differentiation into the neurons was induced. As a result, the abnormal behavior of the mice was reduced.
  • Examples 1 to 4 direct cross-differentiation reprogramming from fibroblasts, which are adult cells, to neurons was induced using metal nanoparticles magnetized by an electromagnetic field, whereas in the present embodiment, embryonic stems were used according to the present invention.
  • the purpose of this study was to determine whether the efficiency of inducing spontaneous differentiation from cells to neurons can be enhanced. More specifically, after the treatment of gold nanoparticles to embryonic stem cells, when the electromagnetic field is applied, the natural differentiation into neurons was confirmed by immunostaining method, the nerve marker genes Map2, Tuj1, Vmat2, Nestin, TH, Changes in the expression levels of DAT and Pitx3 were confirmed by RT-PCR.
  • a group in which no metal nanoparticles and an electromagnetic field were treated was used as a control.
  • the reprogramming method is to induce reprogramming into neurons using electromagnetic-induced metal nanoparticles.
  • Reprogramming efficiency can be remarkably improved, and when this technique is applied to the brain in vivo, it was confirmed that nerve regeneration can effectively alleviate the symptoms of neurological diseases such as Alzheimer's, Parkinson's disease, stroke and hemorrhage. Bar is expected to be useful as a technique for the treatment of cranial nerve disease.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 전자기장으로부터 자기화된 금속 나노입자를 이용한 신경세포로의 직접교차분화방법 및 상기 방법에 의해 분화된 신경세포를 포함하는, 뇌신경 질환 치료용 세포치료제에 관한 것이다. 본 발명에서, 상기 방법을 통하여 신경세포로의 직접교차분화 효율을 현저하게 향상시킬 수 있으며, 뇌졸중 등 뇌신경 질환의 증상을 효과적으로 완화시킬 수 있음을 구체적으로 확인하였는바, 퇴행성 뇌신경 질환 치료에 있어서, 보다 근본적으로 접근하여 타겟 치료를 할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

전자기가 유도된 금속 나노입자를 이용한 신경세포로의 직접교차분화 리프로그래밍 방법
본 발명은 전자기가 유도된 금속 나노입자를 이용한 다양한 신경세포로의 직접교차분화 리프로그래밍 방법 및 상기 방법에 의해 분화된 다양한 신경세포를 포함하는, 뇌신경 질환 치료용 세포치료제에 관한 것이다.
알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌경색, 뇌출혈, 척수손상 등의 뇌신경 질환 치료에 있어서, 신경세포의 재생을 통한 새로운 치료 후보물질이 다양하게 등장되어 왔으며, 이러한 해결책으로는 배아줄기세포 및 만능성 줄기세포 등을 이용하여 환자 특이적 치료용 세포를 만들어 투여함으로써 뇌신경 질환을 치료하는 여러가지 방법이 대두되어 왔다. 그러나 이러한 미분화된 만능성 줄기세포가 이식될 경우, 암을 유발할 위험성이 존재하므로 치료제로 활용함에는 한계가 존재한다.
상기의 문제점을 해소하기 위한 방안 중 하나로서, 만능성 줄기세포 단계를 거치지 않고 바로 목적하는 세포로의 전환을 유도하는 직접교차분화 리프로래밍 기술이 주목받고 있다. 본 기술을 적용한다면, 생체 내외에서, 직접 세포의 운명을 바꾸어 신경세포를 제작함으로써, 뇌신경 질환 치료에 효과적으로 이용될 것이 예상되나, 이 역시, 신경세포로의 직접교차분화 효율이 높지 않아 실질적인 임상에 적용함은 무리가 있는 실정이다. 이에 신경세포로의 직접교차분화 효율을 높이기 위한 시도가 이루어지고 있으나 (한국 특허공개번호 10-2015-0015294), 실제 세포 치료용으로 생체 내에서도 효율적으로 이용될 수 있는 직접교차분화리프로그래밍을 유도할 수 있는 기술은 아직은 미비한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 전자기장으로 전자기가 유도된 금속 나노입자를 이용하여 생체 내외에서 신경세포로의 직접교차분화 리프로그래밍 효율을 현저히 증진시킬 수 있을 뿐만 아니라, 신경세포로의 자연 분화 및 이를 통한 특이적 신경세포 보호 효과를 확인하고 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명의 목적은 전사인자가 도입된 성체세포와 접촉시킨 금속 나노입자에 전자기장을 인가하는 단계를 포함하는, 성체세포에서 신경세포로의 직접교차분화방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 신경줄기세포 또는 신경 전구세포와 접촉시킨 금속 나노입자에 전자기장을 인가하는 단계를 포함하는, 신경세포로의 자연분화방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 분화된 신경세포를 포함하는, 뇌신경 질환 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 분화된 신경세포를 포함하는, 뇌신경 질환 치료용 세포치료제를 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 전사인자가 도입된 성체세포와 접촉시킨 금속 나노입자에 전자기장을 인가하는 단계를 포함하는, 성체세포에서 신경세포로의 직접교차분화방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 전사인자는 Ascl1, Nurr1, Pitx3, 및 Lmx1로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 금속 나노입자는 금 나노입자, 은 나노입자, 및 자성 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 성체세포는 섬유아세포 및 기타 신경세포를 제외한 모든 체세포일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 전자기장은 5 Gauss 내지 100 Gauss의 강도로 인가될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 전자기장은 10Hz 내지 500Hz의 주파수로 인가될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 방법으로 분화된 세포는 도파민 신경 및 가바 신경, 글루탐 신경 등 모든 종류의 신경세포일 수 있다.
또한, 본 발명은 신경줄기세포 또는 신경전구세포와 접촉시킨 금속 나노입자에 전자기장을 인가하는 단계를 포함하는, 신경세포로의 자연분화방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 분화된 신경세포를 포함하는, 뇌신경 질환 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 분화된 신경세포를 포함하는, 뇌신경 질환 세포치료제를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 뇌신경 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌경색, 뇌출혈 및 뇌졸중으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 세포치료제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌신경 질환의 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 분화된 신경세포의 뇌신경 질환 치료제 제조 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 신경세포로의 직접교차분화 리프로그래밍 방법은 전자기가 유도된 금속 나노입자를 이용하여 신경세포로의 리프로그래밍을 유도하는 것으로서, 본 발명에서, 상기 방법을 통하여 생체 내외에서 신경세포로의 직접교차분화 리프로그래밍 효율을 현저하게 향상시킬 수 있으며, 이러한 기술을 생체 내의 뇌에 적용하였을때, 신경 재생을 통하여 알츠하이머, 파킨슨병, 뇌졸중, 뇌출혈 등 뇌신경 질환의 증상을 효과적으로 완화시킬 수 있음을 구체적으로 확인하였는바, 뇌신경 질환 치료를 위한 기술로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
또한, 분화된 신경세포를 활용하여 다양한 뇌신경 질환 치료용 세포치료 기술을 확립하였으며, 이러한 기술은 물리적인 전자기장을 이용하여, 비침습적으로 직접교차 리프로그래밍을 유도하므로, 안전하고 부작용이 적으면서도 효율적인 신경치료를 유도할 수 있다. 아울러, 신경치료가 완료되었을 때에도, 단순히 전자기장 처리를 제거하여 신경 재생 효과를 치료 정도에 따라 조절할 수 있다는 장점이 있다.
도 1은, 본 발명의 전자기가 유도된 금속 나노입자(금 나노입자, 은 나노입자, 자성 나노입자)를 활용하여 신경세포로의 직접교차분화 리프로그래밍하는 방법을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2a는, 전자기장의 다양한 강도 (10G, 20G, 및 30G)에 따른 신경 지표 유전자인 TH, 및 Tuj1의 발현 변화를 면역 염색 및 형광 현미경을 통하여 확인한 결과이다.
도 2b는, 전자기장의 다양한 강도 (10G, 20G, 및 30G)에 따른 신경 지표 유전자인 Tuj1, MAP1, Gad67, Synnapsin의 발현 정도를 RT-PCR을 통하여 비교한 결과이다.
도 3은, 전자기장의 강도 (10G, 20G, 30G, 50G, 100G) 및 파장 (50Hz, 150Hz, 및 250Hz) 변화에 따른 TH+ 신경세포 수의 변화를 비교한 결과이다.
도 4a는, 전자기가 유도된 은 나노입자를 이용한 경우, 신경 지표 유전자 AADC의 변화를 RT-PCR을 통하여 확인한 결과이다.
도 4b는, 전자기가 유도된 마그네틱 나노입자를 이용한 경우, AADC의 변화를 RT-PCR을 통하여 확인한 결과이다.
도 5는, 생체 내 동물모델에서, 본 발명의 신경세포로의 직접교차분화리프로그래밍 방법을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 6은, 동물모델에서, 전사인자 및 금 나노 입자를 마우스의 뇌에 주입하고 전자기장을 동물에 인가한 경우, 신경 지표 유전자인 TH 및 Tuj1의 변화를 면역 염색 및 형광 현미경을 통하여 확인한 결과이다.
도 7a는, 파킨슨병 유발 약물인 6OHDA를 주입한 동물모델에서, 전사인자 및 금 나노입자를 마우스의 뇌에 주입하고 외부에서 전자기장을 인가한 경우, 마우스의 뇌신경 회복효과를 회전수 변화를 통해 확인한 결과이다.
도 7b는, 파킨슨병 유발 약물인 6OHDA를 주입한 동물모델에서, 전사인자 및 은 나노입자를 마우스의 뇌에 주입하고, 외부에서 전자기장을 인가한 경우, 마우스의 뇌신경 회복효과를 회전수 변화를 통해 확인한 결과이다.
도 8a는, 신경세포 파괴 물질인 MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine)를 처리한 동물모델에서, 전사인자 및 금 나노입자를 마우스의 뇌에 처리하고 전자기장을 인가한 경우, 신경 지표 유전자인 Tuj1 및 Map2의 변화를 면역 염색법을 이용하여 염색한 후, 형광 현미경을 통하여 확인한 결과이다.
도 8b는, 신경세포 파괴 물질인 MPTP를 처리한 동물모델에서, 전사인자 및 금 나노입자를 마우스의 뇌에 처리하고 전자기장을 인가한 경우, 신경 지표 유전자인 Tuj1의 변화를 정량화하여 확인한 결과이다.
도 8c는, 신경세포 파괴 물질인 MPTP를 처리한 동물모델에서, 전사인자 및 금 나노입자를 마우스의 뇌에 처리하고 전자기장을 인가한 경우, 신경 지표 유전자인 Map2의 변화를 정량화하여 확인한 결과이다.
도 9는, MPTP에 의해 유도된 뇌신경 질환 마우스 동물모델에서, 전사인자 및 금 나노입자를 마우스의 뇌에 주입하고 외부에서 전자기장을 인가한 경우, 마우스의 뇌신경 회복효과를 구부림, 굽힘, 및 테이프 자가 떼기를 통해 확인한 결과이다.
도 10은, 뇌졸중 동물모델에서, 전사인자 및 금 나노입자를 마우스의 뇌에 주입하고 외부에서 전자기장을 인가한 경우, 마우스의 뇌신경 회복효과를 구부림, 굽힘, 및 테이프 자가 떼기를 통해 확인한 결과이다.
도 11a는, 전자기가 유도된 금 나노입자를 이용하여 배아줄기세포에서 신경세포로의 자연분화를 유도한 경우, 분화된 신경세포 수의 변화를 면역염색법을 이용하여 염색한 후, 형광현미경을 통하여 확인한 결과이다.
도 11b는, 전자기가 유도된 금 나노입자를 이용하여 배아줄기세포에서 신경세포로의 자연분화를 유도한 경우, Map2+ 신경세포 수의 변화를 정량화하여 확인한 결과이다.
도 11c는, 전자기가 유도된 금 나노입자를 이용하여 배아줄기세포에서 신경세포로의 자연분화를 유도한 경우, 신경 지표 유전자인 Map2, Tuj1, Vmat2, Nestin, TH, DAT, 및 Pitx3의 발현량 변화를 RT-PCR을 통하여 분석하여 열지도 형태로 확인한 결과이다.
도 12는, MPTP에 의해 유도된 뇌신경 질환 마우스 동물모델에서, 본 발명의 방법을 통해 배아줄기세포로부터 자연분화된 신경세포를 이식한 경우, 마우스의 뇌신경 회복효과를 원통테스트와 움직임 테스트를 통해 확인한 결과이다.
본 발명자들은, 전자기가 유도된 금속 나노입자를 이용하여 다양한 신경세포로의 직접교차분화 리프로그래밍 (Direct lineage reprogramming) 효율을 현저하게 증진시킬 수 있으며, 이 과정에서 인가되는 전자기장을 조절함으로써 직접교차분화 효율을 자유롭게 조절할 수 있음을 확인하였다. 또한, 이러한 방법을 생체 내에 적용하여, 퇴행성 뇌질환 동물 모델을 이용한 실험에서도 신경세포로의 직접교차분화의 현저한 효율 증진 및 증상의 완화 효과를 구체적으로 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 전사인자가 도입된 성체세포와 접촉시킨 금속 나노입자에 전자기장을 인가하는 단계를 포함하는, 성체세포에서 신경세포로의 직접교차분화방법을 제공할 뿐만 아니라, 신경 줄기세포 또는 신경전구세포와 접촉시킨 금속 나노입자에 전자기장을 인가하는 단계를 포함하는, 신경세포로의 자연분화방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "성체세포"는 분화가 일어난 세포로서, 여러 종류의 세포로 분화할 수 있는 능력을 말하는 다분화능을 완전히 소실하거나 대부분 소실한 상태의 세포를 의미하며, 섬유아세포 및 기타 신경세포를 제외한 모든 체세포일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “신경줄기세포”는 뉴런(Neuron), 별 아교세포(Astrocyte), 희소돌기신경세포 (oligodendrocyte) 등의 신경세포로 분화될 수 있는 다분화능을 가지는 줄기세포 (multipotent stem cell)로서, 바람직하게는 배아줄기세포 또는 역분화 줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 성체세포의 전처리 과정은, 기존에 알려진 신경 유도 전자인자의 도입 및 신경유도 물질을 처리하는 것을 의미한다. 또한, 전사인자의 도입은 바이러스를 이용한 방법 등 당업계에 널리 알려진 방법을 통해서 이루어질 수 있으며, 바람직하게 Ascl1, Nurr1, Pitx3, 및 Lmx1로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 도입할 수 있으나, 신경세포로의 직접교차분화를 위한 전사인자라면, 제한없이 포함될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "신경세포"는 도파민 신경세포, 가바 신경세포, 글루탐 신경세포, 척수신경 세포, 및 모든 종류의 신경세포를 의미하며, 이러한 신경세포들은 뇌와 척추에 위치하여 중추신경계를 구성한다. 이러한 신경세포는 생체 내에서 기억, 사고, 자세 반사, 운동, 및 보상 관련 거동 등 모든 종류의 뇌 기능을 조절하는 역할을 하는바, 뇌신경 질환 치료에 중요한 역할을 한다.
본 발명에서 사용하는 용어, "직접교차분화 (Direct lineage reprogramming, Direct conversion, Trans differentiation)"는 전혀 다른 세포타입을 가지는 성체 세포간 전환을 유도하는 기술로서, 유도만능줄기세포를 제조하는 단계 없이 바로 목적하는 세포로의 전환을 유도한다는 점에서 종래의 기술과 차이가 있다. 현재 직접 교차분화 기술은 질병 모델링, 신약 발굴, 유전자 치료, 및 재생 의학 분야 등에서 이용 가능성을 인정받고 있으며, 이를 이용한 뇌신경 질환 치료에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있으나, 분화 효율이 높지 않아 실질적인 임상에 적용함에 어려움을 겪고 있다. 또한, 직접교차분화 리프로그래밍을 통한 생체 내 교차분화 적용은 임상적으로 상당한 의미를 가짐에도, 적절한 유도방법의 부재로 인해 상용화에 문제가 있었다. 이에, 본 발명은 전자기가 유도된 금속 나노입자를 이용함으로써, 생체 내외에서, 성체세포로부터 신경세포로의 직접교차분화 및 신경세포로의 자연분화 효율을 증진시키고자 하였다.
보다 구체적으로, 신경세포로의 직접교차분화 효율을 증진시키고자 금속 나노입자상에 전사인자가 도입된 성체세포를 위치시킨 후, 전자기장을 인가하여 상기 금속 나노 입자에 전자기를 유도하였으며, 동물의 체내인 뇌에 금속 나노입자와 관련 전사인자를 함께 주입한 후, 동물에 직접 전자기장을 인가하였다.
본 발명에서, 상기 전자기가 유도된 금속 나노입자는, 성체세포에서 신경세포로의 직접교차분화를 촉진시키며, 바람직하게 금, 은, 또는 자성 나노입자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 전자기장은 바람직하게 5 Gauss 내지 50 Gauss의 강도 및/또는 10Hz 내지 500Hz의 주파수로 인가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서는 금속 나노 입자에 인가되는 전자기장의 강도 및 파장을 조절함으로써, 신경세포로의 직접교차분화 효율을 증진시킬 수 있으며, 금 나노입자 뿐만 아니라 은, 또는 자성 나노입자를 이용한 경우에도 우수한 효과를 얻을 수 있음을 확인하였다 (실시예 1 내지 2 참조). 또한, 동물모델을 이용한 in vivo 실험에서도, 상기와 마찬가지로 신경세포로의 직접교차분화 효율이 증진되었으며, 뇌신경 질환 관련 증상이 확연히 완화됨을 확인하였으며 (실시예 3 내지 4 참조), 본 발명의 방법을 통해 신경세포로의 자연분화 효율 역시 증진되며, 상기 신경세포를 뇌신경 질환 치료에 유용하게 이용할 수 있음을 실험적으로 확인하였다 (실시예 5 내지 6 참조).
이에, 본 발명은 상기 방법으로 분화된 신경세포를 포함하는, 뇌신경 질환 치료용 세포치료제를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"는 본 발명에 따른 세포 치료제의 투여에 의해 뇌신경 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 치료 대상이 되는 질병인 "뇌신경 질환"은 신경 특히 뇌신경과 관련된 여러 가지 질병을 총칭하는 것으로서, 바람직하게 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌경색, 뇌출혈 또는 뇌졸중, 척수손상 질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 있어서, "세포치료제"는 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 저작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다.
한편, 본 발명의 다른 양태로서, 상기 세포치료제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌신경 질환의 치료방법을 제공한다.
본 발명에서, "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 전자기장으로 자기화된 금속 나노입자를 이용한 신경세포로의 직접교차분화 유도 효과 확인
본 발명은 전자기장으로 전자기가 유도된 금속 나노입자를 이용하여 성체세포에서 신경세포로의 직접교차분화리프로그래밍 (Direct lineage reprogramming)을 유도하는 기술로서, 그 일례로, 도 1에 나타낸 바와 같이, 전자기장에 의해 전자기가 유도되는, 금 나노 입자로 코팅된 플레이트를 사용하여 전사인자가 전처리된 섬유아세포 (Fibroblast)를 신경세포로 직접교차분화시켰다. 보다 구체적으로, 본 실시예에서는, 외부 전자기장의 강도 및 파장에 따른 신경세포로의 직접교차분화 활성 변화를 확인하고자 하였다.
1-1. 전자기장의 강도에 따른 직접교차분화 효율 변화
전자기장의 강도 변화에 따른 섬유아세포의 직접교차분화 활성을 평가하기 위하여, 상기 금 나노입자로 코팅된 플레이트에 다양한 강도 (10G, 20G, 및 30G)의 전자기장을 인가한 후, 신경 지표 유전자인 TH (Tyrosine hydroxylase), 및 Tuj1 (Class III β-tubulin)의 변화를 면역 염색 및 형광 현미경을 통하여 확인하였다. 또한, Tuj1, MAP1 (Microtubule associated protein 2), Gad67 (Glutamic acid decarboxylase 67), Synnapsin의 발현 정도를 RT-PCR (Realtime PCR)을 통하여 정량적으로 비교하였다. 한편, 대조군으로는 전자기장을 인가하지 않은 군을 이용하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여 전자기장을 인가한 군에서, 신경 지표 유전자인 TH 및 Tuj1이 유의적으로 증가하였으며, 이 중에서도 20G의 전자기장을 인가한 군에서 가장 우수한 효과를 확인할 수 있었다 (도 2a 참조). 또한, 상기 결과와 마찬가지로, 전자기장을 인가한 군에서, Tuj1, MAP1, Gad67, 및 Synnapsin 모두 발현량이 증가하였으며, 10G 또는 30G의 전자기장을 인가한 군과 비교하여 볼 때, 20G 전자기장을 인가한 군에서 발현량이 현저하게 증가함을 확인할 수 있었다 (도 2b 참조).
1-2. 전자기장의 파장에 따른 직접교차분화 효율 변화
전자기장의 파장 변화에 따른 섬유아세포의 직접교차분화 활성을 평가하기 위하여, 상기 금 나노입자로 코팅된 플레이트에 다양한 강도 (10G, 20G, 30G, 50G, 100G) 및 파장 (50Hz, 150Hz, 및 250Hz)의 전자기장을 인가한 후, 필드 (Field) 당 TH+ 신경세포 수의 변화를 측정하여 비교하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 1-1과 마찬가지로, 전자기장을 인가하지 않은 군에 비해 전자기장을 인가한 군에서, 다수의 TH+ 신경세포가 측정되었다. 특히, 30G 이상의 전자기장을 인가한 군에서는 현격하게 세포의 수가 감소하였으며, 20G의 전자기장을 인가한 군에서, 가장 다수의 TH+ 신경세포가 관찰되었다. 또한, 20G의 전자기장을 인가한 군 중에서도 150Hz 또는 250Hz 파장의 전자기장을 인가한 군에서 다수의 TH+ 신경세포를 관찰할 수 있었다.
실시예 2. 다양한 금속 나노입자를 이용한 신경세포로의 효율적 직접교차분화 유도 효과 확인
상기 실시예 1에서는 금속 나노입자 중 금 나노입자와 전자기장을 이용하여 신경세포로의 직접교차분화를 유도했던 반면, 본 실시예에서는, 다양한 금속 나노입자를 이용한 경우에도 신경세포로의 직접교차분화 효율을 증진시킬 수 있는지를 확인하고자 하였다. 구체적으로, 금속 나노입자 중에서 은 나노입자와 자성 나노입자를 이용하였으며, 전자기가 유도된 은 또는 자성 나노입자에 의한 신경세포 유전자 마커인 AADC (Aromatic amino acid decarboxylase)의 변화를 RT-PCR을 통하여 정량적으로 비교하였다.
그 결과, 4에 나타낸 바와 같이, 은 또는 자성 나노입자를 이용한 군 모두에서, 전자기가 유도되지 않은 대조군과 비교하여 AADC가 유의적으로 증가하였음을 확인하였는바, 실시예 1의 금 나노입자뿐만 아니라, 은 나노입자(도 4a 참조) 또는 자성 나노입자(도 4b 참조)를 이용한 경우에도 신경세포로의 직접교차분화 효율을 증진시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 동물모델에서의 신경세포로의 직접교차분화 유도 효과 확인
본 실시예에서는, 동물모델을 이용하여 본 발명의 신경세포로의 직접교차분화 유도 효과를 in vivo 상에서 확인하고자 하였다. 이를 위하여, 도 5에 나타낸 바와 같이, 전사인자인 Ascl1, Nurr1, Pitx3, 및 Lmx1과 금 나노입자를 마우스의 뇌에 주입하고 전자기장을 인가하였으며, 이때, 신경 지표 유전자인 TH, 및 Tuj1의 변화를 면역 염색 및 형광 현미경을 통하여 확인하였다. 대조군으로는 전사인자 및 금 나노입자를 투여하고 전자기장을 인가하지 않은 군 (Auptl)을 이용하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여 전자기장을 인가한 군 (EMF)에서, TH 및 Tuj1이 유의적으로 증가하였으며, 이는 본 발명의 방법을 통하여 체내에서도 신경세포로의 직접교차분화를 촉진시킬 수 있음을 의미한다.
실시예 4. 직접교차분화 유도에 따른 뇌신경 질환 치료효과 확인
본 실시예에서는, 상기 실시예 3의 결과를 토대로, 동물모델을 이용하여 본 발명의 뇌질환 치료 효과를 확인하고자 하였다. 보다 구체적으로 6OHDA (6-hydroxydopamine) 또는 MPTP(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine) 처리에 의한 뇌신경 손상과 그의 회복, 및 뇌졸중 동물 모델에서 뇌신경 증상 완화 효과를 비교하였다.
4-1. 6OHDA (6-hydroxydopamine)에 대한 보호효과
파킨슨병 유발 약물인 6OHDA (6-hydroxydopamine)를 마우스의 뇌에 주입하여 도파민 뉴런을 괴사시켰다. 이후, 금 나노입자 또는 은 나노입자와 같이 전도성을 갖는 나노물질을 마우스의 뇌에 처리하고 전자기장을 인가한 경우, 신경세포의 보호효과를 마우스의 회전수 변화를 통해 확인하였다. 대조군으로는 금속 나노입자 및 전자기장을 전혀 처리하지 않은 군을 이용하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 6OHDA 주입에 의해서 마우스의 회전수가 증가하였던 반면, 상기 마우스에 전사인자 및 금 나노입자 (도 7a 참조) 또는 은 나노입자 (도 7b 참조)를 주입하고 전자기장을 인가한 경우, 신경세포로의 직접교차분화가 유도되어 외부 약물에 의한 마우스의 회전수가 현저하게 감소되었다. 즉, 금 나노입자 또는 은 나노입자와 같은 금속 나노입자는 파킨슨병의 치료를 유도하여, 도파민 신경의 손상으로 인한 마우스의 회전성 행동을 상당히 완화시킴을 확인할 수 있었다.
4-2. MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine )에 대한 보호효과
우선, 신경세포 파괴 물질인 MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine)를 처리하여 인위적으로 신경세포를 파괴하였다. 이후, 전사인자, 및 금 나노입자를 마우스의 뇌에 처리하고 전자기장을 인가한 경우, 신경세포의 보호효과를 면역 염색법을 통해 확인하였다. 또한, MPTP에 의해 유도된 신경질환 마우스 동물모델을 제작하고, 전사인자, 금 나노입자 및 전자기장 처리에 따른 마우스의 행동의 변화를 원통 테스트, 매달리기 테스트, 또는 움직임 테스트를 통하여 관찰하였다. 대조군으로는 금속 나노입자 및 전자기장을 전혀 처리하지 않은 군 (Cont, No AuEMF)을 이용하였다.
그 결과, 도 8에 나타내 바와 같이, MPTP 처리에 의해 신경 지표 유전자인 Tuj1 및 Map2가 유의적으로 감소된 반면, 상기 마우스에 전사인자, 및 금 나노입자를 주입하고 전자기장을 인가한 경우, 상기 신경 지표 유전자인 Tuj1 및 Map2가 거의 감소되지 않았는바, 유의적인 신경세포 보호효과를 확인할 수 있었다.
또한, 도 9에 나타낸 바와 같이, 원통 테스트, 매달리기 테스트, 또는 움직임 테스트 결과, 금 나노입자를 주입하고 전자기장을 인가한 경우, 신경세포로의 직접교차분화가 유도되어 뇌졸중에 의한 마우스의 비정상적 행동이 상당 부분 개선됨을 확인할 수 있었다.
4-3. 뇌졸중 동물모델에서의 치료효과
뇌졸중 모델을 제조한 후, 상기 전사인자와 금속 나노입자를 뇌졸중 마우스의 뇌에 처리하고 전자기장을 인가한 경우, 뇌졸중으로부터 나타나는 쥐의 행동 변화를 구부림, 굽힘, 및 테이프 자가 떼기 테스트를 통하여 관찰하였다. 대조군으로는 금속 나노입자 및 전자기장을 전혀 처리하지 않은 군 (MPTP)을 이용하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 뇌졸중에 의해서 쥐의 비정상적 행동이 증가하였던 반면, 상기 마우스에 전사인자, 및 금속 나노입자를 주입하고 전자기장을 인가한 경우, 신경세포로의 직접교차분화가 유도되어 쥐의 비정상적 행동이 감소함을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 전자기장으로 자기화된 금속 나노입자를 이용한 신경세포로의 자연분화 유도효과 확인
상기 실시예 1 내지 4에서는 전자기장으로 자기화된 금속 나노입자를 이용하여 성체세포인 섬유아세포로부터 신경세포로의 직접교차분화리프로그래밍을 유도하였던 반면, 본 실시예에서는, 본 발명을 이용하여 배아줄기세포로부터 신경세포로의 자연분화 유도 효율 역시 증진시킬 수 있는지를 확인하고자 하였다. 보다 구체적으로, 배아줄기세포에 금 나노입자를 처리한 후, 전자기장을 인가한 경우, 신경세포로의 자연분화를 면역염색법을 통해 확인하였으며, 신경 지표 유전자인 Map2, Tuj1, Vmat2, Nestin, TH, DAT, 및 Pitx3의 발현량 변화를 RT-PCR을 통해 확인하였다. 대조군으로는 금속 나노입자 및 전자기장을 전혀 처리하지 않은 군 (Control)을 이용하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해 금 나노입자를 처리한 후, 전자기장을 인가한 경우, 신경세포로의 자연분화 효율이 현저하게 증가되었으며(도 11a 참조), 상기 결과와 마찬가지로, 신경 지표 유전자인 Map2, Tuj1, Vmat2, Nestin, TH, DAT, 및 Pitx3의 발현량도 통해 현저하게 증가됨을 확인할 수 있었다. 이는, 본 발명의 방법을 통해 신경세포로의 직접교차분화리프로그래밍뿐만 아니라, 자연분화의 효율도 증진시킬 수 있음을 의미한다.
실시예 6. 자연분화 유도에 따른 뇌신경 질환 치료효과 확인
본 실시예에서는, 상기 실시예 5의 결과를 토대로, 동물모델을 이용하여 본 발명의 뇌질환 치료 효과를 확인하고자 하였다. 보다 구체적으로 MPTP에 의해 유도된 신경질환 마우스 동물모델에 본 발명의 방법을 통해 배아줄기세포로부터 자연분화된 신경세포를 이식하였으며, 이에 따른 마우스의 행동 변화를 원통 테스트와 움직임 테스트를 통하여 관찰하였다. 대조군으로는 신경세포를 이식하지 않은 군 (Control)을 이용하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해 본 발명의 방법을 통해 배아줄기세포로부터 자연분화된 신경세포를 이식한 경우, MPTP 마우스의 비정상적 행동이 상당 부분 개선됨을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, 전자기가 유도된 금 나노입자를 이용하는 본 발명을 방법을 통해 자연분화된 신경세포가 뇌신경 질환 치료에 유용하게 이용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명에 따른 신경세포로의 직접교차분화 리프로그래밍 방법은 전자기가 유도된 금속 나노입자를 이용하여 신경세포로의 리프로그래밍을 유도하는 것으로서, 본 발명에서, 상기 방법을 통하여 생체 내외에서 신경세포로의 직접교차분화 리프로그래밍 효율을 현저하게 향상시킬 수 있으며, 이러한 기술을 생체 내의 뇌에 적용하였을때, 신경 재생을 통하여 알츠하이머, 파킨슨병, 뇌졸중, 뇌출혈 등 뇌신경 질환의 증상을 효과적으로 완화시킬 수 있음을 구체적으로 확인하였는바, 뇌신경 질환 치료를 위한 기술로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (12)

  1. 전사인자가 도입된 성체세포와 접촉시킨 금속 나노입자에 전자기장을 인가하는 단계를 포함하는, 성체세포에서 신경세포로의 직접교차분화방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 전사인자는 Ascl1, Nurr1, Pitx3, 및 Lmx1로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 직접교차분화방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 금속 나노입자는 금 나노입자, 은 나노입자, 및 자성 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 직접교차분화방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 성체세포는 섬유아세포인 것을 특징으로 하는, 직접교차분화방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 전자기장은 5 Gauss 내지 50 Gauss의 강도로 인가되는 것을 특징으로 하는, 직접교차분화방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 전자기장은 10 Hz 내지 500 Hz의 주파수로 인가되는 것을 특징으로 하는, 직접교차분화방법.
  7. 배아줄기세포 또는 역분화줄기세포와 접촉시킨 금속 나노입자에 전자기장을 인가하는 단계를 포함하는, 신경세포로의 자연분화방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 분화된 신경세포를 포함하는, 뇌신경 질환 치료용 약학적 조성물.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 분화된 신경세포를 포함하는, 뇌신경 질환 치료용 세포치료제.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 뇌신경 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌경색, 뇌출혈 및 척수신경손상 질환군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 세포치료제.
  11. 제9항 또는 제10항의 세포치료제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌신경 질환의 치료방법.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 분화된 신경세포의 뇌신경 질환 치료제 제조 용도.
PCT/KR2016/010537 2015-10-26 2016-09-21 전자기가 유도된 금속 나노입자를 이용한 신경세포로의 직접교차분화 리프로그래밍 방법 WO2017073910A1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US15/770,550 US11118161B2 (en) 2015-10-26 2016-09-21 Method for direct transdifferentiation reprogramming into neurons using electromagnetic-induced metal nanoparticles

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2015-0148790 2015-10-26
KR20150148790 2015-10-26
KR1020150161299A KR101745796B1 (ko) 2015-10-26 2015-11-17 전자기가 유도된 금속 나노입자를 이용한 신경세포로의 직접교차분화 리프로그래밍 방법
KR10-2015-0161299 2015-11-17

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2017073910A1 true WO2017073910A1 (ko) 2017-05-04

Family

ID=58631702

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2016/010537 WO2017073910A1 (ko) 2015-10-26 2016-09-21 전자기가 유도된 금속 나노입자를 이용한 신경세포로의 직접교차분화 리프로그래밍 방법

Country Status (3)

Country Link
US (1) US11118161B2 (ko)
KR (1) KR101745796B1 (ko)
WO (1) WO2017073910A1 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102128032B1 (ko) * 2018-10-15 2020-06-30 동국대학교 산학협력단 전자기파 반응성 프로모터를 이용하여 타겟 유전자를 과발현시키는 방법
WO2023055129A1 (ko) * 2021-09-29 2023-04-06 서울대학교 산학협력단 자성 나노입자를 함유한 중간엽 줄기세포를 포함하는 신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 용도
KR20230101640A (ko) * 2021-12-29 2023-07-06 주식회사 스탠드업테라퓨티스 체세포로부터 운동성 신경세포로의 직접교차 분화를 위한 조성물 및 이의 용도

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110134252A (ko) * 2010-06-08 2011-12-14 동국대학교 산학협력단 전자기장을 이용한 성체 줄기세포의 신경세포 분화유도 방법

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201302427D0 (en) * 2013-02-12 2013-03-27 Midatech Ltd Nanoparticle delivery compositions
WO2014168585A1 (en) * 2013-04-10 2014-10-16 Agency For Science, Technology And Research Polycaprolactone microcarriers for stem cell culture and fabrication thereof
WO2014188420A1 (en) * 2013-05-20 2014-11-27 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Metal-coated scaffolds for tissue engineering
KR101696874B1 (ko) 2013-07-31 2017-01-16 한국생명공학연구원 직접 리프로그래밍을 통한 유도 도파민성 전구세포 제조방법
KR101548534B1 (ko) * 2013-10-18 2015-09-02 동국대학교 산학협력단 전자기장을 이용한 성체세포를 유도만능 줄기세포로 역분화시키는 방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110134252A (ko) * 2010-06-08 2011-12-14 동국대학교 산학협력단 전자기장을 이용한 성체 줄기세포의 신경세포 분화유도 방법

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHOI, YUN-KYONG ET AL.: "Stimulation of Neural Differentiation in Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells by Extremely Low-frequency Electromagnetic Fields Incorporated with Mnps", APPLIED BIOCHEMISTRY AND BIOTECHNOLOGY, vol. 14, no. 4, 2014, pages 1233 - 1245, XP035399333 *
GLASER, TALITA ET AL.: "Neuronal Adhesion, Proliferation and Differentiation of Embryonic Stem Cells on Hybrid Scaffolds Made of Xanthan and Magnetite Nanoparticles", BIOMEDICAL MATERIALS, vol. 10, no. 4, July 2015 (2015-07-01), pages 1 - 11, XP055379521 *
LEE, CHANG HYUN ET AL.: "The Generation of iPS Cells Using Non-viral Magnetic Nanopart Idebased Transfection", BIOMATERIALS, vol. 32, no. 28, 2011, pages 6683 - 6691, XP028243741 *
PFISTERER, ULRICH ET AL.: "Direct Conversion of Human Fibroblasts to Dopaminergic Neurons", PNAS, vol. 108, no. 25, 2011, pages 10343 - 10348, XP055022966 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20170048111A (ko) 2017-05-08
US11118161B2 (en) 2021-09-14
US20190062702A1 (en) 2019-02-28
KR101745796B1 (ko) 2017-06-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Le Belle et al. Stem cells for neurodegenerative disorders: where can we go from here?
Xuan et al. Effects of engrafted neural stem cells in Alzheimer's disease rats
Lindvall et al. Stem cells in human neurodegenerative disorders—time for clinical translation?
Miller The promise of stem cells for neural repair
Kim Stem cell potential in Parkinson's disease and molecular factors for the generation of dopamine neurons
Liao et al. Exogenous neural stem cell transplantation for cerebral ischemia
Shihabuddin et al. The search for neural progenitor cells: prospects for the therapy of neurodegenerative disease
WO2017073910A1 (ko) 전자기가 유도된 금속 나노입자를 이용한 신경세포로의 직접교차분화 리프로그래밍 방법
Vedam-Mai et al. Tissue response to deep brain stimulation and microlesion: a comparative study
Wu et al. New method for transplantation of neurosphere cells into injured spinal cord through cerebrospinal fluid in rat
Cui et al. Electromagnetic fields for the regulation of neural stem cells
Farzanehfar Towards a better treatment option for Parkinson’s disease: a review of adult neurogenesis
Krueger et al. Effects of low-intensity electrical stimulation and adipose derived stem cells transplantation on the time-domain analysis-based electromyographic signals in dogs with SCI
Hoveizi et al. Transplanted neural-like cells improve memory and Alzheimer-like pathology in a rat model
Moayeri et al. Homing of super paramagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs) labeled adipose-derived stem cells by magnetic attraction in a rat model of Parkinson’s disease
Ma et al. Icariin promotes survival, proliferation, and differentiation of neural stem cells in vitro and in a rat model of Alzheimer’s disease
Yuan et al. Neuromodulation-based stem cell therapy in brain repair: recent advances and future perspectives
Xu et al. Transplanting GABAergic neurons differentiated from neural stem cells into hippocampus inhibits seizures and epileptiform discharges in pilocarpine-induced temporal lobe epilepsy model
WO2018124450A1 (ko) 특정 전자기파 처리를 통한 효율적 3d 중뇌 유사 오가노이드 제조 방법
WO2016153114A1 (ko) 고강도 전자기장과 음파 또는 초음파를 이용한 신경재생시스템
Zhang et al. Research progress of neural stem cells as a source of dopaminergic neurons for cell therapy in Parkinson’s disease
Schumm et al. Enhanced viability and neuronal differentiation of neural progenitors by chromaffin cell co-culture
WO2023055129A1 (ko) 자성 나노입자를 함유한 중간엽 줄기세포를 포함하는 신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 용도
WO2016032152A1 (ko) 성상세포의 생산방법
CN113388580B (zh) 一种诱导脂肪干细胞分化为功能性多巴胺能神经元的方法及用途

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 16860094

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 16860094

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1