CN115927476A - 一种将成纤维细胞重编程为自主神经节类器官的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种将成纤维细胞重编程为自主神经节类器官的方法。本方法利用TetO控制的慢病毒系统，建立了一种利用转录因子组合将小鼠体细胞重编程成自主神经节类器官(induced autonomic ganglion，iAG)的方法；实验结果表明Ascl1、Phox2a/2b和Hand2三种转录因子组合能够将小鼠胚胎成纤维细胞诱导生成自组织的、网络连接的神经团。本方法表明Ascl1、Phox2a/2b和Hand2三因子是将小鼠成纤维细胞重编程iAG类器官的有效手段，诱导产生的iAG类器官可能作为一个模型来破译自主神经性疾病的发病机制，筛选有效的药物和细胞替代治疗的来源。

Description

一种将成纤维细胞重编程为自主神经节类器官的方法

技术领域

本发明属于细胞重编程、细胞替代治疗生物技术领域，具体涉及一种将成纤维细胞重编程为自主神经节类器官的方法。

背景技术

神经节是存在于外周神经系统(peripheral nervous system，PNS)或中枢神经系统(central nervous system，CNS)中的一簇或一群神经细胞。它们经常相互连接，并与PNS和CNS其他结构连接，形成复杂的神经网络。自主神经系统(autonomic nervous system，ANS)控制由平滑肌纤维、心肌纤维和腺体活动调节的非自主功能，如循环、呼吸、心率、体温、出汗、消化和新陈代谢，不能被意识控制，被认为是一种“自动”的神经系统(Cannon,1963；Goldstein,2013)。ANS由交感神经、副交感神经和肠神经系统组成，其中包含多种不同神经元亚型，支配不同的组织和器官。它们是由下丘脑输入到脑干和脊髓的节前神经元来控制的，这些神经元又决定了自主神经节中初级内脏运动神经元的活动。自主神经节由不同类型的功能神经元组成(如调控血管收缩、分泌运动、毛发运动)，支配每个靶组织的神经元亚群可以表达不同神经递质、神经肽、离子通道和受体，它们共同构成了神经元的化学表型(Cane and Anderson,2009)。

外周自主神经节细胞的特异性和分化依赖于细胞外在因素和细胞内在因素的相互作用。其发育过程中的内在因素主要是由转录因子形成的调节网络控制，研究表明，Ascl1/Mash1(Achaete-scute homolog 1)控制着不同神经系中神经元祖细胞发育，突变Ascl1小鼠出生夭折，嗅觉上皮、交感神经、副交感神经和肠神经严重受损(Guillemot etal.,1993；Pattyn et al.,2006)。在外源性BMP2缺失的情况下，Mash1可诱导Phox2a(Paired-like homeobox 2a)和c-RET的表达并促进神经元分化和泛神经元基因的表达。在体内，自主神经节中Phox2a的表达在Mash1^-/-胚胎中显著降低(Lo et al.,1998)。在培养的神经嵴过表达Phox2a引起交感肾上腺素能细胞数量强烈增加。而鸡胚中Phox2a的表达促进去甲肾上腺素能标记基因DBH(dopamine beta-hydroxylase)和TH(tyrosinehydroxylase)、泛神经元基因SCG10和NF160以及胆碱能基因ChAT(cholineacetyltransferase)和VAChT(vesicular acetylcholine transporter)的表达(Stankeet al.,1999)。Phox2b的敲除结果确定了Phox2b是自主神经元发育的重要基因(Pattyn etal.,1999)。研究表明，Phox2足以促进交感神经元的产生，并直接或间接地控制大量交感神经元特有基因的表达。事实上。Ascl1和Phox2对交感神经元的发育都是必不可少的(Lo etal.,1998；Stanke et al.,2004)。此外，Hand2(heart and neural crest derivativesexpressed 2)对去甲肾上腺素能交感神经元分化具有必要和选择性。神经嵴特异性敲除Hand2导致进行性神经元损失、酪氨酸羟化酶TH和多巴胺羟化酶DBH显著减少，导致初始去甲肾上腺素能分化受阻(Hendershot et al.,2008；Lucas et al.,2006；Morikawa etal.,2007)。

近些年体外直接神经元重编程方面取得很大进展，利用化学性的小分子或者转录因子将成纤维细胞或者胶质细胞转变为多巴胺能、GABA能、运动型神经元等，诱导的神经元可用于细胞治疗和疾病模型(Caiazzo et al.,2011；Liu et al.,2013；Son et al.,2011；Yang et al.,2017)。尽管已有研究利用化学性分子从人类多能干细胞(humanpluripotent stem cells，hPSCs)诱导产生交感神经元(Oh et al.,2016)，然而使用来自干细胞的神经元可能会增加肿瘤形成的风险。此外，还有研究利用转录因子将成纤维细胞转变为去甲肾上腺素神经元(Li et al.,2019)，但其诱导产生的是分散存在的、类型单一的神经元，与体内神经节成簇存在以及具有多种细胞类型有所差别。在已发表的一项研究中，利用特定转录因子组合成功将成纤维细胞重编程生成感觉神经节类器官(Xiao etal.,2020)，那么在体外是否有可能诱导产生交感神经节类器官还未知。

参考文献

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发明内容

本发明的目的是提供一种将成纤维细胞重编程为自主神经节类器官的方法。

自主神经系统在维持生理内稳态方面发挥重要作用，其广泛联系使其容易受到破坏，造成自主神经功能障碍(autonomic dysfunction)，包括原发性病因如帕金森病、多系统萎缩、纯自主神经功能衰竭和继发性病因如糖尿病、淀粉样变和免疫介导性疾病，最终会导致心血管、胃肠、体温调节和泌尿生殖系统等多器官功能紊乱。近些年体外直接神经元重编程方面取得很大进展，利用化学性的小分子或者转录因子将成纤维细胞或者胶质细胞转变为多巴胺能、GABA能、运动型神经元等，诱导的神经元可用于细胞治疗和疾病模型。

在已发表的一项研究中，利用特定转录因子组合成功将成纤维细胞重编程生成感觉神经节类器官，而在体外是否有可能诱导产生交感神经节类器官还未知。尽管已有研究利用化学性分子从hPSCs诱导产生交感神经元，然而使用来自干细胞的神经元可能会增加肿瘤形成的风险。此外，还有研究利用转录因子将成纤维细胞转变为去甲肾上腺素神经元，但其诱导产生的是分散存在的、类型单一的神经元，与体内神经节成簇存在以及具有多种细胞类型有所差别。

本发明利用TetO控制的慢病毒系统，在成纤维细胞中过表达自主神经节发育过程中的关键转录因子(Ascl1、Phox2a/2b和Hand2)，利用细胞免疫染色、qRT-PCR、膜片钳、细胞共培养等技术，发现三因子组合APH能够将小鼠成纤维细胞重编程为自组织和网络化iAG类器官，诱导的iAG神经元表现出自主神经细胞的各种分子特征、多种细胞类型以及电生理特性，同时能够在体内存活并调控共培养心肌细胞的跳动。APH将体细胞重编程生成的iAG类器官，与内源性自主神经元在特征和功能相似，可为建立自主神经性疾病模型、研究其发病机制、筛选对抗药物和开发细胞替代疗法提供新的可能性。

因此，本发明的第一个目的是提供转录因子Ascl1、Phox2a和Hand2或转录因子Ascl1、Phox2b和Hand2在诱导产生自主神经节类器官中的应用。

优选，所述的转录因子为DNA形式、RNA形式或蛋白质形式。

本发明的第二个目的是提供一种重编程获得自主神经节类器官的方法，包括以下步骤：

S1.使离体哺乳动物体细胞中过表达或表达转录因子Ascl1、Phox2a和Hand2或转录因子Ascl1、Phox2b和Hand2，得到转基因细胞；

S2.将转基因细胞在神经元诱导培养基中诱导培养，得到自主神经节类器官。

优选，所述的步骤S1，包括以下步骤：将转录因子Ascl1、Phox2a和Hand2共同导入或将转录因子Ascl1、Phox2b和Hand2共同导入离体哺乳动物体细胞中，得到转基因细胞。

优选，所述的导入为通过分别构建表达各转录因子的慢病毒载体，然后共同导入所述的哺乳动物体细胞中。

优选，所述的转录因子Ascl1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，转录因子Phox2a的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，转录因子Hand2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，转录因子Phox2b的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

优选，所述的体细胞为成纤维细胞。更优选的，所述的体细胞为胚胎皮肤成纤维细胞。

优选，所述的哺乳动物为人、小鼠、大鼠、猴、兔、牛、马、猪、狗或猫。

优选，所述的步骤S2的将转基因细胞在神经元诱导培养基中诱导培养，是将转基因细胞在神经元诱导培养基I中培养7天后，更换为神经元诱导培养基II继续培养7-13天，诱导培养期间，每2天更换一次培养基；所述的神经元诱导培养基I含1×B27、1×Pen/Strep、2ng/ml Dox、10ng/ml bFGF、100ng/ml IGF-1、10ng/ml BDNF和10ng/ml GDNF，余量为1:1的DMEM/F12基础培养基；所述的神经元诱导培养基II含10μM forskolin和10ng/mlBMP4，余量为所述的神经元诱导培养基I。

本发明还提供根据所述的方法获得的自主神经节类器官。

本发明获得的上述自主神经节类器官可用于自主神经性疾病模型或细胞治疗模型，筛选有效的对抗药物和开发细胞替代疗法。

本发明建立了一种将动物体细胞重编程为自主神经节类器官的方法，提供了一个新的诱导自主神经节细胞的获得方式，相较于其他方式更为简便、安全和高效，在自主神经性疾病的基础研究、药物筛选及潜在细胞替代治疗方面有很大的应用价值。

附图说明

图1为Ascl1、Phox2a/2b和Hand2将MEFs直接重编程为iAG；图A，重编程示意图，小鼠胚胎成纤维细胞MEFs来源于E13.5的Tau-GFP或C57BL6/J小鼠，感染tet-on元件控制的表达转录因子Ascl1、Phox2a/2b和Hand2的慢病病毒，使用含doxycycline(dox)的神经元诱导培养基诱导；图B，感染GFP和APH(Ascl1、Phox2b和Hand2)病毒不同时间MEFs形态变化，可看出APH感染8d的MEFs开始聚集成簇，在18d有大量连接紧密的iAG细胞团形成；图C-K，Tau-GFP来源的MEFs感染不同组合病毒18d的形态变化(A：Ascl1；P：Phox2a/2b；H：Hand2)，感染AP和APH组合的MEFs均观察到连接紧密的细胞团，而APH三个因子组合的效率更好；图L-O，对不同转录因子组别诱导的神经元进行Tuj1和DAPI染色；图P，单个转录因子以及不同组合诱导iAG的统计图；6×10⁴个MEFs铺至12孔培养板，感染不同组别病毒18d后在荧光显微镜下统计GFP阳性细胞团；Scale bar：80μm(B-K)；40μm(L-O)，^*P<0.0001。

图2为APH诱导的iAG包含大多数种类自主神经节神经元；图A-V，Ascl1、Phox2b和Hand2组合诱导的iAG表达Tuj1、Map2、NF200、Synapsin1、NeuN、Peripherin、Vamp、Gad65、GABA、vGlut2、NPY、TH、DBH、Vmat2、SOM、VIP、ChAT和VAChT等普遍神经元标记分子以及自主神经元标记分子，其中，图A-E为Tau-GFP小鼠来源的MEFs，图F-V为C57BL6/J小鼠来源的MEFs；图W和X，APH组合诱导iAG表达指定基因的qRT-PCR结果，与GFP相比，APH诱导的iAG表达多数神经元分子以及自主神经节神经元特异性分子；图Y，与GFP病毒感染MEFs相比，C57BL6内源性交感神经节中指定基因表达的qRT-PCR结果；图Z，qRT-PCR分析GFP、A、AP(2a)、AP(2b)、AH、AP(2a)H、AP(2b)H病毒感染MEFs中Tubb3(Tuj1)、Map2、TH和DBH的表达，其中Tuj1和Map2为神经元普遍表达的基因，TH、DBH为自主神经节神经元表达的基因；Scalebar：40μm(图A-D、F、G、I、N、P、Q)，20μm(图E、H、J、K-M、O、R-T)，^*p<0.05，^&p<0.01，^#p<0.001。

图3为APH诱导的iAG具有自主神经元电生理特性；图A，高倍浸水物镜(40×)下钳制的Ascl1、Phox2b和Hand2组合诱导的iAG神经元；图B，在诱导13天的神经元中，电压钳记录到的iAG神经元的快速激活和失活的内向钠电流和外向钾电流；图C，在诱导10天的神经元中记录的自发性动作电位(spontaneous action potentials,sAPs)；图D和E，电流注射下的电流钳记录显示iAG神经元具有单峰(Phasic，类型I，D)、多峰(Tonic，类型II，E)动作电位；图F，记录的iAG神经元具有单峰(Phasic)、多峰(Tonic)动作电位以及无动作电位的比例；图G，钳制在I＝0pA(n＝8/10)时的后超极化(after hyperpolarization，AHP)；图H，诱导14-22d的iAG神经元的静息膜电位(resting membrane potential,RMP)；图I，TTX(1μM,n＝6/20)处理后神经元(RMP-40mV)的动作电位被完全阻断；图J，Cd²⁺(300μM,n＝2/20)作用后，神经元(RMP-34mV)的动作电位被完全阻断；图K，Cd²⁺(300μM)单独作用可使神经元(RMP-49mV)的动作电位降低，而Cd²⁺和TTX共同作用可完全阻断，30min洗脱后，动作电位部分恢复(n＝12/20)；图L，记录到的iAG神经元突触活动sAP或sPSC的比例；图M，记录到的iAG神经元自发突触后电流sPSC，能够被AMPA受体拮抗剂CNQX(10μM)或GABA受体拮抗剂picrotoxin(50μM)部分阻断，同时给予CNQX和picrotoxin可完全阻断记录到突触后电流；图N，施加多巴胺(Dopamine，100μM)刺激诱导的iAG神经元记录到的动作电位；图O，施加去甲肾上腺素(Noradrenaline，20μM)记录到的突触后电流；图P，施加乙酰胆碱(Acetylcholine：Ach，1μM)刺激诱导的iAG神经元记录到的动作电位，且能够被部分洗回；图Q，施加Ach刺激诱导的iAG神经元记录到的动作电位可被乙酰胆碱M型受体拮抗剂阿托品(Atropine，ATR，10μM)部分阻断，而同时施加ATR以及乙酰胆碱N型受体拮抗剂美卡拉明(Mecamylamine：MEC，10μM)则可完全阻断该效应；图R，施加5-羟色胺(5-hydroxytryptamine：5-HT,1μM)刺激诱导的iAG神经元记录到的动作电位。

图4为iAG神经元在体内颈上神经节存活；图A，APH转染的Tau-GFP标记的细胞消化后移植到成年大鼠颈上神经节中的示意图；图B-M，细胞移植注射2周后分离SCG，用GFP和TH抗体(B-E)、ChAT抗体(F-I)或VAChT抗体(J-M)进行免疫染色；箭头指向具有代表性的双阳性细胞，标尺：20μm。

图5为iAG神经元支配共培养的心肌细胞；图A，iAG神经元与新生小鼠心肌细胞(NMVMs)共培养示意图；图B，共培养7-10天后，Tuj1和NMVMs标记物cTnT共染色代表性图；上图和右图是Z-stack图像的正位视图(3d重建图像见视频S1)，上面XY截面为XZ截面图像，以绿色边框标示，在XY部分的右边是YZ部分的图像，用红色边框标记，XZ平面在XY、YZ平面上的投影用红线表示，YZ平面在其他两个平面上的投影用绿线标出；图C和D，心肌细胞跳动增加代表强度图，加入尼古丁(1μM)后心肌细胞跳动速度增加；图E，尼古丁处理后心肌细胞跳动增加的统计结果(n＝13)，^**p<0.0001；图F和G，心肌细胞跳动减慢代表强度图，加入尼古丁(1μM)后心肌细胞跳动减慢；图H，尼古丁处理后心肌细胞跳动减慢的统计结果(n＝5)，^*p<0.05。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

本发明利用在动物体细胞内过表达Ascl1、Phox2a/2b和Hand2三种转录因子(APH)，从而将体细胞重编程为自主神经节类器官。所采用的方案可以分为四个步骤：

1、动物体细胞的采集和扩增：本方法使用的体细胞为小鼠胚胎成纤维细胞。

2、在体细胞内过表达转录因子：本方法将转录因子编码序列克隆入慢病毒(lentivirus)载体进行转录因子过表达。

3、转染后的体细胞在特定培养基中培养，以诱导产生神经团。

4、对诱导产生的神经团取样，进行鉴定：包括形态观察、免疫染色、qRT-PCR、电生理记录等。

具体实验过程如下：

实施例1

一、方法

1.小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)制备

(1)迅速取出Tau-GFP或C57BL/6J小鼠E13.5胚胎，放入盛有预冷HBSS缓冲液(不含钙镁，Gibco)的培养皿中，漂洗后转入含有新的HBSS缓冲液的培养皿中，去除包膜、脐带等，分离出胚胎。于显微镜下去除头、脊柱、四肢和内脏，用镊子和弯剪小心分离皮肤组织，放入新培养皿中。

(2)每8个胚胎皮肤组织为一组，加入1mL 0.25％trypsin-EDTA，用弯剪将组织剪碎，置于培养箱消化5min，再用弯剪继续剪碎，共消化3次(15min)。加入适量MEF培养基(含DMEM高糖培养基,10％FBS(Gibco),1×Pen/Strep(Gibco),1×MEM-NEAA(Gibco))终止消化，用移液管不停的吹打至单细胞悬液，按1.5-2个胚胎一个10cm培养皿接种细胞，置于培养箱。

(3)待细胞长满，去除培养基，HBSS洗涤一次，加入1mL 0.25％trypsin-EDTA于培养箱中孵育3min，加入MEF培养基终止消化，吹散的细胞用100μm滤网过筛，1000rpm离心5min收集细胞。

(4)先1mL细胞冻存液(含10％DMSO、30％FBS的DMEM高糖培养基)重悬细胞，再按1皿:4管的比例加入剩余的冻存液，分装至冻存管中，置于冻存盒中，放入-80℃，第二天转移至液氮罐中。复苏的细胞传代后用于后续诱导。

2.慢病毒制备以及MEFs重编程

(1)慢病毒载体的构建：将小鼠转录因子Ascl1编码序列(其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示)、转录因子Phox2a编码序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)、转录因子Phox2b编码序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)、转录因子Hand2编码序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)分别克隆进入含TetO调控序列的慢病毒载体(FUW-TetO-MCS，addgene#84008)的EcoRI位点。目的是将来和RTTA病毒共转染，并可加入Dox(Doxycyclin)控制这些转录因子在体细胞内的表达。经DNA测序验证正确克隆后，制备转染用的质粒。

(2)慢病毒制备：质粒转染前24h，以1:4比例将长满的HEK293T细胞传代至10cm培养皿中，转染前约1h，更换新的培养基(加入9mL)。按照以下标准配制一个10cm培养皿所需的质粒和转染试剂量：①Opti-MEM(500μl)中加入目标质粒FUW-TetO-GFP/Ascl1/Phox2a/Phox2b/Hand2、FUW-M2rtTA(10μg)等，以及包装质粒pMDLg/pRRE(5μg)、pRSV-rev(2.5μg)、pMD2.G(2.5μg)，充分混匀；②在另一个离心管中加入Opti-MEM(500μL)以及40μLlipofectamin 2000，轻轻混匀，室温孵育5min。

(3)将步骤(2)配制的②缓慢加入①中，轻轻混匀，室温孵育20-30min。随后将混合液(1mL)轻轻均匀地滴加于细胞培养皿中。约48h后收集培养基，用0.45μm无菌过滤器过滤后转移至超速离心管中，于4℃超速离心机中21000rpm离心2h。

(4)离心结束后，小心取出套管，此时可在离心管底部看到一层薄薄的白膜样物质，沿着一个方向轻轻倒出上清(勿回流)，剩余约1mL，于4℃摇床过夜。第二天分装保存于-80℃，并对病毒滴度进行测定，使用时避免反复冻融。

3.MEFs重编程产生iAG

(1)感染病毒前一天，将MEFs以6×10⁴/孔的细胞数量铺至预先包被matrigel(2h以上)的12孔板中。感染当天，目标病毒与M2rtTA以1:1混合后，加入1mL含polybrene(10μg/mL)的MEF培养基。弃细胞上清，加入含病毒的培养基。

(2)感染16-24h后，弃上清，更换为神经元诱导培养基I(含DMEM/F12(1:1)(LifeTechnologies),1×B27(Gibco),1×Pen/Strep(Gibco),2ng/ml Dox,10ng/ml bFGF(R&DSystems),100ng/ml IGF-1(R&D Systems),10ng/ml BDNF(R&D Systems)和10ng/ml GDNF(R&DSystems))，培养7天后，更换为神经元诱导培养基II(神经元诱导培养基I+10μMforskolin(Selleck)+10ng/ml BMP4(R&D Systems))，继续培养7-13天。诱导期间，每2天更换一次培养基。诱导2-3周后神经元细胞用于后续实验。

4.iAG鉴定

(1)免疫细胞化学染色(immunocytochemistry，ICC)

a.取出诱导2-3周的神经元培养板，弃培养基，PBS洗涤3次，每次3min，加入适量4％PFA固定15min(不要超过20min)。弃除PFA，PBS洗涤3次，每次3min。随后加入ICC封闭液，室温封闭1.5h。

b.使用抗体稀释液(5％FBS、0.07％Triton-100的PBS)配制抗体，4℃孵育过夜。本实验中用到的一抗包括：mouse anti-Tuj1(Millipore,MAB5564,1:500),rabbit anti-Tuj1(Abcam,ab18207,1:2000),mouse anti-Map2(Sigma,M1406,1:2000),rabbit anti-synapsin1(Calbiochem,574778,1:500),rabbit anti-peripherin(Millipore,ab1530,1:1000),NeuN(Millipore,ABN78,1:2000),rabbit anti-vGLUT2(abcam,ab79157,1:500),rabbit anti-GABA(Sigma,A-2052,1:1000),mouse anti-NF200(Millipore,MAB5266,1:500),rabbit anti-TH(Protos Biotech,CA-101bTHrab,1:1000),rabbit anti-DBH(Protos Biotech,CA-301bDBHrab,1:1000),NPY(Sigma,N9528,1:2000),Gad65(BDBiosciences,559931,1:500),Vmat2(Synaptic Systems,138302,1:200),ChAT(Millipore,AB144P,1:500),VAChT(Synaptic Systems,139103,1:200),VIP(Immunostar,20077,1:200),goat anti-GFP(Abcam,ab6673,1:2000)。

c.次日，取出培养板，PBS漂洗玻片后加入相应的二抗和DAPI反应液，室温避光孵1.5h。弃液体，PBS漂洗后封片，荧光显微镜下观察拍片或暂存于4℃。

(2)荧光定量PCR(qRT-PCR)

取不同组别细胞，使用TRIzol reagent(Invitrogen)提取总RNA，1μg RNA按照HiScript IIQ RT SuperMix for qPCR(Vazyme Biotech)试剂盒去除基因组DNA，并反转录合成cDNA。随后采用Kapa SYBR fast qPCR master mix(Kapa)染料配制反应体系，使用qTOWER³G Real-Time PCR system(Analytikjena)系统进行qRT-PCR反应。得到的数据使用2^-ΔΔct方法进行分析。用于qRT-PCR的引物如表1所示。

表1 qRT-PCR检测的基因及引物

(3)电生理记录(Electrophysiological analysis)

将MEFs铺在包被有Matrigel的12mm的圆形玻片上于24孔培养板中诱导，诱导2-3周的神经元用于记录。将细胞玻片置于安装在配有40×浸没物镜以及DIC光学系统的正置显微镜(BX51W1,Olympus,Japan)载物台上的chamber中。细胞以及记录电极可通过安装在显微镜上的CCD相机(evolve,Photometrics,Tucson,USA)的显示屏观察。使用EPC-10USB放大器(HEKAelectronics,Lambrecht,Germany)和Patchmaster数据采集软件(HEKA)进行全细胞膜片钳记录。硼硅玻璃记录电极使用Sutter P-97水平拉直仪拉到4-7MΩ使用。通氧(95％O₂和5％CO₂)的外液通过蠕动泵(Lead-2,LongerPump,Hebei,China)以1.5-2mL/min的速度不断的流入chamber中。外液成分为(单位：mM)：140NaCl、2.5KCl、10HEPES、10glucose、2CaCl₂和2MgCl₂。电极内液成分为(单位：mM)：105K-gluconate、5KCl、5NaOH、15KOH、0.5CaCl₂、2MgCl₂、5EGTA、2adenosine 5'-triphosphate、0.5guanosine 5'-triphosphate、10HEPES和2ascorbate(pH 7.2)。在电压钳模式下记录全细胞电流，基本电位保持在-60mv，电压从-90到+100mv以10mv增量递增。检测自发突触电流时，细胞膜电位保持在-60mv，以电流钳位模式记录步进电流诱发的动作电位，电流步阶间隔为5pA。通过电流注入记录自发动作电位，以维持初始holding电位在-60mv。数据在10khz用3khz低通滤波器进行数字化，并使用Patchmaster(HEKA)进行分析。使用的拮抗剂和激动剂有：tetrodotoxin(TTX,Hamu-Shanghai,1μM),6cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione(CNQX,Tocris,10μM),picrotoxin(Tocris,50μM),norepinephrine(NE,Selleck,20μM),dopamine(DA,Selleck,100μM),acetylcholine(Ach,Selleck,1μM),atropine(ATR,Selleck,10μM),mecamylamine(MEC,Tocris,10μM),5-hydroxytryptamine(5-HT,Selleck,1μM)and CdCl₂(Sigma,300μM)。

(4)统计分析

本研究中，细胞团计数在100X荧光显微镜下进行。qRT-PCR数据以平均值±标准差(means±SD)表示，使用GraphPad Prism 7(GraphPad software,Inc.)对进行分析，两组间比较采用两独立样本非配对双尾student’s t-test，以P<0.05认为有显著性差异。

二、结果

利用来源于Tau-GFP杂合子胚胎的小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonicfibroblasts，MEFs)，将Ascl1、Phox2b/2a和Hand2以不同组合感染MEFs，在含有doxycycline(dox)的神经元分化培养基培养下观察不同组合对MEFs的重编程能力。结果显示，Ascl1和Phox2a/2b(AP)组合感染MEFs 18d可在荧光显微镜下可观察到GFP阳性细胞团(图1.H、I)。在单独Ascl1以及与其他转录因子组合中并没有观察到此现象(图1.C-G)。当Ascl1、Phox2a/2b和Hand2(APH)三者组合时，同样观察到MEFs形态变化，在第8天开始改变形态，14天后可见明显的细胞形成，并且产生更多的神经团(图1.B、J、K、P)。提示Hand2可增强AP将MEFs重编程生成神经团的能力。从图中可看出双因子或三因子(AP、APH)诱导的神经团由比较粗的成束的神经纤维相互连接，在形态上类似于体内的自主神经节神经丛。进一步的免疫染色结果表明，APH诱导的神经团以及束状神经纤维均能够被神经元标记分子Tuj1标记，而Ascl1中Tuj1标记均为分散的神经元(图1.L-O)。Tuj1标记反应表明Ascl1单独诱导的神经元主要是一种不成熟的神经元状态。我们将APH诱导的的神经团定义为iAG(induced autonomic ganglia)类器官。

通过免疫荧光染色和qRT-PCR，我们检测了多种神经元标记分子，包括神经元普遍分子和细胞类型特异性分子，以确定APH重编程产生的iAG特征。结果显示，它们高度表达神经元普遍分子Tuj1和Map2(图2.A、B、F)，也表达突触蛋白Synapsin和小突触泡蛋白Vamp1(synaptobrevin)(图2.D、I、J)，提示iAG神经元能够形成突触连接并释放突触囊泡。此外，APH诱导的iAG神经元还表达NF200、NeuN、Peripherin(图2.C、G、H)。同时检测到抑制性递质GABA、谷氨酸脱羧酶Gad65和囊泡谷氨酸转运蛋白vGlut2(图2.K-M)，这与体内自主神经节神经元特性也是一致的。自主神经节神经元包含多种细胞类型，主要为去甲肾上腺素能和乙酰胆碱能神经元。我们检测了不同类型细胞特异分子的表达情况。免疫染色结果显示，诱导的iAG表达去甲肾上腺素能神经元标记分子DBH、TH、NPY和Vmat2(图2.N、P-R)以及乙酰胆碱能神经元分子ChAT、VAChT、VIP和SOM(图2.E、S、T、O)。qRT-PCR检测显示，与GFP感染的MEFs相比，APH诱导的iAG中Tuj1、Map2、NF200、p75NTR、vGlut2、GABARγ3、Vmat2、TH、DBH、SOM、VIP、ChAT、VAChT、RET等基因的表达显著上调，进一步证实上述免疫染色结果(图2.W、X)。通过分析C57BL6内源性交感神经节中指定基因表达情况，进一步证实上述免疫染色以及qRT-PCR实验中所使用的自主神经节标记分子的表达(图2.Y)。通过对Ascl1、Phox2a/2b、Hand2构成的组合进行了qRT-PCR(图2.Z)。虽然与GFP组相比，AP和APH诱导的神经元中Tubb3、Map2和TH均明显增高，但是APH组中的TH表达量明显高于AP组，而在AP组中则不表达DBH。提示Hand2能够进一步促进iAG神经元的成熟。

随后，通过全细胞膜片钳记录对具有神经元形态的iAG神经元进行电生理特性评估(图3.A)。记录的绝大多数的神经元有典型的钠和钾电流，并表现出动作电位(图3.B和C)。25.8％的神经元表现出单峰动作电位(single-spiking，图3.D和F)，65.2％的神经元表现出多峰动作电位(multiple-spiking，图3.E和F)。钳制在I＝0pA(n＝8/10)时iAG神经元表现出显著的后超极化(after hyperpolarization，AHP)(图3.G)，同时记录到-41.7±8.8mV(n＝65)的静息膜电位(resting membrane potential,RMP)(图3.H)。通过灌注TTX(电压依赖性Na⁺通道阻滞剂)和/或Cd²⁺(非特异性Ca²⁺通道阻滞剂)确定了这些神经元中动作电位的离子依赖性。其中6个神经元被TTX完全阻断(图3.I)，2个神经元被Cd²⁺阻断(图3.J)，12个神经元需要TTX和Cd²⁺同时存在阻断(图3.K)。这些数据表明，iAG神经元具有类似发育中的啮齿动物自主神经元的电生理特性。同时，大多数神经元都获得了自发的突触后电流(sPSC)反应(图3.L和M)，sPSC可以被AMPA受体拮抗剂CNQX或GABAA受体拮抗剂picrotoxin部分阻断，并被两者完全抑制(图3.M)。这些结果与在iAG神经元中检测到的synapsin、GABA、Gad65和vGlut2的免疫反应性一致(图2.D、I、K-M)，提示iAG神经元之间形成了功能性突触。通过检测iAG神经元对自主神经节中几种常见神经递质的反应，我们发现外源性施加多巴胺(图3.N,n＝5/30)、去甲肾上腺素(图3.O,n＝9/38)、乙酰胆碱(图3.P,Ach,n＝14/34)或5-羟色胺(图3.R,5-HT,n＝3/26)后，诱导的某些iAG神经元中的sAPs或sPSCs增强。多巴胺、去甲肾上腺素或5-HT诱导的反应可以被洗除(图3.N,O,R)，乙酰胆碱诱导的分泌素可以被阿托品(ATR，乙酰胆碱M型受体的拮抗剂)部分抑制，并被ATR和甲胺(MEC，乙酰胆碱M型受体的拮抗剂)完全阻断(图3.Q)。这些结果进一步说明iAG神经元具有成熟自主神经元的药理和生理特性。

将APH重编程的iAG神经元注射到成年大鼠颈上神经节(SCG)中(图4.A)，我们发现GFP⁺iAG神经元在SCG中存活、扩散，表达自主神经元标记物TH、ChAT和VAChT(图4.B-M)，表明iAG神经元能够在体内存活并保持体细胞类型特异性。同时，当将这些神经团与新生小鼠心室肌细胞(NMVM)共培养时(图5.A)，免疫染色显示Tuj1阳性的iAG神经元及共培养的cTnT阳性的心肌细胞发生物理接触(图5.B)。在观察的18个心肌细胞中，有13个细胞的跳动速度明显增加(图5.C-E)，有5个细胞的跳动速率降低(图5.F-H)。因此，iAG神经元能够与小鼠心肌细胞结合，根据神经元亚型调节它们的跳动速率。

Claims (10)

1.转录因子Ascl1、Phox2a和Hand2或转录因子Ascl1、Phox2b和Hand2在诱导产生自主神经节类器官中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的转录因子为DNA形式、RNA形式或蛋白质形式。

3.一种重编程获得自主神经节类器官的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.使离体哺乳动物体细胞中过表达或表达转录因子Ascl1、Phox2a和Hand2或转录因子Ascl1、Phox2b和Hand2，得到转基因细胞；

S2.将转基因细胞在神经元诱导培养基中诱导培养，得到自主神经节类器官。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的步骤S1，包括以下步骤：将转录因子Ascl1、Phox2a和Hand2共同导入或将转录因子Ascl1、Phox2b和Hand2共同导入离体哺乳动物体细胞中，得到转基因细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的导入为通过分别构建表达各转录因子的慢病毒载体，然后共同导入所述的哺乳动物体细胞中。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的转录因子Ascl1的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，转录因子Phox2a的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，转录因子Hand2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，转录因子Phox2b的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的体细胞为成纤维细胞。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的哺乳动物为人、小鼠、大鼠、猴、兔、牛、马、猪、狗或猫。

9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的步骤S2的将转基因细胞在神经元诱导培养基中诱导培养，是将转基因细胞在神经元诱导培养基I中培养7天后，更换为神经元诱导培养基II继续培养7-13天，诱导培养期间，每2天更换一次培养基；所述的神经元诱导培养基I含1×B27、1×Pen/Strep、2ng/ml Dox、10ng/ml bFGF、100ng/ml IGF-1、10ng/mlBDNF和10ng/ml GDNF，余量为1:1的DMEM/F12基础培养基；所述的神经元诱导培养基II含10μM forskolin和10ng/ml BMP4，余量为所述的神经元诱导培养基I。

10.根据权利要求3-9任一项所述的方法获得的自主神经节类器官。

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