JP2023503282A - 改善された生体内リプログラミングシステムおよびこれを用いた細胞転換方法 - Google Patents

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ヨン イ、ヒェ
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Abstract

本発明は、改善された生体内リプログラミングシステムおよびこれを用いた細胞転換方法に関する。本発明のリプログラミングシステムは、出発細胞マーカーのプロモーター、遺伝子多能性維持タンパク質、アミノ酸分離ペプチド、Ｃｒｅ組換え酵素、指向細胞マーカーのプロモーター、ＬｏｘＰ、および蛍光タンパク質をコーディングする遺伝子を含み、細胞の転換を確認するために細胞の固定を必要とせず、細胞が生きている状態でリアルタイムにモニタリング可能であり、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）または生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）ですべて利用可能である。したがって、本発明は、バイオおよび医学分野において大きく利用されることが期待される。

Description

本発明は、改善された生体内リプログラミングシステムおよびこれを用いた細胞転換方法に関する。
最近、幹細胞研究分野では、ＳＯＸ２（Ｓｅｘ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ Ｙ－ｂｏｘ ２）のような遺伝子多能性維持タンパク質が究明されることにより、すでに分化完了した細胞で遺伝子多能性維持タンパク質を過発現させて他の細胞に転換させようとする努力が行われている。例えば、Ｈｕａｎｇらは、一般体細胞でＦｏｘａ３、Ｈｎｆ１ａ、およびＧａｔａ４遺伝子を用いて肝細胞に転換させる研究を行い（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４７５，ｐｐ．３８６－３８９，２０１１）、韓国登録特許第１０－１７０２６２９号には、一般体細胞をＦＬＩ１、またはＥＴＶ２遺伝子を用いて血管の前駆細胞に転換させる方法が開示されている。このように分化がすでに完了した細胞を他の細胞に直接転換させる方法は、既存の誘導万能幹細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、ｉＰＳＣｓ）にリプログラミングし、これを再分化して目的とする細胞に作らなければならない過程とは異なり、誘導万能幹細胞段階を経ることなく、直ちに目的とする細胞への転換を誘導するという点で疾病モデリングと新薬発掘などに利用される可能性が認められており、再生医学分野においても活用性が高いと注目されている。
しかし、従来の公知の細胞転換方法は、転換された細胞の効率が非常に低く、細胞の転換をリアルタイムにモニタリングできる技術が不在である問題点があった。細胞の状態をリアルタイムに測定不可能なため、細胞の転換が完了するまでの正確な時間を測定することができず、また、細胞の転換を確認するためには、細胞を固定（ｆｉｘａｔｉｏｎ）した後、免疫学的方法で確認しなければならなかった。したがって、転換された細胞を２次的に用いることが不可能であり、単に生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）細胞でのみ実施可能という問題点が派生した。
したがって、本発明は、改善された生体内リプログラミングシステムおよびこれを用いた細胞転換方法に関し、本発明のリプログラミングシステムは、細胞の転換を確認するために細胞の固定を必要とせず、細胞が生きている状態でリアルタイムにモニタリング可能であり、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）または生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）ですべて利用可能なため、バイオおよび医学分野において大きく利用されることが期待される。
本発明は、上記の従来の技術上の問題点を解決するためになされたものであって、改善された生体内リプログラミングシステムおよびこれを用いた細胞転換方法に関する。
しかし、本発明がなそうとする技術的課題は以上に言及した課題に制限されず、言及されていないさらに他の課題は以下の記載から当業界における通常の知識を有する者に明確に理解されるであろう。
以下、本願に記載の多様な具体例が図面を参照して記載される。下記の説明において、本発明の完全な理解のために、多様な特異的詳細事項、例えば、特異的形態、組成物および工程などが記載されている。しかし、特定の具体例は、これらの特異的詳細事項の１つ以上なしに、または他の公知の方法および形態とともに実行できる。他の例において、公知の工程および製造技術は、本発明を不必要にあいまにさせないために、特定の詳細事項として記載されない。「一つの具体例」または「具体例」に対する本明細書全体による参照は具体例と結びついて記載された特別な特徴、形態、組成または特性が本発明の一つ以上の具体例に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体にわたる多様な位置で表現された「一つの具体例において」または「具体例」の状況は、必ずしも本発明の同一の具体例を示さない。追加的に、特別な特徴、形態、組成または特性は、一つ以上の具体例において何らかの適した方法で組み合わされる。
明細書において、特別な定義がなければ、本明細書に使われたすべての科学的および技術的な用語は、本発明の属する技術分野における当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。
本発明は、改善された生体内リプログラミングシステムを提供する。本発明の生体内リプログラミングシステムは、ＨＥＫ２９３ＦＴ（ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ２９３ＦＴ ｃｅｌｌｓ）細胞にＧ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎが融合された水泡性口内炎ウイルス遺伝子（ｆｕｓｉｏｇｅｎｉｃ ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｇ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ、ＶＳＶ－Ｇ）、ＧＡＧ／Ｐｏｌ遺伝子、および発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）をＶｉａｆｅｃｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ４９８１、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を用いて導入させて製造したものである。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞は、ヒト胎児腎細胞に由来する細胞で、成長速度が速くて形質転換（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）効率が高いので、遺伝子研究分野において盛んに用いられる細胞である。
前記発現ベクターは、出発細胞マーカーのプローモータ、遺伝子多能性維持タンパク質、アミノ酸分離ペプチド、Ｃｒｅ組換え酵素、指向細胞マーカーのプロモーター、ＬｏｘＰ、および蛍光タンパク質をコーディングする遺伝子を順次に転写するように設計した。蛍光タンパク質は逆転写方向にデザインして、Ｃｒｅ組換え酵素の発現によってＬｏｘＰを認知して転写方向に復位するように設計した。
本明細書において、前記出発細胞マーカーのプロモーターとは、厳密には、出発細胞で細胞特異的に発現するマーカータンパク質をコーディングする遺伝子のプロモーターであり、指向細胞マーカーのプロモーターとは、厳密には、指向細胞で細胞特異的に発現するマーカータンパク質をコーディングする遺伝子のプロモーターである。
前記出発細胞は、分化がすでに完了した細胞として発現ベクターが導入される細胞であり、発現ベクターの転写方向において一番目に位置するマーカーのプロモーターを発現する細胞である。前記出発細胞は、細胞の種類に制限なく選択可能であり、分化完了したすべての体細胞または生殖細胞が出発細胞として選択されてもよい。
前記指向細胞は、出発細胞が転換を目標とする細胞であり、発現ベクターの転写方向において２番目に位置するマーカーのプロモーターを発現する細胞である。前記指向細胞も、細胞の種類に制限なく選択可能であり、分化完了したり、または完了していないすべての体細胞または生殖細胞が指向細胞として選択されてもよい。
具体的には、一態様において、前記出発細胞と指向細胞は、上皮細胞、筋肉細胞、神経細胞、基質細胞、および骨細胞の下位分類から選択されてもよい。
前記上皮細胞は、細胞の層をなし、組織または腺内外を覆う膜組織を構成する細胞であって、単層扁平上皮（ｓｉｍｐｌｅ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）、単層立方上皮（ｓｉｍｐｌｅ ｃｕｂｏｉｄａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）、単層円柱上皮（ｓｉｍｐｌｅ ｃｏｌｕｍｎａｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）、重層扁平上皮（ｓｔｒａｔｉｆｉｅｄ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）、重層立方上皮（ｓｔｒａｔｉｆｉｅｄ ｃｕｂｏｉｄａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）、重層円柱上皮（ｓｔｒａｔｉｆｉｅｄ ｃｏｌｕｍｎａｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）、偽重層上皮（ｐｓｅｕｄｏｓｔｒａｔｉｆｉｅｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）、尿路上皮（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）、および腺上皮（ｇｌａｎｄｕｌａｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）を包括する意味である。
前記筋肉細胞は、筋肉を構成する細胞であって、平滑筋細胞（ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ）、横紋筋細胞（ｓｔｒｉｐｅｄ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ）、および心筋細胞（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｃｅｌｌ）を包括する意味である。
前記神経細胞は、ナトリウム通路、カリウム通路などのイオン通路を発現して、他の細胞とは異なり、電気的な方法で信号を伝達できる細胞であって、感覚神経細胞（ｓｅｎｓｏｒｙ ｎｅｕｒｏｎ）、介在神経細胞（ｉｎｔｅｒｎｅｕｒｏｎ）、運動神経細胞（ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ）、単極性神経細胞（ｕｎｉｐｏｌａｒ ｎｅｕｒｏｎ）、偽単極性神経細胞（ｐｓｅｕｄｏ－ｕｎｉｐｏｌａｒ ｎｅｕｒｏｎ）、双極性神経細胞（ｂｉｐｏｌａｒ ｎｅｕｒｏｎ）、多極性神経細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｌａｒ ｎｅｕｒｏｎ）、有棘性神経細胞（ｓｐｉｎｙ ｎｅｕｒｏｎ）、無棘性神経細胞（ａｓｐｉｎｏｕｓ ｎｅｕｒｏｎ、ｎｏｎ－ｓｐｉｎｙ ｎｅｕｒｏｎ）、コリン性神経細胞（ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎ）、アドレナリン性神経細胞（ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎ）、ドーパミン性神経細胞（ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎ）、およびセロトニン性神経細胞（ｓｅｒｏｔｏｎｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎ）を包括する意味である。
前記基質細胞は、線維性結合組織を構成する細胞で、線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、軟骨芽細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｂｌａｓｔ）、骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）、神経膠細胞（ｎｅｕｒｏｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）、大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、プラズマ細胞（ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌ）を包括する意味である。
前記骨細胞は、骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）、骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｙｔｅ）、および破骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）を包括する意味である。
他の態様において、前記出発細胞と指向細胞は、骨格系、筋肉系、内分泌系、循環系、泌尿系、生殖系、消化系、神経系、皮膚系、呼吸系、および外分泌系を構成する細胞から選択されてもよい。
前記骨格系は、体骨格（頭骨、脊椎、胸郭）、四肢骨格（上肢骨格、下肢骨格）、骨髄などを含む骨、硝子軟骨、線維軟骨、弾力軟骨などを含む軟骨、および線維関節、軟骨関節、潤滑関節などを含む関節を包括する意味である。
前記筋肉系は、骨格筋、平滑筋、および心臓筋を包括する意味である。
前記内分泌系は、脳下垂体、視床下部、松果腺、甲状腺、副甲状腺、胸腺、副腎、膵臓、精巣、および卵巣を包括する意味である。
前記循環系は、心臓、血管（動脈、静脈、毛細血管、大動脈、大静脈、肺動脈、肺静脈）、血液（血漿、赤血球、白血球、血小板）などを含む心血管系、およびリンパ管、リンパ節、脾臓、胸腺、扁桃、パイエル板、粘膜関連リンパ組織などを含むリンパ系を包括する意味である。
前記泌尿系は、腎臓、尿管、膀胱、尿道を包括する意味である。
前記生殖系は、睾丸、副睾丸、精管、精索、尿道、精嚢、前立腺、尿道球腺、陰嚢、陰茎、亀頭、包皮などを含む男性生殖系、および卵巣、子宮管、子宮、膣、処女膜、陰門、大陰唇、小陰唇、乳腺などを含む女性生殖系を包括する意味である。
前記消化系は、口、咽頭、食道、胃、小腸（十二指腸、空腸、回腸）、大腸（盲腸、結腸、直腸）、肛門などを含む消化管、および唾腺、膵臓、胆嚢、肝などを含む消化腺を包括する意味である。
前記神経系は、中枢神経系（脳、脊髓）、末梢神経系（体性神経系、自律神経系（交感神経系、副交感神経系））、目、耳、鼻、および舌を包括する意味である。
前記皮膚系は、皮膚、毛嚢、汗腺、皮脂腺、手足の指の爪、および乳房を包括する意味である。
前記呼吸系は、鼻腔、咽頭、喉頭、器官、気管支、および肺を包括する意味である。
前記外分泌系は、汗腺、尿道球腺、スキーン腺、乳腺、前立腺、尾前腺、粘液、精嚢、唾腺、およびバルトリン腺を包括する意味である。
また、本発明の生体内リプログラミングシステムにおいて、出発細胞マーカーのプロモーターおよび指向細胞マーカーのプロモーターは、当業界における通常の技術者に選択された細胞のマーカーとして知られたタンパク質をコーディングする遺伝子のプロモーターであれば何でも制限なく利用可能である。
以下、出発細胞をＡ細胞、指向細胞をＢ細胞とする。
本発明の態様では、Ａ細胞は基質細胞、Ｂ細胞は神経細胞として選択して実施した。
より具体的には、前記基質細胞は、線維性結合組織を構成する細胞で、線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、軟骨芽細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｂｌａｓｔ）、骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）、神経膠細胞（ｎｅｕｒｏｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）、大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、およびプラズマ細胞（ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌ）を包括するものであり、前記神経膠細胞は、星状膠細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）、希突起膠細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）、小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）、上衣細胞（ｅｐｅｎｄｙｍａｌ ｃｅｌｌ）、シュワン細胞（Ｓｃｈｗａｎｎ ｃｅｌｌ）、神経節膠細胞として衛星細胞（ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｃｅｌｌ）と被膜細胞（ｃａｐｓｕｌｅ ｃｅｌｌ）を包括するものである。
前記Ａ細胞が基質細胞の場合に、Ａ細胞マーカーは、Ｃｏｌ１Ａ２（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｔｙｐｅ Ｉ Ａｌｐｈａ ２ Ｃｈａｉｎ）、ＦＡＰ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＦＳＰ１（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ １）、ビメンチン（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）、ＡＣＴＡ（ａｌｐｈａ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ Ａｃｔｉｎ）、Ｈｓｐ４７（Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ４７）、アグリカン（Ａｇｇｒｅｃａｎ）、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ、ＯＳＣＡＲ（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＲＡＮＫ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ κ Ｂ）、ＧＦＡＰ（Ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＴＲＥＭ２（Ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｏｎ ｍｙｅｌｏｉｄ ｃｅｌｌｓ ２）、ＨｅｘＢ（Ｂｅｔａ－ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ｂｅｔａ）、Ｓ１００（ｃａｌｃｉｕｍ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＣＤ６９、および／またはＧｐｒ３４（Ｐｒｏｂａｂｌｅ Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３４）などを選択することができるが、これらに限定されるものではない。
前記Ｂ細胞が神経細胞の場合に、Ｂ細胞マーカーは、ＳＹＮ（Ｓｙｎａｐｓｉｎ）、Ｔｕｊ１（Ｎｅｕｒｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｌａｓｓ ＩＩＩ ｂｅｔａ－ｔｕｂｕｌｉｎ）、ＭＡＰ２（Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）、および／または神経細糸（Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ）などを選択することができるが、これらに限定されるものではない。
本発明の一具体例のように、Ａ細胞マーカーのプロモーターとしてＧＦＡＰ（Ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）ｐｒｏｍｏｔｏｒ、遺伝子多能性維持タンパク質としてＳＯＸ２（Ｓｅｘ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ Ｙ－ｂｏｘ ２）、アミノ酸分離ペプチドとしてＴ２Ａ（２Ａ ｐｅｐｔｉｄｅ）、Ｂ細胞マーカーのプロモーターとしてＳＹＮ（Ｓｙｎａｐｓｉｎ）、蛍光タンパク質としてｅＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）を対応させることができる。この場合、Ａ細胞は星状膠細胞であり、本発現ベクターによって星状膠細胞から転換されるＢ細胞は神経細胞になる。前記の例示ベクターを星状膠細胞に導入すると、星状膠細胞マーカーであるＧＦＡＰプロモーターによってＳＯＸ２とＣｒｅ組換え酵素が発現し、遺伝子多能性維持タンパク質であるＳＯＸ２の発現は星状膠細胞を神経細胞に転換させることができ、Ｃｒｅ組換え酵素によってＬｏｘＰ ｓｉｔｅが認知されてＬｏｘｐ ｓｉｔｅ間の逆転写方向の蛍光タンパク質を転写方向に復位させる。星状膠細胞が神経細胞に転換されると、神経細胞マーカーであるＳＹＮプロモーターが作動し、ＳＹＮプロモーターによって転写方向に復位したｅＧＦＰが発現して、細胞が緑色蛍光を発現する。これにより、Ａ細胞（星状膠細胞）からＢ細胞（神経細胞）に転換された細胞を生体内で細胞が生きている状態で確認可能である。
もし、前記発現ベクターがＡ細胞（星状膠細胞）以外の他の細胞に導入されれば、Ａ細胞マーカーのプロモーター（ＧＦＡＰ ｐｒｏｍｏｔｏｒ）が作動しないので、蛍光が発現しない。もし、前記発現ベクターがＡ細胞（星状膠細胞）に導入されても、遺伝子多能性維持タンパク質（ＳＯＸ２）によってＢ細胞（神経細胞）以外の他の細胞に転換されれば、Ｂ細胞マーカーのプロモーター（ＳＹＮ ｐｒｏｍｏｔｏｒ）が作動しないので、蛍光が発現しない。もし、前記発現ベクターが最初からＢ細胞（神経細胞）に導入されれば、Ｃｒｅ組換え酵素が発現しないので、Ｃｒｅ－ｌｏｘＰの作動失敗によって蛍光が発現しない。単にＡ細胞（星状膠細胞）がＢ細胞（神経細胞）に転換された場合にのみ、蛍光が発現する。
前記Ｔ２Ａペプチドは、１８個程度の比較的短いアミノ酸配列を有するｓｅｌｆ－ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｖｉｒａｌ ｐｅｐｔｉｄｅであって、２つの互いに異なるタンパク質の間に２Ａ配列を入れてｆｕｓｉｏｎして細胞で発現させると、２Ａの最後のアミノ酸であるＰｒｏの前でアミノ酸結合が分離されるので、まるで２つのタンパク質を別に発現したような効果を奏することができる。２Ａの一種としてＦ２Ａ、またはＥ２Ａに代替利用可能である。
前記Ｃｒｅ－ｌｏｘＰシステムは、特定の遺伝子を選択的に除去したり（Ｄｅｌｅｔｉｏｎ）、方向を回転させたり（Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ）、または位置を変更（Ｔｒａｎｓｌｉｃａｔｉｏｎ）させることができる特定のサイト組換え（ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）システムである。形質転換の瞬間から遺伝子が発現する他のベクターとは異なり、必要な時期に必要な組織でのみ挿入された遺伝子の発現を誘導することができる。操作しようとする遺伝子の前後にｌｏｘＰを位置させ、これに先立ってＣｒｅ組換え酵素を発現させると、Ｃｒｅ－ｌｏｘＰ結合によってｌｏｘＰの間に位置したターゲット遺伝子が操作される（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｃｒｅ－ｌｏｘ／）。
本発明の改善された生体内リプログラミングシステムは、疾病モデリングと新薬発掘などに利用される可能性が認められており、再生医学分野においても活用性が高いと注目されている。
例えば、特定の細胞をＡ細胞に設定してＢ細胞に転換させることによりＡ細胞を除去すれば、Ａ細胞の不在によってどのような疾病が発生するかモデリング可能である。
例えば、特定の疾病がある個体においてＡ細胞をＢ細胞に転換させてＢ細胞の数を増加させることにより疾病が治療される場合、前記疾病に対してＢ細胞を薬学的用途に利用することができる。
また、例えば、分化完了した細胞として再生がほとんど行われない細胞の場合、損傷後機能の喪失を、その他の細胞（Ａ細胞）を当該細胞（Ｂ細胞）に転換させることにより機能の再生を誘導することができる。より具体的に説明すれば、神経細胞は損傷後再生がほとんど行われないので、神経損傷時、感覚的、運動的障害を誘発することがある。しかし、神経細胞以外のその他の細胞（Ａ細胞）を神経細胞（Ｂ細胞）に転換させることにより、機能の喪失を回復することが可能である。
本発明の改善された生体内リプログラミングシステムは、特定の細胞をＡ細胞に設定してＢ細胞に転換させる過程を、細胞が生きている状態で生細胞イメージングが可能である。これは、細胞を固定（ｆｉｘａｔｉｏｎ）しないので、転換された細胞を２次的に用いることが可能であり、細胞がＡ細胞からＢ細胞に転換される過程をタイムラプス（ｔｉｍｅ－ｌａｐｓｅ、時間差）なしにリアルタイムに確認可能である。前記生細胞イメージングは、蛍光顕微鏡を用いることが好ましい。
本発明の一具体例において、「診断」とは、病理状態の存在または特徴を確認することを意味し、疾患の発生を確認し、疾患の深度を判断することである。このために、疾患が疑われる個体からの組織の肉眼的または細胞学的確認により疑われる疾患を診断することができ、疾患の発病が疑われる個体の検体（臨床的には、細胞、血液、髄液、胸水、腹水、関節液、膿、分泌液、痰、咽頭粘液、尿、胆汁、大便など）内に含まれている脂質の濃度を測定する方法、疾患関連タンパク質を直接検出する方法、前記タンパク質に対する抗体の濃度を測定する方法、または前記タンパク質および／または前記抗体をコーディングする核酸を直接検出する方法で疾患を診断することができる。脂質を測定する方法としては、脂質に特異的に反応する染色液を用いた染色があり得るが、これに限定されるものではなく、抗原－抗体結合または疾病関連タンパク質を直接検出する方法を利用した診断的手段としては、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）、放射線免疫分析（ＲＩＡ：Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、放射免疫拡散法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）免疫拡散法、ロケット（ｒｏｃｋｅｔ）免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈殿分析法（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、補体固定分析法（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｆｉｘａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、フローサイトメトリー（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ、ＦＡＣＳ）、タンパク質チップ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｉｐ）などがあるが、これらに限定されるものではなく、疾患関連タンパク質をコーディングする核酸を直接検出する方法としては、逆転写重合酵素反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、競争的逆転写重合酵素反応（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ）、リアルタイム逆転写重合酵素反応（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ）、ＲＮａｓｅ保護分析法（ＲＰＡ；ＲＮａｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）、ノーザンブロッティング（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）またはＤＮＡチップなどがあるが、これらに限定されるものではない。
本発明の一具体例において、「スクリーニング」とは、様々な物質からなる候補群から目的とするある特定の性質を有する物質を特定の操作または評価方法で選別することである。本発明の目的上、本発明のスクリーニングは、特定の疾病がある個体においてＡ細胞をＢ細胞に転換させてＢ細胞の数を増加させることにより疾病が治療される場合が発生するＢ細胞を追跡する過程であり、また、前記Ｂ細胞への転換効果が最も著しいＡ細胞を追跡する過程であるが、これに限定するものではない。
本発明の一具体例において、「投与」とは、何らかの適切な方法で個体に特定の組成物を導入することを意味し、組成物の投与経路は、目的組織に到達できる限り、いかなる一般的な経路を通して投与されてもよい。経口投与、腹腔内投与、血管内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与、腔内投与、腹腔内投与、硬膜内投与が行われるが、これに限定されない。本発明において、有効量は、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含有された有効成分および他の成分の種類および含有量、剤形の種類および個体の年齢、体重、一般健康状態、性別および食事、投与時間、投与経路および組成物の分泌率、治療期間、同時使用される薬物をはじめとする多様な因子によって調節可能である。成人の場合、前記組成物を１回５０ｍｌ～５００ｍｌの量で体内に投与可能であり、化合物の場合に０．１ｎｇ／ｋｇ－１０ｍｇ／ｋｇ、タンパク質に対するモノクロナール抗体の場合に０．１ｎｇ／ｋｇ－１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与されてもよい。投与間隔は、１日１回～１２回であってもよいし、１日１２回投与する場合には、２時間ごとに１回ずつ投与することができる。また、ペプチドおよび核酸は、免疫反応を増進するために考案された他の治療、例えば、当業界にて周知のようなアジュバントまたはサイトカイン（またはサイトカインをコーディングする核酸）と混合して投与可能である。バイオリスチック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）伝達または生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）処理のような他の標準伝達方法が使用されてもよい。生体外処理において、例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）、樹状細胞、末梢血液単核球細胞、または骨髄細胞を患者または適当な供与者から得て、免疫組成物で生体外で活性化された後、その患者に投与される。
本発明の一具体例において、Ａ細胞マーカーのプロモーター、遺伝子多能性維持タンパク質、Ｃｒｅ組換え酵素、Ｂ細胞マーカーのプロモーター、ＬｏｘＰ、および蛍光タンパク質をコーディングする遺伝子を順次に含む、Ａ細胞のＢ細胞転換用発現ベクターを提供し、前記発現ベクターは、細胞が生きている状態でＡ細胞がＢ細胞に転換されることを確認可能である、Ａ細胞のＢ細胞転換用発現ベクターを提供し、前記蛍光タンパク質をコーディングする遺伝子は、逆転写方向に含まれるものである、Ａ細胞のＢ細胞転換用発現ベクターを提供し、前記発現ベクターは、アミノ酸分離ペプチドを追加的に含むものである、Ａ細胞のＢ細胞転換用発現ベクターを提供し、前記アミノ酸分離ペプチドは、Ｔ２Ａ、Ｆ２Ａ、およびＥ２Ａからなるグループより選択されたいずれか１つ以上である、Ａ細胞のＢ細胞転換用発現ベクターを提供し、前記遺伝子多能性維持タンパク質は、ＳＯＸ遺伝子族（Ｓｅｘ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ｇｅｎｅ ｆａｉｍｌｙ）、Ｍｙｃ遺伝子族（ｐｒｏｔｏ－ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ）、Ｋｌｆ遺伝子族（Ｋｒｕｐｐｅｌ－ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ）、およびＯｃｔ遺伝子族（ｏｃｔａｍｅｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ）からなるグループより選択されたいずれか１つ以上である、Ａ細胞のＢ細胞転換用発現ベクターを提供する。
また、前記発現ベクターにおいて、前記Ａ細胞は、基質細胞であり、前記Ｂ細胞は、神経細胞である、Ａ細胞のＢ細胞転換用発現ベクターを提供し、前記基質細胞は、線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、軟骨芽細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｂｌａｓｔ）、骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）、神経膠細胞（ｎｅｕｒｏｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）、大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、およびプラズマ細胞（ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌ）からなるグループより選択されるいずれか１つである、Ａ細胞のＢ細胞転換用発現ベクターを提供し、前記Ａ細胞マーカーのプロモーターは、Ｃｏｌ１Ａ２（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｔｙｐｅ Ｉ Ａｌｐｈａ ２ Ｃｈａｉｎ）、ＦＡＰ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＦＳＰ１（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ １）、ビメンチン（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）、ＡＣＴＡ（ａｌｐｈａ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ Ａｃｔｉｎ）、Ｈｓｐ４７（Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ４７）、アグリカン（Ａｇｇｒｅｃａｎ）、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ、ＯＳＣＡＲ（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＲＡＮＫ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ κ Ｂ）、ＧＦＡＰ（Ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＴＲＥＭ２（Ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｏｎ ｍｙｅｌｏｉｄ ｃｅｌｌｓ ２）、ＨｅｘＢ（Ｂｅｔａ－ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ｂｅｔａ）、Ｓ１００（ｃａｌｃｉｕｍ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＣＤ６９、およびＧｐｒ３４（Ｐｒｏｂａｂｌｅ Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３４）からなるグループより選択されるいずれか１つのプロモーターである、Ａ細胞のＢ細胞転換用発現ベクターを提供し、前記Ｂ細胞マーカーのプロモーターは、ＳＹＮ（Ｓｙｎａｐｓｉｎ）、Ｔｕｊ１（Ｎｅｕｒｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｌａｓｓ ＩＩＩ ｂｅｔａ－ｔｕｂｕｌｉｎ）、ＭＡＰ２（Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）、および神経細糸（Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ）からなるグループより選択されるいずれか１つのプロモーターである、Ａ細胞のＢ細胞転換用発現ベクターを提供する。
本発明の他の具体例において、前記発現ベクターを有効成分として含む、神経損傷治療用薬学組成物を提供する。
本発明のさらに他の具体例において、前記発現ベクター、Ｇ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎが融合された水泡性口内炎ウイルス（ｆｕｓｉｏｇｅｎｉｃ ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｇ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ、ＶＳＶ－Ｇ）、およびＧＡＧ／Ｐｏｌ遺伝子を含む、レンチウイルスベクターを提供する。
本発明のさらに他の具体例において、前記発現ベクターを含む、ヒトを除いた形質転換体を提供する。
本発明のさらに他の具体例において、（ａ）前記発現ベクターを製造するステップと、（ｂ）前記発現ベクターをＡ細胞に導入するステップと、を含む、Ａ細胞をＢ細胞に転換させる方法を提供し、前記（ｂ）ステップの後に、細胞をＢ細胞培養用培地で培養するステップを追加的に含む、Ａ細胞をＢ細胞に転換させる方法を提供し、前記（ｂ）ステップの後に、細胞内蛍光発現を確認するステップを追加的に含む、Ａ細胞をＢ細胞に転換させる方法を提供する。
本発明のさらに他の具体例において、細胞が生きている状態でＡ細胞がＢ細胞に転換されることを確認する方法であって、（ａ）前記発現ベクターを製造するステップと、（ｂ）前記発現ベクターをＡ細胞に導入するステップと、を含む、生細胞イメージング（ｌｉｖｅ ｃｅｌｌ ｉｍａｇｉｎｇ）方法を提供し、前記イメージングは、蛍光顕微鏡を用いることを特徴とする、生細胞イメージング方法を提供する。
本発明のさらに他の具体例において、（ａ）前記発現ベクターを製造するステップと、（ｂ）ヒトを除いた個体に前記発現ベクターを導入するステップと、を含む、Ａ細胞がＢ細胞に転換された動物モデルの製造方法を提供する。
本発明のさらに他の具体例において、（ａ）ヒトを除いた疾病動物モデルの第１個体と第２個体を用意するステップと、（ｂ）（イ）細胞をＡ細胞、（ハ）細胞をＢ細胞とする、前記発現ベクターＩを製造するステップと、（ｃ）（ロ）細胞をＡ細胞、（ハ）細胞をＢ細胞とする、前記発現ベクターＩＩを製造するステップと、（ｄ）前記第１個体に発現ベクターＩを導入し、前記第２個体に発現ベクターＩＩを導入するステップと、（ｅ）前記第１個体と第２個体の疾病治療効果を比較して、第１個体の治療効果がより良い場合に、前記（イ）細胞を（ハ）細胞転換用細胞として選別するステップと、を含む、Ｂ細胞転換用Ａ細胞のスクリーニング方法を提供する。
本発明のさらに他の具体例において、前記ベクターを有効成分として含む、Ｂ細胞の損傷による疾患の治療用薬学組成物を提供し、前記Ｂ細胞は、神経細胞であり、前記Ｂ細胞の損傷による疾患は、てんかん、筋萎縮性側索硬化症（ルーゲーリック病）、脳膜炎、脳髄膜炎、脳性麻痺、脳炎、脳卒中、脳梗塞、脳出血、虚血性脳発作、多発性硬化症、頭痛、片頭痛、緊張性頭痛、舞踏病、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｏｎｇｔｏｎｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、ウィルソン病（Ｗｉｌｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、脳振盪、脳挫傷、硬膜下血腫、外傷性クモ膜下血腫、脊髓損傷、動静脈奇形、脳動脈瘤、水頭症、二分脊椎、睡眠無呼吸症侯群、失神、神経麻痺、重症無力症、振戦症（身振い症）、脊髓炎、アルツハイマー、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、および運動機能障害からなるグループより選択されるいずれか１つである、薬学組成物を提供する。
本発明のさらに他の具体例において、前記ベクターを投与してＢ細胞の損傷による疾患を予防または治療する方法を提供し、前記Ｂ細胞は、神経細胞であり、前記Ｂ細胞の損傷による疾患は、てんかん、筋萎縮性側索硬化症（ルーゲーリック病）、脳膜炎、脳髄膜炎、脳性麻痺、脳炎、脳卒中、脳梗塞、脳出血、虚血性脳発作、多発性硬化症、頭痛、片頭痛、緊張性頭痛、舞踏病、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｏｎｇｔｏｎｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、ウィルソン病（Ｗｉｌｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、脳振盪、脳挫傷、硬膜下血腫、外傷性クモ膜下血腫、脊髓損傷、動静脈奇形、脳動脈瘤、水頭症、二分脊椎、睡眠無呼吸症侯群、失神、神経麻痺、重症無力症、振戦症（身振い症）、脊髓炎、アルツハイマー、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、および運動機能障害からなるグループより選択されるいずれか１つである、予防または治療する方法を提供する。
本発明のさらに他の具体例において、Ｂ細胞の損傷による疾患の予防または治療のための、前記記載のベクターの用途を提供し、前記Ｂ細胞は、神経細胞であり、前記Ｂ細胞の損傷による疾患は、てんかん、筋萎縮性側索硬化症（ルーゲーリック病）、脳膜炎、脳髄膜炎、脳性麻痺、脳炎、脳卒中、脳梗塞、脳出血、虚血性脳発作、多発性硬化症、頭痛、片頭痛、緊張性頭痛、舞踏病、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｏｎｇｔｏｎｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、ウィルソン病（Ｗｉｌｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、脳振盪、脳挫傷、硬膜下血腫、外傷性クモ膜下血腫、脊髓損傷、動静脈奇形、脳動脈瘤、水頭症、二分脊椎、睡眠無呼吸症侯群、失神、神経麻痺、重症無力症、振戦症（身振い症）、脊髓炎、アルツハイマー、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、および運動機能障害からなるグループより選択されるいずれか１つである、前記ベクターの用途を提供する。
以下、前記本発明を段階ごとに詳細に説明する。
従来の公知の細胞転換方法は、細胞の転換をリアルタイムにモニタリングできる技術が不在で、細胞の状態をリアルタイムに測定不可能であり、単に生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）細胞でのみ実施可能という問題点があった。したがって、本発明は、改善された生体内リプログラミングシステムおよびこれを用いた細胞転換方法に関し、本発明のリプログラミングシステムは、細胞が生きている状態でリアルタイムにモニタリング可能であり、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）または生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）ですべて利用可能なため、バイオおよび医学分野において大きく利用されることが期待される。
本発明の一実施例による、本発明の発現ベクターとして直接交差分化確認用ベクターであるＡｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎ ｖｉｖｏ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ａ－ＩＶＲ）の構造を示す図である。 本発明の一実施例による、Ｉｎ ｖｉｔｒｏでＡ－ＩＶＲにより神経細胞に転換された神経膠細胞、より具体的には、星状膠細胞の免疫染色の結果を示す図である。 本発明の一実施例による、Ｉｎ ｖｉｔｒｏでＡ－ＩＶＲにより神経細胞に転換されたマウス胚線維芽細胞の光学写真、および免疫染色の結果を示す図である。 本発明の一実施例による、Ｉｎ ｖｉｔｒｏでＡ－ＩＶＲにより神経細胞に転換されたヒト線維芽細胞の光学写真、および免疫染色の結果を示す図である。 本発明の一実施例による、Ａ－ＩＶＲ移植された脊髓損傷動物モデルの運動機能の回復結果を示す図である。 本発明の一実施例による、Ａ－ＩＶＲ移植された脊髓損傷動物モデルの脊髓組織における免疫染色の結果を示す図である。
本発明の一態様において、出発細胞として神経膠細胞（ｎｅｕｒｏｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、指向細胞として神経細胞（ｎｅｕｒｏｎ）を選択して神経膠細胞を神経細胞に転換させる場合に、前記出発細胞マーカーのプロモーターはＧＦＡＰ（Ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）プロモーターを、指向細胞マーカーのプロモーターはＳＹＮ（Ｓｙｎａｐｓｉｎ）プロモーターを選択する。本発明の他の態様において、出発細胞として線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、指向細胞として神経細胞（ｎｅｕｒｏｎ）を選択して線維芽細胞を神経細胞に転換させる場合には、出発細胞マーカーのプロモーターとしてＣｏｌ１Ａ２（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｔｙｐｅ Ｉ Ａｌｐｈａ ２ Ｃｈａｉｎ）プロモーターを選択する。
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨により、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないことは当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。
実施例１．生体内リプログラミングのためのレンチウイルスベクターの作製
ＨＥＫ２９３ＦＴ（ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ２９３ＦＴ ｃｅｌｌｓ）細胞にＧ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎが融合された水泡性口内炎ウイルス（ｆｕｓｉｏｇｅｎｉｃ ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｇ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ、ＶＳＶ－Ｇ）、ＧＡＧ／Ｐｏｌ遺伝子、および発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）を、Ｖｉａｆｅｃｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ４９８１、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を用いて導入させた。発現ベクターは、出発細胞マーカーのプロモーター、ＳＯＸ２（Ｓｅｘ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ Ｙ－ｂｏｘ ２）、Ｔ２Ａ（２Ａ ｐｅｐｔｉｄｅ）、Ｃｒｅ組換え酵素、指向細胞マーカーのプロモーター、ＬｏｘＰ、およびｅＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）を順次に転写されるように配列し、ｅＧＦＰは、逆転写方向にデザインしてＬｏｘＰの発現によって転写方向に復位するように設計した。前記発現ベクターの遺伝子図を図１に示した。
例えば、本発明の一態様において、出発細胞として神経膠細胞（ｎｅｕｒｏｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、指向細胞として神経細胞（ｎｅｕｒｏｎ）を選択して神経膠細胞を神経細胞に転換させる場合に、前記出発細胞マーカーのプロモーターはＧＦＡＰ（Ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）プロモーターを、指向細胞マーカーのプロモーターはＳＹＮ（Ｓｙｎａｐｓｉｎ）プロモーターを選択する。本発明の他の態様において、出発細胞として線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、指向細胞として神経細胞（ｎｅｕｒｏｎ）を選択して線維芽細胞を神経細胞に転換させる場合には、出発細胞マーカーのプロモーターとしてＣｏｌ１Ａ２（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｔｙｐｅ Ｉ Ａｌｐｈａ ２ Ｃｈａｉｎ）プロモーターを選択する。
７２時間後に培地を取り除き、レンチウイルスベクターを濃縮できるＰＥＧ－ｉｔ Ｖｉｒｕｓ Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＬＶ８１０Ａ－１、Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）で７２時間濃縮した後、ＥＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ）培地に再浮遊して、本発明の直接交差分化確認用ベクターであるＡｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎ ｖｉｖｏ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ａ－ＩＶＲ）レンチウイルスベクターを得た。
実施例２．神経膠細胞から転換された神経細胞の製造および確認
６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに神経膠細胞を１×１０５／ｗｅｌｌでＥＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（ＰＳ）培地で培養し、前記実施例１の方法で出発細胞を神経膠細胞、指向細胞を神経細胞として選択して作製したレンチウイルスベクター（Ａ－ＩＶＲ）を、１０ｕｇ／ｍｌのＰｏｌｙｂｒｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴＲ－１００３－Ｇ、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）と共に導入した。Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅはウイルスと標的細胞の膜間の電気的反発を中和させて、ウイルスと標的細胞との結合力を増加させる。３日後、ＥＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１ｕｇピューロマイシン培地に切り替え、１週間遺伝子が導入されていない細胞をピューロマイシンを用いて選別した。１週間後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２：ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（２：１）、０．８％Ｎ２、０．４％Ｂ２７、１％ＰＳ培地に切り替えた後、２日に１回ずつ培地を切り替えながら５週間神経細胞への転換を誘導した。
５週後、細胞をＰＢＳを用いて３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定した。以後、０．３％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄後、１０％Ｎｏｒｍａｌ Ｄｏｎｋｅｙ Ｓｅｒｕｍを用いてｂｌｏｃｋｉｎｇし、神経膠細胞マーカー（ＧＦＡＰ）、および神経細胞マーカー（Ｔｕｊ１、ＭＡＰ２、Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ）で免疫染色を進行させた。免疫染色の具体的なプロセスは、先行文献（Ｌｅｅ ＨＹ ｅｔ ａｌ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｐａｒｔ Ａ．２０１５Ｊｕｌ；２１（１３－１４）：２０４４－５２）と同様に進行させた。前記免疫染色の結果を図２に示した。
実験の結果、Ｉｎ ｖｉｔｒｏでＡ－ＩＶＲを用いて神経膠細胞、より具体的には、星状膠細胞を神経細胞に転換誘導する場合、神経膠細胞の標識タンパク質であるＧＦＡＰの発現は減少し、神経細胞の標識タンパク質であるＴｕｊ１、Ｍａｐ２、ＮｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔがＧＦＰと共に発現することが明らかになった。これにより、Ａ－ＩＶＲによって神経膠細胞が神経細胞に転換され、ＧＦＰも神経細胞の分化と共に発現することを確認することができた。
実施例３．線維芽細胞から転換された神経細胞の製造および確認
０．１％ゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ）コーティングされた１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにマイトマイシン－Ｃ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ）を処理して成長を抑制させたＳＴＯ ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌ（細胞成長のための支持体として使用）を２．５×１０５／ｗｅｌｌでＤＭＥＭ１０％ＦＢＳ１％ペニシリン－ストレプトマイシン（ＰＳ）培地で１日培養し、翌日、マウス胚線維芽細胞（Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ；ＭＥＦ）、またはヒト線維芽細胞（Ｈｕｍａｎ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）を４×１０５／ｗｅｌｌでｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌ上に播種して、ＤＭＥＭあるいはＩＭＤＭ１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓで１日培養した。以後、前記実施例１の方法により、出発細胞を皮膚細胞、指向細胞を神経細胞として選択して作製したレンチウイルスベクター（Ａ－ＩＶＲ）を、１０ｕｇ／ｍｌのＰｏｌｙｂｒｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴＲ－１００３－Ｇ、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）と共に導入した。２４時間後、ＤＭＤＭ／Ｆ１２、１％Ｂ２７、２ｍＭ Ｌ－Ｇｌｕｔａｍａｔｅ、１％Ｐ／Ｓ、２０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ、および２ｕｇ／ｍｌヘパリンを含む培地に切り替えた後、６－７日追加培養した。以後、小さいコロニー（ｃｏｌｏｎｙ）が生じると、ａｃｃｕｔａｓｅ（ｃｅｌｌ ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を用いて細胞を引き離した後、６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅで３日間追加培養し、生成された球体（ｓｐｈｅｒｅ）を０．１％ゼラチンコーティングされた１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに移して１４日間培養し、神経細胞への転換を誘導した。
免疫染色は実施例２に記載の方法と同様に進行させかつ、免疫染色時のマーカーは線維芽細胞マーカー（Ｃｏｌ１Ａ２）、および神経細胞マーカー（Ｔｕｊ１）を用いた。前記免疫染色の結果を細胞の光学撮影写真と共に、図３と図４に示した。
実験の結果、Ｉｎ ｖｉｔｒｏでＡ－ＩＶＲを用いて線維芽細胞を神経細胞に転換誘導する場合、線維芽細胞の標識タンパク質であるＣｏｌ１Ａ２の発現は減少し、神経細胞の標識タンパク質であるＴｕｊ１がＧＦＰと共に発現することが明らかになった。前記結果は、出発細胞として線維芽細胞を、マウス胚線維芽細胞を用いるか、ヒト線維芽細胞を用いる場合とも同一であった。これにより、Ａ－ＩＶＲによって線維芽細胞が神経細胞に転換され、ＧＦＰも神経細胞の分化と共に発現することを確認することができた。
実施例４．Ａ－ＩＶＲ移植された脊髓損傷動物モデルの神経再生効果の確認
脊髓損傷動物モデルは体重２０ｇ前後の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いた。腹腔注射でケタミンとロンプンを混合して麻酔し、椎弓切除術でＴｈｏｒａｃｉｃ Ｖｅｒｔｅｂｒａｅ１０（胸椎１０番、Ｔ１０）部分を切開して脊髓を露出させた後、専用フォーセプス（ｓｅｌｆ－ｃｌｏｓｅｄ ｆｏｒｃｅｐｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて３秒間脊髓を圧迫させることにより脊髓損傷を与えた。以後、筋肉と皮膚を縫合した。脊髓損傷動物モデル作製２週後、損傷部位の皮膚と筋肉を再度開いて、損傷部位に、実施例１の方法により、出発細胞を神経膠細胞（より具体的には、星状膠細胞）、指向細胞を神経細胞として選択して作製したレンチウイルスベクター（Ａ－ＩＶＲ）４μｌを３３Ｇハミルトン注射器で移植した（ｎ＝１０）。対照群マウスにはＡ－ＩＶＲの代わりにＥＭＥＭを移植した（ｎ＝１０）。損傷１週間後から、運動機能検査のために、毎週Ｂａｓｓｏ－Ｍｏｕｓｅ－Ｓｃａｌｅ（ＢＭＳ）を測定した。ＢＭＳは計９点に分けられており、大きく３つの段階に区分するが、１番目の段階で足首の動きを測定し、２番目の段階で体重の乗る歩行および歩数の回復を測定し、最後の段階で歩数の安定と尾の回復状態を測定する。ＢＭＳの具体的なプロセスは、先行文献（Ｂａｓｓｏ ＤＭ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ．２００６Ｍａｙ；２３（５）：６３５－５９）と同様に進行させた。前記ＢＭＳ測定の結果を図５に示した。実験の結果、Ａ－ＩＶＲを移植した２週後から、対照群と比較して、Ａ－ＩＶＲ移植されたマウスの運動機能が有意に回復することが分かった。
脊髓損傷後８週目（Ａ－ＩＶＲ移植６週目）にマウスを犠牲にし、脊髓組織を得て、４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で固定した後、脱水して凍結包埋を施した。包埋を施した組織中、損傷部位（胸椎１０番）を神経（ＭＡＰ２）、活性型神経膠細胞（ＧＦＡＰ）、神経芽細胞（ＳＯＸ２）、初期神経細胞（Ｔｕｊ１）、成熟した神経細胞（ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ）マーカーで免疫染色し、すべての有核細胞（ｎｕｃｌｅａｔｅｄ ｃｅｌｌ）の核は４’６’ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ、１ｕｇ／ｍｌ）（ｖｅｃｔｏｒ、ＣＡ、ＵＳＡ）で対照染色した。免疫染色の具体的なプロセスは、先行文献（Ｌｅｅ ＨＬ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２０１６Ｍａｒ２８；２２６：２１－３４）と同様に進行させ、染色の結果はレーザスキャニング共焦点顕微鏡（ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＬＳＣＭ）で検鏡した。前記染色の結果を図６に示した。実験の結果、損傷部位を中心に神経膠細胞の標識タンパク質であるＧＦＡＰの発現が確認された。また、神経芽細胞の標識タンパク質であるＳｏｘ２はＧＦＰと共に発現しないが、初期神経細胞の標識タンパク質であるＴｕｊ１と成熟した神経細胞の標識タンパク質であるＮｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔはＧＦＰと共に発現することが明らかになった。ＧＦＡＰは共に発現しなかった。これにより、Ａ－ＩＶＲによって神経膠細胞が神経細胞に転換（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）され、ベクター導入６週後には、神経芽細胞を経て神経細胞に分化することが分かった。
前記実施例１～４の結果から、本発明の改善された生体内リプログラミングシステムが細胞を出発細胞から指向細胞に転換（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）させることができることと、これを細胞が生きている状態で確認可能であることが分かった。これは、生体内でその他の細胞から必要細胞を生産可能であることを意味する。
以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単に好ましい実施形態に過ぎず、よって、本発明の範囲が制限されないことは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は添付した請求項とその等価物によって定義される。
本発明は、改善された生体内リプログラミングシステムおよびこれを用いた細胞転換方法に関し、本発明のリプログラミングシステムは、細胞の転換を確認するために細胞の固定を必要とせず、細胞が生きている状態でリアルタイムにモニタリング可能であり、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）または生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）ですべて利用可能なため、バイオおよび医学分野において大きく利用されることが期待される。

Claims (26)

  1. Ａ細胞マーカーのプロモーター、遺伝子多能性維持タンパク質、Ｃｒｅ組換え酵素、Ｂ細胞マーカーのプロモーター、ＬｏｘＰ、および蛍光タンパク質をコーディングする遺伝子を順次に含む、Ａ細胞のＢ細胞転換用発現ベクター。
  2. 前記発現ベクターは、細胞が生きている状態でＡ細胞がＢ細胞に転換されることを確認可能である、請求項１に記載のＡ細胞のＢ細胞転換用発現ベクター。
  3. 前記蛍光タンパク質をコーディングする遺伝子は、逆転写方向に含まれるものである、請求項１に記載のＡ細胞のＢ細胞転換用発現ベクター。
  4. 前記発現ベクターは、アミノ酸分離ペプチドを追加的に含むものである、請求項１に記載のＡ細胞のＢ細胞転換用発現ベクター。
  5. 前記アミノ酸分離ペプチドは、Ｔ２Ａ、Ｆ２Ａ、およびＥ２Ａからなるグループより選択されたいずれか１つ以上である、請求項４に記載のＡ細胞のＢ細胞転換用発現ベクター。
  6. 前記遺伝子多能性維持タンパク質は、ＳＯＸ遺伝子族（Ｓｅｘ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ｇｅｎｅ ｆａｉｍｌｙ）、Ｍｙｃ遺伝子族（ｐｒｏｔｏ－ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ）、Ｋｌｆ遺伝子族（Ｋｒｕｐｐｅｌ－ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ）、およびＯｃｔ遺伝子族（ｏｃｔａｍｅｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ）からなるグループより選択されたいずれか１つ以上である、請求項１に記載のＡ細胞のＢ細胞転換用発現ベクター。
  7. 前記Ａ細胞は、基質細胞であり、
    前記Ｂ細胞は、神経細胞である、請求項１に記載のＡ細胞のＢ細胞転換用発現ベクター。
  8. 前記基質細胞は、線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、軟骨芽細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｂｌａｓｔ）、骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）、神経膠細胞（ｎｅｕｒｏｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）、大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、およびプラズマ細胞（ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌ）からなるグループより選択されるいずれか１つである、請求項７に記載のＡ細胞のＢ細胞転換用発現ベクター。
  9. 前記Ａ細胞マーカーのプロモーターは、Ｃｏｌ１Ａ２（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｔｙｐｅ Ｉ Ａｌｐｈａ ２ Ｃｈａｉｎ）、ＦＡＰ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＦＳＰ１（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ １）、ビメンチン（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）、ＡＣＴＡ（ａｌｐｈａ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ Ａｃｔｉｎ）、Ｈｓｐ４７（Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ４７）、アグリカン（Ａｇｇｒｅｃａｎ）、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ、ＯＳＣＡＲ（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＲＡＮＫ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ κ Ｂ）、ＧＦＡＰ（Ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＴＲＥＭ２（Ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｏｎ ｍｙｅｌｏｉｄ ｃｅｌｌｓ ２）、ＨｅｘＢ（Ｂｅｔａ－ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ｂｅｔａ）、Ｓ１００（ｃａｌｃｉｕｍ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＣＤ６９、およびＧｐｒ３４（Ｐｒｏｂａｂｌｅ Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３４）からなるグループより選択されるいずれか１つのプロモーターである、請求項７に記載のＡ細胞のＢ細胞転換用発現ベクター。
  10. 前記Ｂ細胞マーカーのプロモーターは、ＳＹＮ（Ｓｙｎａｐｓｉｎ）、Ｔｕｊ１（Ｎｅｕｒｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｌａｓｓ ＩＩＩ ｂｅｔａ－ｔｕｂｕｌｉｎ）、ＭＡＰ２（Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）、および神経細糸（Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ）からなるグループより選択されるいずれか１つのプロモーターである、請求項７に記載のＡ細胞のＢ細胞転換用発現ベクター。
  11. 請求項１に記載の発現ベクターを有効成分として含む、神経損傷治療用薬学組成物。
  12. 請求項１に記載の発現ベクター、Ｇ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎが融合された水泡性口内炎ウイルス（ｆｕｓｉｏｇｅｎｉｃ ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｇ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ、ＶＳＶ－Ｇ）、およびＧＡＧ／Ｐｏｌ遺伝子を含む、レンチウイルスベクター。
  13. 請求項１に記載の発現ベクターを含む、ヒトを除いた形質転換体。
  14. （ａ）請求項１に記載の発現ベクターを製造するステップと、
    （ｂ）前記発現ベクターをＡ細胞に導入するステップと、を含む、Ａ細胞をＢ細胞に転換させる方法。
  15. 前記（ｂ）ステップの後に、細胞をＢ細胞培養用培地で培養するステップを追加的に含む、請求項１４に記載のＡ細胞をＢ細胞に転換させる方法。
  16. 前記（ｂ）ステップの後に、細胞内蛍光発現を確認するステップを追加的に含む、請求項１４に記載のＡ細胞をＢ細胞に転換させる方法。
  17. 細胞が生きている状態でＡ細胞がＢ細胞に転換されることを確認する方法であって、
    （ａ）請求項１に記載の発現ベクターを製造するステップと、
    （ｂ）前記発現ベクターをＡ細胞に導入するステップと、を含む、生細胞イメージング（ｌｉｖｅ ｃｅｌｌ ｉｍａｇｉｎｇ）方法。
  18. 前記イメージングは、蛍光顕微鏡を用いることを特徴とする、請求項１７に記載の生細胞イメージング方法。
  19. （ａ）請求項１に記載の発現ベクターを製造するステップと、
    （ｂ）ヒトを除いた個体に前記発現ベクターを導入するステップと、を含む、Ａ細胞がＢ細胞に転換された動物モデルの製造方法。
  20. （ａ）ヒトを除いた疾病動物モデルの第１個体と第２個体を用意するステップと、
    （ｂ）（イ）細胞をＡ細胞、（ハ）細胞をＢ細胞とする、請求項１に記載の発現ベクターＩを製造するステップと、
    （ｃ）（ロ）細胞をＡ細胞、（ハ）細胞をＢ細胞とする、請求項１に記載の発現ベクターＩＩを製造するステップと、
    （ｄ）前記第１個体に発現ベクターＩを導入し、前記第２個体に発現ベクターＩＩを導入するステップと、
    （ｅ）前記第１個体と第２個体の疾病治療効果を比較して、第１個体の治療効果がより良い場合に、前記（イ）細胞を（ハ）細胞転換用細胞として選別するステップと、を含む、Ｂ細胞転換用Ａ細胞のスクリーニング方法。
  21. 請求項１に記載のベクターを有効成分として含む、Ｂ細胞の損傷による疾患の治療用薬学組成物。
  22. 前記Ｂ細胞は、神経細胞であり、
    前記Ｂ細胞の損傷による疾患は、てんかん、筋萎縮性側索硬化症（ルーゲーリック病）、脳膜炎、脳髄膜炎、脳性麻痺、脳炎、脳卒中、脳梗塞、脳出血、虚血性脳発作、多発性硬化症、頭痛、片頭痛、緊張性頭痛、舞踏病、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｏｎｇｔｏｎｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、ウィルソン病（Ｗｉｌｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、脳振盪、脳挫傷、硬膜下血腫、外傷性クモ膜下血腫、脊髓損傷、動静脈奇形、脳動脈瘤、水頭症、二分脊椎、睡眠無呼吸症侯群、失神、神経麻痺、重症無力症、振戦症（身振い症）、脊髓炎、アルツハイマー、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、および運動機能障害からなるグループより選択されるいずれか１つである、請求項２１に記載の薬学組成物。
  23. 請求項１に記載のベクターを投与してＢ細胞の損傷による疾患を予防または治療する方法。
  24. 前記Ｂ細胞は、神経細胞であり、
    前記Ｂ細胞の損傷による疾患は、てんかん、筋萎縮性側索硬化症（ルーゲーリック病）、脳膜炎、脳髄膜炎、脳性麻痺、脳炎、脳卒中、脳梗塞、脳出血、虚血性脳発作、多発性硬化症、頭痛、片頭痛、緊張性頭痛、舞踏病、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｏｎｇｔｏｎｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、ウィルソン病（Ｗｉｌｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、脳振盪、脳挫傷、硬膜下血腫、外傷性クモ膜下血腫、脊髓損傷、動静脈奇形、脳動脈瘤、水頭症、二分脊椎、睡眠無呼吸症侯群、失神、神経麻痺、重症無力症、振戦症（身振い症）、脊髓炎、アルツハイマー、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、および運動機能障害からなるグループより選択されるいずれか１つである、請求項２３に記載の予防または治療する方法。
  25. Ｂ細胞の損傷による疾患の予防または治療のための、請求項１に記載のベクターの用途。
  26. 前記Ｂ細胞は、神経細胞であり、
    前記Ｂ細胞の損傷による疾患は、てんかん、筋萎縮性側索硬化症（ルーゲーリック病）、脳膜炎、脳髄膜炎、脳性麻痺、脳炎、脳卒中、脳梗塞、脳出血、虚血性脳発作、多発性硬化症、頭痛、片頭痛、緊張性頭痛、舞踏病、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｏｎｇｔｏｎｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、ウィルソン病（Ｗｉｌｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、脳振盪、脳挫傷、硬膜下血腫、外傷性クモ膜下血腫、脊髓損傷、動静脈奇形、脳動脈瘤、水頭症、二分脊椎、睡眠無呼吸症侯群、失神、神経麻痺、重症無力症、振戦症（身振い症）、脊髓炎、アルツハイマー、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、および運動機能障害からなるグループより選択されるいずれか１つである、請求項２５に記載の用途。

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