KR102594254B1 - 운동성 신경세포 직접교차 분화용 인자 - Google Patents

운동성 신경세포 직접교차 분화용 인자 Download PDF

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Abstract

본 출원은 체세포로부터 운동성 신경세포로의 직접교차 분화를 위한 신규한 분화인자 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

운동성 신경세포 직접교차 분화용 인자 {Factor for direct Conversion into motor neuron}
본 출원은 운동성 신경세포 직접교차 분화를 위한 신규한 분화인자에 관한 것이다.
본 출원은 상기 신규한 분화인자를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 출원은 상기 조성물을 이용한 직접교차 분화 방법에 관한 것이다.
본 출원은 상기 신규한 분화인자의 다양한 용도에 관한 것이다.
재생의학에서 줄기세포가 많이 이용된다. 줄기세포는 인체를 구성하는 모든 세포로 분화할 수 있는 만능세포로, 이론적으로 모든 종류의 기능세포로 분화 가능하고, 무한 증식이 가능하다. 줄기세포는 그 기원에 따라 배아 줄기세포, 성체 줄기세포, 정원 줄기세포 및 역분화 줄기세포(또는 유도만능 줄기세포, induced pluripotent stem cell) 등이 있다.
하지만, 줄기세포는 종류에 따라 윤리적인 문제, 안정성 문제, 분화 효율이 낮은 문제가 있다. 또한, 역분화 줄기세포는 기형종 형성 가능성 및 낮은 분화 효율의 문제점을 가지고 있다.
줄기세포는 이와 같은 다양한 문제점이 존재하기 때문에, 재생의학 분야에서는 새로운 기술을 요구하고 있다.
최근 각광받고 있는 것이 직접교차 분화 기술이다. 직접교차 분화는 유도만능 줄기세포로 리프로그래밍하고 이를 재분화하여 목적하는 세포로 만드는 과정을 거치치 않고 바로 목적하는 세포로 전환을 유도한다는 점에서 차이를 가진다.
즉, 전혀 다른 세포 타입을 가지는 성숙한(분화가 끝난) 세포 간의 전환을 유도하는 방법이다. 그러나, 종래의 직접교차 분화 방법은 효율이 낮은 한계가 있기 때문에, 이러한 한계를 극복할 수 있는 새로운 방법이 요구되고 있는 실정이다.
한국등록특허 제2217496호 미국 등록특허 제9770471호
Conversion of mouse and human fibroblasts into functional spinal motor neurons. Cell Stem Cell. 2011 Sep 2;9(3):205-18. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nat Neurosci. 2013 Sep;16(9):1219-27.
본 출원의 일 과제는, 운동성 신경세포 직접교차를 위한 신규한 분화인자를 제공하는 것을 목적으로 한다. 특히, 상기 신규한 분화인자는 Gsta4(Glutathione S-transferase A4) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;에 관한 것이다.
본 출원의 다른 과제는, 상기 신규한 분화인자를 포함하는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 출원의 다른 과제는, 상기 조성물을 이용한 직접교차 분화 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 출원의 또 다른 과제는, 상기 신규한 분화인자의 다양한 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 출원은 전술한 상기 과제를 해결하기 위하여,
본 출원은 일 구체예로서, 체세포로부터 유도된 모터뉴런으로의 직접교차 분화를 위한 조성물로, Gsta4(Glutathione S-Transferase Alpha 4) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;을 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 ii) Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 중 선택되는 1개 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 핵산; 을 더 포함할 수 있다.
상기 조성물은 ii)에서 Hb9 및 Lhx3가 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
이 때, Ascl1 단백질은 서열번호 17일 수 있고, Ascl1 단백질을 코딩하는 핵산은 서열번호 18의 서열을 가질 수 있고;
Brn2 단백질은 서열번호 19일 수 있고, Brn2 단백질을 코딩하는 핵산은 서열번호 20의 서열을 가질 수 있고;
Myt1L 단백질은 서열번호 21일 수 있고, Myt1L 단백질을 코딩하는 핵산은 서열번호 22의 서열을 가질 수 있고;
Hb9 단백질은 서열번호 13일 수 있고, Hb9 단백질을 코딩하는 핵산은 서열번호 14의 서열을 가질 수 있고;
Isl1 단백질은 서열번호 23일 수 있고, Isl1 단백질을 코딩하는 핵산은 서열번호 24의 서열을 가질 수 있고;
Lhx3 단백질은 서열번호 15일 수 있고, Lhx3 단백질을 코딩하는 핵산은 서열번호 16의 서열을 가질 수 있고;
Ngn2 단백질은 서열번호 25일 수 있고, Ngn2 단백질을 코딩하는 핵산은 서열번호 26의 서열을 가질 수 있고;
NeuroD1 단백질은 서열번호 27일 수 있고, NeuroD1 단백질을 코딩하는 핵산은 서열번호 28의 서열을 가질 수 있다.
본 출원의 다른 구체예로서, 직접교차 분화를 위한 분화인자 발현을 위한 벡터로서, 상기 직접교차 분화는 체세포로부터 유도된 모터뉴런으로 전환되는 것이고, 상기 벡터는
i) Gsta4 단백질을 암호화하는 핵산; 및 ii) 프로모터;를 포함하고,
이 때, 상기 i)과 ii)는 작동가능하게 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 벡터를 제공할 수 있다.
상기 벡터는 iii) Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 중 선택되는 1개 이상의 단백질을 코딩하는 핵산; 을 더 포함할 수 있다.
직접교차 분화를 위한 분화인자 발현을 위한 벡터로서, 상기 직접교차 분화는 체세포로부터 유도된 모터뉴런으로 전환되는 것이고, 상기 벡터는 적어도, 제 1벡터 및 제 2벡터를 포함할 수 있고,
상기 제 1벡터는,
i) Gsta4 단백질을 암호화하는 핵산; 및 ii) 프로모터;를 포함하고,
이 때, 상기 i)과 ii)는 작동가능하게 연결되어 있고,
상기 제 2벡터는,
iii) Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 중 선택되는 1개 이상의 단백질을 코딩하는 핵산; 및 iv) 프로모터;를 포함하고,
이 때, 상기 iii)과 iv)는 작동가능하게 연결되어 있고,
상기 ii)와 iv)는 서로 동일한 프로모터 또는 상이한 프로모터이고,
상기 iii)은 1개의 벡터에 포함되거나 또는 2개 이상의 벡터에 포함될 수 있는 것을 특징으로 하는 벡터가 제공될 수 있다.
상기 벡터는 바이러스 벡터 또는 비바이러스 벡터일 수 있고, 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV), 백시니아바이러스, 폭스바이러스, HIV(Human immunodeficiency virus), MLV(Murineleukemia virus), ASLV(Avian sarcoma/leukosis), SNV(Spleen necrosis virus), RSV(Rous sarcoma virus), MMTV(Mouse mammary tumor virus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus), 에피조말(episomal), 단순포진 바이러스 중 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 출원의 다른 구체예로서, 직접교차 분화를 위한 방법으로, 체세포로부터 유도된 모터뉴런으로 전환되는 것이고, 상기 방법은, Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물을 체세포에 도입함;을 포함하고, 이 때, 상기 방법은 유도만능줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)가 생성되지 않는 것을 특징으로 하는 방법이 제공될 수 있다.
상기 체세포는 섬유아세포(fibroblast), 상피세포(epithelial cell), 내피세포(endothelial cell), 근육세포, 신경세포, 모발세포, 모근세포, 모낭세포, 구강상피세포, 소변에서 추출한 체세포, 위점막세포, 배상세포, 가스트린 세포(gastrin cell/G cell), B세포, 주피세포, 별아교세포(astrocyte), 혈액세포, 희소돌기아교 전구세포 중 선택되는 하나 이상일 수 있다.
상기 도입으로 1주 내지 7주 이내로 체세포가 유도된 모터뉴런으로 분화될 수 있다.
본 출원의 다른 구체예로서, 체세포로부터 유도된 모터뉴런으로의 직접교차 분화를 위한, Gsta4 단백질;을 포함하는, 신경계 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물이 제공될 수 있다.
또한, 체세포로부터 유도된 모터뉴런으로의 직접교차 분화를 위한, Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;이 도입된 체세포를 포함하는, 신경계 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물이 제공될 수 있다.
상기 약학적 조성물은, Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 중 선택되는 1 이상의 단백질을 코딩하는 핵산;을 더 포함할 수 있다.
체세포로부터 유도된 모터뉴런으로의 직접교차 분화를 위한 분화인자가 과발현되는 모터뉴런을 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물이 제공될 수 있다. 이 때, 상기 모터뉴런은 Gsta4, Ascl1(Achaete-scute homolog 1), Brn2(POU Class 3 Homeobox 2), Myt1L(Myelin Transcription Factor 1 Like), Hb9(Homeobox HB9), ISL1(ISL LIM homeobox 1), Lhx3(LIM homeobox 3), Ngn2(neurogenin 2), NeuroD1(Neuronal Differentiation 1) 중 선택되는 하나 이상의 분화인자가 과발현될 수 있다.
본 출원의 또 다른 구체예로서, 신경계 질환을 예방 또는 치료하는 방법으로,
i) Gsta4 단백질; 또는 ii) Gsta4 단백질; 및 Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 중 선택되는 1개 이상의 단백질; 을 대상에 투여함;
을 포함하고, 상기 직접교차 분화는 유도만능줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)가 생성되지 않는 것을 특징으로 하는 방법이 제공될 수 있다.
신경계 질환을 예방 또는 치료하는 방법으로, Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물;이 도입된 체세포를 대상에 투여함; 을 포함하는 방법이 제공될 수 있다.
신경계 질환을 예방 또는 치료하는 방법으로, 체세포에 Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물;을 도입하여 유도된 모터뉴런을 대상에 투여함; 을 포함하는 방법이 제공될 수 있다.
상기 신경계 질환은 척수 손상, 파킨슨병, 뇌졸증, 근위축성 척수측색경화증, 운동 신경손상, 외상에 의한 말초신경손상, 허혈성 뇌손상, 신생아 저산소성 허혈성 뇌손상, 뇌성마비, 간질, 난치성 간질, 알츠하이머병, 선천성 대사성 신경계질환, 외상성 뇌손상(traumatic brain injury), 운동성 신경세포 손상 또는 이로 유발되는 질환 중 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 출원에 따르면 다음과 같은 효과가 발생된다.
첫째, 본 출원에 의하면, 운동성 신경세포 직접교차 분화를 위한 신규한 분화인자를 제공할 수 있게 된다. 상기 신규한 분화인자는 체세포의 운동성 신경세포로의 효과적인 분화를 가능하게 하는 바, 신경질환의 치료 등에 유용할 수 있다.
도 1은 본 실시예에서 사용한 AAV 벡터 모식도이다.
(a)는 Gsta4를 포함하는 AAV 벡터 모식도; (b)는 Ascl1, Isl1, Lhx3 및 Ngn2(Neurog2로도 불림)를 포함하는 AAV 벡터 모식도; (c)는 Brn2, Hb9(Mnx1로도 불림) 및 NeuroD1 포함하는 AAV 벡터 모식도; (d)는 Gsta4 및 Myt1l을 포함하는 AAV 벡터 모식도; (e)는 Gsta4, Hb9 및 Lhx3을 포함하는 AAV 벡터 모식도;이다.
도 2는 마우스 유래 섬유아세포에 신규한 분화인자 Gsta4를 도입하여 운동성 신경세포로의 직접교차 분화정도를 신경세포 마커(ChaT, Map2)의 발현을 확인한 결과이다. (a)는 면역형광염색법 결과이고, (b)는 (a)의 결과를 수치화한 것이다.
도 3은 인간유래 섬유아세포에 종래 분화인자(Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2, NeuroD1)를 도입하여 운동성 신경세포로의 직접교차 분화 정도를 신경세포 마커(Synapsin, Map2, Hb9)의 발현변화로 확인한 결과이다.
도 4는 마우스 유래 섬유아세포에 신규한 분화인자 Gsta4 및 종래 분화인자(Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2, NeuroD1)를 도입하여 운동성 신경세포로의 직접교차 분화 정도를 신경세포 마커(Synapsin, Map2, Hb9)의 발현변화로 확인한 결과이다.
도 5는 마우스 유래 섬유아세포에 분화인자를 도입하여 운동성 신경세포로의 직접교차 분화정도를 면역형광염색법으로 신경세포 마커(ChaT, Map2)의 발현을 확인한 결과이다. 이 때 사용된 분화인자는 Gsta4 단독; Gsta4 및 종래 분화인자 조합;이다.
도 6은 도 5의 면역형광염색된 세포의 수를 수치화한 그래프이다.
도 7은 마우스 유래 섬유아세포에 분화인자를 도입하여 운동성 신경세포로의 직접교차 분화정도를 신경세포 마커(Synapsin, Map2)의 발현변화로 확인한 결과이다. 이 때 사용된 분화인자는 종래분화 인자 단독; Gsta4 및 종래 분화인자 조합;이다.
도 8은 마우스 유래 섬유아세포에 분화인자를 도입하여 운동성 신경세포로의 직접교차 분화정도를 면역형광염색법으로 신경세포 마커(ChaT, Map2)의 발현을 확인한 결과이다. 이 때 사용된 분화인자는 Mnx1 및 Lhx3 조합; 와 Gsta4, Mnx1 및 Lhx3 조합;을 사용하였다. (a)는 면역형광염색 결과이고, (b)는 (a)의 결과를 수치화한 것이다.
도 9는 마우스 유래 섬유아세포에 분화인자를 도입하여 운동성 신경세포로의 직접교차 분화정도를 신경세포 마커(Synapsin, Map2, Hb9)의 발현을 확인한 결과이다. 이 때 사용된 분화인자는 Gsta4 단독; Mnx1 및 Lhx3 조합; Gsta4, Mnx1 및 Lhx3 조합;을 사용하였다.
도 10은 마우스 유래 섬유아세포에 분화인자를 도입하여 운동성 신경세포의 직접분화 정도를 신경세포 마커(Synapsin, Map2)의 발현을 확인한 결과이다. 이 때 사용된 분화인자는 Ascl1, Brn2 및 Myt1L 조합; Gsta4, Ascl1, Brn2 및 Myt1L 조합;을 사용하였다.
도 11은 인간유래 섬유아세포에 분화인자를 도입하여 운동성 신경세포로의 직접교차 분화 정도를 신경세포 마커(Synapsin, Map2, Hb9)의 발현변화로 확인한 결과이다. 이 때 사용된 분화인자는 Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 조합; Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2, NeuroD1 및 Gsta4 조합;을 사용하였다.
도 12는 마우스 성상세포에 분화인자를 도입하여 운동성 신경세포로의 직접교차 분화정도를 면역형광염색법으로 신경세포 마커(vChaT, Map2)의 발현을 확인한 결과이다. 이 때 사용된 분화인자는 Hb9, Isl1, Lhx3 및 Ascl1 조합; Hb9, Isl1, Lhx3, Ascl1, Brn2, Myt1L 및 Ngn2 조합 (기존 알려진 factors로 기재); 기존 알려진 factors 및 Gsta4 조합;을 사용하였다.
도 13은 인간섬유아세포에 분화인자를 도입하여 운동성 신경세포로의 직접교차 분화정도를 면역형광염색법으로 신경세포 마커(NEUN, Map2)의 발현을 확인한 결과이다.
도 14는 척수 손상으로 인한 하반신 마비 모델인 SCI(Spinal cord injury) 마우스 모델의 척수손상 부위인 L5에 분화인자를 투여(injection으로 표시)하여 형태학적 변화, 생리학적 분석, 행동학적 분석 등을 하기 위한 전반적인 실험 설계도를 나타낸 것이다.
도 15는 SCI 마우스 모델에 분화인자를 투여한 후 척수 손상 부위의 형태학적 변화를 확인하기 위해 크리스탈 바이올렛 염색법의 결과이다. 이 때, Mock은 AAV(Adeno-associated virus)를 투여한 군; Control은 종래 분화인자(Ascl1, Brn2, Myt1l, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 조합)를 도입한 AAV를 투여한 군; +Gsta4는 상기 종래 분화인자 및 Gsta4를 도입한 AAV를 투여한 군;을 지칭한다.
도 16은 SCI 마우스 모델에 분화인자를 투여한 후 운동성 신경세포 마커(ChaT, Map2)의 면역형광염색법을 확인한 결과이다. 이 때, Mock은 AAV(Adeno-associated virus)를 투여한 군; Control은 종래 분화인자(Ascl1, Brn2, Myt1l, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 조합)를 도입한 AAV 를 투여한 군; +Gsta4는 상기 종래 분화인자 및 Gsta4를 도입한 AAV를 투여한 군;을 지칭한다.
도 17은 도 16 내 하얀점선으로 된 네모박스 부분을 확인한 결과이다.
도 18는 도 16의 면역형광염색의 결과를 수치화한 것이다.
도 19은 SCI 마우스 모델에 분화인자를 투여한 후 운동성 신경세포의 전기생리학적 변화를 분석한 결과이다. (a)는 patch clamp를 수행한 신경세포; (b)는 활동전위(Action potential)를 측정한 결과; (c)는 시냅스전 신경세포에서 오는 신호를 측정한 결과;이다. 이 때, Sham은 척수부위가 손상되지 않은 정상군; mock은 SCI 마우스 모델에 AAV를 투여한 군; control은 종래 분화인자(Ascl1, Brn2, Myt1l, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 조합)를 도입한 AAV를 투여한 군; +Gsta4는 상기 종래 분화인자 및 Gsta4를 도입한 AAV를 투여한 군;을 지칭한다.
도 20은 SCI 마우스 모델에 분화인자를 투여한 후 척수 손상부위(L5)에서 하반신 마비 치료효과를 BBB 스코어(Basso Beattie, and Bresnahan score)로 분석한 결과이다. (a)는 (b)의 관찰 결과를 수치화한 그래프이다. 이 때, Sham은 척수부위가 손상되지 않은 정상군; mock은 SCI 마우스 모델에 AAV를 투여한 군; -Gsta4는 종래 분화인자(Ascl1, Brn2, Myt1l, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 조합)를 투여한 군; +Gsta4는 상기 종래 분화인자 및 Gsta4를 투여한 군;을 지칭한다.
도 21는 SCI 마우스 모델에 분화인자를 투여한 후 하반신 마비 치료효과를 행동학적 분석으로 확인한 결과이다. (a)는 Forced swimming test; (b)는 Self urination; (c)는 (a)와 (b)를 수치화한 것; (d)는 Foot printing test;결과를 나타낸다.
달리 정의되지 않는 한, 본 출원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 출원에 기재된 것과 유사 또는 동일한 방법 및 물질이 본 출원의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 이하에 기재된다. 본 출원에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 논문 및 다른 참고문헌은 전체가 참고로 포함된다. 추가로, 물질, 방법 및 실시에는 단지 예시적이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
용어 정의
● 직접교차 분화(Direct Reprogramming / Direct cell-Conversion / Transdifferentiation)
본 출원에서 사용되는 용어 "직접교차 분화(Direct Reprogramming/Direct Conversion/Transdifferentiation)"는 최종적으로 분화된 세포에 분화인자를 도입하여 목적하는 세포로 전환(conversion)시키는 것을 지칭한다. 특히, 직접교차 분화는 전혀 다른 세포타입을 가지는 성숙한 세포간의 전환을 유도한다. 다시 말해, 체세포로부터 전능성 단계(Pluripotent state)를 경유하지 않고 목적하는 세포로 전환시키는 것이다. 용어 직접교차 분화, 직접분화, 직접교차는 상호교환 하여 사용할 수 있다.
● 직접교차 분화 인자(Direct cell-Conversion factor, converting factor)
본 출원에서 용어 “직접교차 분화 인자”는 전술한 직접교차 분화에 관여하는 인자를 지칭한다. 이 때, 상기 분화인자는 유전자, 화합물, 단백질, 핵산 등일 수 있다. 용어 '직접교차 분화 인자(Direct cell-Conversion factor)'는 '분화인자(converting factor)'와 상호교환 하여 사용될 수 있다.
● 유도된 운동성 신경세포(induced Motor Neuron, iMN)
본 출원에서 용어 유도된 운동성 신경세포”는 직접교차 분화로 인해 유도된 운동성 신경세포를 지칭한다. 상기 유도된 운동성 신경세포는 본 출원의 신규 분화인자를 이용하여 체세포 등을 직접교차분화시켜 인위적으로 제작한 운동 뉴런을 의미한다. 용어 '유도된 운동성 신경세포'는 모터뉴런, iMN 와 상호교환 하여 사용될 수 있다.
● 치료
본 출원에서 사용되는 용어 "치료"는 질환, 질병, 증상 등을 완화시키거나 그 진행을 억제하는 것을 의미한다. 상기 치료는 본 발명의 조성물, 직접교차 분화인자 등에 의해 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다. 이러한 치료효과를 나타내는 물질을 통칭하여 “치료제(treatment agent)”또는 “약학적 조성물(pharmaceutical composition)”로 지칭한다. 특히, 유전자 치료제는 질병 치료 등을 목적으로, 인체 내에 유전자를 다양한 형태와 방법으로 전달하는 유전물질을 의미한다. 또한 세포 치료제는 질병 치료 등을 목적으로, 인체 내에 치료물질을 세포의 형태로 전달되는 경우를 의미한다.
● 약(about)
본 출원에서 사용되는 용어 “약”은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
1. 직접교차 분화를 위한 신규한 인자: Gsta4 (glutathione S-transferase alpha 4)
직접교차 분화 특징
직접교차 분화는 완전히 분화된 세포를 줄기세포로의 역분화(reprogramming) 단계 없이 다른 계통의 세포로 만드는 것이다. 이 과정은 완전히 분화된 세포를 줄기세포 단계를 거치지 않고 다른 계통의 특정한 세포로 전환시키는 효과를 나타낸다.
현재까지, 직접교차분화는 2가지 방법론인 SDR(Somatic cell-specific factor-mediated Direct Reprogramming), PDR(Pluripotent cell-specific factor-mediated Direct Reprogramming) 이 제시되고 있다. SDR은 대상세포에 목적하는 세포에서 많이 발현되는 인자를 과발현시켜 목적하는 세포로의 직접교차 분화를 유도하는 것이다. PDR은 유도만능줄기세포 리프로그래밍시 사용되는 인자인 OCT4, SOX2, KLF4, C-Myc을 이용하여 불완전한 중간 단계의 세포 타입(줄기세포와 유사한 세포)으로 탈분화시킨 뒤, 배양배지 조성을 통해 목적하는 세포타입으로 직접교차 분화시키는 것이다. PDR의 경우 여러가지 세포 타입으로 직접교차 분화시키더라도, 초기에 과발현 시켜주는 리프로그래밍 인자 4개(OCT4, SOX2, KLF4, C-Myc)가 공통적으로 사용되고 있다.
공지된 직접교차 분화인자(known Direct cell-Conversion factors)
직접교차 분화를 위해 사용되고 있는 공지의 분화인자로 Ascl1(Achaete-scute homolog 1), Nurr1(Nuclear Receptor Subfamily 4 Group A Member 2), Lmx1a(LIM Homeobox Transcription Factor 1 Alpha), Foxa2(Forkhead box protein A2), Brn2(POU Class 3 Homeobox 2), Sox2(sex determining region Y-box 2), Foxg1(Forkhead Box G1), Lhx3(LIM homeobox 3), HB9(Homeobox HB9), IsL1(ISL LIM homeobox 1), Ngn2(neurogenin 2), NeuroD1(Neuronal Differentiation 1), Myt1l(Myelin Transcription Factor 1 Like), NeuroD2(Neuronal Differentiation 2), miR-9(microRNA-9), miR-124(microRNA-124), Zic1(Zic Family Member 1), Gata5(GATA Binding Protein 5), Hnf4α(Hepatocyte nuclear factor 4 alpha), HNF1α(hepatocyte nuclear factor 1 alpha), Foxa1(Forkhead Box A1), Foxa3(Forkhead Box A3), Tbx5(T-Box Transcription Factor 5), Mef2c(Myocyte Enhancer Factor 2C), Oct4(Octamer-binding transcription factor 4), PRDM16(PR/SET Domain 16), MyoD(myoblast determination protein 1), Klf4(Kruppel-like factor 4), c-Myc(cellular Myc) 등이 알려져 있다(Mol Cell. 2012 Sep 28;47(6):827-838.).
특히, 모터뉴런으로의 직접교차 분화를 위해 사용하는 분화인자로, Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2, NeuroD1 등이 알려져 있다.
종래 직접교차 분화 인자의 문제점
*상기 직접교차 분화는 유도만능줄기세포 단계를 거치지 않고, 전혀 다른 세포 타입을 가지는, 분화가 끝난 세포 간의 전환을 할 수 있다는 장점이 있다. 하지만, 현재까지 알려진 분화인자들은 단독 또는 조합으로 사용시 세포 간의 전환 효율이 낮거나 거의 없다는 문제가 있어왔다.
직접교차 분화를 위한 신규한 인자 Gsta4 개괄
본 출원은 직접교차 분화를 위한 신규한 인자인 Gsta4(glutathione S-transferase alpha 4)를 개시한다.
상기 Gsta4는 단독으로 사용해도 체세포를 모터뉴런으로 효과적으로 직접교차 분화시킬 수 있다. 나아가, 상기 Gsta4는 종래 직접교차 분화인자와 함께 사용하면, 종래 분화인자만 사용하는 경우와 비교하여, 모터뉴런으로의 분화 효율을 보다 더 높일 수 있다.
이하, 신규한 분화인자인 Gsta4에 대해 더 구체적으로 설명한다.
Gsta4의 종래 알려진 기능
Gsta4는 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST, glutathione S-transferases)에 속하는 효소이다. 포유류의 세포질에는 8가지의 GST인 알파(alpha), 카파(kappa), 뮤(mu), 오메가(omega), 파이(pi), 시그마(sigma), 테타(theta) 및 제타(zeta)가 생산되는 것으로 알려져 있다. 그 중 알파는 6번 염색체에 있으며 GSTA1, GSTA2, GSTA3, GSTA4, GSTA5 등이 있다.
GTA4로도 불리는 Gsta4는 상기 Gsta4는 세포 방어 기작, 독소 분해, 항암 효과에 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한, 활성산소를 줄임으로써 세포 스트레스를 줄이는 데에도 큰 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 그리고 Gsta4의 부재는 파킨슨병, 알츠하이머 등의 질환에 있어서 부정적인 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 그러나, 세포 간의 직접교차분화 인자로의 기능은 보고된 바 없다.
Gsta4의 신규 기능
본 출원은 직접교차 분화를 가능하게 하는, Gsta4의 신규한 기능을 개시한다. 즉, 직접교차 분화를 위한 신규한 분화인자로서 Gsta4를 개시한다.
특히, 본 출원의 Gsta4가 체세포를 모터뉴런으로 전환(직접교차 분화)시키는 기능을 가진다는 것은 기존에 보고된 바 없으며, 본 발명자가 실험적으로 확인하여 발굴한 것이다. 이하에서 기재하는 Gsta4 용어는 신규기능인 직접교차 분화인자로 작동하는 것으로 해석한다. 또한, 이하에서 편의상 Gsta4로 기재하는 경우, 문맥에 따라 Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 지칭하는 것으로 해석한다.
Gsta4의 형태(1) - Gsta4 단백질
일 태양으로, 본 출원은 직접교차 분화를 위한 Gsta4 단백질을 개시한다.
상기 Gsta4 단백질은 야생형 또는 변이체일 수 있다. 상기 변이체는 야생형의 아미노산 서열 중 1 이상이 결실, 치환, 삽입된 것일 수 있다. 또한 상기 Gsta4 변이체는 야생형 아미노산 서열과 서열 동일성(sequence identity)을 가진 서열일 수 있다. 이 때, 서열 동일성은 50% 내지 99%일 수 있다. 바람직하게는 Gsta4 단백질은 야생형 아미노산 서열과 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다.
임의의 실시예로, 본 출원의 직접교차를 위한 Gsta4 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열일 수 있다.
서열번호 1: maarpklhyp ngrgrmesvr wvlaaagvef deefletkeq lyklqdgnhl lfqqvpmvei dgmklvqtrs ilhyiadkhn lfgknlkert lidmyvegtl dllellimhp flkpddqqke vvnmaqkaii ryfpvfekil rghgqsflvg nqlsladvil lqtilaleek ipnilsafpf lqeytvklsn iptikrflep gskkkpppde iyvrtvynif rp
다른 실시예로, Gsta4 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가지는 서열일 수 있다.
Gsta4의 형태(2) - Gsta4 단백질을 코딩하는 핵산
*다른 예로, 본 출원은 직접교차 분화를 위한 Gsta4 단백질을 코딩하는 핵산을 개시한다. 상기 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다.
상기 Gsta4 단백질을 코딩하는 핵산은 야생형 또는 변이체일 수 있다. 상기 변이체는 야생형의 핵산 서열 중 1 이상이 결실, 치환, 삽입된 것일 수 있다. 또한 상기 Gsta4 변이체는 야생형 단백질을 코딩하는 핵산 서열과 서열 동일성(sequence identity)을 가진 서열일 수 있다. 이 때, 서열 동일성은 50% 내지 99%일 수 있다. 바람직하게는 Gsta4 단백질을 코딩하는 핵산은 야생형 핵산 서열과 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 이상의 서열 동일성인 서열을 가질 수 있다.
Gsta4 단백질을 코딩하는 핵산서열은 공지된 서열일 수 있다.
상기 핵산서열은 인트론 및 엑손 서열을 포함할 수 있다.
상기 핵산서열은 엑손 서열만 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 Gsta4 단백질을 코딩하는 핵산서열은 인트론이 제외된 CDS(Coding Sequence) 서열을 포함할 수 있다.
상기 핵산 서열은 Gsta4 단백질을 코딩하는 DNA 서열 및 이에 상응하는(전사 결과물인) mRNA 서열일 수 있다.
상기 핵산 서열은 Gsta4 유전자의 엑손 서열에 상응하는(전사 결과물인) mRNA 서열일 수 있다
일 구체예에서, Gsta4 단백질을 코딩하는 핵산은 Gsta4 유전자의 전장 DNA 서열(full DNA sequence)인 서열번호 2를 포함할 수 있다.
서열번호 2: gctttgtgcg gctccaggcc tccgagtgga ctccagaaag cctgaaaagc tatcatggca gcaaggccca agctccacta tcccaacgga agaggccgga tggagtccgt gagatgggtt ttagctgccg ccggagtcga gtttgatgaa gaatttctgg aaacaaaaga acagttgtac aagttgcagg atggtaacca cctgctgttc caacaagtgc ccatggttga aattgacggg atgaagttgg tacagacccg aagcattctc cactacatag cagacaagca caatctcttt ggcaagaacc tcaaggagag aaccctgatt gacatgtacg tggaggggac actggatctg ctggaactgc ttatcatgca tcctttctta aaaccagatg atcagcaaaa ggaagtggtt aacatggccc agaaggctat aattagatac tttcctgtgt ttgaaaagat tttaaggggt cacggacaaa gctttcttgt tggtaatcag ctgagccttg cagatgtgat tttactccaa accattttag ctctagaaga gaaaattcct aatatcctgt ctgcatttcc tttcctccag gaatacacag tgaaactaag taatatccct acaattaaga gattccttga acctggcagc aagaagaagc ctccccctga tgaaatttat gtgagaaccg tctacaacat ctttaggcca taaaacaaca catccatgtg tgagtgacag tgtgttccta gagatggtat tgtctacagt catgtcttaa tggatcccag ctctgtcatg gtgctatcta tgtattaagt tgggtcctaa gttgggtctt ttgtgtcaac gagatcatct cttctagaaa tatcaacctt ttttgtccag taaataattg ttaggggatc tttattggaa aacttttttg gagaggctgg tatttaagtt agatctgatt gggctactca tgtcctgtag ccagttcatc ctcataataa gaatgggcag gatctcttgt tctctcctga gtgtctttct actctcctga gcgtctttct gctctcctta tcctgttctc ttatccttat cccctccagt ctctgcctaa tttttagtgt ttaataacaa ccgaatgtct agtaaatgac tctcctctga gctgtaataa ataaaatggt agtaatgaat gcaatcagta ttagccaaaa taaagaattt atgagtcatt
다른 구체예에서, Gsta4 단백질을 코딩하는 핵산은 CDS 서열인 서열번호 12를 가질 수 있다.
서열번호 12: Atggcagcaaggcccaagctccactatcccaacggaagaggccggatggagtccgtgagatgggttttagctgccgccggagtcgagtttgatgaagaatttctggaaacaaaagaacagttgtacaagttgcaggatggtaaccacctgctgttccaacaagtgcccatggttgaaattgacgggatgaagttggtacagacccgaagcattctccactacatagcagacaagcacaatctctttggcaagaacctcaaggagagaaccctgattgacatgtacgtggaggggacactggatctgctggaactgcttatcatgcatcctttcttaaaaccagatgatcagcaaaaggaagtggttaacatggcccagaaggctataattagatactttcctgtgtttgaaaagattttaaggggtcacggacaaagctttcttgttggtaatcagctgagccttgcagatgtgattttactccaaaccattttagctctagaagagaaaattcctaatatcctgtctgcatttcctttcctccaggaatacacagtgaaactaagtaatatccctacaattaagagattccttgaacctggcagcaagaagaagcctccccctgatgaaatttatgtgagaaccgtctacaacatctttaggccataa
다른 실시예로, Gsta4 단백질을 코딩하는 핵산은 서열번호 2로 표시되는 DNA 서열과 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 이상의 서열 동일성인 서열을 가질 수 있다.
다른 실시예로, Gsta4 단백질을 코딩하는 핵산은 서열번호 12로 표시되는 CDS서열과 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 이상의 서열 동일성인 서열을 가질 수 있다.
Gsta4의 특징(1)
본 출원의 신규한 직접교차 분화인자인 Gsta4는 체세포를 모터뉴런으로 직접적으로 전환시킬 수 있다. 일 예로, Gsta4는 섬유아세포를 모터뉴런으로 전환시킨다. 다른 예로, Gsta4는 성상세포를 모터뉴런으로 전환시킨다.
Gsta4의 특징(2)
종래 분화인자들의 문제점은 직접교차 분화효율이 낮거나 거의 없는 데 있다. 이에 반해 본 출원의 신규한 분화인자인 Gsta4는 종래 분화인자들에 비해 높은 직접교차 분화 효율을 가진다. 일 예로, Gsta4는 단독으로 사용한 경우, 종래 분화인자에 비해 분화효율이 약 2~10배 높을 수 있다.
Gsta4의 특징(3)
Gsta4는 분화효율이 낮거나 거의 없는 종래 분화인자들의 분화효율을 높여주는 부스팅 기능(boosting function)을 가진다. 상기 부스팅 기능은 종래 분화인자만 사용하는 경우와 비교하여, 종래 분화인자를 Gsta4와 함께 사용하면 분화 효율이 현저히 상승하는 기능을 일컫는다. 일 예로, Gsta4는 종래 분화인자들과 조합하여 사용한 경우, 그렇지 않은 경우에 비해 직접교차 분화 효율을 약 2~10배 높여줄 수 있다.
Gsta4의 특징(4)
Gsta4는 체세포로부터 모터 뉴런으로 직접적으로 유도하는 효과가 있기 때문에, 운동성 신경세포의 손상으로 인해 유발되는 신경계 질환의 치료에 사용될 수 있다. 또한, Gsta4와 종래 직접교차 분화인자를 함께 사용하여 신경계 질환의 치료 효과를 향상시킬 수 있다.
일 예로, Gsta4를 신경계 질환의 치료 대상에 투여시, 염증세포로 인한 스카 감소, 활동 전위 증가, 시냅스전 신경세포들 사이의 신호 전달 등이 증가될 수 있다.
2. Gsta4와 조합가능한 분화인자
Gsta4와 조합가능한 분화인자 개괄
본 출원의 일 태양으로, 전술한 직접교차 분화를 위한 신규한 분화인자인 Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산은 단독 사용뿐만 아니라, 공지 분화인자(known Direct cell-Conversion factor, knowne-DC factor)와 함께 사용할 수 있다.
Gsta4를 종래 공지의 분화인자와 함께 조합하여 사용하면 직접교차 분화효율이 향상될 뿐만 아니라, 직접교차 분화시 분화에 소요되는 시간이 줄어들 수 있다.
상기 공지 분화인자는 직접교차 분화에 관여하는 인자로 알려진 것이라면 제한하지 않는다. 또한, 종래 분화인자의 변이체도 포함될 수 있다. 이 때, 변이체는 야생형의 아미노산 서열 또는 핵산 서열 중 1 이상이 결실, 치환, 삽입된 것일 수 있다.
일 예로, 상기 종래 분화인자는 Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 중 선택되는 1개 이상 일 수 있다.
일 구현예에서, 본 출원은 Gsta4 및 1 이상의 공지 분화인자의 조합을 개시한다.
이하, Gsta4와 종래 분화인자의 조합가능한 조합예에 대해 더 구체적으로 설명한다.
Gsta4와 종래 분화인자의 조합예(1)
상기 Gsta4는 Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 중 선택되는 1개의 종래 분화인자와 조합되어 사용될 수 있다.
이 때, 상기 조합은 예를 들어, Gsta4+Brn2(Gsta4 및 Brn2의 조합을 지칭); Gsta4+Ascl1; Gsta4+Hb9; Gsta4+Lhx3; Gsta4+Myt1L; Gsta4+Isl1; Gsta4+ Ngn2; Gsta4+NeuroD1; 등에서 선택될 수 있다.
Gsta4와 종래 분화인자의 조합예(2)
상기 Gsta4는 Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 중 선택되는 2개의 종래 분화인자와 조합되어 사용될 수 있다.
*이 때, 상기 조합은 예를 들어, Gsta4+Brn2+Hb9(Gsta4, Brn2 및 HB9의 조합을 지칭); Gsta4+Ascl1+Hb9; Gsta4+Lhx3+Hb9; Gsta4+Ngn2+Hb9; Gsta4+Ngn2+NeuroD1; Gsta4+Lhx3+Ngn2; Gsta4+Lhx3+NeuroD1; 등에서 선택될 수 있다.
Gsta4와 종래 분화인자의 조합예(3)
상기 Gsta4는 Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 중 선택되는 3개의 종래 분화인자와 조합되어 사용될 수 있다.
이 때, 상기 조합은 예를 들어, Gsta4+Brn2+Hb9+Ascl1(Gsta4, Brn2, Hb9 및 Ascl1의 조합을 지칭); Gsta4+Brn2+Hb9+NeuroD1; Gsta4+Ascl1+Hb9+NeuroD1; Gsta4+Lhx3+Hb9+NeuroD1; Gsta4+Lhx3+Hb9+Ngn2; Gsta4+Lhx3+Ngn2+NeuroD1; Gsta4+ Hb9+Ngn2+NeuroD1; 등에서 선택될 수 있다.
Gsta4와 종래 분화인자의 조합예(4)
상기 Gsta4는 Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 중 선택되는 4개의 종래 분화인자와 조합되어 사용될 수 있다.
이 때, 상기 조합은 예를 들어, Gsta4+Brn2+Hb9+Ascl1+Isl1(Gsta4, Brn2, Hb9, Ascl1 및 Isl1의 조합을 지칭); Gsta4+Ascl1+Brn2+Myt1L+Hb9; Gsta4+Brn2+Hb9+NeuroD1+Isl1; Gsta4+Ascl1+Hb9+NeuroD1+Isl1; Gsta4+Lhx3+Hb9+NeuroD1+Isl1; Gsta4+Lhx3+Hb9+Ngn2+Isl1; Gsta4+Lhx3+Ngn2+NeuroD1+Isl1; Gsta4+ Hb9+Ngn2+NeuroD1+Isl1; 등에서 선택될 수 있다.
Gsta4와 종래 분화인자의 조합예(5)
상기 Gsta4는 Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 중 선택되는 5개의 종래 분화인자와 조합될 수 있다.
이 때, 상기 조합은 예를 들어, Gsta4+Brn2+Hb9+Ascl1+Isl1+NeuroD1(Gsta4, Brn2, Hb9, Ascl1, Isl1 및 NeuroD1의 조합을 지칭); Gsta4+Ascl1+Brn2+Ngn2+Isl1+Lhx3; Gsta4+Brn2+Hb9+NeuroD1+Isl1+Lhx3; Gsta4+Ascl1+Hb9+NeuroD1+Isl1+Lhx3; Gsta4+Lhx3+Hb9+NeuroD1+Isl1+Ascl1; Gsta4+Lhx3+Hb9+Ngn2+Isl1+NeuroD1; Gsta4+Lhx3+Ngn2+NeuroD1+Isl1+Ascl1; Gsta4+Hb9+Ngn2+NeuroD1+Isl1+Ascl1; 등에서 선택될 수 있다.
Gsta4와 종래 분화인자의 조합예(6)
상기 Gsta4는 Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 중 선택되는 6개의 종래 분화인자와 조합될 수 있다.
이 때, 상기 조합은 예를 들어, Gsta4+Brn2+Hb9+Ascl1+Isl1+NeuroD1+Lhx3(Gsta4, Brn2, Hb9, Ascl1, Isl1, NeuroD1 및Lhx3의 조합을 지칭); Gsta4+Ascl1+Brn2+Ngn2+Isl1+Lhx3+Myt1L; Gsta4+Brn2+Hb9+NeuroD1+Isl1+Lhx3+Ngn2; Gsta4+Ascl1+Hb9+NeuroD1+Isl1+Lhx3+Ngn2; 등에서 선택될 수 있다.
Gsta4와 종래 분화인자의 조합예(7)
상기 Gsta4는 Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 중 선택되는 7개의 종래 분화인자와 조합될 수 있다.
이 때, 상기 조합은 예를 들어, Gsta4+Brn2+Myt1L+Hb9+Isl1+Lhx3+Ngn2+NeuroD1(Gsta4, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1의 조합을 지칭); Gsta4+Ascl1+Myt1L+Hb9+Isl1+Lhx3+Ngn2+NeuroD1; Gsta4+Ascl1+Brn2+Hb9+Isl1+Lhx3+Ngn2+NeuroD1; Gsta4+Ascl1+Brn2+Myt1L+Isl1+Lhx3+Ngn2+NeuroD1; Gsta4+Ascl1+Brn2+Myt1L+Hb9+Lhx3+Ngn2+NeuroD1; Gsta4+Ascl1+Brn2+Myt1L+Hb9+Isl1+Ngn2+NeuroD1; Gsta4+Ascl1+Brn2+Myt1L+Hb9+Isl1+Lhx3+NeuroD1; Gsta4+Ascl1+Brn2+Myt1L+Hb9+Isl1+Lhx3+Ngn2; 등에서 선택될 수 있다.
Gsta4와 종래 분화인자의 조합예(8)
상기 Gsta4는 Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1의 8개의 종래 분화인자와 조합될 수 있다.
Gsta4와 종래 분화인자의 조합비율
전술한 바와 같이, Gsta4와 종래 분화인자는 다양하게 조합하여 사용할 수 있다.
이 때, 직접교차 분화를 위해 Gsta4와 종래 분화인자 각각을 동일한 비율로 사용할 수 있다.
일 예로, Gsta4와 종래 분화인자 1개를 사용할 경우, 1:1의 비율로 사용될 수 있다.
다른 예로, Gsta4와 종래 분화인자 2개를 사용할 경우, 1:1:1, 2:1:1, 2:1:2, 1:2:1 등의 비율로 사용될 수 있다.
다른 예로, Gsta4와 종래 분화인자 3개를 사용할 경우, 1:1:1:1의 비율로 사용될 수 있다.
또한, 직접교차 분화를 위해 Gsta4와 종래 분화인자 각각을 상이한 비율로 사용할 수 있다.
일 구체예로, Gsta4, Hb9 및 Lhx3를 사용할 경우, 1:1:1, 2:1:1, 2:1:2 또는 1:2:1의 비율로 사용될 수 있다.
3. Gsta4를 포함하는 조성물
Gsta4를 포함하는 조성물 개괄
본 출원은 상기 전술한 신규한 분화인자인 Gsta4를 필수적으로 포함하는 조성물을 개시한다.
일 예로, 상기 조성물은 Gsta4만 단독으로 포함할 수 있다.
다른 예로 상기 조성물은 Gsta4 및 종래 분화인자를 조합하여 포함할 수 있다. 이러한 조합의 예시로써, 전술한 조합예 (1) 내지 (8)에 기재된 예를 들 수 있다.
이때, 각 분화인자는 각 단백질을 구성하는 아미노산 서열로 조성물에 포함될 수 있다.
또는, 각 분화인자는 각 단백질을 코딩하는 핵산 서열로 조성물에 포함될 수 있다.
일 구체예로, Gsta4 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 1일 수 있고, Gsta4 단백질을 코딩하는 핵산은 서열번호 2 또는 12의 서열을 가질 수 있다.
일 구체예로, Ascl1 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 17일 수 있고, Ascl1 단백질을 코딩하는 핵산은 서열번호 18의 서열을 가질 수 있다.
일 구체예로, Brn2 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 19일 수 있고, Brn2 단백질을 코딩하는 핵산은 서열번호 20의 서열을 가질 수 있다.
일 구체예로, Myt1L 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 21일 수 있고, Myt1L 단백질을 코딩하는 핵산은 서열번호 22의 서열을 가질 수 있다.
일 구체예로, Hb9 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 13일 수 있고, Hb9 단백질을 코딩하는 핵산은 서열번호 14의 서열을 가질 수 있다.
일 구체예로, Isl1 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 23일 수 있고, Isl1 단백질을 코딩하는 핵산은 서열번호 24의 서열을 가질 수 있다.
일 구체예로, Lhx3 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 15일 수 있고, Lhx3 단백질을 코딩하는 핵산은 서열번호 16의 서열을 가질 수 있다.
일 구체예로, Ngn2 단백질은 서열번호 25일 수 있고, Ngn2 단백질을 코딩하는 핵산은 서열번호 26의 서열을 가질 수 있다.
일 구체예로, NeuroD1 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 27일 수 있고, NeuroD1 단백질을 코딩하는 핵산은 서열번호 28의 서열을 가질 수 있다.
이하에서는, 상기 조성물에 대해 더 구체적으로 설명한다.
조성물 구성예
조성물(1): Gsta4 단독 포함
본 출원의 조성물은 Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;을 포함할 수 있다.
또한, 본 출원의 조성물은 상기 단백질 변이체 또는 상기 핵산 변이체를 포함할 수 있다.
조성물(2): Gsta4 + 종래 분화인자 1개 포함
본 출원의 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
ii) Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 중 선택되는 1개의 단백질; 또는 상기 선택된 단백질을 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
ii) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
ii) Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
ii) Myt1L 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
ii) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;을 포함할 수 있다. 이 때,
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
ii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
ii) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
ii) NeuroD1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;을 포함할 수 있다.
조성물(3): Gsta4 + 종래 분화인자 2개 포함
본 출원의 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
ii) Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 중 선택되는 2개의 단백질; 또는 상기 선택된 2개의 단백질을 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
iii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
iii) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
iii) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
iii) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
iii) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
iii) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
iii) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
iii) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
iii) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
조성물(4): Gsta4 + 종래 분화인자 3개 포함
본 출원의 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
ii) Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 중 선택되는 3개의 단백질; 또는 상기 선택된 3개의 단백질을 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
iv) NeuroD1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
iv) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
iv) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
iv) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
iv) Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
iv) Myt1L 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
iv) NeuroD1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
iv) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
iv) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
iv) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
iv) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
조성물(5): Gsta4 + 종래 분화인자 4개 포함
본 출원의 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
ii) Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 중 선택되는 4개의 단백질; 또는 상기 선택된 4개의 단백질을 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Myt1L 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
v) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
v) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
v) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
v) Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
v) Myt1L 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
v) NeuroD1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
v) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
v) Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
v) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
v) Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
조성물(6): Gsta4 + 종래 분화인자 5개 포함
본 출원의 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
ii) Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 중 선택되는 5개의 단백질; 또는 상기 선택된 5개의 단백질을 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
v) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
vi) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
v) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
vi) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
v) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
vi) Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
v) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
vi) Myt1L 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
v) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
vi) NeuroD1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
*v) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
vi) Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
v) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
vi) Myt1L 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
v) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
vi) NeuroD1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
v) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
vi) Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
v) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
vi) Myt1L 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
*을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
v) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
vi) NeuroD1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
v) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
vi) Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
v) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
vi) Myt1L 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
v) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
vi) NeuroD1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
v) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
vi) Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
v) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
vi) Myt1L 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
v) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
vi) NeuroD1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
조성물(7): Gsta4 + 종래 분화인자 6개 포함
본 출원의 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
ii) Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 중 선택되는 6개의 단백질; 또는 상기 선택된 6개의 단백질을 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
v) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
vi) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
vii) Myt1L 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
v) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
vi) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
vii) Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
v) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
vi) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
vii) Myt1L 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
v) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
vi) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
vii) NeuroD1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
v) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
vi) Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
vii) Myt1L 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
v) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
vi) Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
vii) NeuroD1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
v) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
vi) Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
vii) NeuroD1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
v) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
vi) Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
vii) Myt1L 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
v) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
vi) Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
vii) NeuroD1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
v) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
vi) Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
vii) Myt1L 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
v) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
vi) Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
vii) NeuroD1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
v) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
vi) Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
vii) Myt1L 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
v) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
vi) Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
vii) NeuroD1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
조성물(8): Gsta4 + 종래 분화인자 7개 포함
본 출원의 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
ii) Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 중 선택되는 7개의 단백질; 또는 상기 선택된 7개의 단백질을 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Myt1L 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
v) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
vi) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
vii) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
viii) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
v) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
vi) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
vii) Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
viii) Myt1L 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
v) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
vi) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
vii) Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
viii) NeuroD1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
v) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
vi) Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
vii) Myt1L 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
viii) NeuroD1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
v) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
vi) Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
vii) Myt1L 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
viii) NeuroD1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
v) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
vi) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
vii) Myt1L 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
viii) NeuroD1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
v) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
vi) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
vii) Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
viii) NeuroD1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
v) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
vi) Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
vii) Myt1L 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
viii) NeuroD1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
v) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
vi) Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
vii) Myt1L 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
viii) NeuroD1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
예를 들어, 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iii) Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
iv) Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
v) Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
vi) Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
vii) Myt1L 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
viii) NeuroD1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
조성물(9): Gsta4 + 종래 분화인자 8개 포함
본 출원의 조성물은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
ii) Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1의 단백질; 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함할 수 있다.
여기서, 전술한 조성물은 단백질 형태, 핵산 형태, 단백질 및 핵산이 혼합된 형태를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이 때, 상기 핵산은 DNA, RNA, DNA 및 RNA가 혼합된 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 조성물은, 포함되어 있는 모든 인자들이 단백질 형태로 포함되어 있을 수 있다.
다른 예에서, 상기 조성물은, 포함되어 있는 모든 인자들이 핵산 형태로 포함되어 있을 수 있다.
또 다른 예에서, 상기 조성물은, 포함되어 있는 인자들의 일부는 단백질 형태로, 다른 일부는 핵산 형태로 포함되어 있을 수 있다.
이 때, 상기 핵산 형태는 벡터 형태일 수 있다. 이 때, 상기 벡터는 1개 또는 2개 이상의 벡터로 구성될 수 있다.
또한, 상기 조성물은 바이러스 캡시드를 포함할 수 있다.
이 때, 상기 분화인자는 바이러스 캡시드에 포함되어 전달될 수 있다.
일 예로, 본 출원의 약학적 조성물은 Gsta4 단독 유전자를 포함한 바이러스 캡시드를 포함할 수 있다.
다른 예로, 상기 조성물은 Gsta4를 포함한 바이러스 캡시드; 및
Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1의 중 선택되는 1이상을 포함하는 바이러스 캡시드를 함께 포함할 수 있다.
분화인자 발현용 벡터 (Vector for expression of converting factor)
일 예로, 상기 조성물은 분화인자 발현용 벡터를 포함할 수 있다. 이 때, 상기 벡터는 Gsta4 단백질을 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 또는 상기 Gsta4 단백질을 암호화하는 핵산 외에 종래 분화인자를 암호화하는 핵산;을 추가로 더 포함할 수 있다.
상기 벡터는 대상 세포 내에서 목적하는 분화인자를 효과적으로 발현시키는 기능을 가지고 있고, 이를 위해, 프로모터, 인핸서 등 필요한 기타 추가구성을 더 포함할 수 있다.
벡터의 필수적 구성 - Gsta4 단백질을 암호화하는 핵산
상기 벡터는 Gsta4 단백질을 암호화하는 핵산을 필수로 포함한다.
상기 암호화하는 핵산은 Gsta4 유전자의 전장 서열 또는 일부 서열일 수 있다.
예를 들어, 상기 일부 서열은 Gsta4의 엑손 서열일 수 있다. 이 때, 상기 엑손 서열은 Gsta4 유전자의 서열 중 인트론이 제외된 CDS(Coding Sequence) 서열일 수 있다.
일 예로, 벡터는 서열번호 2 또는 서열번호 12의 DNA서열을 포함할 수 있다.
벡터의 선택적 구성 - 종래 분화인자를 암호화하는 핵산
상기 벡터는 Gsta4 단백질을 암호화하는 핵산 외에 종래 분화인자를 암호화하는 핵산을 선택적으로 더 포함할 수 있다. 상기 Gsta4 및 종래 분화인자를 암호화하는 핵산은 1개의 벡터에 포함되거나 또는 2개 이상의 벡터에 포함될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 벡터는 Gsta4와 종래 분화인자의 조합예 (1) 내지 (8) 중 선택된 분화 인자들의 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다.
예를 들어, 벡터는,
i) 서열번호 2 및 서열번호 12 중 선택되는 서열; 및
ii) 서열번호 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 및 28 중 선택되는 1개의 서열;을 포함할 수 있다.
예를 들어, 발현벡터는,
i) 서열번호 2 및 서열번호 12 중 선택되는 서열; 및
ii) 서열번호 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 중 선택되는 2개의 서열;을 포함할 수 있다.
예를 들어, 발현벡터는,
i) 서열번호 2 및 서열번호 12 중 선택되는 서열; 및
ii) 서열번호 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 중 선택되는 3개의 서열;을 포함할 수 있다.
예를 들어, 발현벡터는,
i) 서열번호 2 및 서열번호 12 중 선택되는 서열; 및
ii) 서열번호 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 중 선택되는 4개의 서열;을 포함할 수 있다.
예를 들어, 발현벡터는,
i) 서열번호 2 및 서열번호 12 중 선택되는 서열; 및
ii) 서열번호 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 중 선택되는 5개의 서열;을 포함할 수 있다.
예를 들어, 발현벡터는,
i) 서열번호 2 및 서열번호 12 중 선택되는 서열; 및
ii) 서열번호 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 중 선택되는 6개의 서열;을 포함할 수 있다.
예를 들어, 발현벡터는,
i) 서열번호 2 및 서열번호 12 중 선택되는 서열; 및
ii) 서열번호 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 중 선택되는 7개의 서열;을 포함할 수 있다.
예를 들어, 발현벡터는,
i) 서열번호 2 및 서열번호 12 중 선택되는 서열; 및
ii) 서열번호 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 및 28의 서열;을 포함할 수 있다.
벡터의 부가 구성(additional component) (1)
상기 벡터는 목적 단백질의 필수적 구성 및 선택적 구성 이외에, 세포 내에서 분화인자 발현에 필요한 부가 구성을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 부가 구성은 발현 조절 요소, 선별 요소 등을 포함할 수 있다.
상기 발현 조절 요소는 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 코작 공통(Kozak consensus) 서열, ITR(inverted terminal repeat), LTR(long terminal repeat), 종결자(terminator), 내부 리보솜 유입 부위(internal ribosome entry site, IRES), 2A 자가 절단 펩타이드(2A self-cleaving peptides) 등일 수 있다.
예를 들어, 상기 프로모터는 SV40 초기 프로모터, LTR(mouse mammary tumor virus long terminal repeat) 프로모터, Ad MLP(adenovirus major late) 프로모터, HSV(herpes simplex virus) 프로모터, CMV(cytomegalovirus) 프로모터, RSV(rous sarcoma virus) 프로모터, U6 프로모터 등일 수 있다.
예를 들어, 상기 2A 자가 절단 펩타이드는 T2A, P2A, E2A, F2A 등일 수 있다. 상기 분화인자 발현을 위한 벡터는 2A 자가 절단 펩타이드를 1개 이상 포함하고 있을 수 있다. 이 때, 상기 2A 자가 절단 펩타이드는 동일한 트랜스크립트(transcript)에서 여러 단백질을 생성한다. 그래서, 벡터 내에서 발현을 목적하는 2개 이상의 서로 다른 단백질 사이에 2A 자가 절단 펩타이드가 위치할 수 있다.
상기 선별 요소는 형광 단백질 유전자, 태그(tag), 리포터 유전자, 항생제 내성 유전자 등일 수 있다.
예를 들어, 상기 형광 단백질 유전자는 GFP 유전자(GFP gene), YFP 유전자(YFP gene), RFP 유전자(RFP gene) 또는 mCherry 유전자(mCherry gene) 등일 수 있다.
예를 들어, 상기 태그는 히스티딘(His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그 및 티오레독신(Trx) 태그 등일 수 있다.
예를 들어, 상기 리포터 유전자는 글루타티온-S-트랜스 퍼라제(GST), 호스라디시(horseradish) 과산화효소(HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제 등일 수 있다.
예를 들어, 상기 항생제 내성 유전자는 하이그로마이신 저항성 유전자(hygromycin resistant gene), 네오마이신 저항성 유전자(neomycin resistant gene), 카나마이신 저항성 유전자(kanamycin resistant gene), 블라스티사이딘 저항성 유전자(blasticidin resistant gene), 제오신 저항성 유전자(zeocin resistant gene) 등일 수 있다.
본 출원의 벡터는 필구적 구성, 선택적 구성 및 부가 구성을 포함하여 목적하는 분화 인자를 효과적으로 발현시키는 데 이용될 수 있다.
일 구체예로, 본 출원의 일 벡터가 Gsta4 단백질을 암호화하는 핵산을 포함할 경우, 상기 벡터는서열번호 36의 서열로 이루어질 수 있다.
일 구체예로, 발현벡터가 Gsta4 단백질을 암호화하는 지핵산 및 Myt1l 단백질을 암호화하는 핵산을 포함할 경우, 해당 벡터는 서열번호 5의 서열로 이루어질 수 있다.
다른 구체예로, 발현벡터가 Gsta4 단백질을 암호화하는 핵산; MNX1 단백질을 암호화하는 핵산; 및 LHX3 단백질을 암호화하는 핵산;을 포함할 경우, 해당 벡터는 서열번호 29의 서열로 이루어질 수 있다.
벡터의 부가 구성(2) (넉인용 구성)
다른 구현예에서, 상기 발현벡터는 분화인자를 대상의 게놈에 넉인시키기 위한 부가 구성(2)를 추가로 포함할 수 있다.
상기 넉인(knock-in)은 분화인자를 대상세포 내 게놈 상에 삽입하는 것을 의미한다. 이러한 경우,삽입된 분화인자의 발현이 세포 내에서 지속되기 때문에, 대상 세포(예를 들어, 체세포)의 모터뉴런으로의 분화효율도 더 높아질 수 있다.
일 구체예에서, 상기 분화인자는 대상 세포 게놈 내 세이프 하버(safe harbor) 영역에 넉인될 수 있다.
상기 세이프 하버는 대상의 게놈 내 특정 부분에 외래(exogenenous) 분화인자가 삽입되어도 부작용을 유발하지 않으면서, 상기 분화인자의 발현이 지속적으로 될 수 있는 유전자 좌위를 일컫는다.
예를 들어, 상기 세이프 하버는 대상 세포의 게놈 서열 중 AAVS1, ROSA26 등을 코딩하는 좌위 영역일 수 있다.
상기 분화인자의 넉인은 당업계에 알려진 방법으로 수행될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 방법은 상기 방법은 전이인자(transposable element, TE) 시스템, CRISPR/Cas 시스템 등을 이용할 수 있다.
상기 전이인자 시스템은 유전체 내에서 위치를 옮겨 다닐 수 있는 DNA 조각을 이용하는 것이다.
예를 들어, 상기 전이인자 시스템은 피기백(piggyBac) 전이인자, 슬리핑뷰티(Sleeping Beauty) 전이인자 등을 포함할 수 있다.
상기 CRISPR/Cas 시스템은 Cas 단백질 및 가이드 RNA(guide RNA), 도너 등으로 구성될 수 있다. 이 때, 상기 도너는 발현시키고자 하는 (i) 분화인자, 및 (ii) 대상 세포 게놈 내 세이프 하버 유전자의 일부 서열과 상동성을 가지는 서열을 포함할 수 있다. 이때 상기 (ii)의 세이프 하버 유전자의 일부 서열과 상동성을 가지는 서열은 도너의 양 말단에서 각각 상동성 암(homology arm)으로 기능할 수 있다.
예를 들어, 상기 Cas 단백질 및 가이드 RNA가 복합체를 형성하여, 대상 세포 게놈 내 세이프 하버 유전자 서열 내에 DSB(double strand break) 절단(cleavage)을 야기하고, 이 때, 상기 절단부위에, 양 말단에 상동성 암을 가지는 분화인자(도너) 서열이 상동성 재조합(Homology-directed repair pathway, HDR)에 의해 삽입될 수 있다. 이 때, 상기 두 상동성 암은 절단부위를 중심으로 upstream의 일부서열과 상동성을 가지는 서열 및 downstream의 일부서열과 상동성을 가지는 서열이다.
벡터 종류
일 예에서, 상기 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다.
일 예로, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV), 백시니아바이러스, 폭스바이러스, HIV(Human immunodeficiency virus), MLV(Murineleukemia virus), ASLV(Avian sarcoma/leukosis), SNV(Spleen necrosis virus), RSV(Rous sarcoma virus), MMTV(Mouse mammary tumor virus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus), 에피조말(episomal) 또는 단순포진 바이러스 등일 수 있다. 바람직하게는 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV)일 수 있다.
다른 예에서, 상기 벡터는 비바이러스 벡터일 수 있다.
일 예로, 상기 비바이러스 벡터는 플라스미드, 파지, 네이키드 DNA, DNA-지질 복합체, DNA-고분자 복합체, mRNA 등일 수 있다.
4. 직접교차 분화방법
직접교차 분화방법 개괄
본 발명의 다른 태양으로, 상기 전술한 분화인자의 발현을 위한 조성물을 이용하여 체세포에서 모터뉴런으로 직접교차 분화시키는 방법을 제공한다.
따라서, 본 출원은 Gsta4를 포함하는 조성물을 이용한 직접교차 분화방법을 개시한다.
상기 조성물을 이용하면 대상 세포가 역분화단계 없이 직접교차 분화되어 특히, 모터뉴런으로 전환(conversion)될 수 있다. 상기 직접교차 분화방법은 통상의 기술자가 공지된 방법을 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 소정의 목적을 달성할 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않는다.
일 구현예로, 상기 직접교차 분화방법은 조성물(1) 내지 (9) 중 선택되는 하나의 조성물을 대상 세포에 도입하는 것을 포함한다.
이 때, 상기 조성물은 Gsta4를 필수적으로 포함하는 것을 특징으로 하고,
상기 직접교차 분화방법은 대상세포가 유도만능줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)로 역분화하는 효과를 나타내지 않는다.
임의의 실시예로, 본 출원의 직접교차 분화방법은 Gsta4 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 대상세포 내에 도입함;을 포함할 수 있다.
임의의 실시예로, 본 출원의 직접교차 분화방법은
Gsta4 단백질; 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 중 선택되는 1개 이상의 단백질; 또는 상기 선택된 단백질을 코딩하는 핵산;을 포함하는 벡터를 대상세포 내에 도입함;을 포함할 수 있다.
일 구체예로, 본 출원의 직접교차 분화방법은 Gsta4 단백질을 코딩하는 핵산, Lhx3 단백질을 코딩하는 핵산, Hb9 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터;를 대상세포 내에 도입함;을 포함할 수 있다.
직접교차 분화의 대상세포(출발세포)
본 출원이 달성하고자 하는 직접교차 분화는 “분화된 세포”에 본 출원의 인자를 도입하여 목적하는 세포로 직접적으로 전환하는 것이다.
본 출원의 직접교차 분화 방법에 사용되는 대상세포인 분화된 세포는 체세포일 수 있다. 체세포는 생식세포를 제외한 모든 세포를 의미한다.
예를 들어, 상기 체세포는 섬유아세포(fibroblast), 상피세포(epithelial cell), 내피세포(endothelial cell), 근육세포, 신경세포, 모발세포, 모근세포, 모낭세포, 구강상피세포, 소변에서 추출한 체세포, 위점막세포, 배상세포, 가스트린 세포(gastrin cell/G cell), B세포, 주피세포, 성상세포(astrocyte), 혈액세포, 희소돌기아교 전구세포 등일 수 있다.
상기 체세포는 사람, 개, 고양이, 말, 양, 토끼, 돼지, 마우스, 낙타 등의 포유 동물 유래의 것 또는 분리된 것일 수 있다.
일 예로, 본 출원의 직접교차 분화방법은,
상기 직접교차 분화를 위한 분화인자의 발현을 위한 조성물을 체세포에 도입함; 을 포함한다.
이 때, 상기 체세포는 조성물 도입 전 일정기간 배양된 체세포일 수 있다.
상기 분화방법은, 조성물이 도입된 체세포를 신경세포 분화를 위한 배양배지에서 추가로 더 배양하는 공정을 더 포함할 수 있다.
이하에서는 상기 분화방법에서 사용되는, 체세포 배양을 위한 배양배지, 신경세포 분화를 위한 배양배지, 분화기간(즉, 조성물을 도입한 체세포를 배양하는 기간), 도입방법 등에 대해 서술한다.
배양배지
상기 배양배지는 목적에 따라 체세포 배양을 위한 배양배지 또는 신경세포 분화를 위한 배양배지일 수 있다.
체세포 배양을 위한 배양배지 및 신경세포 분화를 위한 배양배지는 당업계에 알려진 배양배지를 이용할 수 있다. 또한, 소정의 목적을 위해 배양배지를 적절하게 변경하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 목적인 직접교차 분화의 효율을 높이기 위해 적절히 당업계에 알려진 탄소원, 질소원, 미량원소, 성장인자 등을 조절하여 사용할 수 있다.
예를 들어, 배양배지는 DMEM, MEM, RPMI-1640, Ham's F-10 또는 Ham's F-12 등일 수 있다.
세포 컨플루언스, 배양기간 및 계대배양
체세포의 배양에 있어서, 세포의 컨플루언스를 실험에 용이하도록 조절하여 배양할 수 있다.
이 때, 체세포는 조성물 도입 전의 상태 또는 상기 조성물이 도입된 상태에 따라 적절하게 컨플루언스를 조절할 수 있다. .
체세포의 배양은 세포의 컨플루언스(confluence)가 약 60% 내지 100%가 될 때까지 배양할 수 있다. 바람직하게는 체세포의 컨플루언스가 약 80% 내지 100%가 될 때까지 배양할 수 있다.
또한, 상기 체세포 배양이 실험에 용이한 적정 컨플루언스가 되도록 약 12시간 내지 60시간 동안 배양될 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 체세포 배양은 상기 적정 컨플루언스를 위해 1번 내지 3번 계대 배양할 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
분화인자의 발현을 위한 조성물의 각 구성요소 도입순서
상기 직접교차 분화방법에서, 조성물(1) 내지 조성물(9) 중 선택되는 조성물을 대상세포 내에 도입하는 순서는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 조성물이 포함하는 분화인자가 2개 이상인 경우, 이들은 대상세포 내에 동시에 도입될 수도 있고, 순차적으로 도입될 수도 있다.
예를 들어, 본 출원의 직접교차 분화방법은 Gsta4 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현벡터; Lhx3 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터; 및 Hb9 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터;를 동시에 또는 순차적으로 도입함;을 포함할 수 있다.
분화인자의 발현을 위한 조성물을 대상세포에 도입하는 방법
상기 직접교차 분화방법에서, 상기 직접교차 분화를 위한 분화인자의 발현을 위한 조성물을 대상 세포 내로 도입하는 것은 통상의 기술자가 공지의 기술을 적절히 선택하여 수행할 수 있다.
예를 들어, 상기 조성물을 세포 내에 도입하기 위해 전기천공법, 유전자총, 초음파천공법, 자기주입법(magnetofection), 미세주입법(microinjection), 일시적인 세포 압축 또는 스퀴징, 양이온성 리포좀법, 초산 리튬-DMSO, 지질-매개 형질감염(transfection), 인산칼슘 침전법(precipitation), lipofection, PEI(Polyethyleneimine)-매개 형질감염, DEAE-dextran 매개 형질감염 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
분화인자의 발현을 위한 조성물이 도입된 체세포의 특징
본 출원에서 제공하는 분화인자의 발현을 위한 조성물이 도입된 체세포는 배양 기간이 지남에 따라 분화인자의 발현 및 신경세포 마커의 발현이 증가하고 있는 상태에 있다. .
상기 신경세포 마커는 NEUN, ChAT, Map2, Hb9, Synapsin, Tuj1, IsL1, PAX6, Olig2, Nkx2.2, SMI-32 등일 수 있다.
예를 들어, 본 출원의 분화인자의 발현을 위한 조성물이 도입된 체세포는 배양 기간 1일차에 비해 3일차에 NEUN, ChAT, Map2, Hb9, Synapsin 중 선택되는 하나 이상의 신경세포 마커의 발현이 증가되어 있을 수 있다.
분화 기간
전술한 상기 직접교차 분화방법을 이용하여 체세포에 분화인자가 도입되면 상기 체세포가 적절한 시간이 지난 뒤 모터뉴런으로 전환된다. 체세포가 모터뉴런으로 전환되기까지 배지조성 변경을 통해 분화환경을 유지할 수 있게 할 수 있다. 상기 적절한 시간은 대상세포에 따라 결정될 수 있다.
예를 들어, 분화인자의 발현을 위한 조성물이 도입된 섬유아세포는 약 7일 내지 30일 이내에 모터뉴런으로 전환될 수 있다.
다른 예를 들어, 분화인자의 발현을 위한 조성물이 도입된 성상세포는 약 7일 내지 30일 이내에 모터뉴런으로 전환될 수 있다.
직접교차 분화방법의 결과물
전술한 본 출원의 직접교차 분화방법을 이용하면 체세포가 직접교차 되어 유도된 모터뉴런을 수득할 수 있다. 모터뉴런은 뇌와 척수에서 일어난 운동 자극을 근육이나 샘에 전달하는 신경세포이다.
특히, 본 출원의 직접교차 분화인자가 체세포 내에 도입된 유도된 모터뉴런은 세포 내 상기 분화인자가 과발현(over-expression)되어 있는 발현특징을 가진다. 따라서, 이러한 분화인자의 과발현 환경에 의해, 상기 유도된 모터뉴런은 신경세포 마커들도 과발현되어 있는 특징을 가질 수 있다.
상기 직접교차 분화인자는 Gsta4, Ascl1(Achaete-scute homolog 1), Brn2(POU Class 3 Homeobox 2), Myt1L(Myelin Transcription Factor 1 Like), Hb9(Homeobox HB9), ISL1(ISL LIM homeobox 1), Lhx3(LIM homeobox 3), Ngn2(neurogenin 2), NeuroD1(Neuronal Differentiation 1) 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
예를 들어, 상기 직접교차분화로 수득된 모터뉴런에서는 Gsta4가 과발현되어 있다.
예를 들어, 상기 직접교차분화로 수득된 모터뉴런에서는 Gsta4; 및 Ascl1(Achaete-scute homolog 1), Brn2(POU Class 3 Homeobox 2), Myt1L(Myelin Transcription Factor 1 Like), Hb9(Homeobox HB9), ISL1(ISL LIM homeobox 1), Lhx3(LIM homeobox 3), Ngn2(neurogenin 2) 및 NeuroD1(Neuronal Differentiation 1) 중 선택되는 1개 이상;의 직접교차 분화인자가 과발현되어 있다.
또한, 이러한 분화인자의 과발현은 모터 뉴런 내의 신경세포 마커 단백질의 발현 증가를 야기한다. 상기 신경세포 마커는 NEUN, ChAT, Map2, Synapsin, HB9, Tuj1, IsL1, Notch1, HES1, HES3, E-cadherin, occludin, PAX6, N-cadherin, SOX2, 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
예를 들어, 상기 직접교차분화로 수득된 모터뉴런은 ChAT, Map2, Hb9, Synapsin 중 하나 이상의 신경세포 마커가 과발현될 수 있다.
다른 예를 들어, 상기 직접교차분화로 수득된 모터뉴런은 유도된 Tuj1, IsL1, NEUN 중 하나 이상이 과발현될 수 있다.
직접교차 분화의 결과 확인
본 출원의 직접교차 분화방법은 선택적으로 모터뉴런으로의 전환을 확인하는 과정을 추가로 더 포함할 수 있다.
이 때, 상기 확인하는 과정은 당업계에 알려진 신경세포 마커를 이용하여 확인할 수 있고, 당업계에 알려진 다양한 분자생물학 기법을 통해 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 분자생물학기법은 면역형광염색법, 웨스턴블랏, 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR), 효소결합면역흡착검사(ELISA) 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
본 출원의 직접교차 분화방법의 특징(1)
본 출원에서 개시하는 직접교차 분화방법은 유도만능줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)가 생성되지 않는 특징이 있다. 즉, 체세포의 역분화 과정에 의한 유도만능줄기세포 단계를 거치지 않고, 체세포로부터 목적하는 모터뉴런으로 전환을 직접적으로 유도한다는 점에서 특징이 있다..
예를 들어, 체세포인 섬유아세포 또는 성상세포에 Gsta4 단독; 또는 Gsta4와 종래 분화인자들을 함께 처리하면, 상기 섬유아세포 또는 성상세포는 모터뉴런으로 직접 분화될 수 있다.
본 출원의 직접교차 분화방법의 특징(2)
또한, 본 출원의 방법은 전술한 바와 같이 유도만능줄기세포 단계를 거치지 않기 때문에 대상 세포의 기형종(teratoma)형성 가능성이 낮은 장점이 있다. 즉, 종래 줄기세포 사용의 문제점인 기형종 생성 확률을 현저히 낮춘 방법일 수 있다. 이러한 장점은 본 출원의 방법이 신경계 질환 치료를 위해 더 유용하게 사용될 수 있음을 시사한다.
본 출원의 직접교차 분화방법의 특징(3)
본 출원에서 개시하는 직접교차 분화방법은 종래 분화인자들의 문제점인 분화효율을 개선하는데 큰 기여를 한다. 특히, 섬유아세포 또는 성상세포에 종래 분화인자만 처리하는 것보다 Gsta4와 종래 분화인자들을 함께 처리하면, 모터뉴런으로 직접분화 되는 분화효율을 현저히 향상시킬 수 있다.
5. Gsta4를 포함하는 직접교차 분화용 약학적 조성물
Gsta4를 포함하는 직접교차 분화용 약학적 조성물 개괄
본 출원은 다른 태양으로, 신경질환의 치료를 위한, 상기 전술한 조성물(1) 내지 (9) 중 선택되는 하나의 조성물을 약학적 조성물로서 개시한다. 이하에서 상기 약학적 조성물이 포함할 수 있는 성분 및, 치료 용도를 위한 구체적인 적응증 등을 개시한다.
약학적 조성물의 유효성분
본 출원의 약학적 조성물의 유효성분은 다음 중 하나 이상일 수 있다.
(1) 본 출원의 분화인자
(2) 본 출원의 분화인자를 포함하는 체세포
(3) 본 출원의 분화인자를 이용하여 유도된 모터뉴런
이 때, 상기 분화인자는 Gsta4 단독; 또는 Gsta4 및 종래 분화인자의 조합으로 조성물에 포함될 수 있다. 이 때, 상기 종래 분화인자는 Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 중 선택되는 1 이상; 이다.
상기 (1) 분화인자는 단백질의 형태 또는 핵산의 형태일 수 있다.
일 예로, 본 출원의 신경계 질환 예방 또는 치료를 위한, 약학적 조성물은 Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;을 포함할 수 있다.
다른 예로, 본 출원의 신경계 질환 예방 또는 치료를 위한, 약학적 조성물은 Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및 Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다.
또 다른 예로, 본 출원의 신경계 질환 예방 또는 치료를 위한, 약학적 조성물은 Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및 Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다.
이 때, 상기 (1) 분화인자는 바이러스 캡시드에 포함되어 전달될 수 있다. 일 예로, 본 출원의 약학적 조성물은 Gsta4 단독 유전자를 포함한 바이러스 캡시드를 포함할 수 있다. 다른 예로, 상기 조성물은 Gsta4를 포함한 바이러스 캡시드; Hb9을 포함한 바이러스 캡시드; Lhx3를 포함한 바이러스 캡시드를 함께 포함할 수 있다. 본 출원의 분화인자를 포함하는 바이러스 캡시드를 포함할 경우, 일 종류의 유전자 치료제로 사용될 수 있다.
또한, 상기 (2) 분화인자를 포함하는 체세포는, i) 분화인자를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 체세포; 또는 ii) 분화인자 단백질이 도입된 체세포일 수 있다. 본 출원의 분화인자를 포함하는 체세포를 유효성분으로 포함할 경우, 일 종류의 세포 치료제로 사용될 수 있다. 세포치료제는 조직의 기능을 복원하기 위하여 자가(autologous), 동종(allogenic), 또는 이종(xenogenic) “세포”를 유효성분으로 이용하는 치료제를 의미한다.
일 예로, 본 출원의 신경계 질환 예방 또는 치료를 위한, 약학적 조성물은 Gsta4 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 체세포;를 포함할 수 있다. 본 출원의 신경계 질환 예방 또는 치료를 위한, 약학적 조성물은 Gsta4 단백질이 도입된 체세포;를 포함할 수 있다.
다른 예로, 본 출원의 신경계 질환 예방 또는 치료를 위한, 약학적 조성물은 Gsta4 단백질을 코딩하는 핵산; Hb9 단백질을 코딩하는 핵산; 및 Lhx3 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 체세포;를 포함할 수 있다. 본 출원의 신경계 질환 예방 또는 치료를 위한, 약학적 조성물은 Gsta4 단백질; Hb9 단백질; 및 Lhx3 단백질이 도입된 체세포;를 포함할 수 있다.
또한, 상기 (3) 분화인자를 이용하여 유도된 모터뉴런은 전술한 [4. 직접교차 분화방법]을 이용하여 체세포가 직접교차 분화되어 생성된 모터뉴런이다. 본 출원의 상기 유도된 운동뉴런을 유효성분으로 포함할 경우, 또 다른 종류의 세포 치료제로 사용될 수 있다.
약학적으로 허용가능한 추가(extra) 구성요소
상기 약학적 조성물은 상기 유효성분 이외에, 약학적으로 허용가능한 추가 구성요소를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 추가 구성요소는 담체, 부형제, 희석제, 보존제 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
예를 들어, 상기 담체, 부형제 및 희석제는 락토오즈(lactose), 덱스트로즈, 수크로스(sucrose), 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 증류수, 생리식염수, 글리세롤, 에탄올, HSA(Human serum albumin) 등일 수 있다.
예를 들어, 상기 보존제는 벤조산, 벤조산 나트륨, 소르빈산, 파라옥시벤조산, 클로로부탄올 등일 수 있다.
상기 약학적 조성물을 제제화할 경우 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제 등을 더 포함할 수 있다.
약학적 조성물의 제제화
상기 약학적 조성물은 경구용 또는 비경구용으로 제제화될 수 있다.
예를 들어, 경구용으로 제제화될 경우, 고형제, 액상제, 캡슐제, 반고체 형태 등으로 제조될 수 있다.
다른 예를 들어, 비경구용으로 제제화될 경우, 주사제, 에어로졸제 등으로 제조될 수 있다. 바람직하게는 주사제로 제제화될 수 있다.
약학적 조성물의 타겟 질환
상기 약학적 조성물은 신경계 질환에 적용될 수 있다. 특히, 상기 약학적 조성물은 신경계 질환의 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있다. 본 출원의 신경계 질환은 신경세포 손상 또는 이로 유발되는 질환일 수 있다.
예를 들어, 상기 신경계 질환은 척수 손상, 파킨슨병, 뇌졸증, 헌틴텅병, 루게릭병, 모세혈관 확장성 운동실조병(Ataxia telangiectasia), 근위축성 측색 경화증, 운동 신경손상, 외상에 의한 말초신경손상, 허혈성 뇌손상, 신생아 저산소성 허혈성 뇌손상, 뇌성마비, 말초마비, 중추마비, 사지마비, 양지마비, 간질, 신경세포 발달장애, 신경통, 난치성 간질, 알츠하이머병, 선천성 대사성 신경계질환 및 외상성 뇌손상(traumatic brain injury), 운동성 신경세포 손상 또는 이로 유발되는 질환 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다. 바람직하게는, 상기 신경계 질환은 척수 손상, 파킨슨병, 알츠하이머병, 근위축성 측색 경화증, 말초마비, 중추마비, 사지마비, 양지마비 중 선택될 수 있다.
6. 신경계 질환 치료방법
신경계 질환 치료방법 개괄
상기 전술한 [5. Gsta4를 포함하는 직접교차 분화용 약학적 조성물]을 이용한 신경계 질환 치료방법을 개시한다.
전술한 바와 같이 상기 약학적 조성물은,
Gsta4 또는
Gsta4 및 Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 중 선택되는 1 이상;
을 포함한다.
본 출원의 신경계 질환 치료방법은 (i) 상기 조성물을 그대로 대상(환자)에게 처리하거나, (ii) 상기 조성물을 도입한 체세포를 대상에게 처리하거나, 또는 (iii) 엑스 비보(Ex vivo)에서 유도된 모터뉴런을 생성하여, 이를 대상에게 처리하는 방법으로 수행될 수 있다. 이 때, 상기 (i)의 방법은 대상의 체내에서, 즉, 인비보(In vivo)에서 유도된 모터뉴런을 생성하는 효과를 가질 수 있다.
치료방법(1)
신경계 질환을 치료하는 방법은 본 출원의 “약학적 조성물”을 신경계 질환의 치료 또는 예방이 필요한 대상에 투여하여 생체 내(In vivo)에서 유도된 모터뉴런이 생성되는 방식을 이용할 수 있다.
일 예로, 본 출원의 신경계 질환을 치료하는 방법은,
Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물을 대상에 투여함; 을 포함할 수 있다.
다른 예로, 본 출원의 신경계 질환을 치료하는 방법은,
i) Gsta4 단백질; 및
ii) Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 중 선택되는 1 이상의 단백질;
을 포함하는 조성물을 대상에 투여함; 을 포함할 수 있다.
치료방법(2)
신경계 질환을 치료하는 방법은 본 출원의 약학적 조성물을 도입한 “체세포”를 대상에 투여하는 것을 특징으로 한다.
일 예로, 본 출원의 신경계 질환을 치료하는 방법은,
Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 도입된 체세포를 대상에 투여함;
을 포함할 수 있다.
다른 예로, 본 출원의 신경계 질환을 치료하는 방법은,
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
ii) Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 중 선택되는 1 이상의 단백질; 또는 상기 단백질을 코딩하는 핵산;
을 포함하는 조성물이 도입된 체세포를 대상에 투여함;
을 포함할 수 있다.
전술한 바와 같이 본 출원의 조성물을 도입한 체세포를 대상에 투여하면, 대상의 체내에서, 상기 체세포에 도입되어 있는 분화인자로 인해 체세포가 직접교차 분화되어 모터뉴런으로 전환된다. 이로써, 투여된 대상 내에 상기 모터뉴런이 증식되어 신경계 질환이 치료 또는 예방 될 수 있다.
치료방법(3)
신경계 질환을 치료하는 방법은 본 출원의 조성물을 분리된 체세포에 도입하여 직접교차 분화가 된 모터뉴런을 엑스비보(ex vivo)에서 수득한 후, 상기 “모터뉴런”을 신경계 질환의 치료 또는 예방이 필요한 대상에 투여하는 방식을 이용할 수 있다. 즉, 본 출원의 유도된 모터뉴런을 치료제의 직접적인 유효성분으로 대상에게 적용하는 방식이다.
일 예로, 본 출원의 신경계 질환을 치료하는 방법은,
체세포에 Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물을 도입하여 유도된 모터뉴런을 대상에 투여함;
을 포함할 수 있다.
다른 예로, 본 출원의 신경계 질환을 치료하는 방법은,
체세포에
i) Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
ii) Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 중 선택되는 1 이상의 단백질; 또는 상기 단백질을 코딩하는 핵산;
을 포함하는 조성물을 도입하여 유도된 모터뉴런을 대상에 투여함;
을 포함할 수 있다.
투여 대상
상기 신경계 질환 치료방법의 적용 대상은 정상인에 비해 모터 뉴런의 기능이 저하된 대상 또는 모터 뉴런의 감소로 인해 질병이 발생한 대상일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
신경계 질환의 치료 또는 예방이 필요한 대상은 포유류일 수 있다. 예를 들어, 상기 포유류는 사람, 개, 말, 고양이, 마우스, 토끼, 양, 원숭이 등일 수 있다.
이하에서 설명할 투여 방법, 투여 용량, 약학적 조성물의 농도, 투여주기는 투여 대상의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 식이, 신경계 질환 발병 정도, 다른 약의 섭취 여부, 치료 기간 등을 고려하여 결정될 수 있다.
투여 방법
상기 신경계 질환 치료방법의 투여는 대상의 다양한 경로로 투여될 수 있다.
투여는 경구 투여 또는 비경구 투여일 수 있다. 이 때, 비경구 투여는 주사투여일 수 있다.
상기 주사 투여시 부위는 근육, 피내, 피하, 정맥, 복강, 동맥, 점막, 척수, 골수, 척수강내, 경피 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
일 예로, 상기 투여 부위가 척수일 경우, L1(lumbar 1), L2(lumbar 2), L3(lumbar 3), L4(lumbar 4), L5(lumbar 5), T1(thoracic 1), T2(thoracic 2), T3(thoracic 3), T4(thoracic 4), T5(thoracic 5), T6(thoracic 6), T7(thoracic 7), C1(cervical 1), C2(cervical 2), C3(cervical 3), C4(cervical 4), C5(cervical 5) 등일 수 있다.
다른 예로, 신경계 질환이 발생한 부위 자체에 투여할 수 있다. 임의의 구체예로, 파킨슨병이 발병한 뇌에 직접 투여하는 것일 수 있다.
약학적 조성물의 농도
상기 약학적 조성물의 농도는 전체 조성물 기준으로 다음과 같이 포함될 수 있다. 이 때, 상기 약학적 조성물은 벡터를 포함하는 형태, 벡터로부터 정제된 바이러스를 포함하는 형태, 벡터를 포함하는 세포의 형태, 단백질 형태, 단백질을 포함하는 세포의 형태 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
일 예로, 본 출원의 약학적 조성물을 포함하는 바이러스 벡터를 바이러스로 정제할 경우, 조성물 전체를 기준으로 다음과 같은 농도로 포함될 수 있다.
예를 들어, 상기 약학적 조성물 전체를 기준으로 1x105vg(viral genome)/mL 내지 1x1020vg(viral genome)/mL 농도의 바이러스가 포함될 수 있다.
예를 들어, 상기 약학적 조성물 전체를 기준으로 1x105GC(genome copies)/mL 내지 1x1020vg(genome copies)/mL 농도의 바이러스가 포함될 수 있다.
다른 예를 들어, 상기 약학적 조성물 전체를 기준으로 1x105VP(viral particle)/mL 내지 1x1020VP(viral particle)/mL 농도의 바이러스가 포함될 수 있다.
투여 용량
상기 약학적 조성물의 투여 용량은 투여 방법, 대상 등을 고려하여 적절한 용량을 고려할 수 있다.
일 예로, 투여 용량은 1회에 1uL 내지 20mL 투여될 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
구체예로, 척수투여시 1회에 1uL/kg 내지 20uL/kg 투여될 수 있다. 정맥투여시 1회에 0.5mL/kg 내지 10mL/kg 투여할 수 있다.
투여 주기
상기 약학적 조성물을 대상에 투여하는 주기는 대상의 질환, 발병 정도 등에 따라 투여될 수 있다.
투여 횟수는 하루에 1회 또는 수회 투여할 수도 있고, 장기간에 걸쳐 수회 투여할 수도 있다. 이 때, 일정 기간 간격을 두고 투여할 수도 있다.
상기 투여간격은 1일 내지 60일 등일 수 있다. 이 때, 연속투여 또는 비연속투여 할 수 있다.
치료효과 확인
상기 신경계 질환 치료방법을 투여 대상에 적용한 후, 신경계 질환이 완화 또는 개선 또는 치료된 효과를 다양한 방법으로 확인 할 수 있다.
예를 들어, 스카(scar) 감소, 신경세포 마커 발현 변화, BBB 스코어, 활동 전위, 자발적 반응 등을 통해 확인할 수 있다.
일 예로, 상기 신경계 질환 치료방법을 이용하면 스카가 약 2배 내지 50배 감소될 수 있다.
다른 예로, 상기 신경계 질환 치료방법을 이용하면 신경세포 마커의 발현이 약 2배 내지 50배 증가될 수 있다.
다른 예로, 상기 신경계 질환 치료방법을 이용하면 BBB 스코어가 약 2배 내지 50배 증가될 수 있다.
다른 예로, 상기 신경계 질환 치료방법을 이용하면 활동 전위 또는 자발적 반응이 정상인과 유사한 양상으로 나타날 수 있다.
7. 유도된 모터뉴런의 용도
유도된 운동뉴런의 용도 개괄
본 출원에서는 상기 직접교차 분화방법으로 수득한 모터뉴런의 다양한 용도를 개시한다. 이하에서 상기 모터뉴런을 이용한 약물 스크리닝, 생체 소재용도 등에 대해 설명하도록 하겠다.
모터뉴런의 용도(1) - 약물 스크리닝
일 예로, 본 출원의 유도된 운동뉴런을 이용한 약물 스크리닝 용도가 개시된다. 특히, 신경계 질환의 예방, 치료 약물의 스크리닝에 활용할 수 있다.
상기 유도된 운동뉴런에 후보 약물의 투여 전후에 운동뉴런의 반응성을 확인하는 방법 등으로 신경계 질환 예방 또는/및 치료를 위한 약물의 스크리닝에 유용하게 사용할 수 있다.
모터뉴런의 용도(2) - 인공 장기
다른 예로, 본 출원의 유도된 운동뉴런을 포함하는 인공 장기가 개시된다. 줄기세포를 특정 신체 기관으로 유도해 체외에서 장기와 유사하게 재현하는 오가노이드(organoid)도 인공 장기의 일종이다. 본 출원은 유도만능줄기세포 단계를 거치지 않으므로 줄기세포를 이용하는 오가노이드에 비해 부작용이 적은 인공 장기에 활용될 수 있다.
3D 바이오프린팅에 본 출원의 모터뉴런을 적용할 수 있다. 3D 바이오프린팅은 살아 있는 세포를 활용한 바이오잉크를 3D 프린팅처럼 층층이 쌓아 올려 신경, 각막, 간, 피부, 혈관 등 인공장기를 만드는 것이다. 따라서, 본 출원의 유도된 운동뉴런을 3D바이오프린팅 하여 신경계 질환 및 손상 치료용 인공 장기를 제작할 수 있다.
[발명의 가능한 구현예]
구현예 1: Gsta4 단독
체세포로부터 운동성 신경세포로의 직접교차 분화를 위한 조성물로서, 상기 조성물은,
Gsta4(Glutathione S-transferase A4) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함하고, 상기 운동성 신경세포는 상기 체세포로부터 유도된(분화된) 운동성 신경세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
(체세포가 직접교차 분화되어 유도된 운동 신경세포가 되는 것을 특징으로 하는 조성물.)
구현예 2: Gsta4 + 종래 인자 1개
구현예 1에 있어서,
상기 조성물은,
Ascl1(Achaete-scute homolog 1), Brn2(POU Class 3 Homeobox 2), Myt1L(Myelin Transcription Factor 1 Like), Hb9(Homeobox HB9), ISL1(ISL LIM homeobox 1), Lhx3(LIM homeobox 3), Ngn2(neurogenin 2) 및 NeuroD1(Neuronal Differentiation 1) 중 선택되는 1개의 단백질; 또는 상기 단백질을 코딩하는 핵산;
을 더 포함할 수 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
구현예 3: Gsta4 + 종래 인자 2개
구현예 1에 있어서,
상기 조성물은,
Ascl1(Achaete-scute homolog 1), Brn2(POU Class 3 Homeobox 2), Myt1L(Myelin Transcription Factor 1 Like), Hb9(Homeobox HB9), ISL1(ISL LIM homeobox 1), Lhx3(LIM homeobox 3), Ngn2(neurogenin 2) 및 NeuroD1(Neuronal Differentiation 1) 중 선택되는 2개의 단백질; 또는 상기 단백질을 코딩하는 핵산;
을 더 포함할 수 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
구현예 4: Gsta4 + 종래 인자 3개
구현예 1에 있어서,
상기 조성물은,
Ascl1(Achaete-scute homolog 1), Brn2(POU Class 3 Homeobox 2), Myt1L(Myelin Transcription Factor 1 Like), Hb9(Homeobox HB9), ISL1(ISL LIM homeobox 1), Lhx3(LIM homeobox 3), Ngn2(neurogenin 2) 및 NeuroD1(Neuronal Differentiation 1) 중 선택되는 3개의 단백질; 또는 상기 단백질을 코딩하는 핵산;
을 더 포함할 수 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
구현예 5: Gsta4 + 종래 인자 4개
구현예 1에 있어서,
상기 조성물은,
Ascl1(Achaete-scute homolog 1), Brn2(POU Class 3 Homeobox 2), Myt1L(Myelin Transcription Factor 1 Like), Hb9(Homeobox HB9), ISL1(ISL LIM homeobox 1), Lhx3(LIM homeobox 3), Ngn2(neurogenin 2) 및 NeuroD1(Neuronal Differentiation 1) 중 선택되는 4개의 단백질; 또는 상기 단백질을 코딩하는 핵산;
을 더 포함할 수 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
구현예 6: Gsta4 + 종래 인자 5개
구현예 1에 있어서,
상기 조성물은,
Ascl1(Achaete-scute homolog 1), Brn2(POU Class 3 Homeobox 2), Myt1L(Myelin Transcription Factor 1 Like), Hb9(Homeobox HB9), ISL1(ISL LIM homeobox 1), Lhx3(LIM homeobox 3), Ngn2(neurogenin 2) 및 NeuroD1(Neuronal Differentiation 1) 중 선택되는 5개의 단백질; 또는 상기 단백질을 코딩하는 핵산;
을 더 포함할 수 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
구현예 7: Gsta4 + 종래 인자 6개
구현예 1에 있어서,
상기 조성물은,
Ascl1(Achaete-scute homolog 1), Brn2(POU Class 3 Homeobox 2), Myt1L(Myelin Transcription Factor 1 Like), Hb9(Homeobox HB9), ISL1(ISL LIM homeobox 1), Lhx3(LIM homeobox 3), Ngn2(neurogenin 2) 및 NeuroD1(Neuronal Differentiation 1) 중 선택되는 6개의 단백질; 또는 상기 단백질을 코딩하는 핵산;
을 더 포함할 수 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
구현예 8: Gsta4 + 종래 인자 7개
구현예 1에 있어서,
상기 조성물은,
Ascl1(Achaete-scute homolog 1), Brn2(POU Class 3 Homeobox 2), Myt1L(Myelin Transcription Factor 1 Like), Hb9(Homeobox HB9), ISL1(ISL LIM homeobox 1), Lhx3(LIM homeobox 3), Ngn2(neurogenin 2) 및 NeuroD1(Neuronal Differentiation 1) 중 선택되는 7개의 단백질; 또는 상기 단백질을 코딩하는 핵산;
을 더 포함할 수 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
구현예 9: Gsta4 + 종래 인자 8개
구현예 1에 있어서,
상기 조성물은,
Ascl1(Achaete-scute homolog 1), Brn2(POU Class 3 Homeobox 2), Myt1L(Myelin Transcription Factor 1 Like), Hb9(Homeobox HB9), ISL1(ISL LIM homeobox 1), Lhx3(LIM homeobox 3), Ngn2(neurogenin 2) 및 NeuroD1(Neuronal Differentiation 1) 중 선택되는 7개의 단백질; 또는 상기 단백질을 코딩하는 핵산;
을 더 포함할 수 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
구현예 10: 조성물 조합
구현예 2에 있어서,
상기 조성물은,
Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 또는 Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
구현예 11: 조성물 조합
구현예 3에 있어서,
상기 조성물은,
Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
구현예 12: 조성물 조합
구현예 4에 있어서,
상기 조성물은,
Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
NeuroD1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산
을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
구현예 13: 조성물 조합
구현예 5에 있어서,
상기 조성물은,
Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
Hb9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
Myt1L 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
구현예 14: 조성물 조합
구현예 6에 있어서,
상기 조성물은,
Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
구현예 15: 조성물 조합
구현예 7 있어서,
상기 조성물은,
Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
Brn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
Ascl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
Ngn2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
Isl1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및
Lhx3 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
Myt1L 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
구현예 16: Gsta4 서열
구현예 1에 있어서,
상기 Gsta4 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 이와 동일성이 70% 이상인 서열인 것을 특징으로 하는 조성물.
구현예 17: Hb9 서열
구현예 2에 있어서,
상기 Hb9 단백질은 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열 또는 이와 동일성이 70% 이상인 서열인 것을 특징으로 하는 조성물.
구현예 18: Lhx3 서열
구현예 2에 있어서,
상기 Lhx3 단백질은 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열 또는 이와 동일성이 70% 이상인 서열인 것을 특징으로 하는 조성물.
구현예 19: 서열한정
구현예 11에 있어서,
상기 Gsta4 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 이와 동일성이 70% 이상인 서열이고,
상기 Hb9 단백질은 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열 또는 이와 동일성이 70% 이상인 서열이고,
상기 Lhx3 단백질은 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열 또는 이와 동일성이 70% 이상인 서열인 것을 특징으로 하는 조성물.
구현예 20: 벡터 1
체세포로부터 운동성 신경세포로의 직접교차 분화를 위한 벡터로서, 상기 벡터는,
i) 구현예 1 또는 16; 및
ii) 프로모터;
를 포함하고,
상기 i) 은 ii)에 작동 가능하게 연결되어 있고,
상기 운동성 신경세포는 상기 체세포로부터 유도된(분화된) 운동성 신경세포인 것을 특징으로 하는 벡터.
구현예 21: 벡터 1의 추가 구성
구현예 20에 있어서,
상기 벡터는 구현예 2 내지 9 중 선택되는 하나;
를 더 포함할 수 있는 것을 특징으로 하는 벡터.
구현예 22: 벡터 2
체세포로부터 운동성 신경세포로의 직접교차 분화를 위한 벡터로서, 상기 벡터는,
i) 구현예 3 또는 구현예 11; 및
ii) 프로모터;
를 포함하고,
상기 i) 은 ii)에 작동 가능하게 연결되어 있고,
상기 운동성 신경세포는 상기 체세포로부터 유도된(분화된) 운동성 신경세포인 것을 특징으로 하는 벡터.
구현예 23: 벡터 3
체세포로부터 운동성 신경세포로의 직접교차 분화를 위한 벡터로서, 상기 벡터는 2개 이상의 벡터를 포함할 수 있고,
이 때, 2개 이상의 벡터는 적어도 제 1벡터 및 제 2벡터를 포함하고,
상기 제 1벡터는,
i) 구현예 1 또는 16; 및
ii) 프로모터;
를 포함하고,
상기 i) 은 ii)에 작동 가능하게 연결되어 있고,
상기 제 2벡터는,
iii) 상기 벡터는 구현예 2 내지 9 중 선택되는 하나이상; 및
iv) 프로모터;
를 포함하고,
상기 iii) 은 iv)에 작동 가능하게 연결되어 있고,
이 때, 상기 iii) 상기 벡터는 구현예 2 내지 9 중 선택되는 하나이상은 개별적인 벡터에 포함될 수 있고,
상기 운동성 신경세포는 상기 체세포로부터 유도된(분화된) 운동성 신경세포인 것을 특징으로 하는 벡터.
구현예 24: 벡터 추가구성
구현예 21 내지 구현예 23 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 벡터는 선택적으로 상기 ii) 프로모터 이외의 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 코작 공통(Kozak consensus) 서열, ITR(inverted terminal repeat), LTR(long terminal repeat), 종결자(terminator), 내부 리보솜 유입 부위(internal ribosome entry site, IRES), 형광 단백질 유전자, 글루타티온-S-트랜스 퍼라제(GST), 호스라디시(horseradish) 과산화효소(HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 히스티딘(His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, Myc 태그, 2A 자가 절단 펩타이드(2A self-cleaving peptides), 항생제 내성 유전자 중 선택되는 하나 이상을 더 포함할 수 있는 것을 특징으로 하는 벡터.
구현예 25: 벡터 추가구성 한정
구현예 24에 있어서,
상기 2A 자가 절단 펩타이드는 T2A, P2A, E2A 및 F2A 중 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 벡터.
구현예 26: 벡터 추가구성 한정
구현예 21 내지 구현예 23 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 벡터는 도너(donor), 피기백(piggyBac) 전이인자, 슬리핑뷰티(Sleeping Beauty) 전이인자 중 선택되는 하나 이상을 더 포함할 수 있는 것을 특징으로 하는 벡터.
구현예 27: 벡터 종류 한정
구현예 21 내지 구현예 23 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 벡터는 바이러스 벡터로, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV), 백시니아바이러스, 폭스바이러스, HIV(Human immunodeficiency virus), MLV(Murineleukemia virus), ASLV(Avian sarcoma/leukosis), SNV(Spleen necrosis virus), RSV(Rous sarcoma virus), MMTV(Mouse mammary tumor virus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus), 에피조말(episomal) 및 단순포진 바이러스 중 하나 이상인 것을 특징으로 하는 벡터.
구현예 28: 분화방법(1)
체세포로부터 운동성 신경세포로의 직접교차 분화를 위한 방법으로,
상기 직접교차 분화는 상기 체세포가 직접교차 분화되어 유도된(분화된) 운동성 신경세포로 되는 것이고,
상기 방법은,
a) 구현예 1 또는 구현예 16 또는 구현예 20을 체세포에 도입함;
을 포함하는 방법.
구현예 29: 분화방법(1)
구현예 28에 있어서,
상기 체세포에
b) 구현예 2 내지 9, 21 중 선택되는 어느 하나를 도입함;
을 더 포함할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
구현예 30: 분화방법(1)
구현예 28 또는 구현예 29에 있어서,
상기 도입함; 후
체세포를 신경 분화를 위한 배지를 이용하여 배양함;
을 더 포함할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
구현예 31: 분화방법(2)
체세포로부터 운동성 신경세포로의 직접교차 분화를 위한 방법으로,
상기 직접교차 분화는 상기 체세포가 직접교차 분화되어 유도된(분화된) 운동성 신경세포로 되는 것이고,
상기 방법은,
a) 배양배지에 구현예 1 또는 구현예 16 또는 구현예 20을 혼합함;
b) 상기 혼합물을 이용하여 체세포를 배양함;
을 포함하는 방법.
구현예 32: 분화방법(3)
체세포로부터 운동성 신경세포로의 직접교차 분화를 위한 방법으로,
상기 직접교차 분화는 상기 체세포가 직접교차 분화되어 유도된(분화된) 운동성 신경세포로 되는 것이고,
상기 방법은,
구현예 11 또는 구현예 19 또는 구현예 22;를 체세포에 도입함;
또는
구현예 16, 구현예 17 및 구현예 18을 체세포에 도입함;
을 포함하는 방법.
구현예 33: 도입수단
구현예 28 내지 구현예 32 중 선택되는 어느 한 구현예에 있어서,
상기 도입은 전기천공법, 유전자총, 초음파천공법, 자기주입법(magnetofection), 미세주입법(microinjection), 일시적인 세포 압축 또는 스퀴징, 양이온성 리포좀법, 초산 리튬-DMSO, 지질-매개 형질감염(transfection), 인산칼슘 침전법(precipitation), lipofection, PEI(Polyethyleneimine)-매개 형질감염, DEAE-dextran 매개 형질감염 중 선택되는 어느 하나 이상으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
구현예 34: 체세포 종류
구현예 28 내지 구현예 32 중 선택되는 어느 한 구현예에 있어서,
상기 체세포는 섬유아세포(fibroblast), 상피세포(epithelial cell), 내피세포(endothelial cell), 근육세포, 신경세포, 모발세포, 모근세포, 모낭세포, 구강상피세포, 소변에서 추출한 체세포, 위점막세포, 배상세포, 가스트린 세포(gastrin cell/G cell), B세포, 주피세포, 별아교세포(astrocyte), 혈액세포, 희소돌기아교 전구세포 중 선택되는 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
구현예 35: 분화 기간
구현예 28 내지 구현예 32 중 선택되는 어느 한 구현예에 있어서,
상기 도입으로 체세포가 1주 내지 10주 이내로 운동성 신경세포로 분화되는 것을 특징으로 하는 방법.
구현예 36: 분화방법 특징
구현예 28 내지 구현예 32 중 선택되는 어느 한 구현예에 있어서,
상기 도입은 상기 체세포가 유도만능줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)를 생성하지 않고, 유도된 운동성 신경세포로 되는 것을 특징으로 하는 방법.
구현예 37: 분화방법의 수득물 - 모터뉴런 (분화인자 과발현)
직접교차 분화인자가 과발현되는 모터뉴런으로,
이 때, 상기 직접교차 분화인자는 Gsta4, Ascl1(Achaete-scute homolog 1), Brn2(POU Class 3 Homeobox 2), Myt1L(Myelin Transcription Factor 1 Like), Hb9(Homeobox HB9), ISL1(ISL LIM homeobox 1), Lhx3(LIM homeobox 3), Ngn2(neurogenin 2), NeuroD1(Neuronal Differentiation 1) 중 선택되는 하나 이상이고,
상기 모터뉴런은 체세포로부터 직접교차 분화된 것을 특징으로 하는 모터뉴런.
구현예 38: 분화방법의 수득물 - 모터뉴런 (신경세포 마커 과발현)
신경세포 마커가 과발현되는 모터뉴런으로,
이 때, 상기 신경세포 마커는 NEUN, ChAT, Map2, Hb9, Synapsin, Tuj1, IsL1, PAX6, Olig2, Nkx2.2, SMI-32 중 선택되는 하나 이상이고,
상기 모터뉴런은 체세포로부터 직접교차 분화된 것을 특징으로 하는 모터뉴런.
구현예 39: 약학적 조성물(1)
구현예 1 또는 16 또는 20을 포함하는
신경계 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
구현예 40: 약학적 조성물(2)
구현예 1 또는 16 또는 20; 및
구현예 2 내지 9, 21 중 선택되는 하나;
를 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
구현예 41: 약학적 조성물(3)
구현예 37 또는 38을 포함하는
신경계 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
구현예 42: 적응증
구현예 39 내지 구현예 41 중 선택되는 어느 한 구현예에 있어서,
상기 신경계 질환은 척수 손상, 파킨슨병, 뇌졸증, 헌틴텅병, 루게릭병, 모세혈관 확장성 운동실조병(Ataxia telangiectasia), 근위축성 측색 경화증, 운동 신경손상, 외상에 의한 말초신경손상, 허혈성 뇌손상, 신생아 저산소성 허혈성 뇌손상, 뇌성마비, 말초마비, 중추마비, 사지마비, 양지마비, 간질, 신경세포 발달장애, 신경통, 난치성 간질, 알츠하이머병, 선천성 대사성 신경계질환 및 외상성 뇌손상(traumatic brain injury), 운동성 신경세포 손상 또는 이로 유발되는 질환 중 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
구현예 42: 추가 구성
구현예 39 내지 구현예 41 중 선택되는 어느 한 구현예에 있어서,
상기 약학적 조성물은 허용가능한 담체, 부형제, 희석제, 보존제 중 선택되는 하나 이상을 더 포함할 수 있는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
구현예 43: 치료방법(1)
신경계 질환을 치료하는 방법으로, 상기 방법은,
체세포에 구현예 39 또는 40;을 대상에 투여함;
을 포함하고,
이 때, 상기 체세포는 유도만능줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)를 생성하지 않고, 유도된 운동성 신경세포로 되는 것을 특징으로 하는 방법.
구현예 44: 치료방법(2)
신경계 질환을 치료하는 방법으로, 상기 방법은,
체세포에 구현예 39 또는 40;이 도입된 체세포를 대상에 투여함;
이 때, 상기 체세포는 유도만능줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)를 생성하지 않고, 유도된 운동성 신경세포로 되는 것을 특징으로 하는 방법.
구현예 45: 치료방법(3)
신경계 질환을 치료하는 방법으로, 상기 방법은,
구현예 41;을 대상에 투여함;
을 포함하고,
이 때, 상기 대상 내 체세포는 유도만능줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)를 생성하지 않고, 유도된 운동성 신경세포로 되는 것을 특징으로 하는 방법.
구현예 46: 대상한정(1)
구현예 43, 구현예 44, 구현예 45 중 선택되는 어느 한 구현예에 있어서,
상기 대상은 포유류인 것을 특징으로 하는 방법.
구현예 47: 대상한정(2)
구현예 46에 있어서,
상기 포유류는 사람, 마우스, 개, 고양이 중 선택되는 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
구현예 48: 투여한정
구현예 43, 구현예 44, 구현예 45 중 선택되는 어느 한 구현예에 있어서,
상기 투여시 부위는 근육, 피내, 피하, 정맥, 복강, 동맥, 점막, 척수, 골수, 척수강내, 경피 중 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
구현예 49: 투여용량
구현예 43, 구현예 44, 구현예 45 중 선택되는 어느 한 구현예에 있어서,
상기 투여는 1회에 1uL/kg 내지 20uL/kg 의 용량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
구현예 50: 적응증
구현예 43, 구현예 44, 구현예 45 중 선택되는 어느 한 구현예에 있어서,
상기 신경계 질환은 척수 손상, 파킨슨병, 뇌졸증, 근위축성 척수측색경화증, 운동 신경손상, 외상에 의한 말초신경손상, 허혈성 뇌손상, 신생아 저산소성 허혈성 뇌손상, 뇌성마비, 간질, 난치성 간질, 알츠하이머병, 선천성 대사성 신경계질환, 외상성 뇌손상(traumatic brain injury), 운동성 신경세포 손상 또는 이로 유발되는 질환 중 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
[출원의 실시를 위한 형태]
이하, 실시예를 통하여 본 출원을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 출원을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 출원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어 자명할 것이다.
실험 재료
● 벡터 설계
하기에서 실시하는 벡터는 AAV 벡터(Cell Biolabs, INC., VPK-402)를 사용하였고, 분화인자 도입을 위한 AAV 벡터의 모식도는 도 1에 도시하였다.
도 1(a)는 서열번호 36; 도 1(b)는 서열번호 3; 도 1(c)는 서열번호 4; 도 1(d)는 서열번호 5; 도 1(e)는 서열번호 29;에 해당한다.
● AAV 제작
AAV를 제작하는 데에 293T cell line을 사용하였다. 293T 세포는 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM, Thermal Fisher, #12430112)의 배지에 10% fetal bovine serum (Thermal Fisher, #26140079), 1% antibiotic-antimyotic(Thermal Fisher, #15240096)를 넣고 37℃5% CO2 상태에서 배양하였다. 293T 세포에 도 1의 AAV 벡터와 pHelper, pRapCap을 트랜스펙션(transfection) 하고 48시간 배양하였다. 이후, 바이러스 추출과정을 거쳐 분화인자를 포함하는 바이러스를 추출하였다.
● 세포 배양 및 세포 내 AAV 도입
Human dermal fibroblast (Sigma, 106-05A)는 fibroblast growth medium (Sigma, 116-500)의 배지에 10% fetal bovine serum (Thermal Fisher, #26140079), 1% antibiotic-antimyotic (Thermal Fisher, #15240096)를 넣고 37℃ 5% CO2 상태에서 배양하였다.
Human dermal fibroblasts를 24 well 에 0.025 x 106 개로 세포를 seeding 하여 준비하였다. 세포 seeding 24 시간 후, 분화인자를 처리하였다. 분화인자 처리 24시간 후, fibroblast growth medium으로 교체하였다. 또 24시간 후, neural induction medium 로 교체하였다. 이틀에 한번씩 medium 교체하였다. 14-17일째 되는 날, 세포를 Fixation을 통해 면역형광염색법을 진행하였다.
Mouse astrocyte (Abm, T0289)는 Prigrow III medium (Abm, TM003)의 배지에 10% fetal bovine serum (Thermal Fisher, #26140079), 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco)를 넣고 37℃ 5% CO2 상태에서 배양하였다.
Mouse astrocyte를 24 well 에 0.025 x 106 개로 세포를 seeding하여 준비하였다. 세포 seeding 24시간 후, 분화인자를 처리하였다. 분화인자 처리 24시간 후, Prigrow III medium 로 교체하였다. 24시간 후, Neural induction medium로 교체하였다. 이틀에 한번씩 medium 교체하였다. 14-17일째 되는 날, 세포를 Fixation을 통해 면역형광염색법을 진행하였다.
Mouse embryonic fibroblasts 는 DMEM (Gibco)의 배지에 10% fetal bovine serum (Thermal Fisher, #26140079), 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco)를 넣고 37℃5% CO2 상태에서 배양하였다.
Mouse embryonic fibroblasts 를 24 well 에 0.025 x 106 개로 세포를 seeding하여 준비하였다. 세포 seeding 24시간 후, 분화인자를 처리하였다. 분화인자 처리 24시간 후, DMEM 배지로 교체하였다. 24시간 후, Neural induction medium로 교체하였다. 이틀에 한번씩 medium 교체하였다. 14-17일째 되는 날, 세포를 Fixation을 통해 면역형광염색법을 진행하였다.
AAV를 SCI 모델에 도입할 때는, 마우스 척수 손상 모델의 손상부위 (Lumbar 5)에 방위고정장치 (Stereotaxic,Harvard Apparatus 社)를 이용해 미세주사한 후 60 일간 분석하였다.
● 면역형광염색 (Immunofluorescence staining)
세포 Fixation을 위해 세포를 PBS (Gibco) 로 5분씩 2번 washing하였다. 다음 4% paraformaldehyde (ThermoFisher) 를 넣고 상온에서 10분간 인큐베이션하였다.
Permeabilization을 위해 PBS + 0.1% Triton -X 를 넣고 상온에서 10분간 인큐베이션 하였다. 세포를 PBS로 5분씩 3번 washing하였다.
Blocking 과 immunostaining을 위해 1% BSA + PBST (PBS+ 0.1% Tween 20) 를 넣고 상온에서 30분간 인큐베이션하였다. 1차 안티바디는 ChAT(Invitrogen, 1:1000), Map2 (Millipore, 1:200), NeuN (Merck Millipore, 1:100) 를 사용하였다. 1차 안티바디를 1% BSA +PBST에 넣고 4℃ overnight 하였다. PBS로 5분씩 3번 washing 한 후, 2차 안티바디 Alexa FluorTM 488/594 (ThermoFisher, 1:1000)를 1% BSA +PBST에 넣고 상온에 어두운 곳에서 1시간 인큐베이션한다. PBS로 5분씩 3번 washing 후, DAPI staining을 진행하였다.
● RNA 추출 (RNA extraction) 및 cDNA 합성
세포 2 x 106을 trypsin (ThemoFisher) 으로 떼어낸 후, 13,000 rpm으로 10초 centrifugation 하였다. Supernatant 제거 후, easy-BlueTM (iNtRON) 1 ml 넣고, 10초간 vortexing 한 후, 200 μl Choloroform 첨가 후, vortexing 하였다. 13,000 rpm 10분간 centrifugation 후, 400 μl upper fluid 를 새 1.5 ml 튜브에 옮겼다. 400 μl 2-propanol (Sigma) 넣고, 2-3번 inverting 한 후, RT에 10분간 놓아두었다. 13,000 rpm 5분간 centrifugation 후, upper layer 제거하였다. 1 ml 75% EtOH (Sigma) 넣고, 2-3번 inverting 하였다. 10,000 rpm 4℃ 5분간 centrifugation 후, upper layer 제거하였다. RT 에서 5분간 dry 한 후, 20 μl Distilled water 넣어서 RNA 녹였다. 최종적으로 얻은 RNA는 -70℃에 보관하였다.
AccuPower®CycleScript™ RT PreMix & Master Mix (Bioneer) 를 이용하여 cDNA 합성하였다.
● Real-time quantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR)
qPCR(SYBRGreen Realtime PCR Master Mix, TOYOBO)을 이용하여 수행하였다. qRT-PCR로 인간섬유아세포에서 운동성 신경세포로 분화를 유도한 세포는 Synapsin, Map2 및 Hb9의 발현을 확인하였다. 마우스 유래 섬유아세포에서 운동성 신경세포로 분화를 유도한 세포는 Synapsin, Map2 및 Hb9의 발현을 확인하였다.
이 때 사용된 프라이머는 아래 표와 같다.
이름 서열 서열번호
hSYN1_F GTG GCA CTG ACC AAG ACG TA 서열번호 6
hSYN1_R CTG ACG TCC TCA TGT AGG CC 서열번호 7
hMAP2_F TCC TCC ATT CTC CCT CCT CG 서열번호 8
hMAP2_R CGA ATT GGC TCT GAC CTG GT 서열번호 9
hHb9_F GAG CTT GAA CTG GTG CTC CA 서열번호 10
hHb9_R TCT CAA CAG TAG GTG CCT GC 서열번호 11
mMap2-F ACC TTC CTC CAT CCT CCC TC 서열번호 30
mMap2-R TCC TGC TCT GCG AAT TGG TT 서열번호 31
mHb9-F TCC AGA ACC GCC GAA TGA AA 서열번호 32
mHb9-R CCA TCA GCT CCT CTT CCG TC 서열번호 33
mSynapsin-F TCC TCC TGC TCA ACA ACG AC 서열번호 34
mSynapsin-R CGG TCC AAG GCC AGA AAG AT 서열번호 35
실시예 1: 세포 내에서 Gsta4의 운동성 신경세포로의 직접교차 분화 확인
마우스 유래 섬유아세포에 GSTA4를 AAV를 이용하여 도입하였다. Gsta4로 인한 체세포로부터 신경세포의 분화를 면역염색형광법과 qPCR로 확인하였다 (도 2). 면역형광염색법을 통해 운동성 신경세포 마커인 ChAT과 성숙된 신경세포의 마커인 Map2의 발현을 확인하였다. qPCR을 통해 신경세포의 분화정도를 시냅스 형성 마커인 Synapsin, 성숙된 신경세포 마커인 Map2, 성숙된 신경세포 마커인 Hb9의 각각의 발현 변화를 확인하였다.
Gsta4 단독 처리하였을 때, synapsin의 발현 정도가 대조군 (control로 표시) 대비 약 4배의 발현 증가를 확인하였고, Map2는 대조군 (control로 표시) 대비 약 5배의 발현 증가를 확인하였고, Hb9은 대조군 (control로 표시) 대비 약 2배의 발현 증가를 확인하였다. 이러한 실험 결과를 통해 Gsta4 단독으로도 체세포로부터 신경세포의 효과적인 전환이 이루어질 수 있음을 확인하였다.
실시예 2: 세포 내에서 공지된 분화인자의 운동성 신경세포로의 직접교차 분화 확인
공지의 인자들의 직접교차 분화 효과를 확인하기 위하여, 인간유래 섬유아세포에 종래 분화인자를 도입하여 운동성 신경세포로 직접교차 분화 정도를 확인하였다 (도 3).
이 때, 종래 분화인자는 다음과 같이 도입하였다:
Ascl1 단독 투여; Ascl1, Brn2, Myt1l 조합 투여(ABM으로 표시); Hb9, Isl1, Lhx3 조합 투여(HIL로 표시); ABM 및 HIL 조합 투여; ABM, HIL, Ngn2 및 NeuroD1 조합(HND로 표시).
실시예 1의 Gsta4 단독 처리시 Synapsin, Map2, Hb9의 발현 증가는 대조군 대비 각각 약 4, 5, 2배 정도임을 확인하였다. 이에 반해, Ascl1 단독 투여;시 Synapsin, Map2, Hb9의 발현 증가는 약 1~1.5배에 불과했다. 이를 통해, 공지된 인자 Ascl1 단독 투여에 비해, 본 출원의 신규한 분화인자인 Gsta4 단독 처리시 운동성 신경세포로 직접교차 분화 효율이 높음을 시사한다.
또한, 공지된 인자 3개가 조합된 ABM 투여;시 Synapsin, Map2, Hb9의 발현 증가는 각각 약 2, 4, 1배에 불과했다. 그리고 공지된 인자 3개가 조합된 HIL 투여;시 Synapsin, Map2, Hb9의 발현 증가는 각각 약 2, 1.5, 1.5배에 불과했다. 이를 통해, 공지된 인자 3개 조합 투여를 하더라도, 본 출원의 신규한 분화인자인 Gsta4 단독 처리에 비해 운동성 신경세포로 직접교차 분화 효율이 낮거나 유사함 확인할 수 있었다.
한편, 공지된 인자 6개가 조합된 ABM+HIL 투여; 공지된 인자 8개가 조합된 ABM+HND 투여;시 공지된 인자 1개 투여 또는 3개 조합 투여시에 비해서는 신경세포 마커의 발현들이 증가하는 양상을 확인할 수 있었다. 즉 6개 이상의 인자를 조합하는 경우에는 유의미한 효과를 나타내었다.
실시예 3: Gsta4의 조합 사용에 따른 직접교차 분화 확인
실시예 2에서 공지된 인자들만의 신경세포 전환 효과를 확인한 후, 본 발명의 Gsta4를 이들과 함께 조합하는 경우의 효과를 확인하고자 하였다.
이를 위하여, 마우스 유래 섬유아세포에 AAV를 Gsta4 및 종래 분화인자를 다양한 조합으로 도입하여 분화정도를 qPCR로 신경세포 마커(Synapsin, Map2, Hb9)의 발현을 확인하였다 (도 4).
그 결과, Gsta4와 종래 분화인자를 조합한 군들의 신경세포 마커들의 발현이 대조군 (Control로 표기)에 비해 약 5-10배 증가하는 것을 확인하였다. 실시예 2에서 확인한 종래인자만 사용한 경우와 비교하면, 본 발명의 Gsta4를 조합한 경우에, 각 동일 마커의 발현결과(fold change)가 더 높게 나타남을 알 수 있었다.
또한, 면역형광염색법을 통해 운동성 신경세포 마커인 ChAT과 성숙된 신경세포의 마커인 Map2의 발현을 확인하였다 (도 5, 6). 면역형광염색법을 통해, Gsta4와 종래 분화인자를 조합한 군들에서 ChAT과 Map2의 발현이 나타남을 확인하였다.
즉, 도 4 내지 6을 통해, Gsta4와 종래분화 인자를 함께 사용하여도 체세포가 운동성 신경세포로 효과적으로 직접교차 분화되는 것을 알 수 있었다.
실시예 4: 세포 내에서 Gsta4 유무에 따른 종래 분화인자의 운동성 신경세포로의 직접교차 분화 확인
실시예 2 및 3의 결과 확인 후, 본 발명의 Gsta4를 공지의 분화인자들과 조합하는 경우의 효과를 보다 더 구체적으로 확인하고자 하였다.
종래 분화인자 1개 vs 종래 분화인자 1개+Gsta4 조합의 비교
마우스 유래 섬유아세포에 AAV로 Gsta4 유무에 따른 종래 분화인자를 도입하여 분화정도를 qPCR로 신경세포 마커(Synapsin, Map2)의 발현을 확인하였다 (도 7).
종래 분화인자인 Ascl1, Brn2를 각각 단독으로 투여했을 때보다, Gsta4와 Ascl1 조합 투여 (Gsta4+Ascl1로 표시); Gsta4와 Brn2 조합 투여(Gsta4+Brn2로 표시) 했을 때 신경세포 마커(Synapsin, Map2)의 발현이 약 2~5배 증가하는 것을 확인하였다.
종래 분화인자 2개 vs 종래 분화인자 2개+Gsta4 조합의 비교
마우스 유래 섬유아세포에 AAV로 Gsta4 유무에 따른 종래 분화인자를 도입하여 분화정도를 면역염색형광법으로 신경세포 마커(ChaT, Map2)의 발현을 확인하였다 (도 8).
종래 분화인자인 Mnx1, Lhx3를 조합하여 투여(Mnx1+Lhx3로 표시)했을 때보다, Gsta4와 Mnx1, Lhx3를 조합하여 투여 (Gsta4+Mnx1+Lhx3로 표시); 했을 때 신경세포 마커가 면역염색된 세포의 수가 약 40배 이상 증가한 것을 확인하였다.
또한, qPCR로 신경세포 마커(Synapsin, Map2)의 발현를 확인하였다 (도 9).
종래 분화인자인 Mnx1, Lhx3를 조합하여 투여(Mnx1+Lhx3로 표시)했을 때보다, Gsta4와 Mnx1, Lhx3를 조합하여 투여 (Gsta4+Mnx1+Lhx3로 표시); 했을 때 신경세포 마커의 발현이 약 2~4배 증가하는 것을 확인하였다. 또한, Gsta4 단독 투여(Gsta4로 표시)했을 때는 대조군(Control로 표시)에 비해 신경세포 마커의 발현이 약 2~4배 증가하였다.
종래 분화인자 3개 vs 종래 분화인자 3개+Gsta4 조합의 비교
마우스 유래 섬유아세포에 AAV로 Gsta4 유무에 따른 종래 분화인자를 도입하여 분화정도를 qPCR로 신경세포 마커(Synapsin, Map2)의 발현을 확인하였다 (도 10).
종래 분화인자인 Ascl1, Brn2, Myt1L를 조합하여 투여(Ascl1+Brn2+Myt1l로 표시)했을 때보다, Gsta4와 Ascl1, Brn2, Myt1L 조합 투여 (Gsta4+Ascl1+Brn2+Myt1l로 표시); 했을 때 신경세포 마커(Synapsin, Map2)의 발현이 약 2~4배 증가하는 것을 확인하였다.
종래 분화인자 8개 vs 종래 분화인자 8개+Gsta4 조합의 비교
인간유래 섬유아세포에 AAV로 Gsta4 유무에 따른 종래 분화인자를 도입하여 분화정도를 qPCR로 신경세포 마커(Synapsin, Map2, Hb9)의 발현을 확인하였다 (도 11).
종래 분화인자인 Ascl1, Brn2, Myt1l, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2, NeuroD1 조합하여 투여(ABM+HIL+Ngn2+NeuroD1(HND)로 표시)했을 때보다, Gsta4와 Ascl1, Brn2, Myt1l, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2, NeuroD1 조합하여 투여(ABM+HND+Gsta4로 표시) 신경세포 마커들의 발현이 약 2~5배 증가하는 것을 확인하였다. 또한, Gsta4와 Ascl1, Brn2, Myt1l, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2, NeuroD1 조합하여 투여하였을 때, 대조군(Control로 표시)에 비해 신경세포 마커 발현이 약 10~12배 증가하는 것을 알 수 있었다.
또한, 인간유래 섬유아세포에 AAV로 Gsta4 유무에 따른 종래 분화인자를 도입하여 분화정도를 면역형광 염색법으로 신경세포 마커의 발현(vChaT, Map2)으로 확인하였다 (도 13).
종래 분화인자인 Ascl1, Brn2, Myt1l, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2, NeuroD1 조합하여 도입(기존 알려진 factors로 표시)했을 때는 약 15.51%의 세포가 성숙한 신경세포로 분화하였다. 이에 반해, 상기 기존 알려진 factors 및 Gsta4를 조합하여 도입(기존 알려진 factors+Gsta4로 표시)하였을 때 약 48.72%의 세포가 성숙한 신경세포로 분화됨을 확인할 수 있었다.
종래 분화인자 4개 vs 종래 분화인자 7개 vs 종래 분화인자 7개+Gsta4 조합의 비교
마우스 성상세포에 AAV로 Gsta4 유무에 따른 종래 분화인자를 도입하여 분화정도를 면역형광 염색법으로 신경세포 마커의 발현(vChaT, Map2)으로 확인하였다(도 12).
종래 분화인자인 Hb9, Isl1, Lhx3 및 Ascl1을 조합하여 투여했을 때는 신경세포 마커들이 약 20% 발현했다. 종래 분화인자인 Ascl1, Brn2, Myt1l, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 조합하여 투여(기존 알려진 factors로 표시)했을 때는 신경세포 마커들이 약 50% 발현하였으나, 상기 기존 알려진 factors와 Gsta4를 조합하여 투여(기존 알려진 factors+Gsta4로 표시)했을 때는 신경세포 마커들이 약 70%발현되었다. 즉, 종래 분화인자 7개만 투여했을 때보다, Gsta4와 종래 분화인자 7개를 조합하여 투여했을 때 ChaT 및 Map2의 발현이 증가한 것을 알 수 있었다.
이상의 결과들을 통해, 본 출원의 Gsta4는 섬유아세포, 성상세포 등의 체세포를 직접교차 분화하여 유도된 모터뉴런으로 전환하는 기능을 가진 분화인자임을 알 수 있었다. 또한, Gsta4는 종래 직접교차 분화인자에 비해 분화효율이 높고, 나아가 종래 분화인자와 Gsta4를 함께 사용시, 분화효율이 낮은 종래 분화인자의 분화효율을 높여주는 것을 알 수 있었다.
실시예 5: 생체 내에서 운동성 신경세포로의 직접교차 분화 및 치료 효과 확인
Gsta4의 신경세포 분화 효능을 세포 내에서 확인한 실시예 1 내지 4의 결과를 바탕으로, 생체 내에서 운동성 신경세포로의 직접교차 분화 및 치료효과를 확인하기 위해 도 14의 모식도를 바탕으로 실험을 수행하였다.
하반신 마비질환 동물 모델인 SCI 마우스 모델에서 척추신경 손상 부위가 개선 또는 치료되는 효과를 형태학적, 생리학적, 행동학적 분석 등을 통하여 확인하였다.
1) SCI(Spinal cord injury) 마우스 모델 제작
척수 손상으로 인한 하반신 마비 모델인 SCI 마우스 모델 제작을 위해, ICR 마우스를 마취하여, 척수의 Lumbar 5 부위(이하, L5로 지칭; 척추 T13-L1에 해당)를 손상시켰다. 손상시킨 후, 최종 5주 후 실험에 사용하였다.
2) SCI 마우스 모델에 AAV 투여
SCI 마우스 모델의 L5 부위에 마이크로 실린지 (Hamilton, 705)를 이용하여 이용하여 AAV 2ul를 미세주사 하였다.
실시예 5-1: 척수 손상부위의 형태학적 변화 확인
SCI 마우스 모델에 종래 분화인자 8개(Ascl1, Brn2, Myt1l, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2, NeuroD1)를 도입한 군(Control로 지칭); 종래 분화인자 8개 및 Gsta4를 함께 도입한 군(+Gsta4로 지칭); 분화인자 도입하지 않은 AAV를 도입한 군(Mock으로 지칭); 각각의 척수 손상부위(L5)의 형태학적 변화를 관찰하기 위해 크리스탈 바이올렛(Crystal violet, Sigma) 염색을 하였다(도 15).
도 15를 살펴보면, 직접교차분화를 유도하는 분화인자가 없는 Mock 군은 많은 염증세포가 모여서 진하게 스카(scar)가 형성되었다(붉은색 점선). 종래 분화인자 8개를 도입한 Control 군은 Mock 군에 비해 세포가 모여 있는 스카가 감소되었다. 반면, 종래 분화인자 8개 및 GSTA4를 함께 도입한 군에서는 Control 군에 비해 염증세포로 인한 스카(scar)가 완화되는 것을 확인하였다.
실시예 5-2: 운동성 신경세포 마커 발현 변화 확인
SCI 마우스 모델에 종래 분화인자 8개(Ascl1, Brn2, Myt1l, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2, NeuroD1)를 도입한 군(Control로 지칭); 종래 분화인자 8개 및 Gsta4를 함께 도입한 군(+Gsta4로 지칭); 분화인자 도입하지 않은 AAV를 도입한 군(Mock으로 지칭); 각각의 척수 손상부위(L5)에서 운동성 신경세포 마커의 발현 변화를 관찰하기 위해 면역형광염색법을 수행하였다(도 16, 17 및 18).
도 16, 17 및 18을 살펴보면, Mock 군에 비해 Control 군에서 ChaT와 Map2의 발현이 약 2배 증가하였다. 반면, 종래 분화인자 8개 및 GSTA4를 함께 도입한 군에서는 Control 군에 비해 ChaT와 Map2의 발현이 약 5배 이상 증가하였다. 이는 Gsta4로 인해 성상세포에서 운동성신경세포로의 직접교차분화가 Control 군에 비해 분화 효율이 높음을 의미한다.
실시예 5-3: 전기생리학적 분석을 통한 하반신 마비 치료 효과 확인
척수부위에 손상을 가하지 않은 정상군(Sham으로 지칭); SCI 마우스 모델에 종래 분화인자 8개(Ascl1, Brn2, Myt1l, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2, NeuroD1)를 도입한 AAV를 투여한 군(Control로 지칭); 종래 분화인자 8개 및 Gsta4를 함께 도입한 AAV를 투여한 군(+Gsta4로 지칭); SCI 마우스 모델에 AAV를 도입한 군(Mock으로 지칭);각각의 척수 손상부위(L5)에서 전기생리학적 변화를 확인하였다(도 19).
도 19(a)는 Patch clamp를 수행한 신경세포 사진이다.
도 19(b)의 활동전위 측정결과를 살펴보면, Sham군에서 활동전위는 25 Hz이지만, mock 군에서 2 Hz로 1/10 이상 감소되었다. 반면, 종래 분화인자 8개를 도입한 Control군은 6 Hz로 활동전위가 증가되었고, 종래 분화인자 8개 및 Gsta4를 함께 도입한 군에서는 13 Hz로 Control 군에 비해 2배 이상 증가하였다.
활동 전위의 증가는 신경세포가 신호를 받았을 때, 신호를 전달할 수 있는 능력을 의미한다. 활동 전위가 없으면 신호전달을 할 수 없다. 또한 활동전위는 신경세포의 가장 대표적인 특징입니다. 활동전위가 발생하고 증가한다는 것은 신경세포로 분화가 잘 되었다는 것을 의미한다. 따라서, 분화 인자 8개 및 Gsta4를 함께 도입한 군이 신경세포로 분화가 가장 잘 일어남을 통해, 이의 조합이 신경세포 분화 효율이 좋음을 나타낸다.
도 19(c)의 시냅스전 신경세포에서 오는 신호를 측정한 결과를 살펴보면, Mock 군에서는 1 Hz, Control 군에서는 6 Hz, + Gsta4 군에서는 47 Hz였다.
시냅스전 신경세포에서 오는 신호의 증가는 신경세포들 사이의 신호전달이 증가함을 나타낸다. SCI로 인해 끊어진 신경세포의 연결이 새로운 운동성 신경세포의 재생으로 연결되었다는 것을 나타낸다.
실시예 5-4: 행동학적 분석을 통한 직접교차 분화 확인
척수부위에 손상을 가하지 않은 군(Sham으로 지칭); SCI 마우스 모델에 종래 분화인자 8개(Ascl1, Brn2, Myt1l, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2, NeuroD1)를 도입한 군(-Gsta4로 지칭); 종래 분화인자 8개 및 Gsta4를 함께 도입한 군(+Gsta4로 지칭); SCI 마우스 모델에 AAV를 투여한 군(Mock으로 지칭);각각의 척수 손상부위(L5)에서 BBB 스코어 변화를 확인하였다(도 20).
도 20의 BBB 스코어(Basso Beattie, and Bresnahan score)는 전통적으로 척수 손상 모델에서 사용되는 측정 방법으로 하지의 모양, 각도, 무릎의 각도, 발바닥의 모양 및 각도, 위치 등을 종합적으로 판단하여 점수를 측정한다. 최하 0 점에서 최대 21점으로 정상 동물은 21점이다.
종래 분화인자 8개만 도입한 군(-Gsta4로 표시)은 Mock군과 차이가 없었다 (BBB 스코어 약 4점). 하지만, 종래 분화인자 8개 및 Gsta4를 함께 도입한 군(+Gsta4로 표시)은 AAV 투여 후 3주째(BBB 스코어 약 8점)으로 -Gsta4군에 비해 약 2배 이상 증가하였다.
또한, 척수부위에 손상을 가하지 않은 정상군(Sham으로 지칭); SCI 마우스 모델에 AAV를 도입한 군(Mock으로 지칭); 종래 분화인자 8개 및 Gsta4를 함께 도입한 AAV를 투여한 군(Gsta4+로 지칭); 종래 분화인자 8개만 도입한 AAV를 투여한 군(Control로 지칭); 각각의 Forced swimming test, Self urination, Foot printing test 등의 변화도 확인하였다(도 21).
도 21(a)의 Forced swimming test는 동물모델을 3분간 수조에 넣고 하지가 움직이는 횟수를 측정하였다. Mock 군에서 척수 손상으로 인해 하지는 움직이지 않았다. 하지만, 종래 분화인자 8개를Gsta4와 함께 도입할 경우 하지의 움직임이 약 6배 내지 12배 증가함을 확인하였다.
도 21(b) 및 (c)는 자가 소변 능력을 측정한 결과이다. 척수 손상 마우스는 스스로 소변을 배뇨할 수 없다. 종래 분화인자 8개 및 Gsta4를 함께 도입한 군의 AAV를 투여 후 14일 또는 16일에 스스로 배뇨하는 것을 확인할 수 있었다.
도 21(d)는 Foot printing 테스트 결과이다. Foot printing은 마우스의 하지 발바닥에 붉은색 잉크를 묻히고 발바닥 모양을 확인하는 실험이다. Sham 군의 경우 하지의 발바닥이 선명하게 찍혔지만(11번/20cm), Mock군에서 발바닥 모양을 확인 할 수 없었다(11번/20cm). 이에 반해, 종래 분화인자 8개 및 Gsta4를 함께 도입한 군에서는 마우스의 하지 발바닥이(5번/20cm)찍히는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과들을 통해, 본 출원의 발명자가 발견한 신규한 분화인자인 Gsta4는 체세포를 운동성 신경세포로 직접교차 분화하는 데 중요한 인자임을 알 수 있었다. 또한, Gsta4는 종래 분화인자들에 비해서도 분화 효율이 높고, 나아가 종래 분화인자들과 Gsta4를 함께 사용할 경우, 종래 분화인자들만 사용할 때 보다 분화 효율이 더 높아진다. 더군다나, 발명자들은 척수가 손상된 하반신 마비 모델의 치료 효과도 확인한 바, Gsta4는 향후 다양한 신경계 질환에서 중요한 역할을 할 것으로 예상된다.

Claims (33)

  1. 체세포로부터 유도된 모터뉴런으로의 직접교차 분화를 위한 조성물로,
    상기 조성물은,
    Gsta4(Glutathione S-Transferase Alpha 4) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
    을 포함하는 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 Gsta4 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 Gsta4 단백질을 코딩하는 핵산은 서열번호 2 또는 12의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 ii) Ascl1(Achaete-scute homolog 1), Brn2(POU Class 3 Homeobox 2), Myt1L(Myelin Transcription Factor 1 Like), Hb9(Homeobox HB9), ISL1(ISL LIM homeobox 1), Lhx3(LIM homeobox 3), Ngn2(neurogenin 2) 및 NeuroD1(Neuronal Differentiation 1) 중 선택되는 1개 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 핵산;
    을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 조성물은 ii)에서 Hb9, Lhx3, 또는 Ngn2가 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 4항에 있어서,
    상기 조성물은 ii)에서
    Hb9 및 Ngn2; 또는 Lhx3 및 Ngn2가 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 4항에 있어서,
    상기 조성물은 ii)에서 Hb9, Lhx3및 Ngn2가 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 4항에 있어서,
    상기 조성물은 ii)에서 Hb9, Lhx3, Ngn2 및 Isl1가 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 4항에 있어서,
    상기 조성물은 ii)에서 Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1가 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 4항에 있어서,
    Ascl1 단백질은 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어지고, Ascl1 단백질을 코딩하는 핵산은 서열번호 18로 이루어지고;
    Brn2 단백질은 서열번호 19의 아미노산 서열로 이루어지고, Brn2 단백질을 코딩하는 핵산은 서열번호 20으로 이루어지고;
    Myt1L 단백질은 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어지고, Myt1L 단백질을 코딩하는 핵산은 서열번호 22로 이루어지고;
    Hb9 단백질은 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어지고, Hb9 단백질을 코딩하는 핵산은 서열번호 14로 이루어지고;
    Isl1 단백질은 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어지고, Isl1 단백질을 코딩하는 핵산은 서열번호 24로 이루어지고;
    Lhx3 단백질은 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어지고, Lhx3 단백질을 코딩하는 핵산은 서열번호 16으로 이루어지고;
    Ngn2 단백질은 서열번호 25의 아미노산 서열로 이루어지고, Ngn2 단백질을 코딩하는 핵산은 서열번호 26으로 이루어지고;
    NeuroD1 단백질은 서열번호 27의 아미노산 서열로 이루어지고, NeuroD1 단백질을 코딩하는 핵산은 서열번호 28로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 직접교차 분화를 위한 분화인자 발현을 위한 벡터로서,
    상기 직접교차 분화는 체세포로부터 유도된 모터뉴런으로 전환되는 것이고,
    상기 벡터는
    i) Gsta4 단백질을 암호화하는 핵산; 및
    ii) 프로모터;를 포함하고,
    이 때, 상기 i)과 ii)는 작동가능하게 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 벡터.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 벡터는 iii) Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 중 선택되는 1개 이상의 단백질을 코딩하는 핵산;
    을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  13. 삭제
  14. 직접교차 분화를 위한 분화인자 발현을 위한 벡터로서,
    상기 직접교차 분화는 체세포로부터 유도된 모터뉴런으로 전환되는 것이고,
    상기 벡터는 적어도, 제 1벡터 및 제 2벡터를 포함할 수 있고,
    상기 제 1벡터는,
    i) Gsta4 단백질을 암호화하는 핵산; 및 ii) 프로모터;를 포함하고,
    이 때, 상기 i)과 ii)는 작동가능하게 연결되어 있고,
    상기 제 2벡터는,
    iii) Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 중 선택되는 1개 이상의 단백질을 코딩하는 핵산; 및
    iv) 프로모터;를 포함하고,
    이 때, 상기 iii)과 iv)는 작동가능하게 연결되어 있고,
    상기 ii)와 iv)는 서로 동일한 프로모터 또는 상이한 프로모터이고,
    상기 iii)은 1개의 벡터에 포함되거나 또는 2개 이상의 벡터에 포함되는 것을 특징으로 하는 벡터.
  15. 제 11항 또는 14항에 있어서,
    상기 벡터는 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 코작 공통(Kozak consensus) 서열, ITR(inverted terminal repeat), LTR(long terminal repeat), 종결자(terminator), 내부 리보솜 유입 부위(internal ribosome entry site, IRES), 형광 단백질 유전자, 글루타티온-S-트랜스 퍼라제(GST), 호스라디시(horseradish) 과산화효소(HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 히스티딘(His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, Myc 태그, 2A 자가 절단 펩타이드(2A self-cleaving peptides), 항생제 내성 유전자 중 선택되는 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  16. 제 15항에 있어서,
    상기 2A 자가 절단 펩타이드는 T2A, P2A, E2A, F2A 중 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 벡터.
  17. 제 11항 또는 14항에 있어서,
    상기 벡터는 바이러스 벡터 또는 비바이러스 벡터일 수 있고,
    바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV), 백시니아바이러스, 폭스바이러스, HIV(Human immunodeficiency virus), MLV(Murineleukemia virus), ASLV(Avian sarcoma/leukosis), SNV(Spleen necrosis virus), RSV(Rous sarcoma virus), MMTV(Mouse mammary tumor virus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus), 에피조말(episomal), 단순포진 바이러스 중 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 벡터.
  18. Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물을 체세포에 도입함을 포함하는, 직접교차 분화를 위한 방법으로서,
    상기 직접교차 분화는 체세포가 유도된 모터뉴런으로 전환되는 것이고,
    상기 방법은 유도만능줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)가 생성되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 18항에 있어서,
    상기 체세포는 섬유아세포(fibroblast), 상피세포(epithelial cell), 내피세포(endothelial cell), 근육세포, 신경세포, 모발세포, 모근세포, 모낭세포, 구강상피세포, 소변에서 추출한 체세포, 위점막세포, 배상세포, 가스트린 세포(gastrin cell/G cell), B세포, 주피세포, 별아교세포(astrocyte), 혈액세포, 희소돌기아교 전구세포 중 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19항에 있어서,
    상기 체세포는 사람, 개, 고양이, 말, 양, 토끼, 돼지, 마우스, 낙타 중 선택되는 하나의 포유 동물 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 18항에 있어서,
    상기 방법은, 조성물이 도입된 체세포를 신경세포 분화를 위한 배양배지에서 배양함;을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 18항에 있어서,
    상기 도입은 전기천공법, 유전자총, 초음파천공법, 자기주입법(magnetofection), 미세주입법(microinjection), 일시적인 세포 압축 또는 스퀴징, 양이온성 리포좀법, 초산 리튬-DMSO, 지질-매개 형질감염(transfection), 인산칼슘 침전법(precipitation), lipofection, PEI(Polyethyleneimine)-매개 형질감염, DEAE-dextran 매개 형질감염 중 선택되는 하나 이상으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 18항에 있어서,
    상기 도입 후 체세포가 1주 내지 7주 이내로 유도된 모터뉴런으로 분화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 체세포로부터 유도된 모터뉴런으로의 직접교차 분화를 위한,
    Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는,
    신경계 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
  25. 제 24항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은,
    Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 중 선택되는 1 이상의 단백질; 또는 선택된 단백질을 코딩하는 핵산을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  26. 체세포로부터 유도된 모터뉴런으로의 직접교차 분화를 위한,
    Gsta4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;이 도입된 체세포를 포함하는,
    신경계 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
  27. 제 26항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은,
    Ascl1, Brn2, Myt1L, Hb9, Isl1, Lhx3, Ngn2 및 NeuroD1 중 선택되는 1 이상의 단백질을 코딩하는 핵산;을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  28. 체세포로부터 유도된 모터뉴런으로의 직접교차 분화를 위한 분화인자가 과발현되는 모터뉴런을 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물로,
    상기 모터뉴런은 Gsta4, Ascl1(Achaete-scute homolog 1), Brn2(POU Class 3 Homeobox 2), Myt1L(Myelin Transcription Factor 1 Like), Hb9(Homeobox HB9), ISL1(ISL LIM homeobox 1), Lhx3(LIM homeobox 3), Ngn2(neurogenin 2), NeuroD1(Neuronal Differentiation 1) 중 선택되는 하나 이상의 분화인자가 과발현되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  29. 제 24항, 26항 및 28항 중 선택되는 어느 한 항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 허용가능한 담체, 부형제, 희석제, 보존제 중 선택되는 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  30. 제 24항, 26항 및 28항 중 선택되는 어느 한 항에 있어서,
    상기 신경계 질환은 척수 손상, 파킨슨병, 뇌졸증, 헌틴텅병, 루게릭병, 모세혈관 확장성 운동실조병(Ataxia telangiectasia), 근위축성 측색 경화증, 운동 신경손상, 외상에 의한 말초신경손상, 허혈성 뇌손상, 신생아 저산소성 허혈성 뇌손상, 뇌성마비, 말초마비, 중추마비, 사지마비, 양지마비, 간질, 신경세포 발달장애, 신경통, 난치성 간질, 알츠하이머병, 선천성 대사성 신경계질환 및 외상성 뇌손상(traumatic brain injury), 운동성 신경세포 손상 또는 이로 유발되는 질환 중 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  31. 제 24항, 26항 및 28항 중 선택되는 어느 한 항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 주사제 형태인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  32. 삭제
  33. 삭제
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