KR20230101640A - 체세포로부터 운동성 신경세포로의 직접교차 분화를 위한 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 출원은 체세포로부터 운동성 신경세포로의 직접교차 분화를 위한 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

체세포로부터 운동성 신경세포로의 직접교차 분화를 위한 조성물 및 이의 용도 {A Composition for direct conversion from somatic cell to motor neuron and uses thereof}
본 출원은 체세포로부터 운동성 신경세포로의 직접교차 분화(Direct Reprogramming/Direct Conversion/Transdifferentiation)를 위한 조성물에 관한 것이다.
본 출원은 상기 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 출원은 상기 조성물의 다양한 용도에 관한 것이다.
환경의 변화, 산업의 발전 등으로 인해 다양한 새로운 질환이 증가하고 있다. 지금까지 많은 신약이 개발되었음에도 불구하고 인간은 더욱 효율적이고 효과적인 치료제를 원하고 있다.
최근 각광받고 있는 재생 의학(Regenerative medicine)은 인간의 세포, 조직, 장기를 대체하거나 재생시켜서 원래의 기능을 할 수 있도록 복원시키는 의학 분야이다. 또한, 손상되거나 결손이 발생한 장기, 조직 등의 치유, 재생도 연구하는 분야이다. 나아가 새로운 장기나 조직을 만들어 대체하여 기능을 회복하는 방법도 연구하는 분야이다.
재생 의학 중 하나는 줄기세포를 이용한 것이다. 줄기세포는 인체를 구성하는 모든 세포로 분화할 수 있는 만능세포로, 이론적으로 모든 종류의 기능세포로 분화 가능하고, 무한 증식이 가능하다. 줄기세포는 그 기원에 따라 배아 줄기세포, 성체 줄기세포, 정원 줄기세포 및 역분화 줄기세포(또는 유도만능 줄기세포) 등이 있다.
하지만, 배아 줄기세포는 배아의 파괴가 필요한 만큼 윤리적인 문제점, 안정성 문제점, 분화 효율이 낮은 문제점이 있다. 또한, 체세포에 역분화를 일으키는 특정 인자를 도입하여 모든 세포로 분화가능한 배아줄기세포와 같은 분화 능력을 가진 세포로 만들어, 이를 다시 목적하는 조직 특이적 세포로 분화시키는 역분화 줄기세포는 기형종 형성 가능성 및 낮은 분화 효율의 문제점을 가지고 있다.
줄기세포의 다양한 문제점을 극복할 수 있는 최근 각광받는 재생의학이 직접교차분화(Direct Reprogramming/Direct Conversion/Transdifferentiation)이다. 직접교차분화는 유도만능 줄기세포로 리프로그래밍하고 이를 재분화하여 목적하는 세포로 만드는 과정을 거치지 않고 바로 목적하는 세포로의 전환을 유도한다는 점에서 차이를 가진다. 즉, 전혀 다른 세포타입을 가지는 성숙한(분화가 끝난) 세포 간의 전환을 유도하는 방법이다.
그래서 많은 연구자들은 전분화능 줄기세포 단계를 거치지 않고 다양한 조직 특이적 세포로 유도하는 직접교차 분화를 연구해왔다. 그럼에도 불구하고, 직접교차 분화의 효율이 낮은 한계가 존재한다.
따라서, 직접교차분화의 효율을 높일 수 있는 새로운 인자에 대한 개발 요구되어진다.
1. 한국 등록특허 제2217496호 2. 미국 등록특허 제9770471호
1. Cell Stem Cell. 2011 Sep 2;9(3):205-218.
본 출원의 일 과제는, 체세포로부터 운동성 신경세포로의 직접교차 분화를 위한 조성물 및 이를 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 특히, 상기 조성물은 Gsta4(Glutathione S-Transferase Alpha 4) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 것을 특징을 한다.
본 출원의 다른 과제는, 상기 조성물을 이용하여 체세포로부터 운동성 신경세포로 직접교차 분화하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 출원의 또 다른 과제는, 상기 조성물의 다양한 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 출원은 전술한 상기 과제를 해결하기 위하여, 운동성 신경세포의 직접교차 분화를 위한 신규한 분화인자인 Gsta4 단백질을 이용한다.
이를 위해, 일 양태로 체세포로부터 운동성 신경세포로의 직접교차 분화를 위한 조성물이 제공된다.
Gsta4(Glutathione S-Transferase Alpha 4) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하고,
이 때, 상기 직접교차 분화는 상기 체세포가 운동성 신경세포 되는 체세포로부터 운동성 신경세포로의 직접교차 분화를 위한 조성물이 제공된다.
특히, 상기 조성물은,
Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 중 선택되는 하나 이상의 단백질;
또는 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 더 포함하는 조성물일 수 있다.
상기 체세포는,
섬유아세포(fibroblast), 상피세포(epithelial cell), 내피세포(endothelial cell), 근육세포, 신경세포, 모발세포, 모근세포, 모낭세포, 구강상피세포, 소변에서 추출한 체세포, 위점막세포, 배상세포, 가스트린 세포(gastrin cell/G cell), B세포, 주피세포, 별아교세포(astrocyte), 혈액세포, 줄기세포 중 선택될 수 있다.
다른 양태로, 체세포로부터 운동성 신경세포로의 직접교차 분화를 위한 벡터가 제공된다.
상기 벡터는,
프로모터; 및
Gsta4(Glutathione S-Transferase Alpha 4) 단백질을 코딩하는 DNA을 포함하고,
상기 Gsta4 단백질을 코딩하는 핵산은 상기 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있는 벡터이다.
다른 양태로, 체세포로부터 운동성 신경세포로의 직접교차 분화를 위한 방법이 제공된다.
상기 방법은,
상기 직접교차 분화는 상기 체세포가 운동성 신경세포로 되는 것이고,
상기 방법은,
Gsta4(Glutathione S-Transferase Alpha 4) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물을 체세포에 도입함;을 포함하는 방법이 제공된다.
또 다른 양태로, 체세포로부터 운동성 신경세포로의 직접교차 분화된 신경계 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물이 제공된다.
상기 신경계 질환은 척수 손상, 파킨슨병, 뇌졸중, 근위축성 척수측색경화증, 운동 신경손상, 외상에 의한 말초신경손상, 허혈성 뇌손상, 신생아 저산소성 허혈성 뇌손상, 뇌성마비, 간질, 난치성 간질, 알쯔하이머병, 선천성 대사성 신경계질환 및 외상성 뇌손상(traumatic brain injury) 중 선택되는 하나 이상이고,
상기 조성물은,
Gsta4(Glutathione S-Transferase Alpha 4) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하고,
이 때, 상기 직접교차 분화는 상기 체세포가 운동성 신경세포로 되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물이 제공된다.
또 다른 양태로, 신경계 질환을 치료하는 방법이 제공된다.
상기 신경계 질환을 치료하는 방법은,
체세포에 Gsta4(Glutathione S-Transferase Alpha 4) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물을 도입하여 직접교차 분화된 운동성 신경세포를 수득함;
상기 운동성 신경세포를 대상에 투여함;
을 포함하고, 상기 직접교차 분화는 상기 체세포가 만능 줄기세포로의 분화 없이 운동성 신경세포로 분화되는 것인 방법이 제공된다.
본 출원에 따르면 다음과 같은 효과가 발생된다.
첫째, 본 출원에 의하면, 체세포로부터 운동성 신경세포로의 직접교차 분화를 위한 조성물을 제공을 제공할 수 있게 된다.
둘째, 본 출원에 의하면, 상기 조성물을 이용하여 체세포로부터 운동성 신경세포로 직접교차 분화를 하는 방법을 제공할 수 있게 된다. 이를 이용하여 운동성 신경세포의 손상을 원인으로 하는 다양한 질환을 치료할 수 있는 용도를 제공한다.
도 1은 다양한 분화인자를 인간유래 섬유아세포에 도입하여 운동성 신경세포의 직접분화 정도를 신경세포 마커(Synapsin, Map2, Hb9)의 발현변화로 확인한 결과이다.
도 2는 마우스 성상세포에 분화인자를 도입하여 운동성 신경세포의 직접교차 분화정도를 면역형광염색법으로 확인한 결과이다.
도 3은 인간섬유아세포에 분화인자를 도입하여 운동성 신경세포의 직접교차 분화정도를 면역형광염색법으로 확인한 결과이다.
도 4는 척수 손상으로 인한 하반신 마비 모델인 SCI(Spinal cord injury) 마우스 모델의 척수손상 부위인 L5에 분화인자를 도입한 벡터를 투여하여 운동성 신경세포로 직접교차 분화 유도 후, 마비된 하반신의 회복 효과를 확인하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 5는 분화인자를 도입한 벡터를 투여한 SCI 마우스 모델에서 척수 손상 부위의 형태학적 변화를 확인한 결과이다. 이 때, Mock은 AAV(Adeno-associated virus)를 투여한 군; Control은 종래 분화인자(Ascl1, Brn2, Myt1l, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1)를 도입한 AAV를 투여한 군; +Gsta4는 상기 종래 분화인자 및 Gsta4를 도입한 AAV를 투여한 군;을 지칭한다.
도 6 및 7은 분화인자를 도입한 벡터를 투여한 SCI 마우스 모델에서 운동성 신경세포 마커의 발현 변화를 확인한 결과이다. 도 6 내 하얀점선으로 된 네모박스 부분이 도 7(a)이고, 도 7(b)는 도 6을 수치화한 그래프이다. 이 때, Mock은 AAV(Adeno-associated virus)를 투여한 군; Control은 종래 분화인자(Ascl1, Brn2, Myt1l, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1)를 도입한 AAV 를 투여한 군; +Gsta4는 상기 종래 분화인자 및 Gsta4를 도입한 AAV를 투여한 군;을 지칭한다.
도 8은 분화인자를 도입한 벡터를 투여한 SCI 마우스 모델에서 운동성 신경세포의 전기생리학적 변화를 분석한 결과이다. 도 8(a)는 patch clamp를 수행한 신경세포이고; 도 8(b)는 활동전위(Action potential)를 측정한 결과이고; 도 8(c)는 시냅스전 신경세포에서 오는 신호를 측정한 결과;이다. 이 때, Sham은 척수부위가 손상되지 않은 정상군; mock은 SCI 마우스 모델에 AAV를 투여한 군; control은 종래 분화인자(Ascl1, Brn2, Myt1l, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1)를 도입한 AAV를 투여한 군; +Gsta4는 상기 종래 분화인자 및 Gsta4를 도입한 AAV를 투여한 군;을 지칭한다.
도 9는 분화인자를 도입한 벡터를 투여한 SCI 마우스 모델에서 하반신 마비 치료효과를 BBB 스코어(Basso Beattie, and Bresnahan score) 변화를 분석한 결과이다. 도 9(a)는 도 9(b)관찰 결과를 수치화한 그래프이다.
도 10은 분화인자를 도입한 벡터를 투여한 SCI 마우스 모델에서 하반신 마비 치료효과를 행동학적 분석을 확인한 결과이다. 도 10(a)는 Forced swimming test이고; 도 10(b)는 Self urination 결과이고; 도 10(c)는 도 10(b)를 수치화한 것이고; 도 10(d)는 Foot printing test;결과를 나타낸다.
도 11은 본 실시예에서 사용한 Gsta4를 포함하는 AAV 벡터 모식도이다.
도 12는 본 실시예에서 사용한 Ascl1, Isl1, Lhx3 및 Ngn2를 포함하는 AAV 벡터 모식도이다.
도 13은 본 실시예에서 사용한 Brn2, Hb9 및 NeuroD1 포함하는 AAV 벡터 모식도이다.
도 14는 본 실시예에서 사용한 Myt1l 및 Gsta4를 포함하는 AAV 벡터 모식도이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 출원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 출원에 기재된 것과 유사 또는 동일한 방법 및 물질이 본 출원의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 이하에 기재된다. 본 출원에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 논문 및 다른 참고문헌은 전체가 참고로 포함된다. 추가로, 물질, 방법 및 실시에는 단지 예시적이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 출원에서 용어 "신경계 질환"은 운동뉴런 손상, 중추신경계 또는 말초신경계의 손상, 감염, 영양결핍, 유전자 변이 등으로 유발된 질환을 지칭한다. 또한, 원인불명으로 유발된 신경계 질환도 포함된다. 예를 들어, 신경계 질환은 척수 손상, 파킨슨병, 뇌졸중, 헌팅턴병, 루게릭병, 모세혈관 확장성 운동실조병(Ataxia telangiectasia), 근위축성 측색 경화증, 운동 신경손상, 외상에 의한 말초신경손상, 허혈성 뇌손상, 신생아 저산소성 허혈성 뇌손상, 뇌성마비, 간질, 신경세포 발달장애, 신경통, 난치성 간질, 알츠하이머병, 선천성 대사성 신경계질환 및 외상성 뇌손상(traumatic brain injury) 등일 수 있다. 특히, 본 출원의 신경계 질환은 운동성 신경세포 손상 또는 이로 유발되는 질환일 수 있다.
본 출원에서 용어 "직접교차 분화(Direct Reprogramming/Direct Conversion/Transdifferentiation)"는 최종적으로 분화된 세포에 분화인자(또는 리프로그래밍 인자)를 도입하여 목적하는 세포로 전환시키는 것을 지칭한다. 이 때, 상기 분화인자는 유전자, 화합물, 단백질, 핵산 등일 수 있다. 특히, 직접교차 분화는 전혀 다른 세포타입을 가지는 성숙한 세포간의 전환을 유도한다. 다시 말해, 체세포로부터 전능성 단계(Pluripotent state)를 경유하지 않고 목적하는 세포로 전환시키는 것이다. 용어 직접교차 분화와 직접분화는 상호교환 하여 사용할 수 있다.
신경계 질환을 개선 또는 치료하기 위해 현재까지 다양한 방법을 시도하고 있으나, 대부분의 신경계 질환의 원인이 명백하지 않아 치료제 개발이 어렵다. 또한, 노화가 진행됨에 따라 조직, 세포 등의 재생능력도 감소한다. 이로 인해, 기능적 손실로 인한 퇴행도 유발된다.
신경계 질환 환자의 신경계 변화를 살펴보면, 신경계를 구성하는 세포인 신경세포(또는 뉴런)의 손상, 신경세포 수의 감소, 뉴런 간의 신호 주고받음(즉, 시냅스)이 원활하지 않게 되는 등의 신경세포 자체에 문제가 관찰된다.
신경세포 중 뇌와 척수에서 일어난 운동자극을 근육이나 샘에 전달하는 운동 신경세포(또는 운동 뉴런 또는 운동성 신경세포; Motor neuron)가 손상되면 근육 강도와 기능의 회복이 매우 어렵다. 이를 해결하기 위해, 최근 직접 교차분화 방법을 이용하여 운동 뉴런을 생성하고자 하는 시도가 있었다.
한국 등록특허 제2217496호에서는 OCT4(Octamer-binding transcription factor 4) 단백질, LHX3(LIM homeobox 3) 단백질, ISL1(ISL LIM homeobox 1) 단백질, NKX6.1(NK6 homeobox 1) 단백질 및 SOX11(SRY- box 11) 단백질 중 하나 이상을 포함하는 조성물로 직접 교차분화 방법을 이용하여 섬유아세포로 운동 뉴런을 제조하였다. 또한, 이를 척수 손상 마우스 모델에 주입하여 손상된 신경의 치료효과를 확인하였다.
미국 등록특허 제9770471호에서는 Lhx3, Ascl1; 및 Brn2, Myt1l, Isl1, Hb9, Ngn2 및 NeuroD 중 선택되는 2개를 포함하는 조성물로 섬유아세포로부터 운동뉴런을 생산하는 방법을 개시하고 있다.
이와 같이, 현재까지 보고된 문헌들에서는 운동뉴런의 직접교차 분화를 위하여 다양한 종류의 인자들의 상이한 조합을 이용하고 있으나, 그 효율이 만족스럽지 못했다.
따라서, 지금까지 발견된 운동뉴런의 직접교차 분화인자 조합과 비교하여, 분화 효율을 현저히 높일 수 있는 새로운 인자 및 이의 조합을 찾을 필요가 있다.
● 본 출원의 기술적 특징
본 출원은 운동 뉴런의 직접교차 분화를 위한 신규한 인자를 이용하는 것을 특징으로 한다. 특히, 운동 뉴런의 직접교차 분화를 위해 종래부터 사용된 인자(이하, 종래 인자 또는 기존 인자로 지칭)들 보다 분화효율이 높을 뿐만 아니라, 종래 인자들과 조합하여 직접교차 분화를 하였을 때도 운동 뉴런의 분화 효율이 높아지는 것을 특징으로 한다.
본 출원에서 이용하는 신규한 인자는 Gsta4(Glutathione S-Transferase Alpha 4)이다.
따라서, 본 출원은 Gsta4를 필수구성으로 가진 운동성 신경세포 직접교차 분화를 위한 조성물에 관한 것이다. 또한, 상기 조성물은 선택적으로, 종래에 사용된 운동뉴런 직접교차 분화 인자를 더 포함할 수 있는 것을 특징으로 한다.
상기 조성물은 신경계 손상의 완화; 또는/및 BBB 스코어(Basso Beattie, and Bresnahan score)의 개선; 또는/및 활동 전위(action potential)의 개선; 또는/및 자발적 반응(spontaneous reaction)의 개선; 등의 효과를 나타낼 수 있다.
그러므로, 본 출원은 다음과 같은 기술적 특징을 보유한다.
첫째, 운동 뉴런의 직접교차 분화를 위한 신규한 인자를 확인하여 발굴하였다.
둘째, 상기 신규한 인자 단독으로 운동 뉴런의 직접교차 분화가 될 뿐만 아니라, 신규한 인자를 종래 공지된 인자와 조합하여 사용하였을 때도 운동 뉴런으로의 직접교차 분화가 발생한다.
셋째, 줄기세포를 이용하지 않기 때문에, 줄기세포를 사용할 때 발생하는 안정성 문제, 윤리적 문제, 낮은 효율의 문제가 없다.
넷째, 본 출원의 조성물을 이용하면, 신경계 질환의 개선 또는 치료 효과가 발휘된다.
이하에서, 상기의 기술적 특징을 지닌 본 출원의 체세포로부터 운동성 신경세포로의 직접교차 분화를 위한 조성물 및 이의 용도에 대해서 자세히 설명하도록 한다.
1. 운동성 신경세포의 직접교차 분화를 위한 신규한 분화인자
상기 직접교차 분화는 앞서 설명하였듯이, 완전히 분화된 세포를 다른 계통의 세포로 만드는 것이다. 이러한 과정은 완전히 분화된 세포를, 다른 계통의 목적하는 특정한 세포로 만들어 주어야 하기 때문에 목적하는 세포로 전환시킬 수 있는 인자를 필요로 한다.
완전히 분화된 세포가 직접교차 분화가 일어나면 세포의 크기, 모양, 막전위, 대사 활성, 신호 기전 등의 변화가 발생한다.
상기 완전히 분화된 세포는 체세포일 수 있다. 체세포는 생식세포를 제외한 모든 세포를 의미한다.
예를 들어, 상기 체세포는 섬유아세포(fibroblast), 상피세포(epithelial cell), 내피세포(endothelial cell), 근육세포, 신경세포, 모발세포, 모근세포, 모낭세포, 구강상피세포, 소변에서 추출한 체세포, 위점막세포, 배상세포, 가스트린 세포(gastrin cell/G cell), B세포, 주피세포, 별아교세포(astrocyte), 혈액세포, 줄기세포 등일 수 있다.
본 출원에서 용어 "분화인자"는 직접교차 분화에 직간접적으로 관여하는 인자를 지칭한다. 이 때, 상기 분화인자는 유전자, 화합물, 단백질, 성장인자, 핵산 등일 수 있다. 용어 분화인자는 리프그로그래밍 인자, 전사인자와 상호교환 하여 사용할 수 있다.
종래에 직접교차 분화를 위해 사용하는 분화인자는 Ascl1(Achaete-scute homolog 1), Nurr1(Nuclear Receptor Subfamily 4 Group A Member 2), Lmx1a(LIM Homeobox Transcription Factor 1 Alpha), Foxa2(Forkhead box protein A2), Brn2(POU Class 3 Homeobox 2), Sox2(sex determining region Y-box 2), Foxg1(Forkhead Box G1), Lhx3(LIM homeobox 3), HB9(Homeobox HB9), IsL1(ISL LIM homeobox 1), Ngn2(neurogenin 2), NeuroD1(Neuronal Differentiation 1), Myt1l(Myelin Transcription Factor 1 Like), NeuroD2(Neuronal Differentiation 2), miR-9(microRNA-9), miR-124(microRNA-124), Zic1(Zic Family Member 1), Gata5(GATA Binding Protein 5), Hnf4α(Hepatocyte nuclear factor 4 alpha), HNF1α(hepatocyte nuclear factor 1 alpha), Foxa1(Forkhead Box A1), Foxa3(Forkhead Box A3), Tbx5(T-Box Transcription Factor 5), Mef2c(Myocyte Enhancer Factor 2C), Oct4(Octamer-binding transcription factor 4), PRDM16(PR/SET Domain 16), MyoD(myoblast determination protein 1), Klf4(Kruppel-like factor 4), c-Myc(cellular Myc) 등이 알려져 있다(Mol Cell. 2012 Sep 28;47(6):827-838.). 특히, 운동성 신경세포의 직접교차 분화를 위해 사용하는 분화인자는 Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2, NeuroD1 등으로 알려져 있다.
1) 신규한 분화인자: Gsta4
본 출원의 일 태양은 체세포로부터 운동성 신경세포의 직접교차 분화를 위한 신규한 분화인자에 관한 것이다.
특히, 본 출원의 상기 신규한 분화인자는 체세포로부터 운동성 신경세포의 직접교차 분화를 실험적으로 확인함으로써 발굴한 Gsta4(Glutathione S-Transferase Alpha 4) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산이다.
상기 Gsta4는 종래 세포 방어 기작, 독소 분해, 항암 효과에 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한, 활성산소를 줄임으로써 세포 스트레스를 줄이는 데에도 큰 역할을 하는 것으로 알려져 있다
본 출원의 상기 Gsta4 단백질은 야생형 또는 변이체일 수 있다. 이 때, 상기 Gsta4 단백질은 야생형은 서열번호 1일 수 있다. 상기 Gsta4 단백질을 코딩하는 핵산은 서열번호 2일 수 있다. 상기 Gsta4 단백질의 변이체는 야생형의 아미노산 서열 중 1 이상이 결실, 치환, 삽입된 것일 수 있다.
예를 들어, Gsta4 단백질 변이체는 야생형 아미노산 서열의 1부위 이상에 외래서열이 더 삽입된 것일 수 있다.
다른 예를 들어, Gsta4 단백질 변이체는 야생형 아미노산 서열 중 1 이상이 결실되고, 결실된 부위에 외래서열이 삽입된 것일 수 있다.
본 출원의 상기 Gsta4 단백질은 야생형 서열과 동일성을 가진 서열일 수 있다. 이 때, 서열 동일성(sequence identity)은 50% 내지 99%일 수 있다.
예를 들어, Gsta4 단백질은 야생형 서열과 동일성이 70% 이상인 서열일 수 있다.
다른 예를 들어, Gsta4 단백질은 야생형 서열과 동일성이 80% 이상인 서열일 수 있다.
또 다른 예를 들어, Gsta4 단백질은 야생형 서열과 동일성이 90% 이상인 서열일 수 있다.
본 출원의 상기 Gsta4 단백질은 아형(subtype)을 포함할 수 있다.
본 출원의 상기 Gsta4 단백질은 공지된 아미노산 서열일 수 있다.
예를 들어, Gsta4 단백질의 아미노산 서열은 NP_001503.1 또는 XP_005249092.1일 수 있다.
다른 예를 들어, Gsta4 단백질의 아미노산 서열은 NM_001512.4 또는 XM_005249035.4에 의해 코딩되는 서열일 수 있다.
임의의 일 실시예로, 본 출원의 체세포로부터 운동성 신경세포의 직접교차를 위한 Gsta4 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열일 수 있다.
임의의 다른 실시예로, 본 출원의 체세포로부터 운동성 신경세포의 직접교차를 위한 Gsta4 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 서열 동일성(sequence identity)이 70% 이상, 80%이상, 90%이상인 서열일 수 있다.
본 출원의 상기 Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산은 체세포를 직접교차 분화하여 운동성 신경세포로 전환(conversion)시키는 데 기여한다.
이는 실시예 1 및 2에 더욱 명확하게 개시되어 있다. 본 출원의 신규한 인자인 Gsta4 단백질을 단독으로 사용하면 직접교차 분화를 통해, 체세포가 운동성 신경세포로 전환됨을 알 수 있다.
이를 토대로, 본 출원은 Gsta4가 종래 알려지지 않은 신규한 직접교차 분화인자임을 확인하여 이를 이용하고자 하는 것이다.
체세포를 직접교차 분화하여 운동성 신경세포로 생성시, 본 출원의 신규한 분화인자인 Gsta4 단백질을 이용하면 종래 분화인자를 이용할 때 보다 직접교차 분화율이 30% 내지 500% 증가될 수 있다.
예를 들어, 체세포를 Gsta4 단백질로 직접교차 분화하여 운동성 신경세포 생성시, 종래 분화인자를 이용할 때 보다 분화율이 50% 내지 500%, 바람직하게는 200% 내지 500% 증가될 수 있다.
다른 예를 들어, 체세포를 Gsta4 단백질로 직접교차 분화하여 운동성 신경세포 생성시, 종래 분화인자를 이용할 때 보다 분화율이 100% 내지 350% 증가될 수 있다.
체세포를 직접교차 분화하여 운동성 신경세포로 생성시, 본 출원의 신규한 분화인자인 Gsta4 단백질을 이용하면 종래 분화인자를 이용할 때 보다 직접교차 분화율이 2배 내지 20배 증가될 수 있다.
예를 들어, 체세포를 Gsta4 단백질로 직접교차 분화하여 운동성 신경세포 생성시, 종래 분화인자를 이용할 때 보다 분화율이 2배 내지 15배 증가될 수 있다.
다른 예를 들어, 체세포를 Gsta4 단백질 및 종래 분화인자를 함께 사용하여 직접교차 분화하여 운동성 신경세포 생성시, 종래 분화인자만 이용할 때 보다 분화율이 2배 내지 15배 증가될 수 있다.
2) Gsta4와 종래 분화인자의 조합
상기 Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산은 체세포를 직접교차 분화하여 운동성 신경세포로 전환이 가능하기 때문에, 종래 분화인자와 조합하여 사용하면 직접교차 분화율이 더 높아질 수 있다. 다시 말해, Gsta4 단백질을 종래 분화인자와 함께 사용하면 체세포로부터 운동성 신경세포로의 직접 교차분화에 소요되는 시간이 줄어들 수 있고, 분화 효율이 더 높아질 수 있다.
이 때, 종래 분화인자는 직접교차 분화에 관여하는 인자라면 제한하지 않는다. 또한, 상기 종래 분화인자의 변이체도 포함할 수 있다. 이 때, 변이체는 야생형의 아미노산 서열 중 1 이상이 결실, 치환, 삽입된 것일 수 있다.
본 출원의 Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산과 종래 분화인자 함께 사용할 경우, 목적에 따라 비율을 조절할 수 있다. 이 때, 종래 분화인자는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개 등이 될 수 있다.
일 예로, 2개의 인자, 즉, 종래 분화인자 1개와 Gsta4 단백질을 함께 사용할 수 있다. 이 때, 예를 들어, 조성물 전체에 대해 Gsta4 단백질 및 종래 분화인자 1개의 비율은 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80, 10:90 중 선택되는 하나의 비율로 조합될 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
다른 예로, 3개 이상의 인자, 즉, 종래 분화인자 2개 이상과 Gsta4 단백질을 함께 사용할 수 있다. 이 때, 조성물 전체에 대해 Gsta4 단백질; 및 종래 분화인자 2개 이상;의 비율은 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80, 10:90 중 선택되는 하나의 비율로 조합될 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
예를 들어, 본 출원의 체세포로부터 운동성 신경세포의 직접교차 분화를 위한 분화인자는,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
ii) Ascl1 단백질, Brn2 단백질, Myt1L 단백질, Hb9 단백질, Isl1 단백질, Lhx3 단백질, Ngn2 단백질 및 NeuroD1 단백질 중 선택되는 1개의 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
다른 예를 들어, 본 출원의 체세포로부터 운동성 신경세포의 직접교차 분화를 위한 분화인자는,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
ii) Ascl1 단백질, Brn2 단백질, Myt1L 단백질, Hb9 단백질, Isl1 단백질, Lhx3 단백질, Ngn2 단백질 및 NeuroD1 단백질 중 선택되는 2개의 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
다른 예를 들어, 본 출원의 체세포로부터 운동성 신경세포의 직접교차 분화를 위한 분화인자는,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
ii) Ascl1 단백질, Brn2 단백질, Myt1L 단백질, Hb9 단백질, Isl1 단백질, Lhx3 단백질, Ngn2 단백질 및 NeuroD1 단백질 중 선택되는 3개의 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
또 다른 예를 들어, 본 출원의 체세포로부터 운동성 신경세포의 직접교차 분화를 위한 분화인자는,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
ii) Ascl1 단백질, Brn2 단백질, Myt1L 단백질, Hb9 단백질, Isl1 단백질, Lhx3 단백질, Ngn2 단백질 및 NeuroD1 단백질 중 선택되는 4개의 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
또 다른 예를 들어, 본 출원의 체세포로부터 운동성 신경세포의 직접교차 분화를 위한 분화인자는,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
ii) Ascl1 단백질, Brn2 단백질, Myt1L 단백질, Hb9 단백질, Isl1 단백질, Lhx3 단백질, Ngn2 단백질 및 NeuroD1 단백질 중 선택되는 5개의 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
또 다른 예를 들어, 본 출원의 체세포로부터 운동성 신경세포의 직접교차 분화를 위한 분화인자는,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
ii) Ascl1 단백질, Brn2 단백질, Myt1L 단백질, Hb9 단백질, Isl1 단백질, Lhx3 단백질, Ngn2 단백질 및 NeuroD1 단백질 중 선택되는 6개의 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
또 다른 예를 들어, 본 출원의 체세포로부터 운동성 신경세포의 직접교차 분화를 위한 분화인자는,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
ii) Ascl1 단백질, Brn2 단백질, Myt1L 단백질, Hb9 단백질, Isl1 단백질, Lhx3 단백질, Ngn2 단백질 및 NeuroD1 단백질 중 선택되는 7개의 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
또 다른 예를 들어, 본 출원의 체세포로부터 운동성 신경세포의 직접교차 분화를 위한 분화인자는,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
ii) Ascl1 단백질, Brn2 단백질, Myt1L 단백질, Hb9 단백질, Isl1 단백질, Lhx3 단백질, Ngn2 단백질 및 NeuroD1 단백질 또는 각각의 단백질을 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
이하, 보다 구체적인 예들을 기재한다.
일 구체예로, 본 출원의 체세포로부터 운동성 신경세포의 직접교차 분화를 위한 분화인자는,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
iii) Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
일 구체예로, 본 출원의 체세포로부터 운동성 신경세포의 직접교차 분화를 위한 분화인자는,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
iii) Myt1L 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
일 구체예로, 본 출원의 체세포로부터 운동성 신경세포의 직접교차 분화를 위한 분화인자는,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
iii) Myt1L 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
일 구체예로, 본 출원의 체세포로부터 운동성 신경세포의 직접교차 분화를 위한 분화인자는,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
iv) Myt1L 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
다른 구체예로, 본 출원의 체세포로부터 운동성 신경세포의 직접교차 분화를 위한 분화인자는,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
iv) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
다른 구체예로, 본 출원의 체세포로부터 운동성 신경세포의 직접교차 분화를 위한 분화인자는,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Myt1L 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
v) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
vi) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
vii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
또 다른 구체예로, 본 출원의 체세포로부터 운동성 신경세포의 직접교차 분화를 위한 분화인자는,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Myt1L 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
v) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
vi) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
vii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
viii) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
ix) NeuroD1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
하기에서는 본 출원의 발명자가 도출한 운동성 신경세포의 직접교차 분화를 위한 신규한 인자인 Gsta4를 필수구성으로 포함하는 조성물에 대해서 설명하도록 하겠다.
2. 운동성 신경세포의 직접교차 분화를 위한 조성물
본 출원의 다른 태양은 상기 Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 분화인자로서 포함하는, 운동성 신경세포의 직접교차 분화를 위한 조성물에 관한 것이다.
상기 조성물은 분화인자를 발현할 수 있는 벡터를 포함할 수 있다.
상기 벡터는 바이러스 벡터 또는 재조합 바이러스 벡터일 수 있다.
상기 바이러스는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV), 백시니아바이러스, 폭스바이러스, HIV(Human immunodeficiency virus), MLV(Murineleukemia virus), ASLV(Avian sarcoma/leukosis), SNV(Spleen necrosis virus), RSV(Rous sarcoma virus), MMTV(Mouse mammary tumor virus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus), 에피조말(episomal) 또는 단순포진 바이러스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 벡터는 비바이러스 벡터일 수 있다.
상기 벡터는 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 코작 공통(Kozak consensus) 서열, ITR(inverted terminal repeat), LTR(long terminal repeat), 종결자(terminator), 내부 리보솜 유입 부위(internal ribosome entry site, IRES), 형광 단백질, 글루타티온-S-트랜스 퍼라제(GST), 호스라디시(horseradish) 과산화효소(HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 히스티딘(His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, Myc 태그, 2A 자가 절단 펩타이드(2A self-cleaving peptides) 등을 더 포함할 수 있다.
특히, 본 출원에서 사용한 벡터는 2A 자가 절단 펩타이드를 1개 이상 포함하고 있을 수 있다. 상기 2A 자가 절단 펩타이드는 동일한 트랜스크립트(transcript)에서 여러 단백질을 생성한다. 그래서, 벡터 내에서 발현을 목적하는 2개 이상의 서로 다른 단백질 사이에 2A 자가 절단 펩타이드가 위치한다.
예를 들어, 상기 2A 자가 절단 펩타이드는 T2A, P2A, E2A, F2A 등일 수 있다.
일 실시예로, 본 출원의 벡터는 상기 Gsta4 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터일 수 있다.
다른 실시예로, 본 출원은 상기 Gsta4 단백질을 코딩하는 핵산; 및 종래 분화인자 중 1 이상을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터일 수 있다. 이 때, 종래 분화인자는 앞서 설명한 바와 동일하다.
일 구체예로, 본 출원은 Gsta4 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 레트로바이러스 벡터일 수 있다.
다른 구체예로, 본 출원은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 이와 동일성이 70% 이상인 서열을 포함하는 아데노-연관 바이러스 벡터일 수 있다.
또 다른 구체예로, 본 출원은 Gsta4 단백질을 코딩하는 핵산 및 종래 분화인자를 코딩하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터일 수 있다.
본 출원의 상기 Gsta4 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터는 체세포를 운동성 신경세포로의 직접 교차분화를 위해서, 체세포에 도입될 수 있다. 도입된 벡터로부터 체세포에 Gsta4 단백질이 과발현 되면, 상기 체세포가 운동성 신경세포로 직접 분화(전환)하는 효율이 향상된다. 벡터를 이용하면 Gsta4 단백질을 체세포에 효율적으로 전달할 수 있을 뿐만 아니라, 높은 전달 효율을 가지기 때문에 직접 분화 효율도 높아질 수 있다.
본 출원의 상기 벡터를 포함하는 조성물은 선택적으로 바이러스로 정제할 수 있다.
예를 들어, 바이러스의 정제는 벡터를 포함하는 조성물의 배지를 수집 및 농축 과정으로 수득할 수 있다.
임의의 구체예로, 바이러스의 정제는 분별 원심분리법, 밀도구배 원심분리법, 크로마토그래피, 바이러스 침전법 등을 이용할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 조성물은 분화인자를 포함하는 비벡터 전달체를 포함할 수 있다.
이 때, 상기 비벡터는 플라스미드(Plasmid), 네이키드 DNA(naked DNA), 리포좀(Liposome) 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
임의의 예를 들어, 본 출원은 상기 Gsta4 단백질을 포함하는 조성물 일 수 있다.
임의의 다른 예를 들어, 본 출원은 상기 Gsta4 단백질; 및 종래 분화인자를 포함하는 조성물 일 수 있다. 이 때, 종래 분화인자는 앞서 설명한 바와 동일하다.
일 구체예로, 본 출원은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 이와 상동성이 70% 이상인 서열을 포함하는 조성물 일 수 있다.
상기 조성물은 분화인자의 발현을 위한 기능적 펩타이드를 선택적으로 더 포함할 수 있다. 이 때, 상기 기능적 펩타이드는 2A 자가 절단 펩타이드일 수 있다.
예를 들어, 상기 2A 자가 절단 펩타이드는 T2A, P2A, E2A, F2A 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
한편, 상기 조성물은 의약보조제, 치료제 등의 용도로 사용할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 조성물은 신경계 질환 개선 또는 치료를 위한 약학적 조성물이다.
상기 신경계 질환은 척수 손상, 파킨슨병, 뇌졸중, 헌팅턴병, 루게릭병, 모세혈관 확장성 운동실조병(Ataxia telangiectasia), 근위축성 측색 경화증, 운동 신경손상, 외상에 의한 말초신경손상, 허혈성 뇌손상, 신생아 저산소성 허혈성 뇌손상, 뇌성마비, 간질, 신경세포 발달장애, 신경통, 난치성 간질, 알츠하이머병, 선천성 대사성 신경계질환 및 외상성 뇌손상(traumatic brain injury) 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
특히, 본 출원의 신경계 질환은 운동성 신경세포 손상 또는 이로 유발되는 질환일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 통상적인 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 희석제, 보존제, 기타 보조제 등을 더 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 조성물은 증류수, 생리식염수, 자일리톨, 말리톨, 전분, 아카시아, 고무, 젤라틴, 마그네슘, 솔비톨, 만나톨, 벤조산나트륨 등을 더 포함할 수 있다.
구체적인 예를 들어, 상기 조성물을 제제화할 경우에는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
또한, 본 출원의 상기 조성물은 체세포의 운동성 신경세포로의 직접 분화 효율을 높이기 위해 특이적 배지에서 직접 분화를 수행할 수 있다. 이 때, 상기 특이적 배지는 실험자가 분화 효율을 높이기 위해 세포의 성장 및 증식에 필요한 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질, 항생제, 세포가 분비한 대사산물, 세포 외 매트릭스, 단백질 등이 포함된 배지이다.
상기 조성물은 대상의 신체 어느 부위에 상기 조성물을 적용할지에 따라, 상기 조성물에 추가되는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 희석제, 보존제, 기타 보존제 등이 상이해질 수 있다. 이 때, 상기 대상의 신체 부위는 경구, 근육, 피하, 정맥, 복강 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
본 출원의 상기 조성물은 체세포의 운동성 신경세포로의 직접 분화율을 높이기 위한 형태로 제조될 수 있으며, 나아가 이의 목적을 달성하기 위해 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 희석제, 보존제 등을 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 고형제제 또는 액상제제로 제조할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물이 고형제제로 될 경우, 상기 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 부형제 등이 더 포함될 수 있다. 예를 들어, 상기 부형제는 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등일 수 있다. 다른 예를 들어, 상기 조성물이 액상제제로 될 경우, 상기 조성물은 물, 멸균된 수용액, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 상기 액상제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등일 수 있다.
다시 한번 말하지만, 본 출원은 체세포로부터 운동성 신경세포의 직접교차 분화를 위한 신규한 분화인자인 Gsta4 단백질을 이용한다. Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물은 체세포가 운동 뉴런으로 직접분화 되는 효과가 있기 때문에, 신경계 손상의 완화; 또는/및 BBB 스코어(Basso Beattie, and Bresnahan score)의 개선; 또는/및 활동 전위(action potential)의 개선; 또는/및 자발적 반응(spontaneous reaction)의 개선; 등의 효과를 발휘할 수 있는 장점이 있다.
상기 조성물은 신경계 손상을 10% 내지 99% 완화시킬 수 있다.
상기 조성물은 신경계 손상을 2배 내지 20배 완화시킬 수 있다.
상기 조성물은 BBB 스코어(Basso Beattie, and Bresnahan score)가 10% 내지 99% 증가시킬 수 있다.
상기 조성물은 BBB 스코어(Basso Beattie, and Bresnahan score)가 2배 내지 20배 증가시킬 수 있다.
상기 조성물은 활동 전위를 10% 내지 99% 증가시킬 수 있다.
상기 조성물은 활동 전위를 2배 내지 20배 증가시킬 수 있다.
상기 조성물은 자발적 반응을 10% 내지 99% 증가시킬 수 있다.
상기 조성물은 자발적 반응을 2배 내지 20배 증가시킬 수 있다.
이하에서, 상기 조성물은 제조하는 방법 및 운동성 신경세포의 직접교차 분화를 위한 방법에 대해 자세하게 설명하도록 하겠다.
상기 조성물은 제조하는 방법에 있어서, 본 출원의 신규한 분화인자인 Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물은 체세포의 종류의 따라 운동성 신경세포의 직접교차 분화 효율을 증가시킬 수 있도록 인위적으로 조작할 수 있다. 따라서, Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산의 형태, 서열, 벡터 종류 등은 어떠한 면으로든 본 출원의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 출원의 다른 태양은 체세포로부터 운동성 신경세포의 직접교차 분화를 위한 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
상기 운동성 신경세포의 직접교차 분화를 위한 조성물은 앞서 설명한 바와 같이, 필수적으로 Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함한다.
즉, 상기 운동성 신경세포의 직접교차 분화를 위한 조성물은 Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 필수로 포함한다.
이 때, 선택적으로 상기 조성물은 종래 분화인자를 더 포함할 수 있다.
상기 종래 분화인자는 앞서 기재한 바와 동일하다.
상기 조성물이 종래 분화인자를 선택적으로 더 포함할 경우, 상기 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
ii) Ascl1 단백질, Brn2 단백질, Myt1L 단백질, Hb9 단백질, Isl1 단백질, Lhx3 단백질, Ngn2 단백질 및 NeuroD1 단백질 중 선택되는 1개 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함한다.
조성물의 구성
- i) 단백질 + ii) 단백질
- i) 단백질 + ii) 핵산
- i) 핵산 + ii) 단백질
- i) 핵산 + ii) 핵산
상기 i) 핵산, ii)의 선택된 유전자 핵산은 동일한 하나의 벡터에 포함되거나 각각 독립적인 벡터에 포함될 수 있다.
3. 운동성 신경세포로의 직접교차 분화 방법
상기 조성물은 체세포로부터 운동성 신경세포를 직접교차 분화하기 위해 사용된다.
체세포가 운동성 신경세포로 직접교차 분화할 때 많은 산화 스트레스(oxidative stress)가 발생한다. 산화 스트레스가 많이 발생하면, 세포 신호전달의 메커니즘을 방해하게 된다. 본 발명자들은 Gsta4 단백질이 산화 스트레스 발생을 완화시켜주고, 세포독성도 낮춰주면서 운동성 신경세포로 직접교차 분화를 원활하게 일어나게 하는 것으로 예상하고 있다.
상기 체세포로부터 운동성 신경세포를 직접교차 분화를 하는 방법은 다음과 같다.
상기 체세포로부터 운동성 신경세포를 직접교차 분화를 하는 방법은,
상기 체세포로부터 운동성 신경세포의 직접교차 분화를 위한 조성물을 체세포에 도입함;을 포함한다.
상기 도입은 유전자총, 전기천공법 (electroporation), 리포좀, 플라스미드, 바이러스 벡터, 나노파티클(nanoparticles) 및 PTD (Protein translocation domain) 융합 단백질 방법 중 선택되는 1이상의 방법으로 수행될 수 있다.
상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV), 백시니아바이러스, 폭스바이러스 및 단순포진 바이러스로 구성된 군에서 선택되는 1이상일 수 있다.
다른 일 구현예로, 상기 조작용 조성물은 비벡터로 대상 내로 전달 또는 도입될 수 있다.
상기 비벡터는 전기천공법, 유전자총, 초음파천공법, 자기주입법(magnetofection), 일시적인 세포 압축 또는 스퀴징(예를 들어, 문헌[Lee, et al, (2012) Nano Lett., 12, 6322-6327]에 기재되어 있음), 지질-매개 형질감염 등의 방법을 이용할 수 있다.
일 예로, 전기천공법을 통한 전달은 카트리지, 챔버 또는 큐벳 내에서 세포와 핵산 및/또는 단백질을 암호화하는 핵산서열을 혼합하고, 정해진 지속시간 및 진폭의 전기적 자극을 적용에 의해 수행될 수 있다.
또한, 비벡터의 전달을 위한 조성물은 기타 몇몇 다른 첨가제를 포함할 수 있다.
한편, 본 출원의 운동성 신경세포의 직접교차를 위한 방법을 이용하면, 종래 분화인자를 이용할 때보다 분화 효율의 향상; 신경계 손상의 완화; 또는/및 BBB 스코어(Basso Beattie, and Bresnahan score)의 개선; 또는/및 활동 전위(action potential)의 개선; 또는/및 자발적 반응(spontaneous reaction)의 개선; 등의 효과 등을 발휘할 수 있다.
종래 분화인자를 이용할 때보다 분화 효율의 향상한다는 것은, 체세포가 운동성 신경세포로 직접교차 분화까지 소요되는 시간이 줄어들 수 있다는 것일 수 있다. 또한, 분화 효율이 향상한다는 것은, 체세포가 운동성 신경세포로 전환된 것이 일반적인 운동성 신경세포(즉, 직접교차 분화를 통해 만들어진 운동성 신경세포가 아닌 것)와 유사도가 높다는 것일 수 있다.
예를 들어, 운동성 신경세포의 직접교차를 할 때 종래 분화인자를 이용할 때보다, 본 출원의 조성물을 이용하면 분화효율이 2배 내지 20배 증가될 수 있다.
다른 예를 들어, 운동성 신경세포의 직접교차를 할 때 종래 분화인자를 이용할 때보다, 본 출원의 조성물을 이용하면 신경세포 마커의 발현이 2배 내지 20배 증가될 수 있다.
신경계 손상을 완화시킬 수 있다는 것은, 예를 들어, 신경계의 기능이 약화 또는 손실되었을 때, 이를 개선시킬 수 있는 것이다.
예를 들어, 신경계 손상을 2배 내지 20배 완화시킬 수 있다.
BBB 스코어(Basso Beattie, and Bresnahan score)는 부상 후 운동 행동을 평가하는 것이다. 따라서, BBB 스코어가 낮으면 운동 기능이 떨어지는 것일 수 있다.
다른 예를 들어, BBB 스코어가 2배 내지 20배 증가시킬 수 있다.
신경세포가 시냅스 통해 전달, 교류 등을 할 때 활동 전위를 가지게 된다. 신경세포가 다른 신경세포로 자극을 전달하게 되면, 뉴런들이 행동, 감정 등을 조절하게 한다. 이러한 신경세포의 변화를 통해 감각, 기억 등의 변화를 확인할 수 있다. 활동 전위가 증가 또는 발생된다는 것은 감각, 기억 등이 개선될 수 있는 것이다. 나아가, 자발적 반응도 개선될 수 있는 것이다.
다른 예를 들어, 활동 전위를 2배 내지 20배 증가시킬 수 있다.
또 다른 예를 들어, 자발적 반응을 2배 내지 20배 증가시킬 수 있다.
본 출원은 Gsta4 단백질이라는 신규한 분화인자 또는 이를 포함하는 2이상의 분화인자 조합을 이용하여, 체세포가 운동성 신경세포로 효과적으로 직접교차 분화되는 방법에 관한 것이다. 본 출원의 조성물을 이용하면, 손상된 운동 뉴런의 회복 또는 재상을 통한 치료 효과를 가질 수 있다.
이하에서, 상기 조성물을 이용하여 신경계 질환을 치료하는 방법에 대해 설명한다.
본 출원의 또 다른 태양은 신경계 질환을 치료 또는 예방 또는 개선하는 방법에 관한 것이다.
상기 "신경계 질환"은 척수 손상, 파킨슨병, 뇌졸중, 헌팅턴병, 루게릭병, 모세혈관 확장성 운동실조병(Ataxia telangiectasia), 근위축성 측색 경화증, 운동 신경손상, 외상에 의한 말초신경손상, 허혈성 뇌손상, 신생아 저산소성 허혈성 뇌손상, 뇌성마비, 간질, 신경세포 발달장애, 신경통, 난치성 간질, 알츠하이머병, 선천성 대사성 신경계질환 및 외상성 뇌손상(traumatic brain injury) 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
특히, 본 출원의 신경계 질환은 운동성 신경세포 손상 또는 이로 유발되는 질환일 수 있다.
본 출원의 신경계 질환을 치료 또는 예방 또는 개선하는 방법은,
예를 들어,
대상의 체세포에
Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물; 또는
i) Gsta4(Glutathione S-Transferase Alpha 4) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및 ii) Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 중 선택되는 하나 이상의 단백질; 또는 상기 단백질을 코딩하는 핵산;을 포함하는 조성물;
을 투여함;
을 포함할 수 있다.
다른 예를 들어,
체세포에
Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물; 또는
i) Gsta4(Glutathione S-Transferase Alpha 4) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및 ii) Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 중 선택되는 하나 이상의 단백질; 또는 상기 단백질을 코딩하는 핵산;을 포함하는 조성물;
을 도입하여 직접교차 분화된 운동성 신경세포를 수득함;
상기 운동성 신경세포를 대상에 투여함;
을 포함할 수 있다.
또 다른 예를 들어,
Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물; 또는
i) Gsta4(Glutathione S-Transferase Alpha 4) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및 ii) Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 중 선택되는 하나 이상의 단백질; 또는 상기 단백질을 코딩하는 핵산;을 포함하는 조성물;
이 도입된 체세포를 준비함;
상기 체세포를 대상에 투여함;
을 포함할 수 있다.
상기 대상은 정상인에 비해 운동성 신경세포의 기능이 저하된 대상 또는 운동성 신경세포의 기능은 정상 범위이나 더 증진시키고자 하는 대상일 수 있다. 이 때, 상기 대상은 포유류, 어류, 조류, 유제류일 수 있다. 예를 들어, 상기 포유류는 사람, 개, 고양이, 마우스, 토끼 등일 수 있다.
본 출원에서 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 대상에 본 출원의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미한다.
상기 투여의 부위는 척수, 척수강내(intrathecal), 경구, 질, 고환, 정맥, 복강, 근육, 동맥, 심장, 피하, 유선, 점막 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
임의의 예를 들어, 상기 투여 부위가 척수일 경우, L1(lumbar 1), L2(lumbar 2), L3(lumbar 3), L4(lumbar 4), L5(lumbar 5), T1(thoracic 1), T2(thoracic 2), T3(thoracic 3), T4(thoracic 4), T5(thoracic 5), T6(thoracic 6), T7(thoracic 7), C1(cervical 1), C2(cervical 2), C3(cervical 3), C4(cervical 4), C5(cervical 5) 등일 수 있다.
일 실시예로, 상기 투여 부위는 L5일 수 있다.
상기 투여시, 상기 조성물 전체를 기준으로 상기 조성물의 농도는 다음과 같이 포함될 수 있다.
예를 들어, 상기 조성물 전체를 기준으로 1x105 vg(viral genome)/mL 내지 1x1020 vg(viral genome)/mL 농도의 바이러스가 포함될 수 있다.
다른 예를 들어, 상기 조성물 전체를 기준으로 1x105 GC(genome copies)/mL 내지 1x1020 GC(genome copies)/mL 농도의 바이러스가 포함될 수 있다.
또 다른 예를 들어, 상기 조성물 전체를 기준으로 1x105 VP(viral particle)/mL 내지 1x1020 VP(viral particle)/mL 농도의 바이러스가 포함될 수 있다.
이 때, 상기 조성물은 바이러스를 포함하는 형태, 벡터를 포함하는 형태, 벡터를 포함하는 세포의 형태, 단백질을 포함하는 형태, 단백질을 포함하는 세포의 형태 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
일 구체예로, 상기 조성물을 척수투여시 1회에 5ul 내지 10mL 투여할 수 있다. 바람직하게는, 척수투여시 1회에 5ul 내지 20ul 투여할 수 있다.
다른 구체예로, 상기 조성물을 정맥투여시 1회에 0.5mL/kg 내지 10mL/kg 투여할 수 있다. 바람직하게는, 정맥투여시 1회에 0.5mL/kg 내지 5mL/kg 투여할 수 있다.
상기 경구투여시, 상기 조성물의 투여횟수는 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
이 때, 상기 투여간격은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일 등일 수 있다. 이 때, 연속투여 또는 비연속투여 할 수 있다.
상기 투여시, 상기 조성물 전체를 기준으로 상기 조성물의 농도는 다음과 같이 포함될 수 있다.
상기 조성물은 1회에 0.5ul 내지 10mL의 용량으로 투여될 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
예를 들어, 성인의 경우, 상기 조성물을 1회 1mL 내지 1000mL의 양으로 체내에 투여 가능하다. 구체적인 예를 들어, 상기 조성물을 0.5ml/kg 내지 10ml/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 투여간격은 1일 1회 내지 3회일 수 있으며, 1일 3회 투여할 경우에는 6~8시간마다 1회씩 투여할 수 있다.
상기 투여는 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 식이, 신경계 질환 발병 정도, 다른 약의 섭취 여부, 치료 기간 등을 고려하여 결정될 수 있다.
본 출원의 신경계 질환을 치료 또는 예방 또는 개선하는 방법을 이용한 효과는 종래 분화인자를 이용할 때보다 분화 효율의 향상; 신경계 손상의 완화; 또는/및 BBB 스코어(Basso Beattie, and Bresnahan score)의 개선; 또는/및 활동 전위(action potential)의 개선; 또는/및 자발적 반응(spontaneous reaction)의 개선; 등을 통해 확인할 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
예를 들어, 본 출원의 운동성 신경세포의 직접교차 분화를 위한 조성물을 이용한 신경계 손상 완화의 효과는 스카(scar)의 감소정도를 통해 확인할 수 있다. 이 때, 상기 스카가 상기 조성물 투여 전에 비해 투여 후에 2배 내지 50배 감소될 수 있다.
다른 예를 들어, 본 출원의 운동성 신경세포의 직접교차 분화를 위한 조성물을 이용한 분화 효율의 향상은 운동성 신경 세포의 마커인 ChAT 또는/및 Map2의 발현변화를 통해 확인할 수 있다. 이 때, 상기 ChAT 또는/및 Map2의 발현이 상기 조성물 투여 전에 비해 투여 후에 2배 내지 50배 증가될 수 있다.
또 다른 예를 들어, 본 출원의 운동성 신경세포의 직접교차 분화를 위한 조성물을 이용한 신경계 질환 치료 또는 개선 효과는 BBB 스코어(Basso Beattie, and Bresnahan score), 활동 전위, 자발적 반응 등의 변화를 통해 확인할 수 있다. 이 때, 상기 BBB 스코어(Basso Beattie, and Bresnahan score) 스코어는 상기 조성물 투여 전에 비해 투여 후에 2배 내지 50배 증가될 수 있다. 또한, 활동 전위 또는/및 자발적 반응이 상기 조성물 투여 전에 비해 투여 후에 정상인과 유사한 양상으로 나타날 수 있다.
이처럼, 체세포에서 운동성 신경세포로의 직접교차 분화에 있어서, 본 출원의 신규한 분화인자인 Gsta4 및 이를 포함하는 2이상의 분화인자 조합이 분화 효율도 향상시키고 나아가 신경계 질환을 치료 또는 예방 또는 개선 효과를 나타낸다
상기에서 서술한 바와 같이, 본 출원은 i) 체세포로부터 운동성 신경세포의 직접교차 분화를 위한 신규한 인자인 Gsta4 단백질을 이용한다는 점; ii) 상기 Gsta4 단백질은 운동성 신경세포로의 분화를 발휘한다는 점; iii) Gsta4 단백질을 종래 분화인자와 조합하여 사용하여도 운동성 신경세포로의 분화를 발휘한다는 점; iv) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물을 이용하면 신경계 손상의 완화; 또는/및 BBB 스코어(Basso Beattie, and Bresnahan score)의 개선; 또는/및 활동 전위(action potential)의 개선; 또는/및 자발적 반응(spontaneous reaction)의 개선; 등의 효과를 발휘한다는 점;에 기술적 의의가 있다. 이는 향후, 신경계 손상 질환의 개선 또는 치료 또는 예방을 위한 치료제 개발에도 많은 기여를 할 수 있을 것으로 예상한다.
[출원의 실시를 위한 형태]
이하, 실시예를 통하여 본 출원을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 출원을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 출원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어 자명할 것이다.
실험 재료
● 벡터 설계
하기에서 실시하는 벡터는 AAV 벡터(Cell Biolabs, INC., VPK-402)를 사용하였고, 분화인자를 도입한 AAV 벡터의 모식도는 도 11 내지 도 14이다.
이하, 세포 또는 마우스에 도입하는 AAV 벡터는 도 11만을 도입하거나; 또는 도 12 내지 14를 도입하여 실험을 수행하였다.
도 12 벡터 모식도의 서열은 서열번호 3; 도 13 벡터 모식도의 서열은 서열번호 4; 도 14 벡터 모식도의 서열은 서열번호 5;에 해당한다.
● AAV 제작
AAV를 제작하는 데에 293T cell line을 사용하였다. 293T 세포는 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM, Thermal Fisher, #12430112)의 배지에 10% fetal bovine serum (Thermal Fisher, #26140079), 1% antibiotic-antimyotic(Thermal Fisher, #15240096)를 넣고 37℃, 5% CO2 상태에서 배양하였다. 293T 세포에 도 11 내지 14의 AAV 벡터와 pHelper, pRapCap을 트랜스펙션(transfection) 하고 48시간 배양하였다. 이후, 바이러스 추출과정을 거쳐 분화인자를 포함하는 바이러스를 추출하였다.
● 세포 배양 및 세포 내 AAV 도입
Fibroblast는 Fibroblast Growth Medium (Sigma, 116-500)의 배지에 10% fetal bovine serum (Thermal Fisher, #26140079),1% antibiotic-antimyotic (Thermal Fisher, #15240096)를 넣고 37℃, 5% CO2 상태에서 배양하였다. 2번 계대 배양 후 만들어진 AAV를 투여하여 in vitro 직접교차분화를 분석하였다.
AAV를 SCI 모델에 도입할 때는, 마우스 척수 손상 모델의 손상부위 (Lumbar 5)에 방위고정장치 (Stereotaxic,Harvard Apparatus 社)를 이용해 미세주사한 후 60 일간 분석하였다.
실시예 1: 세포 내에서 종래 분화인자 및 Gsta4의 운동성 신경세포로의 직접교차 분화 확인
섬유아세포를 신경세포로 분화를 유도하는 것으로 알려진 종래 분화인자(Ascl1, Brn2, Myt1l, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1)와 Gsta4를 다양한 조합으로 하여 인간유래 섬유아세포에 AAV를 이용하여 도입하여 신경세포의 분화정도를 qPCR(SYBRGreen Realtime PCR Master Mix, TOYOBO)로 확인하였다. 신경세포의 분화정도를 시냅스 형성 마커인 Synapsin, 성숙된 신경세포 마커인 Map2, 성숙된 신경세포 마커인 Hb9 각각의 변화를 확인하였다. (도 1). 이 때 사용한 프라이머 서열은 Synapsin은 서열번호 6 및 7; Map2는 서열번호 8 및 9; Hb9은 서열번호 10 및 11;을 이용하였다.
도 1을 보면, 종래 분화인자 8개를 다양하게 조합:
Ascl1 단독 투여; Ascl1, Brn2, Myt1l 조합 투여(ABM으로 표시); Hb9, Isl1, Lhx3 조합 투여(HIL로 표시); ABM 및 HIL 조합 투여; ABM, HIL, Ngn2 및 NeuroD1 조합(HND로 표시) 투여;
하였을 때 신경세포 마커들의 발현이 대조군(Control로 표시)에 비해 약 5~6배 증가하는 것을 확인하였다.
특히, 종래 분화인자의 다양한 조합들 중 8개를 모두 투여한 군이 신경세포 마커들의 발현이 가장 높음을 알 수 있었다.
반면, 본 발명자들이 발견한 신규한 분화인자인 Gsta4를 종래 분화인자 8개와 조합하여 도입한 결과(ABM+HND+Gsta4로 표시), 신경세포 마커 발현이 대조군에 비해 약 10~12배 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 종래 분화인자 8개만 도입하였을 때 보다 약 2~5배 증가하는 것을 확인하였다.
또한, 마우스 성상세포에 종래 분화인자를 조합하여 도입한 군과 Gsta4를 종래 분화인자 8개와 조합하여 도입한 군의 신경세포 분화정도를 면역형광 염색법으로 확인하였다(도 2).
도 2를 살펴보면, 운동성 신경세포 마커인 ChaT 및 성숙된 신경세포 마커인 Map2의 발현이 종래 분화인자의 조합에 따라서도 차이가 있음을 확인할 수 있었다. Hb9, Isl1, Lhx3 및 Ascl1을 조합한 군을 도입하였을 때(약 20% 발현) 보다 종래 분화인자 8개를 모두 조합한 군(Ascl1, Brn2, Myt1l, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1)을 도입하였을 때(약 50% 발현) ChaT 및 Map2의 발현이 증가한 것을 확인하였다.
반면, 종래 분화인자 8개 및 Gsta4를 함께 도입한 군(previously known factors+Gsta4로 표시)에서는 ChaT 및 Map2의 발현이 약 70%로, 종래 분화인자 8개만 도입하였을 때 보다 발현이 증가한 것을 확인할 수 있었다.
즉, 종래 분화인자와 Gsta4를 조합하여 도입한 군에서 마우스 성상세포의 운동성 신경세포로 직접 분화되는 정도가 높음을 의미한다.
나아가, 인간 섬유아세포에 종래 분화인자 8개를 모두 도입한 군과 Gsta4를 종래 분화인자 8개와 조합하여 도입한 군의 신경세포 분화정도를 면역형광 염색법으로 확인하였다(도 3).
도 3을 살펴보면, 신경세포 바이오 마커인 NEUN 및 성숙된 신경세포 마커인 Map2의 발현의 정도가 차이가 있음을 확인할 수 있었다. 종래 분화인자 8개를 모두 조합한 군(Ascl1, Brn2, Myt1l, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1)을 도입하였을 때 약 15.51%의 세포가 성숙한 싱경세포로 분화하였다. 반면, 종래 분화인자 8개 및 Gsta4를 함께 도입한 군에서는 약 48.72%의 세포가 성숙한 신경세포로 분화됨을 확인할 수 있었다.
즉, 이의 결과를 통해, 본 발명자들이 발견한 신규한 분화인자인 Gsta4는 종래 분화인자들보다 신경세포 분화 효율이 높은 인자임을 알 수 있었다.
실시예 2: 생체 내에서 운동성 신경세포로의 직접교차 분화 및 치료 효과 확인
Gsta4의 신경세포 분화 효능을 세포 내에서 확인한 실시예 1의 결과를 바탕으로, 생체 내에서 운동성 신경세포로의 직접교차 분화 및 치료효과를 확인하기 위해 도 4의 모식도를 바탕으로 실험을 수행하였다.
하반신 마비질환 동물 모델인 SCI 마우스 모델에서 척추신경 손상 부위가 개선 또는 치료되는 효과를 형태학적, 생리학적, 행동학적 분석 등을 통하여 확인하였다.
1) SCI(Spinal cord injury) 마우스 모델 제작
척수 손상으로 인한 하반신 마비 모델인 SCI 마우스 모델 제작을 위해, ICR 마우스를 마취하여, 척수의 Lumbar 5 부위(이하, L5로 지칭; 척추 T13-L1에 해당)를 손상시켰다. 손상시킨 후, 최종 5주 후 실험에 사용하였다.
2) SCI 마우스 모델에 AAV 투여
SCI 마우스 모델의 L5 부위에 마이크로 실린지 (Hamilton, 705)를 이용하여 이용하여 AAV 2ul를 미세주사 하였다.
실시예 2-1: 척수 손상부위의 형태학적 변화 확인
SCI 마우스 모델에 종래 분화인자 8개를 도입한 군(Control로 지칭); 종래 분화인자 8개 및 Gsta4를 함께 도입한 군(+Gsta4로 지칭); 분화인자 도입하지 않은 AAV를 도입한 군(Mock으로 지칭); 각각의 척수 손상부위(L5)의 형태학적 변화를 관찰하기 위해 CV(Crystal violet, Sigma) 염색을 하였다(도 5).
도 5를 살펴보면, 직접교차분화를 유도하는 분화인자가 없는 Mock 군은 많은 염증세포가 모여서 진하게 스카(scar)가 형성되었다(붉은색 점선). 종래 분화인자 8개를 도입한 Control 군은 Mock 군에 비해 세포가 모여 있는 스카가 감소되었다. 반면, 종래 분화인자 8개 및 GSTA4를 함께 도입한 군에서는 Control군에 비해 염증세포로 인한 스카(scar)가 완화되는 것을 확인하였다.
실시예 2-2: 운동성 신경세포 마커 발현 변화 확인
SCI 마우스 모델에 종래 분화인자 8개를 도입한 군(Control로 지칭); 종래 분화인자 8개 및 Gsta4를 함께 도입한 군(+Gsta4로 지칭); 분화인자 도입하지 않은 AAV를 도입한 군(Mock으로 지칭); 각각의 척수 손상부위(L5)에서 운동성 신경세포 마커의 발현 변화를 관찰하기 위해 면역형광염색법을 수행하였다(도 6 및 7).
도 6 및 7을 살펴보면, Mock 군에 비해 Control군에서 ChaT와 Map2의 발현이 약 2배 증가하였다. 반면, 종래 분화인자 8개 및 GSTA4를 함께 도입한 군에서는 Control군에 비해 ChaT와 Map2의 발현이 약 5배 이상 증가하였다. 이는 Gsta4로 인해 성상세포에서 운동성신경세포로의 직접교차분화가 Control 군에 비해 분화 효율이 높음을 의미한다.
실시예 2-3: 전기생리학적 분석을 통한 하반신 마비 치료 효과 확인
척수부위에 손상을 가하지 않은 정상군(Sham으로 지칭); SCI 마우스 모델에 종래 분화인자 8개를 도입한 AAV를 투여한 군(Control로 지칭); 종래 분화인자 8개 및 Gsta4를 함께 도입한 AAV를 투여한 군(+Gsta4로 지칭); SCI 마우스 모델에 AAV를 도입한 군(Mock으로 지칭);각각의 척수 손상부위(L5)에서 전기생리학적 변화를 확인하였다(도 8).
도 8(a)의 Patch clamp를 수행한 신경세포 사진이다.
도 8(b)의 활동전위 측정결과를 살펴보면, Sham군에서 활동전위는 25 Hz이지만, mock 군에서 2 Hz로 1/10 이상 감소되었다. 반면, 종래 분화인자 8개를 도입한 Control군은 6 Hz로 활동전위가 증가되었고, 종래 분화인자 8개 및 Gsta4를 함께 도입한 군에서는 13 Hz로 Control 군에 비해 2배 이상 증가하였다.
활동 전위의 증가는 신경세포가 신호를 받았을 때, 신호를 전달할 수 있는 능력을 의미한다. 활동 전위가 없으면 신호전달을 할 수 없다. 또한 활동전위는 신경세포의 가장 대표적인 특징입니다. 활동전위가 발생하고 증가한다는 것은 신경세포로 분화가 잘 되었다는 것을 의미한다. 따라서, 분화 인자 8개 및 Gsta4를 함께 도입한 군이 신경세포로 분화가 가장 잘 일어남을 통해, 이의 조합이 신경세포 분화 효율이 좋음을 나타낸다.
도 8(c)의 시냅스전 신경세포에서 오는 신호를 측정한 결과를 살펴보면, Mock 군에서는 1 Hz, Control 군에서는 6 Hz, + Gsta4 군에서는 47 Hz였다.
시냅스전 신경세포에서 오는 신호의 증가는 신경세포들 사이의 신호전달이 증가함을 나타낸다. SCI로 인해 끊어진 신경세포의 연결이 새로운 운동성 신경세포의 재생으로 연결되었다는 것을 나타낸다.
실시예 2-4: 행동학적 분석을 통한 직접교차 분화 확인
척수부위에 손상을 가하지 않은 군(Sham으로 지칭); SCI 마우스 모델에 종래 분화인자 8개를 도입한 군(-Gsta4로 지칭); 종래 분화인자 8개 및 Gsta4를 함께 도입한 군(+Gsta4로 지칭); SCI 마우스 모델에 AAV를 투여한 군(Mock으로 지칭);각각의 척수 손상부위(L5)에서 BBB 스코어 변화를 확인하였다(도 9).
도 9의 BBB 스코어(Basso Beattie, and Bresnahan score)는 전통적으로 척수 손상 모델에서 사용되는 측정 방법으로 하지의 모양, 각도, 무릎의 각도, 발바닥의 모양 및 각도, 위치 등을 종합적으로 판단하여 점수를 측정한다. 최하 0 점에서 최대 21점으로 정상 동물은 21점이다.
종래 분화인자 8개만 도입한 군(-Gsta4로 표시)은 Mock군과 차이가 없었다 (BBB 스코어 약 4점). 하지만, 종래 분화인자 8개 및 Gsta4를 함께 도입한 군(+Gsta4로 표시)은 AAV 투여 후 3주째(BBB 스코어 약 8점)으로 -Gsta4군에 비해 약 2배 이상 증가하였다.
또한, 척수부위에 손상을 가하지 않은 정상군(Sham으로 지칭); SCI 마우스 모델에 AAV를 도입한 군(Mock으로 지칭); 종래 분화인자 8개 및 Gsta4를 함께 도입한 AAV를 투여한 군(Gsta4+로 지칭); 종래 분화인자 8개만 도입한 AAV를 투여한 군(Control로 지칭); 각각의 Forced swimming test, Self urination, Foot printing test 등의 변화도 확인하였다(도 10).
도 10(a)의 Forced swimming test는 동물모델을 3분간 수조에 넣고 하지가 움직이는 횟수를 측정하였다. Mock 군에서 척수 손상으로 인해 하지는 움직이지 않았다. 하지만, Gsta4를 함께 도입할 경우 하지의 움직임이 약 6배 내지 12배 증가함을 확인하였다.
도 10(b) 및 (c)는 자가 소변 능력을 측정한 결과이다. 척수 손상 마우스는 스스로 소변을 배뇨할 수 없다. 종래 분화인자 8개 및 Gsta4를 함께 도입한 군의 AAV를 투여 후 14일 또는 16일에 스스로 배뇨하는 것을 확인할 수 있었다.
도 10(d)는 Foot printing 테스트 결과이다. Foot printing은 마우스의 하지 발바닥에 붉은색 잉크를 묻히고 발바닥 모양을 확인하는 실험이다. Sham 군의 경우 하지의 발바닥이 선명하게 찍혔지만(11번/20cm), Mock군에서 발바닥 모양을 확인 할 수 없었다(11번/20cm). 이에 반해, 종래 분화인자 8개 및 Gsta4를 함께 도입한 군에서는 마우스의 하지 발바닥이(5번/20cm)찍히는 것을 확인할 수 있었다(도10).
상기 결과들을 통해, 본 출원의 발명자가 발견한 신규한 분화인자인 Gsta4는 체세포를 운동성 신경세포로 직접교차 분화하는 데 중요한 인자임을 알 수 있었다. 또한, Gsta4는 종래 분화인자들에 비해서도 분화 효율이 높고, 나아가 종래 분화인자들과 Gsta4를 함께 사용할 경우, 종래 분화인자들만 사용할 때 보다 분화 효율이 더 높아진다. 더군다나, 발명자들은 척수가 손상된 하반신 마비 모델의 치료 효과도 확인한 바, Gsta4는 향후 다양한 신경계 질환에서 중요한 역할을 할 것으로 예상된다.
<110> Stand up THERAPEUTICS <120> A Composition for direct conversion from somatic cell to motor neuron and uses thereof <130> STANDUP20211217 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gsta4_Protein <400> 1 Met Ala Ala Arg Pro Lys Leu His Tyr Pro Asn Gly Arg Gly Arg Met 1 5 10 15 Glu Ser Val Arg Trp Val Leu Ala Ala Ala Gly Val Glu Phe Asp Glu 20 25 30 Glu Phe Leu Glu Thr Lys Glu Gln Leu Tyr Lys Leu Gln Asp Gly Asn 35 40 45 His Leu Leu Phe Gln Gln Val Pro Met Val Glu Ile Asp Gly Met Lys 50 55 60 Leu Val Gln Thr Arg Ser Ile Leu His Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn 65 70 75 80 Leu Phe Gly Lys Asn Leu Lys Glu Arg Thr Leu Ile Asp Met Tyr Val 85 90 95 Glu Gly Thr Leu Asp Leu Leu Glu Leu Leu Ile Met His Pro Phe Leu 100 105 110 Lys Pro Asp Asp Gln Gln Lys Glu Val Val Asn Met Ala Gln Lys Ala 115 120 125 Ile Ile Arg Tyr Phe Pro Val Phe Glu Lys Ile Leu Arg Gly His Gly 130 135 140 Gln Ser Phe Leu Val Gly Asn Gln Leu Ser Leu Ala Asp Val Ile Leu 145 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tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 420 gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 480 gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 540 tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctcgtttag 600 tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagacacc 660 gggaccgatc cagcctcccc tcgaagctta catgtggtac catggcagca aggcccaagc 720 tccactatcc caacggaaga ggccggatgg agtccgtgag atgggtttta gctgccgccg 780 gagtcgagtt tgatgaagaa tttctggaaa caaaagaaca gttgtacaag ttgcaggatg 840 gtaaccacct gctgttccaa caagtgccca tggttgaaat tgacgggatg aagttggtac 900 agacccgaag cattctccac tacatagcag acaagcacaa tctctttggc aagaacctca 960 aggagagaac cctgattgac atgtacgtgg aggggacact ggatctgctg gaactgctta 1020 tcatgcatcc tttcttaaaa ccagatgatc agcaaaagga agtggttaac atggcccaga 1080 aggctataat tagatacttt cctgtgtttg aaaagatttt aaggggtcac ggacaaagct 1140 ttcttgttgg taatcagctg agccttgcag atgtgatttt actccaaacc attttagctc 1200 tagaagagaa aattcctaat atcctgtctg catttccttt cctccaggaa tacacagtga 1260 aactaagtaa tatccctaca attaagagat tccttgaacc tggcagcaag aagaagcctc 1320 cccctgatga aatttatgtg agaaccgtct acaacatctt taggccaggt agcggtgcca 1380 ctaacttctc cctgttgaaa caagcagggg atgtcgaaga gaatcctggt ccaatggagg 1440 tggacaccga ggagaagcgg catcgcacgc ggtccaaagg ggttcgagtt cccgtggaac 1500 cagccataca agagctgttc agctgtccca cccctggctg tgacggcagt ggtcatgtca 1560 gtggcaaata tgcaagacac agaagtgtat atggttgtcc cttggcgaaa aaaagaaaaa 1620 cacaagataa acagccccag gaacctgctc ctaaacgaaa gccatttgcc gtgaaagcag 1680 acagctcctc agtggatgag tgtgacgaca gtgatgggac tgaggacatg gatgagaagg 1740 aggaggatga gggggaggag tactccgagg acaatgacga gccaggggat gaggacgagg 1800 aggacgagga gggggaccgg gaggaggagg aggagatcga ggaggaggat gaggacgatg 1860 acgaggatgg agaagatgtg gaggatgaag aagaggaaga ggaggaggag gaggaggagg 1920 aagaggaaga agaaaacgaa gaccatcaaa tgaattgtca caatactcga ataatgcaag 1980 acacagaaaa ggatgataac aataatgacg aatatgacaa ttacgatgaa ctggtggcca 2040 agtcattgtt aaacctcggc aaaatcgctg aggatgcagc ctaccgggcc aggactgagt 2100 cagaaatgaa cagcaatacc tccaatagtc tggaagacga tagtgacaaa aacgaaaacc 2160 tgggtcggaa aagtgagttg agtttagact tagacagtga tgttgttaga gaaacagtgg 2220 actcccttaa actattagcc caaggacacg gtgttgtgct ctcagaaaac atgaatgaca 2280 gaaattatgc agacagcatg tcgcagcaag acagtagaaa tatgaattac gtcatgttgg 2340 ggaagcccat gaacaatgga ctcatggaaa agatggtgga ggagagcgat gaggaggtgt 2400 gtctgagcag tctggagtgt ttgaggaatc agtgcttcga cctggccagg aagctcagtg 2460 agaccaaccc gcaggagagg aatccgcagc agaacatgaa catccgtcag catgtccggc 2520 cagaagagga cttcccagga aggacgccgg acagaaacta ctcggacatg ctgaacctca 2580 tgcggctgga ggagcagttg agcccccggt cgagagtgtt tgccagctgt gcgaaggagg 2640 atgggtgtca tgagcgggac gacgatacca cctctgtgaa ctcggacagg tctgaagagg 2700 tgttcgacat gaccaagggg aacctgaccc tgctggagaa agccatcgct ttggaaacgg 2760 aaagagcaaa ggccatgagg gagaagatgg ccatggaagc tgggaggagg gacaatatga 2820 ggtcatatga ggaccagtct ccgagacaac ttcccgggga ggacagaaag cctaaatcca 2880 gtgacagcca tgtcaaaaag ccatactatg atccctcaag aacagaaaag aaagagagca 2940 agtgtccaac ccccgggtgt gatggaaccg gccacgtaac tgggctgtac ccacatcacc 3000 gcagcctgtc cggatgcccg cacaaagata gggtccctcc agaaatcctt gccatgcatg 3060 aaagtgtcct caagtgcccc actccgggct gcacggggcg cgggcatgtc aacagcaaca 3120 ggaactccca ccgaagcctc tccggatgcc cgatcgctgc agcagagaaa ctggccaagg 3180 cacaggaaaa gcaccagagc tgcgacgtgt ccaagtccag ccaggcctcg gaccgcgtgc 3240 tcaggccaat gtgctttgtg aagcagctgg agattcctca gtatggctac agaaacaatg 3300 tccccacaac tacgccgcgt tccaacctgg ccaaggagct cgagaaatat tccaagacct 3360 cgtttgaata caacagttac gacaaccata cttatggcaa gcgagccata gctcccaagg 3420 tgcaaaccag ggatatatcc cccaaaggat atgatgatgc gaagcggtac tgcaaggacc 3480 ccagccccag cagcagcagc accagcagct acgcgcccag cagcagcagc aacctgagct 3540 gcggcggggg cagcagcgcc agcagcacgt gcagcaagag cagcttcgac tacacgcacg 3600 acatggaggc ggcccacatg gcggccaccg ccatcctcaa cctgtccacg cgctgccgcg 3660 agatgccgca gaacctgagc accaagccgc aggacctgtg cgccacgcgg aaccctgaca 3720 tggaggtgga tgagaacggg accctggacc tcagcatgaa caagcagagg ccgcgggaca 3780 gctgctgccc catcctgacc cctctggagc ccatgtcccc ccagcagcag gcagtgatga 3840 acaaccggtg tttccagctg ggcgagggcg actgctggga cttgcccgta gactacacca 3900 aaatgaaacc ccggaggata gacgaggacg agtccaaaga cattactcca gaagacttgg 3960 acccattcca ggaggctcta gaagaaagac ggtatcccgg ggaggtgacc atcccaagtc 4020 ccaaacccaa gtaccctcag tgcaaggaga gcaaaaagga cttaataact ctgtctggct 4080 gccccctggc ggacaaaagc attcgaagta tgctggccac cagctcccaa gaactcaagt 4140 gccccacgcc tggctgtgat ggttctggac atatcaccgg caattatgct tctcatcgga 4200 gcctttcagg ttgcccaaga gcaaagaaaa gtggtatcag gatagcacag agcaaagaag 4260 ataaagaaga tcaagaaccc atcaggtgtc cggtccccgg gtgcgacggc cagggccaca 4320 tcactgggaa gtacgcgtcc catcgcagcg cctccgggtg ccccttggcg gccaagaggc 4380 agaaagacgg gtacctgaat ggctcccagt tctcctggaa gtcggtcaag acggaaggca 4440 tgtcctgccc cacgccagga tgcgacggct caggccacgt cagcggcagc ttcctcacac 4500 accgcagctt gtcaggatgc ccgagagcca cgtcagcgat gaagaaggca aagctttctg 4560 gagagcagat gctgaccatc aaacagcggg ccagcaacgg tatagaaaat gatgaagaaa 4620 tcaaacagtt agatgaagaa atcaaggagc taaatgaatc caattcccag atggaagccg 4680 atatgattaa actcagaact cagattacca cgatggagag caacctgaag accatcgaag 4740 aggagaacaa agtgattgag cagcagaacg agtctctcct ccacgagctg gcgaacctga 4800 gccagtctct gatccacagc ctggctaaca tccagctgcc gcacatggat ccaatcaatg 4860 aacaaaattt tgatgcttac gtgactactt tgacggaaat gtatacaaat caagatcgtt 4920 atcagagtcc agaaaataaa gccctactgg aaaatataaa gcaggctgtg agaggaattc 4980 aggtctgagc ggccgctcta gaggatccaa gcttatcgat accgtcgacc tcgagggccc 5040 agatctaatt caccccacca gtgcaggctg cctatcagaa agtggtggct ggtgtggcta 5100 atgccctggc ccacaagtat cactaagctc gctttcttgc tgtccaattt ctattaaagg 5160 ttcctttgtt ccctaagtcc aactactaaa ctgggggata ttatgaaggg ccttgagcat 5220 ctggattctg cctaataaaa aacatttatt ttcattgcaa tgatgtattt aaattatttc 5280 tgaatatttt actaaaaagg gaatgtggga ggtcagtgca tttaaaacat aaagaaatga 5340 agagctagtt caaaccttgg gaaaatacac tatatcttaa actccatgaa agaaggtgag 5400 gctgcaaaca gctaatgcac attggcaaca gcccctgatg cctatgcctt attcatccct 5460 cagaaaagga ttcaagtaga ggcttgattt ggaggttaaa gttttgctat gctgtatttt 5520 acattactta ttgttttagc tgtcctcatg aatgtctttt cactacccat ttgcttatcc 5580 tgcatctctc agccttgact ccactcagtt ctcttgctta gagataccac ctttcccctg 5640 aagtgttcct tccatgtttt acggcgagat ggtttctcct cgcctggcca ctcagcctta 5700 gttgtctctg ttgtcttata gaggtctact tgaagaagga aaaacagggg gcatggtttg 5760 actgtcctgt gagcccttct tccctgcctc ccccactcac agtgacccgg aatccctcga 5820 catctagagc atggctacgt agataagtag catggcgggt taatcattaa ctacaaggaa 5880 cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg 5940 cgaccaaagg tcgcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg cctcagtgag cgagcgagcg 6000 cgcagctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc 6060 ctgaatggcg aatggcgatt ccgttgcaat ggctggcggt aatattgttc tggatattac 6120 cagcaaggcc gatagtttga gttcttctac tcaggcaagt gatgttatta ctaatcaaag 6180 aagtattgcg acaacggtta atttgcgtga tggacagact cttttactcg gtggcctcac 6240 tgattataaa aacacttctc aggattctgg cgtaccgttc ctgtctaaaa tccctttaat 6300 cggcctcctg tttagctccc gctctgattc taacgaggaa agcacgttat acgtgctcgt 6360 caaagcaacc atagtacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta 6420 cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc gctttcttcc 6480 cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt 6540 tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat tagggtgatg 6600 gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca 6660 cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct atctcggtct 6720 attcttttga tttataaggg attttgccga tttcggccta ttggttaaaa aatgagctga 6780 tttaacaaaa atttaacgcg aattttaaca aaatattaac gcttacaatt taaatatttg 6840 cttatacaat cttcctgttt ttggggcttt tctgattatc aaccggggta catatgattg 6900 acatgctagt tttacgatta ccgttcatcg attctcttgt ttgctccaga ctctcaggca 6960 atgacctgat agcctttgta gagacctctc aaaaatagct accctctccg gcatgaattt 7020 atcagctaga acggttgaat atcatattga tggtgatttg actgtctccg gcctttctca 7080 cccgtttgaa tctttaccta cacattactc aggcattgca tttaaaatat atgagggttc 7140 taaaaatttt tatccttgcg ttgaaataaa ggcttctccc gcaaaagtat tacagggtca 7200 taatgttttt ggtacaaccg atttagcttt atgctctgag gctttattgc ttaattttgc 7260 taattctttg ccttgcctgt atgatttatt ggatgttgga atcgcctgat gcggtatttt 7320 ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatatggt gcactctcag tacaatctgc 7380 tctgatgccg catagttaag ccagccccga cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga 7440 cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc 7500 atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga gacgaaaggg cctcgtgata 7560 cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt cttagacgtc aggtggcact 7620 tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg 7680 tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt 7740 atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 7800 ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 7860 gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 7920 caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 7980 ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 8040 gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 8100 cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 8160 atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 8220 gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac 8280 ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 8340 ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 8400 atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 8460 ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 8520 gacgagttct tctgactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa 8580 cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa 8640 atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga 8700 tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg 8760 ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact 8820 ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gttcttctag tgtagccgta gttaggccac 8880 cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg 8940 gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg 9000 gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga 9060 acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc 9120 gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg 9180 agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc 9240 tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc 9300 agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt 9360 cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc 9420 gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc 9480 ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag ctgcgcgctc 9540 gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg 9600 cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact aggggttcct 9660 tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctacgta gccatgctct agcggcctcg 9720 gcctctgcat aaataaaaaa aattagtcag ccatgagctt ggcccattgc atacgttgta 9780 tccatatcat aatatgtaca tttatattgg ctcatgtcca acattac 9827 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSYN1_F <400> 6 gtggcactga ccaagacgta 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSYN1_R <400> 7 ctgacgtcct catgtaggcc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hMAP2_F <400> 8 tcctccattc tccctcctcg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hMAP2_R <400> 9 cgaattggct ctgacctggt 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hHb9_F <400> 10 gagcttgaac tggtgctcca 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hHb9_R <400> 11 tctcaacagt aggtgcctgc 20

Claims (14)

  1. 체세포로부터 운동성 신경세포로의 직접교차 분화를 위한 조성물로서,
    상기 조성물은,
    i) Gsta4(Glutathione S-Transferase Alpha 4) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
    ii) Ascl1(Achaete- scute homolog 1), Brn2(POU Class 3 Homeobox 2), Myt1L(Myelin Transcription Factor 1 Like), Hb9(Homeobox HB9), Isl1(ISL LIM homeobox 1), Lhx3(LIM homeobox 3), Ngn2(neurogenin 2) 및 NeuroD1(Neuronal Differentiation 1)의 단백질; 또는 상기 단백질을 코딩하는 핵산;
    을 포함하고,
    이 때, 상기 직접교차 분화는 상기 체세포가 운동성 신경세포 되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 Gsta4 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 이와 동일성이 70% 이상인 서열인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 체세포는 섬유아세포(fibroblast), 상피세포(epithelial cell), 내피세포(endothelial cell), 근육세포, 신경세포, 모발세포, 모근세포, 모낭세포, 구강상피세포, 소변에서 추출한 체세포, 위점막세포, 배상세포, 가스트린 세포(gastrin cell/G cell), B세포, 주피세포, 별아교세포(astrocyte), 혈액세포, 줄기세포 중 선택되는 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 체세포로부터 운동성 신경세포로의 직접교차 분화를 위한 벡터로서,
    상기 벡터는,
    프로모터; 및
    i) Gsta4(Glutathione S-Transferase Alpha 4) 단백질을 코딩하는 핵산; 및
    ii) Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 의 단백질을 코딩하는 핵산;
    을 포함하고,
    상기 i) 및 ii)는 상기 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있고,
    이 때, 상기 직접교차 분화는 상기 체세포가 운동성 신경세포로 되는 것을 특징으로 하는 벡터.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로 바이러스(Retrovirus) 벡터, HIV(Human immunodeficiency virus) 벡터, MLV(Murineleukemia virus)벡터, ASLV(Avian sarcoma/leukosis) 벡터, SNV(Spleen necrosis virus)벡터, RSV(Rous sarcoma virus)벡터, MMTV(Mouse mammary tumor virus) 벡터, 아데노바이러스(Adenovirus) 벡터, 아데노 관련 바이러스 (Adenoassociatedvirus) 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 벡터 및 에피조말 (episomal) 벡터로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 벡터.
  6. 제 4항에 있어서,
    상기 벡터는 선택적으로 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 코작 공통(Kozak consensus) 서열, ITR(inverted terminal repeat), LTR(long terminal repeat), 종결자(terminator), 내부 리보솜 유입 부위(internal ribosome entry site, IRES), 형광 단백질, 글루타티온-S-트랜스 퍼라제(GST), 호스라디시(horseradish) 과산화효소(HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 히스티딘(His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, Myc 태그, 2A 자가 절단 펩타이드(2A self-cleaving peptides) 중 선택되는 하나 이상을 더 포함할 수 있는 것을 특징으로 하는 벡터.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 2A 자가 절단 펩타이드는 T2A, P2A, E2A 및 F2A 중 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 벡터.
  8. 제 4항에 있어서,
    상기 벡터를 포함하는 세포로부터 추출된 바이러스는 조성물 전체를 기준으로 1x105 vg(viral genome)/mL 내지 1x1020 vg(viral genome)/mL 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 벡터.
  9. 체세포로부터 운동성 신경세포로의 직접교차 분화를 위한 방법으로,
    상기 직접교차 분화는 상기 체세포가 운동성 신경세포로 되는 것이고,
    상기 방법은,
    i) Gsta4(Glutathione S-Transferase Alpha 4) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
    ii) Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 의 단백질; 또는 상기 단백질을 코딩하는 핵산;을 포함하는 조성물을 체세포에 도입함;
    을 포함하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 도입은 유전자총, 전기천공법 (electroporation), 리포좀, 플라스미드, 바이러스 벡터, 나노파티클(nanoparticles) 및 PTD (Protein translocation domain) 융합 단백질 방법 중 선택되는 하나 이상으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 9항에 있어서,
    상기 체세포는 섬유아세포(fibroblast), 상피세포(epithelial cell), 내피세포(endothelial cell), 근육세포, 신경세포, 모발세포, 모근세포, 모낭세포, 구강상피세포, 소변에서 추출한 체세포, 위점막세포, 배상세포, 가스트린 세포(gastrin cell/G cell), B세포, 주피세포, 별아교세포(astrocyte), 혈액세포, 줄기세포 중 선택되는 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 9항에 있어서,
    상기 도입으로 1주 내지 7주 이내로 체세포가 운동성 신경세포로 분화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 체세포로부터 운동성 신경세포로의 직접교차 분화된 신경계 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물로서,
    상기 신경계 질환은 척수 손상, 파킨슨병, 뇌졸중, 근위축성 척수측색경화증, 운동 신경손상, 외상에 의한 말초신경손상, 허혈성 뇌손상, 신생아 저산소성 허혈성 뇌손상, 뇌성마비, 간질, 난치성 간질, 알쯔하이머병, 선천성 대사성 신경계질환, 외상성 뇌손상(traumatic brain injury), 운동성 신경세포 손상 또는 이로 유발되는 질환 중 선택되는 하나 이상이고,
    상기 조성물은,
    i) Gsta4(Glutathione S-Transferase Alpha 4) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
    ii) Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 의 단백질; 또는 상기 단백질을 코딩하는 핵산;
    을 포함하고,
    이 때, 상기 직접교차 분화는 상기 체세포가 운동성 신경세포로 되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 허용가능한 담체, 부형제, 희석제, 보존제, 기타 보조제 중 선택되는 하나 이상을 더 포함할 수 있는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5772182A (en) 1996-04-17 1998-06-30 United Technologies Corporation Fuel flow control valve
US5817497A (en) * 1996-11-26 1998-10-06 Incyte Pharmaceuticals Glutathione s-transferase
US9770471B2 (en) * 2011-08-17 2017-09-26 President And Fellows Of Harvard College Conversion of somatic cells into functional spinal motor neurons, and methods and uses thereof
KR101745796B1 (ko) * 2015-10-26 2017-06-09 동국대학교 산학협력단 전자기가 유도된 금속 나노입자를 이용한 신경세포로의 직접교차분화 리프로그래밍 방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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1. Cell Stem Cell. 2011 Sep 2;9(3):205-218.

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