CN116157511A - 一种用于诱导体细胞直接转分化为运动神经元的组合物以及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于诱导体细胞直接转分化为运动神经元(motor neuron)的组合物、通过将所述组合物引入到体细胞中以诱导直接转分化出的运动神经元、用于预防或治疗神经系统疾病和损伤的药物组合物和细胞治疗剂、用于筛选预防或治疗神经系统疾病的药物的组合物以及用于制备人造组织的3D打印生物材料组合物。当使用本发明一方面的组合物，通过诱导直接转分化因子的表达，可以有效诱导体细胞分化为运动神经元，而无需经历诱导多能干细胞的多能性(Pluripotency)步骤，因此，利用其可以有效地预防和治疗神经系统疾病和损伤。此外，如果利用一方面的被诱导出的运动神经元，可以用于制备用于能够治疗被认为是疑难疾病的神经系统疾病和损伤的人造组织的3D打印生物材料组合物，因此，可以广泛应用于再生医疗领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于诱导体细胞直接转分化为运动神经元(motor neuron)的组合物、通过将所述组合物引入到体细胞中以诱导直接转分化出的运动神经元、用于预防或治疗神经系统疾病和损伤的药物组合物和细胞治疗剂、用于筛选预防或治疗神经系统疾病药物的组合物以及用于制备人造组织的3D打印生物材料组合物。
背景技术
现有的使用胚胎干细胞和诱导多能干细胞的运动神经元分化方法是破坏胚胎以建立胚胎干细胞，或经历从体细胞重编程(Reprogramming)为诱导多能干细胞的步骤，然后经历再次分化(Differentiation)为运动神经元的步骤才能制备出细胞。而且，传统的方法在使用胚胎干细胞方面可能会出现伦理问题，并且在使用诱导多能干细胞的情况下，执行分化步骤时需要投入时间成本、金钱成本和努力，但存在效率(efficiency)低且很难人为控制分化能力的问题，因此，是一种低效率的方法。此外，在体外水平上难以确保药物代谢和毒性验证所需的足够数量的细胞，并且在应用用于运动神经元功能再生的细胞治疗的步骤，极有可能形成源自未分化细胞的畸胎瘤(teratoma)，因此，使用所述细胞存在安全问题。
为了消除如上所述的形成畸胎瘤的风险，正在研究将体细胞直接转分化为其他谱系的体细胞或多能干细胞而不经历多能干细胞的状态,但由于这样的细胞重编程过程的机制为诱导而使用的基因数量太多，难以阐明详细机制，因此，至今为止阐明的程度微乎其微。此外，尽管重编程技术已经确立，但仍需不断开发技术简单、高效的方法用于实际治疗应用，并且被这样开发出来的技术必须在效率和安全性方面进行评估，因此，具有局限性。而且，至今为止还没有从体细胞仅表达数个基因来制备运动神经元的已知方法。
据此，本发明人在对体细胞直接转分化为运动神经元的方法进行研究的过程中，已证实诱导特定基因的转录因子在体细胞中的异位表达可以有效地将体细胞诱导为神经元细胞，并且完成了本发明。
发明内容
技术问题
本发明的一方面涉及一种用于诱导体细胞直接转分化为运动神经元(motorneuron)的组合物，其包括选自由以下组成的组中的一种或更多种：(1)选自由八聚体结合转录因子4(Octamer-binding transcription factor 4，OCT4)蛋白、LIM同源框3(LIMhomeobox 3，LHX3)蛋白、ISL LIM同源框1(ISL LIM homeobox 1，ISL1)蛋白、NK6同源框1(NK6 homeobox1，NKX6.1)蛋白、神经元素2(neurogenin 2，NGN2)蛋白以及转录因子SOX-11(SRY-box 11，SOX11)蛋白组成的组中的一种或更多种蛋白质；(2)编码所述蛋白质的核酸分子；以及(3)引入所述核酸分子的载体。
本发明的另一方面涉及一种将体细胞直接转分化为运动神经元的方法，其包括将组合物接触或插入到体细胞中的步骤，其中，所述组合物包括选自由以下组成的组中的一种或更多种：(1)选自由八聚体结合转录因子4(Octamer-binding transcription factor4，OCT4)蛋白、LIM同源框3(LIM homeobox 3，LHX3)蛋白、ISL LIM同源框1(ISL LIMhomeobox 1，ISL1)蛋白、NK6同源框1(NK6 homeobox 1，NKX6.1)蛋白、神经元素2(neurogenin 2，NGN2)蛋白以及转录因子SOX-11(SRY-box 11，SOX11)蛋白组成的组中的一种或更多种蛋白质；(2)编码所述蛋白质的核酸分子；以及(3)引入所述核酸分子的载体。
本发明的另一方面涉及一种将选自以下的一种或更多种引入到体细胞中以诱导直接转分化出的运动神经元：(1)核酸分子，其编码选自由八聚体结合转录因子4(Octamer-binding transcription factor 4，OCT4)蛋白、LIM同源框3(LIM homeobox 3，LHX3)蛋白、ISL LIM同源框1(ISL LIM homeobox 1，ISL1)蛋白、NK6同源框1(NK6 homeobox 1，NKX6.1)蛋白、神经元素2(neurogenin 2，NGN2)蛋白以及转录因子SOX-11(SRY-box 11，SOX11)蛋白组成的组中的一种或更多种蛋白质；以及(2)引入所述核酸分子的载体。
本发明的另一方面涉及一种用于预防或治疗神经系统疾病和损伤的药物组合物和细胞治疗剂，其包括将通过直接转分化而被诱导出的运动神经元作为活性成分。
本发明的再一方面涉及一种用于筛选预防或治疗神经系统疾病的药物的组合物，其包括将被诱导直接转分化出的运动神经元作为活性成分。
本发明的再一方面涉及一种用于制备用于治疗神经系统疾病和损伤的人造组织的3D打印生物材料组合物。
本发明的再一方面涉及一种用于预防或治疗神经系统疾病和损伤的方法，其包括将所述用于诱导直接转分化的组合物或通过直接转分化而被诱导出的运动神经元施用于所需的个体。
技术方案
为了达到上述目的，本发明的一方面提供一种用于诱导体细胞直接转分化为运动神经元(motor neuron)的组合物，其包括选自由以下组成的组中的一种或更多种：(1)选自由八聚体结合转录因子4(Octamer-binding transcription factor 4，OCT4)蛋白、LIM同源框3(LIM homeobox 3，LHX3)蛋白、ISL LIM同源框1(ISL LIM homeobox 1，ISL1)蛋白、NK6同源框1(NK6 homeobox 1，NKX6.1)蛋白、神经元素2(neurogenin 2，NGN2)蛋白以及转录因子SOX-11(SRY-box 11，SOX11)蛋白组成的组中的一种或更多种蛋白质；(2)编码所述蛋白质的核酸分子；以及(3)引入所述核酸分子的载体。
本发明的另一方面提供一种将体细胞直接转分化为运动神经元的方法，其包括将组合物接触或插入到体细胞中的步骤，其中，所述组合物包括选自由以下组成的组中的一种或更多种：(1)选自由八聚体结合转录因子4(Octamer-binding transcription factor4，OCT4)蛋白、LIM同源框3(LIM homeobox 3，LHX3)蛋白、ISL LIM同源框1(ISL LIMhomeobox 1，ISL1)蛋白、NK6同源框1(NK6 homeobox 1，NKX6.1)蛋白、神经元素2(neurogenin 2，NGN2)蛋白以及转录因子SOX-11(SRY-box 11，SOX11)蛋白组成的组中的一种或更多种蛋白质；(2)编码所述蛋白质的核酸分子；以及(3)引入所述核酸分子的载体。
本发明的另一方面提供一种将选自以下的一种或更多种引入到体细胞中以诱导直接转分化出的运动神经元：(1)核酸分子，其编码八聚体结合转录因子4(Octamer-binding transcription factor 4，OCT4)蛋白、LIM同源框3(LIM homeobox 3，LHX3)蛋白、ISL LIM同源框1(ISL LIM homeobox 1，ISL1)蛋白、NK6同源框1(NK6 homeobox 1，NKX6.1)蛋白、神经元素2(neurogenin 2，NGN2)蛋白以及转录因子SOX-11(SRY-box 11，SOX11)蛋白组成的组中的一种或更多种蛋白质；以及(2)引入所述核酸分子的载体。
本发明的另一方面提供一种用于预防或治疗神经系统疾病和损伤的药物组合物和细胞治疗剂，其包括将通过直接转分化而被诱导出的运动神经元作为活性成分。
本发明的再一方面提供一种用于筛选预防或治疗神经系统疾病的药物的组合物，其包括将被诱导直接转分化出的运动神经元作为活性成分。
本发明的再一方面提供一种用于制备用于治疗神经系统疾病和损伤的人造组织的3D打印生物材料组合物。
本发明的再一方面提供一种用于预防或治疗神经系统疾病和损伤的方法，其包括将所述用于诱导直接转分化的组合物或通过直接转分化而被诱导出的运动神经元施用于所需的个体。
在下文中，将更详细地描述本发明。
术语“直接转分化(Direct Conversion)”是指在高等生物中诱导具有完全不同细胞类型的成熟(分化结束的)细胞之间的转化的过程(Kim，J.et al,Neurobiol.22,778-784,2012)。与现有技术需要重编程为诱导多能干细胞(Induced Pluripotent StemCells,iPSC)并将其重新分化为靶细胞不同，直接转分化在无需经历诱导多能干细胞的步骤，诱导直接转分化为靶细胞这一点上存在差异，并且其用于疾病建模和新药开发等的潜力被认可，因此，被认为是一种可应用于基因治疗和再生医学等的技术。
本发明的一方面提供的一种用于诱导直接转分化的组合物可以包括选自由以下组成的组中的一种或更多种：(1)选自由八聚体结合转录因子4(Octamer-bindingtranscription factor 4，OCT4)蛋白、LIM同源框3(LIM homeobox 3，LHX3)蛋白、ISL LIM同源框1(ISL LIM homeobox 1，ISL1)蛋白、NK6同源框1(NK6 homeobox 1，NKX6.1)蛋白、神经元素2(neurogenin 2，NGN2)蛋白以及转录因子SOX-11(SRY-box 11，SOX11)蛋白组成的组中的一种或更多种蛋白质；(2)编码所述蛋白质的核酸分子；以及(3)引入所述核酸分子的载体。
本发明的一方面的所述组合物包括八聚体结合转录因子4(Octamer-bindingtranscription factor 4，OCT4)蛋白、LIM同源框3(LIM homeobox 3，LHX3)蛋白、ISL LIM同源框1(ISL LIM homeobox 1，ISL1)蛋白、NK6同源框1(NK6 homeobox 1，NKX6.1)蛋白、神经元素2(neurogenin 2，NGN2)蛋白以及转录因子SOX-11(SRY-box 11，SOX11)蛋白质中任何一种或更多种蛋白质；和/或包括编码所述蛋白质中任何一种或更多种蛋白质的核酸分子。
例如，所述组合物可以包括八聚体结合转录因子4(OCT4)、LIM同源框3(LHX3)、ISLLIM同源框1(ISL1)、NK6同源框1(NKX6.1)、神经元素2(NGN2)或转录因子SOX-11(SOX11)，也可以包括八聚体结合转录因子4(OCT4)和LIM同源框3(LHX3)；八聚体结合转录因子4(OCT4)和ISL LIM同源框1(ISL1)；八聚体结合转录因子4(OCT4)和NK6同源框1(NKX6.1)；八聚体结合转录因子4(OCT4)和神经元素2(NGN2)；八聚体结合转录因子4(OCT4)和转录因子SOX-11(SOX11)；八聚体结合转录因子4(OCT4)、LIM同源框3(LHX3)和ISL LIM同源框1；八聚体结合转录因子4(OCT4)、LIM同源框3(LHX3)和NK6同源框1(NKX6.1)；八聚体结合转录因子4(OCT4)、LIM同源框3(LHX3)和神经元素2(NGN2)；八聚体结合转录因子4(OCT4)、LIM同源框3(LHX3)和转录因子SOX-11(SOX11)的组合。
本发明的一方面的编码八聚体结合转录因子4(Octamer-binding transcriptionfactor4，OCT4)蛋白、LIM同源框3(LIM homeobox 3，LHX3)蛋白、ISL LIM同源框1(ISL LIMhomeobox1，ISL1)蛋白、NK6同源框1(NK6 homeobox 1，NKX6.1)蛋白、神经元素2(neurogenin 2，NGN2)蛋白以及转录因子SOX-11(SRY-box 11，SOX11)蛋白质中的任何一种或更多种蛋白质的核酸分子可以以插入到表达八聚体结合转录因子4(Octamer-bindingtranscription factor 4，OCT4)蛋白、LIM同源框3(LIM homeobox 3，LHX3)蛋白、ISL LIM同源框1(ISL LIM homeobox 1，ISL1)蛋白、NK6同源框1(NK6 homeobox 1，NKX6.1)蛋白、神经元素2(neurogenin 2，NGN2)蛋白以及转录因子SOX-11(SRY-box 11，SOX11)蛋白的载体的状态使用，其中，所述载体包括编码所述一种或更多种蛋白质的核酸分子。
在本发明中，“载体”是作为能够在合适的宿主细胞中表达靶蛋白的表达载体，可以指包括可操作地连接的必需的调节要素的基因递送系统以表达基因插入物。
本发明的载体除了包括诸如启动子、操纵子、起始密码子、终止密码子、多聚腺苷酸化信号和增强子的表达调控元件，还包括膜靶向或用于分泌的信号序列或前导序列，并且可以根据不同目的被多样地制备。载体的启动子可以是组成型或诱导型。此外，表达载体包括用于选择含有载体的宿主细胞的选择性标志物，并且如果是可复制的表达载体，包括复制起点。载体可以自主复制或整合到宿主DNA中。
作为一具体实施例，已证实将编码八聚体结合转录因子4(Octamer-bindingtranscription factor 4，OCT4)蛋白、LIM同源框3(LIM homeobox 3，LHX3)蛋白、ISL LIM同源框1(ISL LIM homeobox 1，ISL1)蛋白、NK6同源框1(NK6 homeobox 1，NKX6.1)蛋白、神经元素2(neurogenin 2，NGN2)蛋白以及转录因子SOX-11(SRY-box 11，SOX11)蛋白组成的组中的一种或更多种蛋白质的核酸分子或引入所述核酸分子的载体引入到体细胞中，以直接转分化为运动神经元。
此外，本发明的组合物可以通过载体引入可诱导运动神经元直接转分化的转录因子，而在本发明中可使用的载体可以是选自由例如，质粒载体、粘粒载体、病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体(Retrovirus)、人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiencyvirus，HIV)载体、鼠白血病病毒(Murineleukemia virus，MLV)载体、禽肉瘤白血病病毒(Avian sarcoma/leukosis，ASLV)载体、脾坏死病毒(Spleen necrosis virus，SNV)载体、劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)载体、小鼠乳腺肿瘤病毒(Mouse mammary tumorvirus，MMTV)载体、腺病毒(Adenovirus)载体、腺相关病毒(Adenoassociatedvirus)载体、单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus)载体以及游离型(episomal)载体组成的组中一种或更多种载体。
所述八聚体结合转录因子4(Octamer-binding transcription factor 4，OCT4)蛋白、LIM同源框3(LIM homeobox 3，LHX3)蛋白、ISL LIM同源框1(ISL LIM homeobox 1，ISL1)蛋白、NK6同源框1(NK6 homeobox 1，NKX6.1)蛋白、神经元素2(neurogenin 2，NGN2)蛋白以及转录因子SOX-11(SRY-box 11，SOX11)蛋白可以以编码所述蛋白质中的任何一种或更多种蛋白质的核酸分子或引入所述核酸分子的载体的形式提供。所述八聚体结合转录因子4(Octamer-binding transcription factor 4，OCT4)蛋白、LIM同源框3(LIMhomeobox3，LHX3)蛋白、ISL LIM同源框1(ISL LIM homeobox 1，ISL1)蛋白、NK6同源框1(NK6 homeobox1，NKX6.1)蛋白、神经元素2(neurogenin 2，NGN2)蛋白以及转录因子SOX-11(SRY-box 11，SOX11)蛋白可以包括源自人、马、绵羊、猪、山羊、骆驼、羚羊、狗等哺乳动物的所有八聚体结合转录因子4(Octamer-binding transcription factor 4，OCT4)蛋白、LIM同源框3(LIM homeobox 3，LHX3)蛋白、ISL LIM同源框1(ISL LIM homeobox 1，ISL1)蛋白、NK6同源框1(NK6 homeobox 1，NKX6.1)蛋白、神经元素2(neurogenin 2，NGN2)蛋白以及转录因子SOX-11(SRY-box 11，SOX11)蛋白。此外，可以在本发明中使用的八聚体结合转录因子4(Octamer-binding transcription factor 4，OCT4)蛋白、LIM同源框3(LIMhomeobox3，LHX3)蛋白、ISL LIM同源框1(ISL LIM homeobox 1，ISL1)蛋白、NK6同源框1(NK6 homeobox1，NKX6.1)蛋白、神经元素2(neurogenin 2，NGN2)蛋白以及转录因子SOX-11(SRY-box 11，SOX11)蛋白不仅可以包括具有它们的野生型(wild type)氨基酸序列的蛋白质，还可以包括选自由八聚体结合转录因子4(Octamer-binding transcription factor4，OCT4)蛋白、LIM同源框3(LIM homeobox 3，LHX3)蛋白、ISL LIM同源框1(ISL LIMhomeobox 1，ISL1)蛋白、NK6同源框1(NK6 homeobox 1，NKX6.1)蛋白、神经元素2(neurogenin 2，NGN2)蛋白以及转录因子SOX-11(SRY-box 11，SOX11)蛋白组成的组中的一种或更多种蛋白质的变异体(例如，各个蛋白质的亚型(subtype))。
所述八聚体结合转录因子4(Octamer-binding transcription factor 4，OCT4)蛋白、LIM同源框3(LIM homeobox 3，LHX3)蛋白、ISL LIM同源框1(ISL LIM homeobox 1，ISL1)蛋白、NK6同源框1(NK6 homeobox 1，NKX6.1)蛋白、神经元素2(neurogenin 2，NGN2)蛋白以及转录因子SOX-11(SRY-box 11，SOX11)蛋白的变异体是指八聚体结合转录因子4(Octamer-binding transcription factor 4，OCT4)蛋白、LIM同源框3(LIM homeobox 3，LHX3)蛋白、ISL LIM同源框1(ISL LIM homeobox 1，ISL1)蛋白、NK6同源框1(NK6homeobox1，NKX6.1)蛋白、神经元素2(neurogenin 2，NGN2)蛋白以及转录因子SOX-11(SRY-box 11，SOX11)蛋白的野生型氨基酸序列的一个或更多个氨基酸残基由于缺失、插入、非保守或保守取代或其组合，在具有与野生型氨基酸序列不同的序列的同时，还保持野生型(wild-type)蛋白质固有的生物学功能。所述变异体可以是与野生型蛋白质表现出相同生物学活性的功能等同物或根据需要对蛋白质的理化性质进行修饰的变异体，也可以是对物理、化学环境，其结构稳定性增强或生理学活性增强的变异体。
所述八聚体结合转录因子4(Octamer-binding transcription factor 4，OCT4)蛋白、LIM同源框3(LIM homeobox 3，LHX3)蛋白、ISL LIM同源框1(ISL LIM homeobox 1，ISL1)蛋白、NK6同源框1(NK6 homeobox 1，NKX6.1)蛋白、神经元素2(neurogenin 2，NGN2)蛋白以及转录因子SOX-11(SRY-box 11，SOX11)蛋白或其变异体可以是从天然分离的，或重组或合成产生(non-naturally occurring)的。
此外，编码八聚体结合转录因子4(Octamer-binding transcription factor 4，OCT4)蛋白、LIM同源框3(LIM homeobox 3，LHX3)蛋白、ISL LIM同源框1(ISL LIM homeobox1，ISL1)蛋白、NK6同源框1(NK6 homeobox 1，NKX6.1)蛋白、神经元素2(neurogenin 2，NGN2)蛋白以及转录因子SOX-11(SRY-box 11，SOX11)蛋白中的任何一种或更多种蛋白质的核酸作为编码野生型或如上所述的变异体形式的所述蛋白质的碱基序列，一个或更多个碱基可以由于取代、缺失、插入或其组合发生变异，并且可以通过从天然中分离或化学合成法制备。
所述具有编码八聚体结合转录因子4(Octamer-binding transcription factor4，OCT4)蛋白、LIM同源框3(LIM homeobox 3，LHX3)蛋白、ISL LIM同源框1(ISL LIMhomeobox 1，ISL1)蛋白、NK6同源框1(NK6 homeobox 1，NKX6.1)蛋白、神经元素2(neurogenin 2，NGN2)蛋白以及转录因子SOX-11(SRY-box 11，SOX11)蛋白中的任何一种或更多种蛋白质的碱基序列的核酸可以是单链或双链，并且可以是DNA分子(基因组，cDNA)或RNA(mRNA)分子。
在一具体实施例中，将通过慢病毒的八聚体结合转录因子4(OCT4)或八聚体结合转录因子4(OCT4)和LIM同源框3(LIM homeobox 3，LHX3)的直接转分化因子引入到成纤维细胞中，并且异位表达所述因子以将成纤维细胞直接转分化为运动神经元，其中，所述成纤维细胞被选为体细胞的代表例。此外，已证实通过对所述被诱导出的运动神经元进行逆转录聚合酶链式反应(Reverse transcription PCR)，与引入直接转分化因子之前的成纤维细胞不同的运动神经元标志物显示在被诱导出的运动神经元中。
术语“体细胞”可以是指除生殖细胞之外的任何细胞，并且可以源自或分离自哺乳动物，例如，人、马、绵羊、猪、山羊、骆驼、羚羊和狗等。此外，本发明的组合物可以诱导体细胞直接转分化为运动神经元，而所述体细胞可以是选自由成纤维细胞(fibroblast)、上皮细胞、肌肉细胞、神经细胞、毛细胞、毛根细胞、毛囊细胞、口腔上皮细胞、从尿液中提取的体细胞、胃粘膜细胞、杯状细胞、G细胞、B细胞、周细胞、星形胶质细胞(astrocyte)、血细胞、神经干细胞、造血干细胞、脐带血干细胞以及间充质干细胞组成的组中的一种或更多种，但不限于此。只是在本发明的一具体实施例中将成纤维细胞作为体细胞。
术语“运动神经元(motor neuron)”作为构成神经系统的一种神经元，是指将源于脊髓等中枢神经系统的信号传递给诸如肌肉或腺体等效应器(effector)以进行操作的神经元。此外，“被诱导出的运动神经元”可以是指例如，体细胞通过根据本发明的一方面的直接转分化以诱导为运动神经元。
在一具体实施例中，所述直接转分化方法可以包括以下步骤：在培养基中培养体细胞；在所述培养的体细胞中，将插入八聚体结合转录因子4(Octamer-bindingtranscription factor 4，OCT4)蛋白基因、LIM同源框3(LIM homeobox 3，LHX3)蛋白基因、ISL LIM同源框1(ISL LIM homeobox 1，ISL1)蛋白基因、NK6同源框1(NK6 homeobox 1，NKX6.1)蛋白基因、神经元素2(neurogenin 2，NGN2)蛋白基因以及转录因子SOX-11(SRY-box 11，SOX11)蛋白基因中的任何一种或更多种蛋白质基因的载体进行转染(transfection)；以及在能够诱导所述转染的体细胞直接转分化的培养条件下进行培养。
此外，在所述直接转分化的方法中，可以进一步包括将八聚体结合转录因子4(Octamer-binding transcription factor 4，OCT4)蛋白基因、LIM同源框3(LIMhomeobox3，LHX3)蛋白基因、ISL LIM同源框1(ISL LIM homeobox 1，ISL1)蛋白基因、NK6同源框1(NK6 homeobox 1，NKX6.1)蛋白基因、神经元素2(neurogenin 2，NGN2)蛋白基因以及转录因子SOX-11(SRY-box 11，SOX11)蛋白基因中的任何一种或更多种蛋白质基因转染到体细胞中的步骤。
用于培养所述体细胞的培养基包括本领域常用的用于培养体细胞的所有培养基。用于培养的培养基一般含有碳源、氮源和微量元素成分。在本发明的一具体实施例中，使用了含有硫酸鱼精蛋白(protamine sulphate)的培养基，但不限于此。
此外，能够诱导所述体细胞直接转分化的培养条件可以包括本领域中常用于诱导体细胞直接转分化的培养基和/或常规培养条件。
通过将所述用于诱导直接转分化的组合物引入到体细胞中的步骤，可以诱导八聚体结合转录因子4(Octamer-binding transcription factor 4，OCT4)、LIM同源框3(LIMhomeobox3，LHX3)、ISL LIM同源框1(ISL LIM homeobox 1，ISL1)、NK6同源框1(NK6homeobox 1，NKX6.1)、神经元素2(neurogenin 2，NGN2)以及转录因子SOX-11(SRY-box 11，SOX11)等直接转分化因子的异位表达(Ectopic expression)。异位表达是指某个基因在其原本表达的组织或细胞之外表达，或在与原本表达时间不同的时间表达。根据本发明的方法，可以有效地将体细胞制备为运动神经元。
根据本发明的一方面公开的方法和组合物被诱导出的运动神经元，其特征在于，在不表达源自原始细胞的标志物的同时，仅有在运动神经元中表达的标志物显示。在本发明的一方面，为了获得被诱导直接转分化出的运动神经元，可以利用组合物来诱导直接转分化，其中，所述组合物包括八聚体结合转录因子4(Octamer-binding transcriptionfactor 4，OCT4)蛋白、LIM同源框3(LIM homeobox 3，LHX3)蛋白、ISL LIM同源框1(ISL LIMhomeobox 1，ISL1)蛋白、NK6同源框1(NK6 homeobox 1，NKX6.1)蛋白、神经元素2(neurogenin 2，NGN2)蛋白以及转录因子SOX-11(SRY-box 11，SOX11)蛋白中的任何一种或更多种蛋白质。
已证实通过包括核酸分子或引入所述核酸分子的载体的组合物直接转分化为运动神经元，其中，所述核酸分子编码八聚体结合转录因子4(Octamer-bindingtranscription factor4，OCT4)蛋白、LIM同源框3(LIM homeobox 3，LHX3)蛋白、ISL LIM同源框1(ISL LIM homeobox1，ISL1)蛋白、NK6同源框1(NK6 homeobox 1，NKX6.1)蛋白、神经元素2(neurogenin 2，NGN2)蛋白以及转录因子SOX-11(SRY-box 11，SOX11)蛋白中的任何一种或更多种蛋白质。
此外，作为一具体实施例，已证实在包括编码八聚体结合转录因子4(Octamer-binding transcription factor 4，OCT4)蛋白的核酸分子或引入所述核酸分子的载体中，进一步包括编码LIM同源框3(LIM homeobox 3，LHX3)的核酸分子或引入所述核酸分子的载体，并且根据所述组合物将体细胞直接转分化为运动神经元。
此外，所述被诱导直接转分化出的运动神经元可以根据所述组合物中包括的八聚体结合转录因子4(Octamer-binding transcription factor 4，OCT4)蛋白、LIM同源框3(LIM homeobox 3，LHX3)蛋白、ISL LIM同源框1(ISL LIM homeobox 1，ISL1)蛋白、NK6同源框1(NK6 homeobox 1，NKX6.1)蛋白、神经元素2(neurogenin 2，NGN2)蛋白以及转录因子SOX-11(SRY-box 11，SOX11)蛋白中的任何一种或更多种蛋白质；和/或编码所述蛋白质中的任何一种或更多种蛋白质的核酸分子提供。
术语“预防”是指通过消除或及早发现神经系统疾病和损伤的病因来预防该疾病的所有行为。
术语“治疗”是指根据本发明的组合物改善或有益地改变由神经系统疾病和损伤引起的症状的所有行为。
可预防或治疗的所述神经系统疾病和损伤可以是选自由例如，脊髓损伤、帕金森病、脑卒中、肌萎缩侧索硬化、运动神经损伤、外伤造成的末梢神经损伤、缺血性脑损伤、新生儿缺氧缺血性脑损伤、脑性瘫痪、癫痫、顽固性癫痫、阿尔茨海默病、先天性神经系统代谢性疾病以及创伤性脑损伤(traumatic brain injury)组成的组中的一种或更多种，但不限于此，并且包括神经系统的功能衰退、丧失和/或由异常功能引起的所有疾病和/或病理状况。
所述组合物包括被诱导出的运动神经元同时，可以进一步包括一种或更多种已知的具有预防或治疗神经系统疾病和损伤的作用的活性成分。
所述组合物可以进一步包括药学上可接受的添加剂，可以使用例如，淀粉、糊化淀粉、微晶纤维素、乳糖、聚维酮、胶体二氧化硅、磷酸氢钙、乳糖、甘露醇、麦芽糖、阿拉伯树胶、预糊化淀粉、玉米淀粉、粉状纤维素、羟丙基纤维素、欧巴代、羟基乙酸淀粉钠、巴西棕榈蜡、合成硅酸铝、硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸铝、硬脂酸钙以及白糖等。基于所述组合物，根据本发明的药学上可接受的添加剂的含量优选为包括0.1至90重量份，但不限于此。
所述组合物在实际临床施用时可以以各种口服或肠胃外的剂型施用，而在制剂化的情况下，可以使用常用的稀释剂或赋形剂制备，例如，填充剂、增量剂、结合剂、润湿剂、崩解剂以及表面活性剂等，并且优选使用文献中公开的(Remington's PharmaceuticalScience,最近,Mack Publishing Company,Easton PA)作为本领域已知的合适制剂。可以包括在所述组合物中的载体、赋形剂和稀释剂包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、低聚糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁以及矿物油等。
所述组合物的优选剂量根据个体的状态和体重、疾病的严重程度、药物类型、施用途径和时间而不同，但可以由本领域技术人员进行适当地选择。为了达到预期的效果，本发明的被诱导直接转分化出的运动神经元，以体重为70㎏的成人患者为基准，可以以例如，约1000至10000个细胞/次、1000至100000个细胞/次、1000至1000000细胞/次、1000至10000000细胞/次、1000至100000000细胞/次、1000至1000000000细胞/次以及1000至10000000000细胞/次，间隔一定时间每天施用一次或更多次，也可以间隔一定时间数次施用。
所述组合物可以通过多种途径施用于个体。可以设想施用的所有方式，例如，可以通过口服、直肠或静脉内、肌肉内或皮下注射施用，并且如果是皮肤涂抹方式，可以通过任何途径施用。
“个体”是指需要治疗神经系统疾病和损伤的对象，更为具体的是指哺乳动物，例如，人类或非人灵长类、小鼠(mouse)、大鼠(rat)、狗、猫、马以及牛等。
在本发明的一方面，所述组合物可以单独使用，或与使用手术、放射疗法、激素疗法、化学疗法以及生物反应调节剂的方法并用，以预防和治疗神经系统疾病和损伤。所述包括被诱导直接转分化出的运动神经元的药物组合物中进一步包括HB9蛋白。
术语“细胞治疗剂”作为使用自体(autologous)、同种异体(allogenic)或异种(xenogenic)细胞以恢复组织功能的治疗剂，是指用于抑制癌症的治疗剂。如果将被诱导直接转分化出的运动神经元作为活性成分包括在内，则可以作为治疗和预防神经系统疾病和损伤的细胞治疗剂。
所述细胞治疗剂可以进一步包括药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体可以使用例如，盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇、人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)以及这些成分中的一种或更多种的混合物，并且根据所需可以加入其他常规添加剂，例如，抗氧化剂、缓冲剂以及抑菌剂等。
所述细胞治疗剂可以另外加入例如，稀释剂、分散剂、表面活性剂、结合剂以及润滑剂，并且可以制剂化成例如，水溶液、悬浮液或乳化液等的注射制剂。
所述用于筛选预防或治疗神经系统疾病和损伤的药物的组合物作为在存在和不存在神经系统疾病和损伤的治疗候选物质的情况下，确认本发明的被诱导分化出的运动神经元的反应性的方法，可以有效地用于筛选神经系统疾病和损伤的治疗剂。例如，本发明的一方面的被诱导分化出的运动神经元作为恢复或治疗神经系统疾病和损伤性疾病的重要细胞，可以用于评价候选物质的毒性或药效。
所述毒性评价可以根据本领域判断毒性的常规方法进行评估，例如，在存在或不存在本发明的一方面的治疗候选物质的情况下，或根据本发明的被分化诱导出的运动神经元的IC50等。此外，所述药效评价可以根据本领域能够确认对神经系统疾病和损伤性疾病的治疗有效的方法进行评估，例如，在存在或不存在本发明的一方面的治疗候选物质的情况下，本发明的被诱导分化出的运动神经元促进损伤的神经再生等。
所述3D打印技术作为一种打印三维(3D)立体固体物质的输出技术，所述3D打印生物材料组合物是指生物相容性高分子、天然高分子、生物分子、生物活性物质以及细胞，其具有仿生、小型组织和自发地自我组装的特征。
根据本发明的一方面，通过将通过直接转分化而被诱导出的运动神经元按照所需的形状或图案沉积成型，可以制备用于治疗神经系统疾病和损伤的人造组织，因此，可以广泛应用于再生医疗领域。
考虑到本专利申请书的复杂性省略了重复的内容，并且本专利申请书中未另外定义的术语具有本发明所属技术领域中常用的含义。
附图说明
图1a为成纤维细胞直接转分化以诱导为运动神经元的过程的示意图。
图1b涉及确认通过三维培养制备的被诱导出的运动神经元的组织学形式的结果。
图2为示出确认通过单一或组合的直接转分化因子基因被诱导出的运动神经元中HB9基因表达的结果(图2A)，以及确认通过所述因子诱导的运动神经元直接转分化的效率的结果(图2B)的图。
图3为示出对被诱导出的运动神经元进行免疫荧光染色的结果的图。
图4为示出确认在被诱导出的运动神经元(诱导型运动神经元中间细胞、通过感染八聚体结合转录因子4(OCT4)制备的诱导型运动神经元细胞、感染八聚体结合转录因子4(OCT4)后处理LIM同源框3(LHX3)的诱导型运动神经元细胞)中表达的运动神经元标志物的结果的图。
图5为示出确认与作为来源的细胞的成纤维细胞相比，在被诱导出的运动神经元中出现的基因相对表达水平的差异的结果的图。
图6为确认对于大鼠脊髓损伤模型的神经损伤治疗效果与对照组大鼠相比的结果的BBB评分(BBB score)的结果(图6A)，和确认在脊髓部分进行苏木精—伊红染色法(H&E)以示出的结果的图(图6B)，其中，所述BBB评分为能够确认运动恢复功能恢复程度的指标。
具体实施方式
在下文中，将详细描述实验例和实施例以帮助理解本发明。然而，以下实验例和实施例仅用于示例本发明的内容，本发明的范围不限于以下实验例和实施例。提供本发明的实验例和实施例是为了向本领域的普通技术人员更完整地描述本发明。
[实验例和实施例]
<实验例1>克隆以及慢病毒质粒的包装
使用HepG2的cDNA，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增转录因子(八聚体结合转录因子4(OCT4)和LIM同源框3(LHX3))。然后，将所述转录因子转移到慢病毒载体，并且通过测序进行确认。慢病毒包装是采用X-tremeGENE 9DNA转染试剂(Transfection Reagent，Roche，06365787001)，并且以3：2：1的比例分别加入慢病毒转移质粒(lentiviral transferplasmid)、包装质粒(packaging plasmid,psPAX2)以及包膜质粒(envelope plasmid，VSV-G)进行的。加入DMEM将总体积为200μl的混合物用50％汇合度(confluent)的293T细胞处理，转化48小时。将细胞培养基在超速离心机中以80000g离心分离1小时30分钟，然后将离心分离后的慢病毒颗粒在1ml的DMEM(Gibco，10313-021)中稀释后，用于转化。
<实验例2>细胞培养基以及诱导型运动神经元(induced motor neurons，iMN)的制备
将皮肤成纤维细胞以3×104个细胞(cells)接种在含10％胎牛血清(FBS)的培养基的明胶包被6孔(well)培养板上。一天后，在含有6μg/ml的硫酸鱼精蛋白上用分别表达八聚体结合转录因子4(OCT4)、LIM同源框3(LHX3)、ISL LIM同源框1(ISL1)、NK6同源框1(NKX6.1)、神经元素2(NGN2)以及转录因子SOX-11(SOX11)的pMX逆转录病毒载体和表达八聚体结合转录因子4(OCT4)和LIM同源框3(LHX3)；八聚体结合转录因子4(OCT4)和ISL LIM同源框1(ISL1)；八聚体结合转录因子4(OCT4)和NK6同源框1(NKX6.1)；八聚体结合转录因子4(OCT4)和神经元素2(NGN2)；八聚体结合转录因子4(OCT4)和转录因子SOX-11(SOX11)；八聚体结合转录因子4(OCT4)、LIM同源框3(LHX3)和ISL LIM同源框1(ISL1)；八聚体结合转录因子4(OCT4)、LIM同源框3(LHX3)和NK6同源框1(NKX6.1)；八聚体结合转录因子4(OCT4)、LIM同源框3(LHX3)和神经元素2(NGN2)；八聚体结合转录因子4(OCT4)、LIM同源框3(LHX3)和转录因子SOX-11(SOX11)组合的pMX逆转录病毒载体感染成纤维细胞，以制备诱导型运动神经元。此后，去除病毒上清液，并且用新鲜培养基替代。用载体感染成纤维细胞后，将制备的诱导型运动神经元(iMN)接种在作为运动神经元分化培养基的多聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白包被的4孔(PDL/laminin-coated 4-well)培养板上。平皿接种后，培养细胞，机械分离神经元细胞群，并且在明胶包被的培养板上挑取(picking)成熟的诱导型运动神经元(iMN)或用胰蛋白酶消化处理以进行传代培养(subculture)。
<实验例3>RNA提取以及cDNA合成
在RiboEX(Geneall,301-001)中提取细胞裂解物中的总RNA(total RNA)。RNA提取是根据制造商的协议进行的。通过将500ng的RNA和oligo-dT引物加入到总共为20μl的反应混合物中，并且用莫洛尼(氏)鼠白血病病毒(M-MuLV)逆转录酶(NEB，M0253L)合成cDNA。
<实验例4>RT-PCR分析
使用Taq聚合酶(Taq polymerase)(Invitrogen，10342-020)和引物对在58℃下进行35个循环的逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。在1％琼脂糖凝胶上，对聚合酶链式反应(PCR)产物用100V进行25分钟的凝胶电泳，然后将其对运动神经元标志物基因、运动神经元祖细胞以及神经外胚层标志物重复实验3次，用持家基因(housekeeping gene)甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Gapdh)归一化。通过Ct值计算方法测量并分析基因表达，并且所有实验均按照制造商的说明进行。
<实验例5>免疫荧光染色
在室温下，用4％多聚甲醛(Tech&Innovation,BPP-9004)固定细胞10分钟。用杜氏磷酸缓冲盐溶液(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline，DPBS,Corning,21-031-CV)将被固定的细胞洗涤3次。然后，在室温下，用含0.1％聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100，Sigma，T9284)的杜氏磷酸缓冲盐溶液(DBPS)浸渍细胞10分钟。用杜氏磷酸缓冲盐溶液(DBPS)洗涤3次后，在室温下，用含4％胎牛血清(FBS)的杜氏磷酸缓冲盐溶液(DBPS)反应1小时，以封闭非特异性结合。随后进行了以下步骤：在室温下，将细胞与一抗一起培养1小时后，用含0.05％吐温-20(Tween-20，Sigma，P7949)的杜氏磷酸缓冲盐溶液(DBPS)洗涤3次。然后，将荧光二抗在样本中处理，并且在黑暗中培养1小时。如果需要双重染色，则在根据上述步骤处理一抗之前，进行30分钟的进一步的封闭步骤。
<实验例6>微阵列分析
使用微阵列分析，用成纤维细胞、感染八聚体结合转录因子4(OCT4)后的成纤维细胞对诱导型运动神经元中间细胞(iMN intermediate cell)，仅用八聚体结合转录因子4(OCT4)感染制备的诱导型运动神经元(Mock_iMN)以及感染八聚体结合转录因子4(OCT4)后通过处理LIM同源框3(LHX3)制备的诱导型运动神经元细胞(LHX3_iMN)进行全局基因表达轮廓分析，并且分别进行比较。根据制造商的说明，使用RNeasy mini kit(Qiagen)分离总RNA。样本与Affymetrix阵列(Affymetrix array)进行杂交。并且，通过多阵列对数健壮算法(Robust Multi-array Analysis，RMA)计算以归一化。而数据处理和绘图是通过内部开发的矩阵实验室(Matlab)进行的。基因和样本的层次聚类是通过一种负相关性度量和非加权平均距离链接方法(one minus correlation metric and the unweighted averagedistance(UPGMA)linkage)进行的。
<实验例7>脊髓损伤模型的制备以及诱导型运动神经元的植入
脊髓损伤模型是使用气动冲孔装置制备的，所述气动冲孔装置用于损伤6周龄雄性大鼠的脊髓的胸椎节段9(level 9，T9)。受伤一周后，将收获的诱导型运动神经元(iMNs)用细胞膜红色荧光探针(DiI)标记，并且通过脑立体定位法(stereotaxic)，以1×105诱导型运动神经元/大鼠(iMNs/rat)的浓度分别注射到脊髓的胸椎节段8(level 8，T8)和胸椎节段10(level 10，T10)。定期给大鼠提供水和食物，并且按摩它们的膀胱以使它们排尿。动物实验过程已获得动物设施(animal facility)和蔚山科学技术大学IBR委员会的批准。动物实验过程是基于美国国立卫生研究院的动物研究指南进行的。
实施例1.通过直接转分化因子诱导为诱导型运动神经元(induced motorneurons,iMN)
为了诱导为运动神经元，将皮肤成纤维细胞接种在培养基中，并且通过慢病毒表达系统将八聚体结合转录因子4(OCT4)(一种引起诱导为运动神经元的转录因子)在成纤维细胞中转化24小时，以制备诱导型运动神经元中间细胞(iMN intermediate cell)。然后，通过慢病毒表达系统将LIM同源框3(LHX3)进一步引入到所述细胞中，以制备诱导型运动神经元或未引入LIM同源框3(LHX3)的诱导型运动神经元。然后，将其皮肤组织贴附于明胶包被的培养皿中进行培养后使用。所述实验过程示意图如图1a所示，并且所述被诱导出的运动神经元的三维培养的细胞组织形态如图1b所示。
如图1b所示，已证实在通过慢病毒转化后约20天左右形成聚集体并将其三维培养后的第5天，则出现典型的运动神经元形态。通过如上所述结果，已证实通过八聚体结合转录因子4(OCT4)和LIM同源框3(LHX3)在作为体细胞的成纤维细胞中处理，以诱导所述因子的异位表达(ectopic expression)，则可以有效地制备运动神经元。特别地，已证实通过如上所述过程被诱导出的运动神经元显示出在实际运动神经元中出现的特征性形态。
实施例2.通过直接转分化因子诱导为诱导型运动神经元(induced motorneurons,iMN)
进行了确认以下内容的实验：将直接转分化因子的单个基因和两个或更多个基因组合引入到体细胞中以诱导直接转分化为运动神经元的情况下，直接转分化效率是否有效显现；以及所述直接转分化因子组合之间的直接转分化效率。在与实验例2相同的条件下，使用直接转分化因子单个基因以及其组合制备诱导型运动神经元，确认在制备的运动神经元中作为直接转分化的运动神经元标志物的HB9的表达结果如图2A所示，并且测量单个基因以及其组合之间直接转分化效率的结果如图2B所示。
如图2A所示，已证实作为运动神经元标志物的HB9在单个直接转分化因子中按照八聚体结合转录因子4(OCT4)、LIM同源框3(LHX3)、ISL LIM同源框1(ISL1)、NK6同源框1(NKX6.1)、神经元素2(NGN2)以及转录因子SOX-11(SOX11)的顺序表达降低，并且在组合因子八聚体结合转录因子4(OCT4)和LIM同源框3(LHX3)；八聚体结合转录因子4(OCT4)、LIM同源框3(LHX3)和ISL LIM同源框1(ISL1)；八聚体结合转录因子4(OCT4)、LIM同源框3(LHX3)和NK6同源框1(NKX6.1)；八聚体结合转录因子4(OCT4)、LIM同源框3(LHX3)和神经元素2(NGN2)；八聚体结合转录因子4(OCT4)、LIM同源框3(LHX3)和转录因子SOX-11(SOX11)组合中，已证实与作为运动神经元标志物的HB9的表达水平相比成纤维细胞提升500倍或更多倍。此外，如图2B所示，已证实在单个直接转分化因子基因中，八聚体结合转录因子4(OCT4)是在表达作为运动神经元标志物的HB9的细胞中具有最高的直接转分化效率。此外，在组合直接转分化因子中，已证实所有组合均显示出60％或更高的效率，因此，已证实组合直接转分化因子的直接转分化效率高于单个因子。
实施例3.确认被诱导直接转分化出的运动神经元的特性
为了确认在所述实施例1和2中，诱导型运动神经元(iMN)除了形态之外，是否还显示出实质的运动神经元的特征，进行蛋白质印迹法、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分析的同时，还进行了免疫荧光染色。按照实验例4至6公开的方法进行了实验，并且将免疫荧光染色的结果显示在图3，确认通过蛋白质印迹法表达的基因标志物的结果显示在图4，以及与作为来源的细胞的成纤维细胞相比，被诱导出的运动神经元中显示出的基因相对表达水平的差异显示在图5。
如图3所示，已证实在成纤维细胞中没有表达的运动神经元标志物HB9、ISLT1、NK6同源框1(NKX6.1)、微管相关蛋白2(MAP2)和β-微管蛋白III(TUJ1)在制备出的诱导型运动神经元(iMN)中表达强。此外，如图4所示，已证实在诱导型运动神经元中间细胞(iMNintermediate cell)中，显示出ISLT1和微管相关蛋白2(MAP2)标志物的表达，并且已证实仅用八聚体结合转录因子4(OCT4)诱导出运动神经元的组(+Mock_iMN)表达ISLT1和微管相关蛋白2(MAP2)的同时，进一步表达LIM1。已证实通过进一步引入LIM同源框3(LHX3)诱导出的运动神经元组(+LHX3_iMN)中，LIM1、HB9、ISLT1、NK6同源框1(NKX6.1)以及微管相关蛋白2(MAP2)全部表达。
而且，如图5所示，已证实在诱导型运动神经元中间细胞中，ISLT1的表达明显增强，此外，也已证实在仅用八聚体结合转录因子4(OCT4)诱导出运动神经元的组(Mock_iMN)中，ISLT1、微管相关蛋白2(MAP2)和LIM1的表达提升10倍或更多倍。已证实在通过进一步引入LIM同源框3(LHX3)以诱导的运动神经元组(LHX3_iMN)中，LIM1、HB9、ISLT1、NK6同源框1(NKX6.1)、SCSL1以及微管相关蛋白2(MAP2)的表达水平均提升了约10倍或更多倍。
根据如上所述结果，已证实被制备出的诱导型运动神经元(iMN)与实际运动神经元不仅形态相同，运动神经元标志物明显显示也相同。然而，如图3和图4所示，已证实根据使用的直接转分化反应转录因子的组合可以确认的运动神经元标志物的表达模式可能略有不同。
因此，综合如上所述的结果，已证实从成纤维细胞被诱导出的运动神经元与实际运动神经元相同，以证实通过所述实施例公开的方法，可以有效率地诱导出运动神经元。
实施例4.确认通过对脊髓损伤动物模型施用诱导型运动神经元(iMN)治疗神经损伤的效果
为了证实所述实施例制备的运动神经元对脊髓损伤动物模型施用时是否具有治疗作用，进行了实验。实验方法与实验例7相同，对于在进一步被诱导的诱导型运动神经元(iMN)中进一步并用HB9以施用的大鼠脊髓损伤模型的神经损伤治疗效果，将施用诱导型运动神经元(iMN)的组与对照组大鼠进行对比，其对比结果通过BBB评分确认的结果显示在图6A，在脊髓部分进行苏木精—伊红染色法(H&E)以确认的结果显示在图6B，其中，所述BBB评分为确认运动恢复功能恢复程度的指标。
如图6A所示，已证实与对照组相比，注射诱导型运动神经元(iMN)的组随着时间的推移，运动机能恢复程度从引用5周后开始明显提升。此外，已证实在诱导型运动神经元(iMN)中并用HB9一起施用的组中，运动机能的恢复从注射1周后开始稳步提升，特别是从3周后开始运动机能明显恢复。此外，如图6B所示，已证实在被诱导出的诱导型运动神经元(iMN)中进一步并用HB9以施用的情况下，与对照组相比，脊髓损伤部分的受损组织明显减少。
通过如上所述结果，施用被诱导出的运动神经元可以有效地治疗神经系统疾病和损伤，因此，已证实其可以应用为能够预防或治疗所述疾病等的治疗组合物的可能性。
有益效果
当使用本发明一方面的组合物，通过诱导直接转分化因子的表达，可以有效地诱导体细胞分化为运动神经元，而无需经历诱导多能干细胞的多能性(Pluripotency)步骤，因此，利用其可以有效地预防和治疗神经系统疾病和损伤。此外，如果利用一方面的被诱导出的运动神经元，可以用于能够治疗被认为是疑难疾病的神经系统疾病和损伤的药物组合物和用于制备人造组织的3D打印生物材料组合物，因此，可以广泛应用于再生医疗领域。
Claims (13)
1.一种诱导体细胞直接转分化为运动神经元(motor neuron)的组合物，其包括选自由以下组成的组中的一种或更多种：(1)选自由八聚体结合转录因子4(Octamer-bindingtranscription factor 4，OCT4)蛋白、LIM同源框3(LIM homeobox 3，LHX3)蛋白、ISL LIM同源框1(ISL LIM homeobox 1，ISL1)蛋白、NK6同源框1(NK6 homeobox 1，NKX6.1)蛋白、神经元素2(neurogenin 2，NGN2)蛋白以及转录因子SOX-11(SRY-box 11，SOX11)蛋白组成的组中的一种或更多种蛋白质；(2)编码所述蛋白质的核酸分子；以及(3)引入所述核酸分子的载体。
2.根据权利要求1所述的诱导体细胞直接转分化为运动神经元(motor neuron)的组合物，其包括选自由以下组成的组中的一种或更多种：八聚体结合转录因子4(OCT4)蛋白、编码所述蛋白质的核酸分子、以及引入所述核酸分子的载体；和选自由以下组成的组中的一种或更多种：LIM同源框3(LHX3)、ISL LIM同源框1(ISL1)、NK6同源框1(NKX6.1)、神经元素2(NGN2)以及转录因子SOX-11(SOX11)组成的组中的一种或更多种蛋白质，编码所述蛋白质的核酸分子以及引入所述核酸分子的载体。
3.根据权利要求1所述的诱导体细胞直接转分化为运动神经元(motor neuron)的组合物，其特征在于，所述体细胞是选自由成纤维细胞(fibroblast)、上皮细胞、肌肉细胞、神经细胞、毛细胞、毛根细胞、毛囊细胞、口腔上皮细胞、从尿液中提取的体细胞、胃粘膜细胞、杯状细胞、G细胞、B细胞、周细胞、星形胶质细胞(astrocyte)、血细胞、神经干细胞、造血干细胞、脐带血干细胞以及间充质干细胞组成的组中的一种或更多种。
4.根据权利要求1所述的诱导体细胞直接转分化为运动神经元(motor neuron)的组合物，其特征在于，所述载体是选自由例如，质粒载体、粘粒载体、病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体(Retrovirus)、人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)载体、鼠白血病病毒(Murineleukemia virus，MLV)载体、禽肉瘤白血病病毒(Aviansarcoma/leukosis，ASLV)载体、脾坏死病毒(Spleen necrosis virus，SNV)载体、劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)载体、小鼠乳腺肿瘤病毒(Mouse mammary tumor virus，MMTV)载体、腺病毒(Adenovirus)载体、腺相关病毒(Adenoassociatedvirus)载体、单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus)载体以及游离型(episomal)载体组成的组中一种或更多种载体。
5.一种将体细胞直接转分化为运动神经元(motor neuron)的方法，其包括将组合物接触或插入到体细胞中的步骤，其中，所述组合物包括选自由以下组成的组中的一种或更多种：(1)选自由八聚体结合转录因子4(Octamer-binding transcription factor 4，OCT4)蛋白、LIM同源框3(LIM homeobox 3，LHX3)蛋白、ISL LIM同源框1(ISL LIM homeobox 1，ISL1)蛋白、NK6同源框1(NK6 homeobox 1，NKX6.1)蛋白、神经元素2(neurogenin 2，NGN2)蛋白以及转录因子SOX-11(SRY-box 11，SOX11)蛋白组成的组中的一种或更多种蛋白质；(2)编码所述蛋白质的核酸分子；
以及(3)引入所述核酸分子的载体。
6.一种将选自以下的一种或更多种引入到体细胞中以诱导直接转分化出的运动神经元：(1)核酸分子，其编码八聚体结合转录因子4(Octamer-binding transcription factor4，OCT4)蛋白、LIM同源框3(LIM homeobox 3，LHX3)蛋白、ISL LIM同源框1(ISL LIMhomeobox1，ISL1)蛋白、NK6同源框1(NK6 homeobox 1，NKX6.1)蛋白、神经元素2(neurogenin 2，NGN2)蛋白以及转录因子SOX-11(SRY-box 11，SOX11)蛋白组成的组中的一种或更多种蛋白质；以及(2)引入所述核酸分子的载体。
7.一种用于预防或治疗神经系统疾病和损伤的药物组合物，其包括将权利要求1所述的组合物或权利要求6所述的被诱导直接转分化出的运动神经元作为活性成分。
8.根据权利要求7所述的用于预防或治疗神经系统疾病和损伤的药物组合物，其中，所述神经系统疾病和损伤选自由脊髓损伤、帕金森病、脑卒中、肌萎缩侧索硬化、运动神经损伤、外伤造成的末梢神经损伤、缺血性脑损伤、新生儿缺氧缺血性脑损伤、脑性瘫痪、癫痫、顽固性癫痫、阿尔茨海默病、先天性神经系统代谢性疾病以及创伤性脑损伤(traumaticbraininjury)组成的组。
9.一种用于预防或治疗神经系统疾病和损伤的细胞治疗剂，其包括将权利要求6所述的被诱导直接转分化出的运动神经元作为活性成分。
10.根据权利要求7所述的用于预防或治疗神经系统疾病和损伤的药物组合物，其进一步包括HB9蛋白。
11.一种用于筛选预防或治疗神经系统疾病和损伤的组合物，其包括权利要求6所述的被诱导直接转分化出的运动神经元作为活性成分。
12.一种用于制备用于治疗神经系统疾病和损伤的人工组织的3D打印生物材料组合物，其包括权利要求6的被诱导直接转分化出的运动神经元作为活性成分。
13.一种用于预防或治疗神经系统疾病和损伤的方法，其包括将权利要求1所述的组合物或权利要求6所述的被诱导直接转分化出的运动神经元施用于所需的个体的步骤。
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