CN109219441A - 表达间充质和神经元标志物的牙髓干细胞及其组合物治疗神经疾病的用途 - Google Patents

表达间充质和神经元标志物的牙髓干细胞及其组合物治疗神经疾病的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了包含人未成熟牙髓干细胞(hIDPSC)的药物组合物，其中hIDPSC表达CD44和CD13。本发明还提供治疗神经疾病或病症的方法，其包括向受试者全身施用包含hIDPSC的药物组合物，其中hIDPSC表达CD44和CD13。例如，用于治疗神经疾病或病症，包括在诊断为早期HD的受试者中支持神经保护机制或在诊断为PD的受试者中修复损失的DA神经元。

Description

表达间充质和神经元标志物的牙髓干细胞及其组合物治疗神 经疾病的用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年3月9日提交的美国专利申请第15/065,259号(以US 2016/0184366公开)的优先权，其中前述申请通过引用整体并入本文。
技术领域
本申请涉及产生干细胞的方法、干细胞和包含干细胞的组合物，其适合于治疗适于全身施用的几种疾病，尤其是神经疾病。
背景技术
尽管已经鉴定了负责神经退行性疾病的基因及其蛋白，但涉及这些疾病的发病机制仍然是未知的，这阻碍了有效治疗干预的开发。目前已知的是，尽管它普遍存在，例如亨廷顿蛋白的突变形式引起神经退行性和中型多棘神经元的选择性损失，这在疾病的早期阶段优先发生在纹状体和大脑皮质的较深层中。因此，已经调查了细胞疗法作为额外的或替代的治疗，其可以对该疾病和其它类似的神经退行性疾病的过程有积极贡献。干细胞是生命基本的组成部分，在所有高等生物的起源和发育中起着至关重要的作用。由于例如通过突变的亨廷顿(mHTT)蛋白的积累引起的神经元细胞死亡，这种脑损伤不可能仅通过基于药物的疗法来治疗。基于干细胞的疗法对于重建患者受损脑区域神经组织的形态设计和功能能力非常重要。这些疗法过去具有双重作用：移植干细胞旁分泌作用(抗细胞凋亡、抗炎、抗瘢痕、抗细菌和血管生成作用)、刺激局部细胞存活、抑制炎症、通过产生生物活性分子的脑组织再生，所述生物活性分子的作用有利于来自固有的和可能来自供体干细胞的新神经元产生。
脑源性神经营养因子(BDNF)是负责脑和脊髓中发现的BDNF蛋白表达的基因。这种蛋白通过在这些细胞的生长、成熟(分化)和维持中发挥作用来促进神经细胞(神经元)的存活。在脑中，BDNF蛋白在发生细胞间通信的神经细胞(突触)之间的连接处起作用。BDNF蛋白有助于调节突触可塑性，这对于学习和记忆是重要的，并且被发现在控制饮食、饮酒和体重的脑区域中表达。因此，BDNF在调节所有这些功能方面具有额外的作用。越来越多的证据提示，突触功能障碍是神经退行性疾患(包括阿尔茨海默病)的关键病理生理学标志。BDNF信号传导的缺陷导致几种主要疾病和疾患的发病机制，例如亨廷顿氏病和抑郁症。因此，操纵BDNF通路代表了对不同神经和精神疾患的可行治疗方法。单独施用BDNF提供了治疗神经退行性疾病的可行方法。然而，由于神经退行性疾病表现的遗传和个体多态性，很难为每个患者找到理想的剂量。过量的BDNF可诱导脑内肿瘤形成；在另一个方面，低BDNF剂量不能提供有效的治疗。移植后的干细胞处于患者生物学的控制之下，其可以对每个患者有效地调节细胞的BDNF分泌。此外，调查干细胞移植治疗阿尔茨海默病的益处的研究表明移植的神经干细胞(NSC)支持宿主脑细胞之间形成新的连接。这些研究表明，加强这些连接可以逆转阿尔茨海默病小鼠模型中的记忆损失。似乎BNSF是NSC天然分泌的一种因子，可以复制干细胞移植产生的作用。
过去NSC一般难以获得并且不能以足够的治疗量获得，以通过静脉内(IV)注射应用于干细胞疗法。通常，两种策略用于增加BDNF分泌。第一种是将生长因子添加到体外培养的干细胞的培养介质中以诱导BDNF分泌。然而，由于干细胞仅在体外条件下产生该因子，该策略具有很大的局限性。因此，当将这些细胞移植到患者时，它们迅速消耗BDNF的“储备”，这阻止了神经退行性疾病的长期治疗。另一种方法是产生遗传操作的干细胞，其经过适合的修饰以过表达BDNF。值得注意的是，甚至NSC也需要进行遗传工程化以产生治疗上足够水平的BDNF。然而，基因修饰的根源在于基因疗法——一种仍有待证明方法。因此，非常需要新的细胞类型和细胞培养方法，其可以导致干细胞具有升高的BDNF分泌。
脑室下区(SVZ)是整个生命过程中产生新神经元的独特脑区域(Altman J和DasGD 1965)，并且产生的细胞在成年期修复中起作用。紧邻SVZ下的血管平行于切向的成神经细胞迁移的方向，并通过BDNF信号传导引导迁移性成神经细胞。现在可以理解，成年人脑中SVZ的组织与任何其它研究的脊椎动物的组织显著不同。具体地，成年人脑中的该区域含有独特的星形胶质细胞带，其在体内增殖并且可以在体外作为NSC起作用。中枢神经系统中的星形胶质细胞具有许多重要和多样的功能。它们涉及神经血管单元的形成，神经血管单元由神经元、星形胶质细胞和血管组成。星形胶质细胞突起(processes)延伸到血管并与血管相互作用。星形胶质细胞末梢(endfeet)与作为血管壁组成部分的基底层紧密接触，并与内皮细胞一起形成血脑屏障(BBB)。在成年人脑中分离在神经原性龛(niche)以及血管周围具有迁移和归巢的能力、能够进一步分化成神经元和胶质细胞的干细胞，是开发新神经退行性细胞疗法的基础。
多巴胺(DA)是成体SVZ中的主要神经发生(neurogenesis)因子(Baker等人，2004)。SVZ与纹状体的接近使其成为纹状体-神经退行性相关疾患(如亨廷顿氏病(HD)和帕金森病(PD))的神经退行性疗法靶标。两种病理的表征在于运动功能障碍的不同临床症状，并且两者都被认为通过不同机制涉及SVZ-纹状体DA微环路(micro-circuitry)通路。在HD中发生的疾病产生的DA神经支配是一种天然的保护性反馈机制，以补偿由内在的遗传突变引起的纹状体固有神经元退行性病理(Parent M等人，2013)。DA受体D2的失调是模型小鼠中亨廷顿氏病病理的灵敏的量度(Crook等人，2012；Chen等人，2013)。相反，由于黑质纹状体区域的神经发生受损，PD与DA神经元的大量退行性相关，并且是病理的主要原因(Hoglinger等人，2004)。
初始炎症应答发生在体内，以限制外来细菌或病毒或寄生虫的侵入，并防护组织抵抗分子危害物，通过抗炎机制，所述分子危害物被进一步从生物体中去除。然而，慢性炎症(CI)是一把双刃剑。CI是持久性事件，并且它持续伤害并杀死健康细胞，例如在炎症成为自我维持的类风湿性关节炎中。
在神经退行性疾病中，蛋白的几种分子在细胞内紧密聚集在一起，病理学家称之为“淀粉样蛋白”结构，它们容易堵塞脑。这种蛋白存在于阿尔茨海默病中——淀粉样蛋白β和tau；帕金森病中——α突触核蛋白(alpha synuclein)和亨廷顿氏病中——亨廷顿蛋白。这些聚集体经常在脑中形成大的不溶性沉积物。然而，真正有毒性的被认为是这些蛋白的小的可溶性聚集体。由于这些聚集体在脑中的积累，慢性炎症反应存在于许多与年龄相关的神经退行性疾患中，这包括上述疾病(Nuzzo等人，2014)。
阿尔茨海默病(AD)携带者脑中的退化组织，存在的受损神经元和神经突、高度不溶性淀粉样蛋白β肽沉积物和神经元纤维缠结，为炎症提供了明显的刺激(Zotova等人，2010；Schott和Revesz，2013)。
许多研究提示，在AD中观察到的慢性炎症加速了疾病过程，甚至可能是一种疾病引发因素。头部损伤和全身感染的病史通常是引起脑部炎症的因素，并且已知是AD的风险因素。脑免疫细胞(胶质细胞)的过度作用是阿尔茨海默病的另一个标志。尽管已提示炎症与神经元的损伤和毒性相关，胶质细胞、神经元和淀粉样蛋白斑之间的关系仍然不清楚。胶质细胞释放的炎症介体(mediators)对神经元的毒性极大。因此，它们被认为是神经退行性介体。
当细胞具有免疫活性时，两种密切相关的炎症促进蛋白IL-12和IL-23是由小胶质细胞泵出的蛋白。研究表明，这些蛋白在AD患者的脑脊液中以升高的水平存在。在脑已经斑块化(plaque-ridden)的老年阿尔茨海默病小鼠中阻断这些炎症蛋白，降低了可溶的、毒性更强的淀粉样蛋白β形式的水平，并逆转了小鼠的认知缺陷(Vom Berg等人，2012；Griffin，2013)。
最近，已经描述了其它抗炎方法，如阻断蛋白NLRP3和小胶质细胞蛋白MRP14，并且似乎在相同的阿尔茨海默病小鼠模型中也作用良好。这些方法降低脑炎症、淀粉样蛋白β沉积和认知障碍。在遗传工程缺乏NLRP3的阿尔茨海默病小鼠中，小胶质细胞被逆转回非炎症状态，在这种状态下，它们消耗更多的淀粉样蛋白β并分泌神经元有益蛋白。在另一项研究中，靶向小胶质细胞蛋白MRP14，这也有助于将小胶质细胞逆转为非炎症状态(Heneka等人，2013；Zhang等人，2012)。
对AD至关重要的另一个因素是衰老。衰老可能通过加重与神经元相关的常见年龄相关问题来帮助引发阿尔茨海默病，神经元功能上缺陷并失去转运和妥当安置蛋白的能力。炎症通过增加炎症区域中淀粉样蛋白β的产生，使神经元应激，并加速其蛋白转运和处理系统与年龄相关的衰退而恶化该问题。炎症使小胶质细胞恢复炎症状态，从而降低其清理脑的能力(Swindell等人，2013)。
目前，假设炎症通过增加淀粉样蛋白β的产生而有助于启动AD过程。炎症似乎在AD中是自我维持的，因为它降低了小胶质细胞去除淀粉样蛋白β的能力。因此，淀粉样蛋白β的持续沉积不允许炎症消退(resolve)，这在老年AD携带者中变得更加严重(Akiyama等人,2000；Vom Berg等人,2012；Zang等人,2012；Griffin,2013；Heneka等人,2013；Swindell等人,2013；Schott和Revesz,2013)。
强烈提示炎症对亨廷顿氏病(HD)神经退行性的贡献；然而，在AD中研究较少(Soulet和Cicchetti，2011；Ellrichmann等人，2013)。因此，HD中免疫系统的活化通过促炎症细胞因子的升高表达得到明确证明，所述促炎症细胞因子对身体的免疫应答是至关重要的，如IL-6和TNF-α。在小鼠模型和有症状的以及症状发生前的HD患者中，这些促炎症细胞因子在纹状体、血浆和CSF中显著增加。此外，通过在HD患者和小鼠模型中的中枢(小胶质细胞)和外周先天免疫系统(单核细胞和巨噬细胞)的表达突变mHTT的骨髓细胞中升高IL-6的产生来检测先天免疫细胞过度活跃。据报道，在症状发作前许多年，携带HD基因的人的血液中存在异常高水平的细胞因子(等人,2008；等人,2014a,b)。细胞因子的组成和它们的表达水平(可以在患者的血液中测量)可以用于确定开始治疗干预的需要以及治疗的时间。
由于细胞内存在异常HD蛋白(亨廷顿蛋白)，在HD患者中血细胞以及脑中的小胶质细胞中过度活跃，因此提示异常免疫活化可能是HD中最早的异常之一。患者的血液特征可以提供对HD在脑中的作用以及HD严重程度标志物的新认识。异常免疫活化可能是旨在减缓HD的未来治疗的靶标(Soulet和Cicchetti，2011，Ellrichmann等人，2013)。
帕金森病的特征在于黑质中多巴胺能神经元的减缓和进行性退化。使用动物模型，研究人员获得了关于外周和中枢神经系统免疫成分涉及炎症应答的一致发现，炎症引发PD的免疫应答。持续和增加的促炎症机制的存在导致一种过程，其中细胞保护机制被克服，并且更多易感的细胞如多巴胺能神经元进入细胞死亡通路，这导致了一系列对PD进展至关重要的事件(Doursout等人，2013)。炎症应答也表现为胶质反应、T细胞浸润和炎症细胞因子的表达增加以及源自活化的胶质细胞的其它毒性介体，这是公知的PD的特征。然而，最近的体外研究提出，涉及到由受损多巴胺能神经元释放的介体所活化的小胶质细胞和随后的星形胶质细胞，即使它们不太可能是神经元损失的主要原因(Hirsch等人，2003)。在患者中，流行病学和遗传学研究支持神经炎症在PD病理生理学中的作用。尸检研究证实了PD患者受影响的脑区域中先天性和适应性免疫的参与。已经在患者的黑质中检测到活化的小胶质细胞和T淋巴细胞，伴随着促炎症介体的表达增加(Tufekci等人，2012；Hirsch等人，2012)。另一项研究在2008年至2012年间招募了87名帕金森病患者与37名健康对照，在常规血液检验中测量了炎症标志物，如C反应蛋白(CRP)、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α、嗜酸细胞活化趋化因子(eotaxin)、干扰素γ诱导的蛋白-10、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和巨噬细胞炎症蛋白1-β。所有参与者也都接受了体检。该研究表明，即使在控制了如年龄、性别和疾病持续时间的因素后，神经炎症程度与更严重的抑郁症、疲劳和认知障碍显著相关(Lindqvist等人，2013)。神经炎症过程可能代表神经保护的靶标，并且抗炎策略可能是PD治疗的主要方法之一。
已经检验了多种方法来修复神经退行性相关的CNS疾病，包括临床运动功能障碍疾病(Wernig M等人，2011)。用于神经再生细胞疗法的干细胞来源包括间充质干细胞(MSC)、神经祖细胞(NP)、人胎儿神经干细胞(huNSC)和多能干细胞(胚胎(ESC)和诱导(iPSC))。通过主要的细胞操作和/或高度介入性递送方法，大多数关于神经病症的细胞疗法的研究使用神经元样细胞。例如，WO 2008/132722和美国专利申请公开第2013/0344041号公开了遗传操作的干细胞以诱导干细胞特性或释放神经营养因子；WO 2009/144718和美国专利申请公开第2014/0335059号和第2014/0154222号公开了通过暴露于培养中的生物、天然或化学化合物，以高于非诱导阶段的水平诱导释放神经营养因子；以及其它研究使用胎儿干细胞的永生化细胞系，其表达神经元分化的早期标志物。尽管对干细胞疗法进行了研究，但没有数据显示通过静脉内(IV)注射的干细胞疗法可以在患有神经退行性疾病的脑室中通过BDNF的分泌或者D2的表达直接导致神经发生。
发明内容
在一些方面，本发明涉及未成熟牙髓干细胞(IDPSC)。
在一个实施方案中，本发明涉及人未成熟牙髓干细胞(hIDPSC)，其表达CD44和CD13并且缺乏CD146表达，其通过下述方法获得，所述方法包括：a)从人乳牙获得牙髓(DP)；b)采用含有抗生素的溶液洗涤DP，并将DP放入具有培养介质的容器中；c)在观察到hIDPSC的长出(outgrowth)和粘附后，将DP机械转移到另一个具有培养介质容器中，以建立外植体培养物；d)重复步骤b)和c)，收集表达CD44和CD13并且缺乏CD146表达的hIDPSC。
在另一个实施方案中，本发明涉及人未成熟牙髓干细胞(hIDPSC)，其表达CD44和CD13，并且缺乏CD146、HLA-DR和HLA-ABC表达，其通过下述方法获得，所述方法包括：a)从人乳牙获得牙髓(DP)；b)采用含有抗生素的溶液洗涤DP，并将DP放入具有培养介质的容器中；c)在观察到hIDPSC的长出和粘附后，将DP机械转移到另一个具有培养介质容器中，以建立外植体培养物；d)重复步骤b)和c)，收集表达CD44和CD13且缺乏CD146、HLA-DR和HLA-ABC表达的hIDPSC。
在一些方面，通过一种方法获得hIDPSC，所述方法进一步包括：e)通过免疫染色hIDPSC样品以检测CD44、CD13、CD146、HLA-DR和/或HLA-ABC，来证实hIDPSC中CD44和CD13的表达以及CD146的缺乏表达。
在其它方面，免疫染色涉及采用流式细胞术分析样品。
在某些实施方案中，步骤b)和c)重复超过5次，并且从5次转移DP后产生的外植体培养物中收集hIDPSC。在其它实施方案中，步骤b)和c)重复10次以上，并且从10次转移DP后产生的外植体培养物中收集hIDPSC。
在一个方面，外植体培养物包含半汇合的hIDPSC集落。在另一个方面，来自步骤c)的hIDPSC的外植体培养物在收集前传代。在另一个方面，hIDPSC的外植体培养物的传代包括hIDPSC的酶促处理和hIDPSC的转移以扩增外植体培养物。
在一些实施方案中，本发明的hIDPSC通过下述方法获得，所述方法包括：从牙齿中提取牙髓(DP)；在第一容器中的基础培养介质中培养DP，以建立DP外植体培养物，其中不与或与至少一种选自以下的细胞外基质成分一起培养DP外植体培养物：纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、聚赖氨酸、硫酸乙酰肝素蛋白多糖和enactin；将DP机械转移到第二容器中以建立第二DP外植体培养物；重复机械转移DP的步骤，直至建立至少15个DP外植体培养物；传代DP外植体培养物以产生传代DP培养物；并且将早期收获群和晚期收获群的传代DP培养物组合以产生药物组合物，其中早期收获群包括从前15个DP外植体培养物中的至少一个建立的传代DP培养物，并且晚期收获群包括从在第15个DP外植体培养物之后的DP外植体培养物中至少一个建立的传代DP培养物。在一些实施方案中，培养步骤在低氧条件下发生。在一些实施方案中，将早期收获群与晚期收获群的传代DP培养物组合以产生药物组合物的步骤包括：同时解冻早期收获群和晚期收获群的传代DP培养物的冷冻储备；合并解冻的传代DP培养物以产生药物组合物。
对于一些实施方案，在生产方法中在基础培养介质中培养DP持续至少三天，之后将DP机械转移。在一些实施方案中，生产方法进一步包括创建传代DP培养物的冷冻储备。在一些方面，传代DP培养物的冷冻储备在DP外植体培养物的第三代时创建。
在一些实施方案中，本发明涉及通过下述方法获得的hIDPSC，所述方法包括：从牙齿中提取牙髓(DP)；在第一容器中的基础培养介质中培养DP以建立DP外植体培养物，其中包含从神经嵴起源的组织富集的晚期收获的干细胞是CD44和CD13是双阳性的。在一些方面，从神经嵴起源组织所富集的以及CD44和CD13双阳性的干细胞是未成熟的牙髓干细胞(IDPSC)。
在一些实施方案中，本发明涉及通过下述方法获得的hIDPSC，所述方法包括：从牙齿中提取牙髓(DP)；在第一容器中在基础培养介质中培养DP以建立DP外植体培养物，其中，与从早期收获获得的干细胞相比，包含从神经嵴起源组织所富集的晚期收获的干细胞表现出内源性BDNF和/或其它神经营养因子(NF3、NF4和NF5)的分泌水平增加。在一些方面，从神经嵴起源组织所富集的、并且分泌高水平内源性BDNF和/或其它神经营养因子(NF3、NF4和NF5)的干细胞是未成熟的牙髓干细胞(IDPSC)。
在其它实施方案中，本发明的hIDPSC是通过产生hIDPSC的方法所获得的，所述hIDPSC表达CD44和CD13且缺乏CD146表达，这使得hIDPSC能够穿过BBB，和/或所述hIDPSC缺乏CD146、HLA-DR和/或HLA-ABC的表达，这防止了免疫细胞对hIDPSC的排斥。
在一个实施方案中，通过产生表达至少一种安全标志物的干细胞的方法获得本发明的hIDPSC，所述安全标志物选自ATP结合盒亚家族G成员2(ABCG2)、p53和非活性nanog。非活性nanog是主要定位于干细胞的细胞质表达的nanog。在一些方面，至少75％的干细胞表达ABCG2、至少75％的干细胞表达p53或不超过5％的干细胞表达非活性nanog。一些干细胞进一步表达安全标志物SOX2。在一些这样的实施方案中，不超过30％的干细胞表达SOX2。
还通过产生干细胞的方法获得本发明的hIDPSC，所述干细胞可以进一步分泌至少一种选自以下的标志物：脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养素-3(NT3)、神经营养素-4(NT4)、神经营养素-5(NT5)和p75。在一些这样的实施方案中，药物组合物的干细胞表达BDNF、NT3、NT4、NT5和p75(CD271)。
在另一个实施方案中，通过产生干细胞的方法获得本发明的hIDPSC，所述干细胞表达至少一种选自BDNF、NT3、NT4、NT5和p75的神经上皮干细胞标志物。在一些方面，通过本发明的方法产生的干细胞表达BDNF、NT3、NT4、NT5和p75。这些细胞可以进一步表达至少一种选自ABCG2、非活性nanog、p53和SOX2的安全标志物。在一些方面，当至少一种标志物是ABCG2时，至少75％的干细胞表达至少一种标志物。在一些方面，至少75％的干细胞表达p53。在一些方面，不超过5％的干细胞表达非活性nanog。在一些方面，不超过30％的干细胞表达SOX2。
在一个实施方案中，本发明涉及干细胞，其中干细胞包含从神经嵴起源的组织所富集的晚期收获。在一些实施方案中，神经嵴起源的组织是牙髓。在一些方面，从神经嵴起源的组织所富集的干细胞是未成熟的牙髓干细胞(IDPSC)。从神经嵴起源的组织所富集的早期收获干细胞包含前十五个或前25个收获周期的IDPSC，而晚期收获干细胞包含来自六十个或更后的或者第二十六或更后的收获周期的IDPSC。
在其它实施方案中，本发明包含这样一种hIDPSC，其表达CD44和CD13且缺乏CD146表达，这使得其能够穿过BBB，和/或其缺乏CD146、HLA-DR和/或HLA-ABC的表达，这防止了免疫细胞对hIDPSC的排斥。
在一个实施方案中，本发明涉及表达至少一种安全标志物的干细胞，所述安全标志物选自ATP结合盒亚家族G成员2(ABCG2)、p53和非活性nanog。非活性nanog是主要定位于干细胞的细胞质表达的nanog。在一些方面，至少75％的干细胞表达ABCG2，至少75％的干细胞表达p53，或不超过5％的干细胞表达非活性nanog。一些干细胞还表达安全标志物SOX2。在一些这样的实施方案中，不超过30％的干细胞表达SOX2。
本发明的干细胞可以进一步分泌至少一种选自以下的标志物：脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养素-3(NT3)、神经营养素-4(NT4)、神经营养素-5(NT5)和p75。在一些这样的实施方案中，药物组合物的干细胞表达BDNF、NT3、NT4、NT5和p75(CD271)。
在另一个实施方案中，本发明的干细胞表达至少一种选自BDNF、NT3、NT4、NT5和p75的神经上皮干细胞标志物。在一些方面，通过本发明的干细胞表达BDNF、NT3、NT4、NT5和p75。这些细胞可以进一步表达至少一种选自ABCG2、非活性nanog、p53和SOX2的安全标志物。在一些方面，当至少一种标志物是ABCG2时，至少75％的干细胞表达至少一种标志物。在一些方面，至少75％的干细胞表达p53。在一些方面，不超过5％的干细胞表达非活性nanog。在一些方面，不超过30％的干细胞表达SOX2。
在一些实施方案中，本发明涉及包含根据本文公开的方法产生的hIDPSC的组合物。
在一些实施方案中，本发明涉及包含本文公开的hIDPSC的组合物。
在其它实施方案中，本发明涉及用于治疗神经疾病或病症的药物组合物，所述神经疾病或病症选自帕金森病(PD)、多发性硬化、癫痫、肌萎缩侧索硬化(ALS)、中风、局部缺血、自身免疫性脑脊髓炎、糖尿病性神经病变、青光眼性神经病变，阿尔茨海默病、亨廷顿氏病(HD)、自闭症、精神分裂症、运动疾患和惊厥疾患。
本发明进一步涉及用于向受试者全身施用以治疗神经病症的药物组合物。神经疾病或病症可以是神经退行性疾病或病症、自闭症、精神分裂症、癫痫、中风、局部缺血、运动疾患或惊厥疾患。神经退行性疾病或病症可以是帕金森病(PD)、多发性硬化、癫痫、肌萎缩侧索硬化(ALS)、中风、自身免疫性脑脊髓炎、糖尿病性神经病变、青光眼性神经病变，阿尔茨海默病或亨廷顿氏病(HD)。
本发明还涉及使用本发明的hIDPSC和/或药物组合物治疗神经疾病或病症的方法。
本发明还涉及治疗神经疾病或病症的方法，其包括向受试者施用本发明的hIDPSC和/或药物组合物。
在一些实施方案中，本发明的hIDPSC和/或药物组合物的施用是全身的，并且被施用于有需要的受试者。
在本发明的一些实施方案中，这种方法支持在诊断患有早期HD的受试者中的天然神经保护机制，或者在诊断患有PD的受试者中修复损失的DA神经元。这种方法还可以用作具有HD风险的受试者的预防性治疗。
在所述方法的一个实施方案中，通过穿过血/脑屏障(BBB)并诱导神经发生的本发明干细胞和/或药物组合物治疗神经疾病或病症。在一些方面，在穿过BBB后，将hIDPSC直接移植到脑实质中，包括纹状体。在一些实施方案中，诱导的神经发生是多巴胺相关的。例如，多巴胺相关的神经发生通过干细胞的自我分化或通过外源性干细胞对固有干细胞的迁移和分化的活化而发生。在一些方面，大量多巴胺相关的神经发生在脑室下区(SVZ)发生。
在所述方法的一些实施方案中，hIDPSC和/或药物组合物提供神经保护。例如，采用药物组合物干细胞的高基础水平的神经营养和免疫保护因子表达以及释放模式，提供了全身神经保护。在一些方面，这些药物组合物的干细胞是IDPSC。
在一些实施方案中，所述方法还包括测量受试者中DA受体的量。在一些方面，DA受体是受体D2。在一些实施方案中，测量受试者中DA受体(例如受体D2)的量，包括使受试者成像以检测DA受体的存在。
在一些方面，受试者被施用单次施用药物组合物，或者第一次和第二次施用药物组合物。在第一次施用后至少7天、至少14天、至少21天或至少30天进行hIDPSC和/或药物组合物的重复(1至6次)施用，以及每年一次或每年两次。在一些实施方案中，hIDPSC和/或药物组合物的施用是通过静脉内注射的。在一些实施方案中，可每年重复施用药物组合物，例如，重复三次。
在所述方法的一些实施方案中，hIDPSC和/或包含干细胞的药物组合物包含受试者自体的干细胞。例如，鉴于大多数这些疾病是遗传性和年龄依赖性的，在受试者表现出疾病之前从偶发的“健康细胞”中收集来自受试者自体干细胞。在其它实施方案中，hIDPSC和/或包含受试者同种异体的hIDPSC的药物组合物，而无论干细胞表达的主要组织相容性复合物是否与受试者表达的主要组织相容性复合物相匹配。药物组合物还可以包含受试者自体的干细胞和受试者同种异体的干细胞的组合。
在一个方面，本发明涉及防止受试者的中枢神经系统(CNS)中神经元损失的方法，所述方法包括向受试者施用hIDPSC和/或包含hIDPSC的药物组合物，其中hIDPSC表达CD44和CD13。
在另一个方面，本发明提供了促进受试者的CNS中神经元细胞生长和修复的方法，所述方法包括向受试者施用hIDPSC和/或包含hIDPSC的药物组合物，其中hIDPSC表达CD44和CD13。
在另一个方面，本发明涉及增加受试者CNS中多巴胺和cAMP调节的神经元磷蛋白(DARPP-32)、多巴胺受体D2和/或脑源性神经营养因子(BDNF)表达的方法，所述方法包括向所述受试者施用hIDPSC和/或包含hIDPSC的药物组合物，其中所述hIDPSC表达CD44和CD13。
在某些方面，hIDPSC和/或药物组合物的施用是全身的。在一个方面，全身施用是静脉内或腹膜内的。
在其它方面，本发明涉及hIDPSC和/或包含表达CD44和CD13的hIDPSC的药物组合物，其用于治疗选自以下的神经疾病或病症：帕金森病(PD)、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化(ALS)、中风、自身免疫性脑脊髓炎、糖尿病性神经病变、青光眼性神经病变、阿尔茨海默病、亨廷顿氏病(HD)、自闭症、精神分裂症、中风、局部缺血、运动疾患和惊厥疾患。
在其它方面，本发明涉及hIDPSC和/或包含表达CD44和CD13的hIDPSC的药物组合物用于治疗选自以下的神经疾病或病症的用途：帕金森病(PD)、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化(ALS)、中风、自身免疫性脑脊髓炎、糖尿病性神经病变、青光眼性神经病变、阿尔茨海默病、亨廷顿氏病(HD)、自闭症、精神分裂症、中风、局部缺血、运动疾患和惊厥疾患。
本发明还涉及使用本发明的hIDPSC和/或药物组合物制备治疗神经疾病或病症的药物的方法。
附图说明
图1描述了来自早期和晚期收获的hIDPSC的免疫表型。收获0-10被定义为早期收获。超过10次收获的所有收获都被定义为晚期收获。
图2描述了晚期收获(13次收获)和第3代的IDPSC。细胞的P75(CD271)(A、C、D)、巢蛋白(E-G)、CD13(H)和CD73(I)免疫阳性，并且细胞不与CD146(J)和HLA-ABC(K)反应。插图描述了各自第二抗体的对照。A-G光学显微镜。H-L落射荧光。放大倍数：A、J-20×；C、E-G、H、I、L-10×；D、K-40×。
图3描述了a)在T20第3代以一式三份进行的CFU-F测定，表明LP群的IDPSC的高克隆形成能力。b)和c)进行FACS分析以显示LP(晚期群)IDPSC(批次#11)包含约80％表达BDNF和DARPP32的细胞，而EP早期群IDPSC的这些标志物是阴性的(数据未显示)以及包含很少数表达D2的细胞。
图4A描述了采用第二抗体的对照细胞中BrdU(B-J)的阳性免疫染色。图4B和图4C描述了与BrdU抗体阳性反应的LP(晚期群)IDPSC的定量。(A)-落射荧光，(B)和(C)-FACS分析。放大倍数(A)-200×。(B、E和H)-400×。(C、F、I、D、G和J)-1000×。
图5描述了在重编程(reprogramming)hIDPSC之前(黑色)和之后(白色)以及人胚胎干细胞(hESC)(条纹)中观察到的内源Oct4、Nanog和Sox2基因表达的定量PCR。
图6描述了通过流式细胞术定量EP(早期群)和LP(晚期群)IDPSC中的GFAP(胶质纤维酸性蛋白)和β-III-微管蛋白表达。
图7描述了EP(早期群)和LP(晚期群)hIDPSC的流式细胞术分析。在体外DP收获和hIDPSC传代后观察到CD146和CD13表达的变化。对于EP-hIDPSC，观察到～33％的CD146阳性细胞，而对于LP-hIDPSC，少于1％的细胞对该标志物呈阳性。对于EP-hIDPSC，观察到～52％的CD13阳性细胞，而对于LP-hIDPSC，95％的细胞对该标志物呈阳性。
图8描述了从C57BL-6小鼠的牙髓分离的IDPSC的免疫染色。IDPSC的Oct4(A-B)呈阳性，其表达主要定位于核中。细胞的Nanog也是阳性的，尽管仅在(C)中表达。在Nanog+细胞中观察到对称分裂(D)。两种Sox2+IDPSC和一种Sox2-细胞由对称和不对称分裂产生(E)。可以观察到对称分裂的Sox2+细胞的核蛋白定位(F)。Sox2+细胞的不对称分裂更多的定型(committed)子细胞损失Sox2表达(G)。A-C：200×。D-G：400×。
图9描述了视叶中的对称至不对称的神经干细胞分裂的转换。
图10描述了在不同培养介质中在塑料基质上生长7天的IDPSC中未分化的LSC和分化的角膜细胞蛋白(作为缘神经外胚层谱系的示例)的表达。在Epilife、DMEM/KO、KSFM和SHEM培养介质中培养的IDPSC缺乏ABCG2(A1-A4)的表达。然而，在DMEM/F12(也称为基础培养介质(A5))中培养的IDPSC中检测到ABCG2的表达。这些细胞发展成纤维细胞样形态。在Epilife、KSFM和DMEM/F12中培养的IDPSC缺乏CK3/12(B1、B3、B5)的表达。然而，DMEM/KO和SHEM培养的IDPSC表达CK3/12并且具有上皮细胞样形态(B2、B4)。落射荧光(EF)。核采用DAPI(蓝色)染色。比例尺：A1-A4、B1、B2和B4为10μm；A5、B3和B5为5μm。
图11描述了在羊膜(AM)上的不同培养介质中在7天期间生长的IDPSC中未分化的LSC和分化的角膜细胞标志物的表达。在DMEM/F12、SHEM、KSFM和DMEM/KO培养介质中生长的IDPSC中检测到波形蛋白(A和A1-A3)。在基础培养介质和SHEM中生长的IDPSC中检测到ABCG2(B和B1)，但在KSFM和DMEM/KO中生长的IDPSC中未检测到(B2和B3)。在DMEM/F12、SHEM和KSFM中培养的IDPSC未检测到CK3/12表达(C、C1和C2)。在DMEM/KO中生长的IDPSC中检测到一些表达CK3/12的IDPSC(C3)。这些表达CK3/12的IDPSC具有成纤维细胞样形态。核采用DAPI染色(蓝色)。EF。比例尺：A1-A4、B1、B2、B4＝10μm；A5、B3、B5＝5μm。
图12描述了试验用药品CELLAVITATM(干细胞)的药理学功效研究。
图13描述了包含适合治疗神经疾病和病症的早期和晚期群的IDPSC的IDPSC组合物的制造过程的方案。
图14描述了hIDPSC在人疾病的动物模型中局部施用之前的长期低温保存、之后解冻和运输期间，其稳定性研究的时间表。
图15描述了HD疾病模型中的中试研究的时间表。通过施用3-NP，在前4天，第0天(D0)至第4天(D4)期间诱导HD。在第5天(D5)，通过静脉内注射施用IDPSC移植。在第9天(D9)使动物安乐死，然后固定脑组织并对病变进行组织学分析，以检测IDPSC的生物分布和植入(Vybrant+使用特异性抗体的免疫组织化学)。
图16描述了HD疾病模型中组I研究的时间表。在前4天，第0天(D0)至第4天(D4)期间诱导HD。在第5天(D5)，通过静脉内注射施用IDPSC移植。在第35天(D35)使动物安乐死，然后固定脑组织并对病变进行组织学分析，以检测IDPSC的生物分布和植入(使用特异性抗体的Vybrant+免疫组织化学)。
图17列出了用于评价3-NP诱导的神经退行性过程的“全局生物标志物”(即国际上接受的)以及IDPSCw移植对该过程的作用。
图18描述了用于评价神经退行性的标志物的定位。红色圆圈指向HD病变的常见位置并形成瘢痕组织，其标记为胶原蛋白I的阳性表达。在健康区域中，可观察到GABA能和受体D2蛋白的表达。通过使用免疫组织化学检测人核并使用免疫荧光共定位CD73和hIDPSC来显示IV施用后hIDPSC的植入。
图19描述了静脉内注射入动物后hIDPSC的植入。光学切片表明在不同的焦深(A1-A4)存在具有Vybrant(绿色)染色的IDPSC，核采用PI(红色)进行染色。细胞表现出毛细血管主要相关以及不同的形态类型：神经元样细胞和周细胞(A6)。在A2-A4上，可以观察到沿着毛细血管的不同位置的两个周细胞，并且两者均表现类似的形态。在A4显示了轴突分支。A5表现A2-A4中显示的脑组织内神经元形态的图示。神经元核用核仁点亮显示(light)，可以观察到与被强染色的核的差异。共聚焦显微镜的人造蓝色。落射荧光+数字干涉对比(DIC)，比例尺＝10μm。
图20描述了IV施用后4天hIDPSC的植入。光学切片表明采用Vybrant(绿色)染色的hIDPSC，并且与抗hIDPSC抗体(红色)阳性反应。两者的叠加产生黄色。细胞表现出接近毛细血管定位。使用MSC的两种标志物：CD73和CD105，表明与hIDPSC的阳性反应(A-D)。E.体外培养的阳性对照hIDPSC。共聚焦显微镜。落射荧光+数字干涉对比(DIC)。比例尺：A＝5μm；B＝10μm；C＝20μm；D＝5μm。
图21描述了使用抗人核(hNu)抗体的免疫组织化学结果。在大鼠脑的皮质中可以观察到很少的hIDPSC细胞，而在纹状体中可以观察到许多细胞。光学显微镜。90×。比例尺：5μm(左)和25μm(右)。
图22描述了使用抗人核(hNu)抗体，注射IDPSC后30天的脑的免疫组织化学结果。蓝色圆圈指向表现三角形神经元样主体的细胞。三角形主体的细胞的尺寸表示细胞是“神经元”。白色圆圈指向成纤维细胞样细胞。光学显微镜。90×。
图23描述了使用抗人核(hNu)抗体的脑的免疫组织化学结果。在蓝色圆圈中显示了定位于纹状体和SVZ中的hIDPSC。光学显微镜。90×
图24描述了在hIDPSC移植后30天CELLAVITATM(干细胞)处理的动物中的神经元的阳性DARPP32免疫染色(A、B)未处理的动物(3-NP+盐水)在纹状体或皮质中未显示DARPP32免疫染色。(C，D)在hIDPSC处理的动物的皮质和纹状体中产生大鼠神经元。蓝色圆圈，(C)具有神经元的区域和(D)更高放大倍数。光学显微镜。放大倍数：20×和90×。
图25描述了在施用IDPSC之前和施用IDPSC 30天之后HD大鼠模型的纹状体中受体D2的表达。来自具有评分3和2的动物的样品，其是采用3-NP处理但未接受IDPSC处理的动物。在评分2的样品中，仅可观察到一些受体D2阳性细胞，而在评分3的样品中未观察到这样的细胞。来自具有评分为1的动物的样品，其是采用3-NP和IDPSC处理的动物。在评分1的样本中，可见许多受体D2阳性细胞。高放大倍数的插图显示了免疫染色和神经元形态的细节。
图26描述了组II和III的实验设计，以研究在HD疾病模型中多次IDPSC移植和升高的细胞剂量的作用。
图27描述了如何确定由3-NP诱导的HD大鼠的运动退化程度的示例性方案。
图28描述了在3-NP诱导之前、3-NP诱导之后(第4天)和采用IDPSC(hIDPSC)处理之后的中试研究动物的体重。
图29描述了在3-NP诱导之前和3-NP诱导之后的组II和组III动物的体重。
图30描述了3-NP诱导后和采用hIDPSC处理后30天的组II动物的体重。
图31描述了3-NP诱导后和采用hIDPSC处理后30天的组III动物的体重。
图32描述了HD疾病模型(组I、II、III和IV)中的中试研究的时间表。在前4天，第0天(D0)至第4天(D4)期间，通过3-NP诱导HD。在第5天(D5)，通过静脉内注射施用IDPSC移植。在第9天(D9)使动物安乐死，然后固定脑组织并对病变进行组织学分析，以检测IDPSC的生物分布和植入(Vybrant+使用特异性抗体的免疫组织化学)。在第35天(D35)使组I和组III安乐死，以及在第95天使组II和组IV安乐死，然后固定脑组织并对病变进行组织学分析，以检测IDPSC的生物分布和植入(Vybrant+使用特异性抗体的免疫组织化学)。
图33表现了hIDPSC施用后4天hIDPSC在大鼠脑组织中的定位。将hIDPSC细胞染成绿色(Vybrant)并将核染成红色(PI)(A1-A4)。细胞主要定位于毛细血管，观察到两种形态类型：神经元样细胞和周细胞。注意到A2、A3和A4中毛细血管中周细胞的不同定位；在A4中，hIDPSC定位于轴突分叉处。A5：脑组织中的神经元形态(A2-A4)；A6：显示周细胞定位的脑毛细血管示意图。共聚焦显微镜。落射荧光+数字干涉对比(DIC)显微镜。比例尺＝10μm。
图34描述了IV施用后4天hIDPSC的植入。光学切片表明采用Vybrant(绿色)染色的hIDPSC，并且与抗hIDPSC抗体(红色)阳性反应。两者的叠加产生黄色。细胞表现出接近毛细血管定位。使用MSC的两种标志物：CD73和CD105，表明与hIDPSC的阳性反应(A-D)。E.体外培养的阳性对照hIDPSC。共聚焦显微镜。落射荧光+数字干涉对比(DIC)。比例尺：A＝5μm；B＝10μm；C＝20μm；D＝5μm。
图35描述了免疫组织化学图像，其显示hIDPSC施用后30天hIDPSC的阳性抗人核(hNu)染色及其在大鼠脑组织中的定位。注意：皮质中的一些hIDPSC(左)和纹状体中的大量hIDPSC(右)。光学显微镜。90×放大倍数。比例尺：分别为5μm和25μm。
图36显示注射3-NP和施用hIDPSC后大鼠脑组织的免疫组织化学图像。注意：细胞中的阳性抗人核(hNu)免疫染色。神经元样细胞用蓝色圈出，成纤维细胞样细胞用白色圈出。光学显微镜，90×放大倍数。
图37描述了未处理动物(3-NP+盐水)(a-b1)；对照动物(无3-NP或hIDPSC)(c、c1)；和处理的动物(3-NP+hIDPSC)(d-f1)的纹状体中的尼氏染色。在实验组中观察到不同的评分：评分1(a、a1、d和d1)；评分2(b、b1、e和e1)；评分3(c、c1、f和f1)。广泛退化的区域(a、a1)；严重(d、d1)、中度(b、b1、e和e1)、轻度(f、f1)和无(c、c1)神经元损失。放大倍数：10×(a-f)和20×(a-f1)。(b、c、e和f)中的插图显示典型的尼氏染色的神经元形态(40×)。光学显微镜(a-f)。
图38描述了未处理动物(3-NP+盐水)(a-b)、对照(无3-NP或hIDPSC)(c)和处理动物(3-NP+hIDPSC)(d-e1)的纹状体中DARPP32免疫染色。在(a)中没有免疫染色(蓝色箭头，评分1)，(b)一些DARPP32+细胞(评分2)，和(c)显示阳性DARPP32免疫染色的对照动物(无3-NP或hIDPSC)(评分3)。在(d、d1)中，处理动物(3-NP+hIDPSC)中的神经元损失，具有一些DARPP32染色的细胞(评分2)(黑色箭头)。在(e、e1)中，强抗DARPP-32免疫染色(评分3)。插图(a、b、c、d1)显示DARPP32+神经元(黑色箭头)(40×)。HE(苏木精和伊红)染成蓝色的核。放大倍数：10×(a、c、d和e)和20×(d、e1)。
图39描述了hIDPSC后大鼠纹状体中的神经元生长。施用hIDPSC在hIDPSC处理的动物中导致神经修复作用，(A)尼氏染色和(B)DARPP32表达。(C)与对照相比，在施用hIDPSC后显示神经元恢复的动物数量。大多数hIDPSC处理的动物(3-NP+hIDPSC)具有评分3和2(中度和轻度)，而大多数未处理的动物(3NP+盐水)具有评分2和1(严重和中度)。
图40描述了3-NP注射后(a-f)和CELLAVITATM(干细胞)施用后(g-j)大鼠脑组织中的BDNF表达(a、b)。3-NP注射后7天缺乏BDNF表达(c，d)，30天后低表达(e，f)。对照动物(无3-NP或CELLAVITATM(干细胞)。CELLAVITATM(干细胞)施用后7天(g、h)和30天(i、j)的BDNF表达。放大倍数：10×(a、c、e、f、g和h)和20×(b、d、i和j)。
图41描述了在3-NP HD模型中施用CELLAVITATM(干细胞)30天后大鼠纹状体中DARPP32的表达。共聚焦显微镜，A重叠图像。落射荧光+数字干涉对比(DIC)显微镜。B-D：落射荧光。比例尺：10μm。
图42描述了hIDPSC施用对经处理的(3-NP+hIDPSC)和未处理的动物(3-NP+盐水)的体重的作用。在3-NP施用之前和之后4天以及每次施用hIDPSC之后(每30天)记录体重。在3-NP施用后30、60和90天，在3NP处理的动物中未观察到体重增加。在第一次施用hIDPSC后，hIDPSC处理的动物(1×106剂量)的体重增加。
图43描述了在hIDPSC静脉内移植后4天，3-NP处理的动物的脑中BDNF表达的代表图。在皮质中观察到强的BDNF分泌(1a、1b)。海马体中显示较低的BDNF分泌(1c、1d)。在纹状体中观察到强的BDNF表达(1e、1f)。对照3-NP组在相同脑区域中未显示BDNF分泌(2a-2f)。光学显微镜。在1a、1c、1e、2a、2c、2e中放大倍数为20×；在1b、1d、1f、2b、2d、2f中放大倍数为40×。1b和1d中的箭头和1e和1f中的星号表明分泌BDNF的细胞。核采用HE(苏木精和伊红)复染。
图44描述了在hIDPSC静脉内移植后30天在3-NP处理的动物的脑中代表性BDNF表达。在皮质中观察到强的BDNF分泌(1a、1b)。在海马体中观察到较低的BDNF分泌(1c、1d)。在纹状体中观察到强的BDNF表达(1e、1f)。对照3-NP组在相同脑区中未显示BDNF分泌(2a-2f)。光学显微镜。在1a、1c、1e、2a、2c、2e中放大倍数为20×；在1b、1d、1f、2b、2d、2f中放大倍数为40×。1b和1d中的箭头和1e和1f中的星号表明分泌BDNF的细胞。
图45描述了所有HD疾病模型研究的实验设计，以评价IDPSC移植后HD诱导的大鼠的功能表征。
图46描述了正常MSC和ES(或iPS)细胞之间的主要差异。肿瘤形成与ES和iPS细胞相关，但与正常MSC无关。
图47描述了hIDPSC在诱导神经发生和提供神经保护中的功效机制的方案。
图48描述了CELLAVITATM(干细胞)分离和批量制剂的早期阶段开发过程。
图49描述了CELLAVITATM(干细胞)的另一种早期阶段开发制造方法。
图50描述了由几个主要步骤组成的CELLAVITATM(干细胞)生产过程。
图51描述了试验用药品CELLAVITATM(干细胞)的安全研究。
具体实施方式
如本文所使用的，如在本说明书和权利要求中使用的动词“包括”及其词形变化以其非限制性含义使用，意味着包括该词后面的项目，但不排除未具体提及的项目。此外，通过不定冠词“一”或“一个”引用一个元素并不排除存在多于一个元素的可能性，除非上下文明确要求存在一个且仅一个元素。因此，不定冠词“一”或“一个”通常意味着“至少一个”。
如本文所使用的，关于细胞群中一种基因的表达水平的术语“高表达”(对于感兴趣的抗原，强免疫阳性)是指该群的至少75％表达该基因。
如本文所使用的，关于细胞群中一种基因的表达水平的术语“低表达”是指不超过该群的30％表达该基因。在优选的实施方案中，低表达是指不超过该群的25％表达该基因。
如本文所使用的，关于细胞群中一种基因的表达水平的术语“不表达”是指在群中没有表达感兴趣基因的可检测细胞。无可检测的表达包括在测量表达的方法的误差范围内的表达水平。
如本文所使用的，术语“受试者”或“患者”是指任何脊椎动物，包括但不限于人和其它灵长类动物(例如，黑猩猩和其它猿和猴物种)、农场动物(例如，牛、绵羊、猪、山羊和马)、驯养哺乳动物(如狗和猫)、实验动物(例如啮齿类动物，如小鼠、大鼠和豚鼠)和禽类(如驯养、野生和猎禽，如鸡、火鸡和其它鹑鸡类禽、鸭、鹅等)。在一些实施方案中，受试者可以是哺乳动物。在其它实施方案中，受试者可以是人。
如本文所使用的，术语“干细胞”是指未成熟的、非特化的(unspecialized)细胞，其在某些条件下可分化成成熟的功能细胞。
如本文所使用的，术语“神经干细胞”或“NSC”是指多能细胞，其可自我更新并且能够终末分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。
如本文所使用的，术语“神经祖细胞”是指沿细胞分化阶段比神经干细胞更进一步的未分化细胞。因此，这些细胞源自神经干细胞，并且可以产生能够分化成中枢神经系统(CNS)和外周神经系统(PNS)的多于一种细胞类型的后代。
如本文所使用的，术语“神经前体细胞”或“NPC”是指由神经干细胞及其所有未分化后代组成的混合细胞群。因此，NPC包括NPC和NSC。NPC还可以分为神经元NPC和胶质NPC，它们分别产生神经元和胶质细胞。
如本文所使用的，术语“收获周期”包含在组织中的干细胞粘附和长出之后将器官(例如，神经嵴起源如牙髓)或组织转移至新的细胞培养容器，之后保存(例如，低温保存)和/或继代培养(sub-culturing)长出的IDPSC。使用外植体技术从器官培养物(牙髓)第一次分离的干细胞是早期群，因此从第一个收获周期分离的干细胞是早期群细胞(器官培养物的第一次转移)。例如，干细胞从牙髓组织中分离，来自人脱落的乳牙(SHED)的干细胞不能分为早期和晚期群，因为这些细胞仅使用酶促方法从牙髓中分离一次，在SHED分离后丢弃。因此，只能分离出一种SHED细胞群。此外，在酶促消化后，SHED可以从一个细胞培养瓶传递到另一个细胞培养瓶，从而计数细胞传代，这一般在SHED达到半汇合时进行。
与SHED不同，未成熟牙髓干细胞(IPDSC)不使用酶促方法。在DP首次粘附于塑料和细胞长出后(早期群细胞)，可以从牙髓的外植体培养物中分离IDPSC。在此阶段，牙髓不被丢弃并用于随后的外植体牙髓培养-晚期群。因此，从第二个或更后的收获周期分离的IDPSC是晚期群细胞。例如，从第二个或更后的收获周期分离的IPDSC是晚期群未分化的干细胞。如本文所使用的，术语“早期传代”是指来自外植体培养物的前五代的细胞。如本文所使用的，术语“晚期传代”是指第五代后传代的细胞，例如，第六代或更后的外植体培养物。因此，IDPSC可以来自早期或晚期群，并且此外被分类为早期或晚期传代。
本发明涉及这样的发现：一种IDPSC的特定组合物，即由早期和晚期干细胞群组成的来自神经嵴起源组织的独特干细胞群，其可以穿过血/脑屏障(BBB)并诱导神经发生。神经嵴起源的组织包括例如牙齿、牙周和毛囊组织。毛囊组织包括触须的囊组织。
在3-NP(三硝基丙酸)HD大鼠模型中评价hIDPSC。在静脉内注射采用荧光蛋白(Vibrant)标记的1×106和1×107个细胞/移植(3×106个细胞/kg和3×107个细胞/kg)后1个月后，以及使用特异性抗人抗体进行疫组织化学分析后，显示hIDPSC植入大鼠脑中。在不同的脑室(皮质、纹状体和脑室下区-SVZ)中观察到细胞植入。
穿过BBB的能力使得治疗神经病症的干细胞疗法的全身施用(例如IV施用)成为可能，这提供了相比局部施用方法的更显著的优势。除了全身施用介入性较小外，使干细胞迁移到需要帮助的位置可降低在施用部位发生有害细胞团块的风险。例如，尽管在临床前和临床研究中通常考虑鞘内(IT)施用干细胞疗法，当干细胞是MSC时，所述方法可能具有显著的风险。据报道，根据细胞密度，通过脑室内(ICV)进入脑实质的骨髓来源的MSC在64％的严重实验性变应性脑脊髓炎动物中形成细胞团块(推测是对来自该炎症的化学引诱信号的应答)。早期传代的核型正常MSC也在初始动物中诱导团块(Grigoriadis等人，2011)。因此，直接植入CNS内的MSC本身产生尚且未知的后果的局部病理(Snyder等人，2011)。这些团块的体积似乎与细胞密度相关。因此，与IV相比，IT和ICV应用的细胞数量和应用数量可能是有限的并且是风险因素。
IDPSC的组合物可以是包含表达间充质和神经上皮干细胞免疫表型的干细胞的药物组合物的形式。在一些实施方案中，表达的间充质和神经上皮干细胞分子谱是MSC和神经上皮细胞/祖细胞的标志物以及编码神经保护和免疫保护因子的基因的表达。
表达MSC免疫表型的细胞包括CD44的表达。先前的多发性硬化动物模型发现NCS粘附于发炎的内皮细胞，然后穿过BBB进入发炎的CNS区域的跨内皮迁移，这依次由功能性细胞粘附分子(CAM)的组成型表达介导，尤其是CD44(Rampon C等人，2008)。尽管hIDPSC如何能够穿过BBB的确切机制尚不清楚，但相信这些细胞具有这种能力，因为它们具有周细胞(perycite)样表征(Barros等人，2014)。已知周细胞在神经血管单元中整合内皮和星形胶质细胞的功能以及调节BBB中起关键作用(Armulik等人，2010；Liu等人，2012)。根据之前的研究(Yilmaz等人，2011)，由于CD44的表达，间充质干细胞(MSC)可以在全身施用后植入脑中，CD44是E和L血管内皮选择蛋白的配体(Dimitroff等人，2001)。MSC表现与白细胞类似的归巢机制。白细胞迁移的第一步涉及在血流中捕获自由流动的白细胞，其由称为选择蛋白的糖蛋白介导。P选择蛋白和E选择蛋白由血管内皮表达，并且是白细胞通过血管迁移时的滚动应答的主要介体(Luster等人，2005)。MSC可以使用这种或类似的机制植入几种器官(Sackstein等人，2008)，如脑。因此，CD44被认为是MSC迁移到脑的关键因素。与BM MSC类似，hIDPSC表达CD44，这提示CD44还涉及hIDPSC向几种器官的迁移(Barros等人，2014，Castanheira等人，2013)，包括静脉内施用后的脑。令人惊讶的是，hIDPSC还表达了CD13(氨肽酶N)(Kerkis等人，2006；Kerkis和Caplan，2012)，其是多功能蛋白，在细胞迁移、细胞增殖、细胞分化中起着不同的作用(Taylor等人，1993；Mina-Osorio等人，2008a/b)。在毛细血管形成过程中，CD13参与血管生成产生和调节血管生成信号，并作为血管生成的血管的标志物(Bhagwat等人，2001)。这提示它可能在hIDPSC迁移和靶向脑血管系统的能力中起作用。在3-NP大鼠研究中，hIDPSC显示与脑毛细血管紧密相关。
在一些实施方案中，IDPSC缺乏CD146、HLA-DR和/或HLA-ABC的表达。缺乏这些标志物的表达有助于使用hIDPSC作为安全的异源性疗法。内皮在分子的交换中起重要作用，也在血液和下层组织之间的免疫细胞中起重要作用。内皮分子S-Endo 1抗原(CD146)优先位于内皮连接处，并且已被声称支持内皮完整性。因此，在人中，MCAM(CD146)在健康个体的外周循环中的T细胞(3％)中表达。MCAM阳性T细胞还表现出增加的与内皮单层结合的能力，并且这些细胞可代表适应性免疫应答的早期成分(Dagur等人，2015)。因此，表达该标志物的干细胞可以与BBB结合而不穿过BBB，并且具有免疫反应性。
间充质干细胞基因型模式还包括多能标志物OCT3/4和nanog的低表达。有趣的是，本发明药物组合物的未分化的干细胞不需要表达c-Myc、KLf-4和REX-1。事实上，这些干细胞可能是c-Myc、KLf-4和REX-1阴性的。
表达神经上皮干细胞分子谱的干细胞表达至少一种、优选两种、更优选多于两种NPC生物标志物和NSC生物标志物，其选自：波形蛋白、巢蛋白、SOX2、p75以及神经细胞发育和存活所需的其它神经营养因子。p75是神经营养受体标志物。在最近的工作中，假设p75NTR和/或TrkB表达或其信号传导的正常化将改善亨廷顿氏病中的BDNF(脑源性神经营养因子)神经保护疗法(Brito等人，2013)。
神经元发育和存活所需的示例性神经营养因子包括BDNF(脑源性神经营养因子)、GNDF(胶质细胞系来源的神经营养因子)、NGF(神经生长因子)和NT(神经营养因子)。BNDF在亨廷顿氏病(Gauthier等人；Strand等人)和帕金森病(Mogi等人)中起关键作用，两者都是多巴胺相关的神经退行性疾病。一些研究表明，野生型HD过表达的htt蛋白增加了CNS细胞中BDNF的表达，而突变的htt蛋白导致BDNF的下调，导致神经营养支持不足和神经元细胞死亡(Zuccato等人，2001)。AD患者的脑中NGF水平降低(Calissano等人)；然而，NGF施用可部分降低老年啮齿类动物的胆碱能萎缩(Fischer W等人)。在一些实施方案中，优选的NGF是NGF-β。神经元发育和存活所需NT包括NT3、NT4或NT5。已知NT4和NT5促进感觉和运动轴突生长。
在一些实施方案中，干细胞包含需要药物组合物的受试者自体的细胞。在其它实施方案中，干细胞包含需要药物组合物的受试者同种异体的细胞。在一些实施方案中，干细胞包含需要药物组合物的受试者自体的和同种异体的细胞的组合。
在一个实施方案中，干细胞的组合物从神经嵴起源的组织分离，所述神经嵴起源的组织选自牙齿组织、牙周组织和毛囊组织。在优选的实施方案中，神经嵴起源的组织是牙髓。在一个最优选的实施方案中，干细胞来自未成熟牙髓，例如，国际申请第PCT/IB14/59850号和美国专利申请第14/2140,016号中公开的人未成熟牙髓干细胞(IDPSC)。IDPSC携带多种神经元标志物并经历强分化而分化成为神经元。IDPSC免疫表型的新颖之处是这些标志物的出乎意料的表达，并且同时是MSC的典型标志物，它们是根据国际细胞疗法协会用于定义多能间充质基质细胞的最低标准中所表现的免疫表型(Dominici等人，2006)。MSC的IDPSC和多种神经元标志物的这种表达组合对于MSC并不典型(Dominici等人，2006)，并且尚未公开于MSC。
本发明中考虑的药物组合物优选是等渗的。对于静脉内注射，未成熟干细胞群应当在每次注射104-1010个细胞之间，例如，每kg体重104、105、106和107个细胞。包含干细胞群的药物组合物可以与其它药学活性化合物或方式联合使用。因此，在一些实施方案中，药物组合物可以进一步包含另一种药学活性化合物或治疗方式。
间充质干细胞
在体内，MSC存在于骨髓、脐带组织、牙髓和脂肪垫中。然而，在骨髓中，MSC相对较少，每10000个细胞中仅包含一个，而其它来源在这些细胞中显著更丰富。在生物体中，MSC在人生命中的疾病、创伤或损伤的情况下负责组织再生。MSC的这种功能是由它们的自我更新和可塑性的能力(分化-产生不同细胞类型的能力)介导的。MSC可以从上述组织中分离并在实验室中容易地培养。在从患者获得有限数量的细胞后，MSC可以在体外快速繁殖并低温保存用于将来的临床应用。
MSC能够分泌多种生物活性分子，如细胞因子，通过构建再生微环境提供“营养活性”，以及提供其它有助于免疫调节细胞功能的分子，甚至可以将像线粒体那么大的产物转移到需要帮助的受损细胞。当在体内移植时，响应趋化性刺激的MSC可以从局部和周围部位迁移到病灶损伤处。此外，MSC可以起到降低慢性炎症、抑制细胞凋亡、提供肌成纤维细胞的外观、抑制瘢痕形成和刺激组织固有祖细胞的有丝分裂的作用，因此重塑受损组织。这就是MSC也被称为“医学信号传导细胞”的原因。它们刺激血管生成，即新血管形成的过程，这与神经发生密切相关，神经发生是新神经细胞产生的过程。血管作为神经元祖细胞向受损脑区域迁移的框架起着重要作用。MSC分泌的因子也降低了氧化损伤的破坏作用。使用所有这些作用机制，MSC可以显著改善病变的微环境，从而导致受损细胞的恢复。因此，MSC被认为是“细胞护理人员”。
当从人获得的MSC为了追踪它们而被标记时，注射到具有某种类型组织损伤的小鼠中，它们明显均匀地迁移到受损组织中。这些细胞可以存在或不存在于组织中相当长的一段时间，这取决于疾病模型。MSC的持续存在对于治疗的开发是重要的，但不是基本的，因为它表明治疗的潜在积极的长期作用可能能够持续存在。
重要的是要理解，MSC的暂时存在不是宿主免疫系统作用的结果，因为具有或不具有功能性免疫系统的受损小鼠的实验都会产生相同的结果。进一步的调查表明，MSC可以抑制免疫系统并降低炎症。换言之，MSC在生物之间转移可以表现出非常低的免疫排斥，这种免疫排斥发生在接受移植时生物体的免疫系统攻击外来组织时。这一发现使MSC成为移植或注射至宿主的良好候选物，因为它们可以避免宿主免疫系统的排斥(Le Blank,Ringdén,2006；English,2012；Miguel等人,2012；Griffin等人,2012；Ankrum等人,2014)。
细胞疗法的关键问题是将MSC递送至脑的途径，已经以多种不同的方式实现。已经提出了几种将MSC递送到脑中的方法，如鞘内注射、静脉内注射到脊髓周围的空间，甚至通过鼻的途径。在早期发育中，由于未成熟内皮细胞和神经祖细胞、神经元、放射状胶质细胞和周细胞之间复杂的多细胞相互作用，它们与MSC具有类似的特征，形成血脑屏障(BBB)并控制选择性分子或细胞在血流和脑间质空间之间的运输。BBB对于治疗脑恶性肿瘤和神经退行性疾病的治疗剂(药物或细胞)的递送存在显著的问题。全身输注的MSC可以治疗急性损伤、炎症疾病、中枢神经系统(CNS)中风甚至脑肿瘤，因为它们具有再生能力和分泌营养、免疫调节或其它工程化治疗因子的能力。然而，在正常和病理条件下，MSC是否具有穿过BBB迁移的能力仍未得到解决(Liu等人，2013)。
体外扩增的MSC的全身输注(例如IV)是最低限度介入性且方便的程序，其用于大量正在进行的临床试验中。因此，需要了解移植的MSC是否可以在脑的局部缺血和受损部位归巢并植入以发挥其治疗作用。尚无数据提示或公开最低限度操纵的MSC的全身递送可能导致细胞通过BBB直接移植到脑中。
可以获得的、培养的MSC的简单性，和它们独特的“营养活性”以及它们转移到宿主中而无免疫排斥的可能性，这是采用MSC的干细胞疗法成为治疗神经疾病和病症(例如神经退行性)有前景途径的原因。根据最近的公开，MSC可以通过分泌营养因子来支持修复神经退行性，所述营养因子是刺激细胞分化和存活的蛋白。这些因子的作用使神经细胞能够进行几个可以支持存活的过程：轴突延伸、生长和细胞附着。虽然有证据表明MSC可以促进脑中的细胞生长和修复，但尚未明确证实MSC可以成为具有发信号或与其它神经细胞通信能力的成熟神经细胞。
先前的研究已经检验了MSC疗法在HD动物模型(其中HD由QA或3-NP诱导的化学模型以及转基因小鼠系R6/2-J2、N171-82Q和R6/2)中的潜力。然而，尽管作者称检验的细胞为MSC，但未证实这些细胞具有MSC典型的免疫表型，如国际细胞疗法协会(Dominici等人，2006)所定义的。这些临床前研究使用同种异体和异种原代培养物、和在正常氧水平(常氧)或低氧水平(缺氧)下生长的来自骨髓、脂肪组织和脐带血的永生化细胞系，以及单核细胞。因此，这些研究尚未确定被国际细胞疗法协会视为MSC的细胞可以成功地用于治疗神经疾病，而在培养中无需先前的特殊操作。
在这些实验中使用的细胞数量从每半球/纹状体105、2×105、4×105、5×105和高达106不等。在整个研究中，施用MSC移植的时间显著变化，时间为1-3天、2-4周和8周。直接植入后在脑中发现这些细胞，但是直接的脑内(intrabrain)递送是一种高度介入性的危险程序。因此，这些研究未表明可以使用施用干细胞疗法的最低限度的介入方法，如通过IV注射进行全身施用。
除了一项研究之外的所有研究都使用了不高于第10代的细胞。排除研究使用了第40代和第50代的小鼠脐带血来源的(mUBC来源的)MSC。有趣的是，该研究观察到多能干细胞标志物的表达，例如阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA4)随着传代而增加，以及不同于低传代mUCB来源的MSC移植，高传代mUCB来源的MSC的移植赋予显著的运动益处。不幸的是，由于较高的传代数，潜在的多能性起源和核型突变的高风险使得临床应用处于危险中。
与这些研究不同，本发明提供了一种治疗神经疾病和病症的方法，其使用具有如国际细胞疗法协会所定义的MSC典型免疫表型的独特IDPSC群，即使在最低限度的介入性施用中也是有效的，例如通过经典的IV递送途径。
正如先前关于采用假定的MSC治疗HD的研究所表明的，治疗神经退行性疾病的希望是使用干细胞。不幸的是，只有将胎儿供体组织施用至纹状体的治疗进行临床试验，这只是一个小的试验。
HD中的细胞疗法旨在保护易患疾病的神经元群和/或替代功能障碍或将死亡的神经元。因此，HD细胞疗法的临床进展集中于建立将胎儿来源细胞移植到患病纹状体中的方案。该策略有助于临床干细胞疗法的发展，并提供了数年的改善和稳定期，但不能永久治愈疾病(Bachoud-Levi等人，2006)。患者3至10年术后期的长期随访表明，HD的胎儿纹状体同种异体移植是安全的。然而，未观察到持续的功能益处，可能是由于与其它在HD患者中更成功移植的报告相比，在这项安全研究中植入的细胞数量较少(Barker等人，2013)。
干细胞疗法的使用是不可避免的，因为细胞内和细胞机制涉及HD表型。干细胞疗法还可以加速脑组织再生过程。干细胞是一种重要的疗法，它将有助于重建HD中受损最严重的脑区域。只用药物方法不能重建受损的脑区域，尤其是在HD晚期阶段。
MSC可以通过酶促消化从人恒牙和乳牙提取获得(Gronthos等人，2000；Miura等人，2003)，或者通过器官培养，之后外植体(未成熟牙髓干细胞，IDPSC)技术获得，如在国际申请第PCT/IB14/59850号和美国专利申请第14/2140,016号中公开的。IDPSC从牙髓组织获得，在解剖学上起源自外胚间充质(ectomesenchymal)组织，更确切地来自神经嵴，其是胚胎早期形成中存在的大量组织。它最终形成颈部和颅骨的硬组织和软组织。
已知神经嵴起源的IDPSC在出生前迁移到不同的主要外胚层组织中，并且具有自我更新的能力和显示与胚胎干(ES)细胞几乎相同的发育潜力，但不具有在体外形成胚体和在体内形成畸胎瘤的风险(Kerkis和Caplan，2012)。神经嵴起源的迁移后干细胞产生所有颅面骨、中枢和外周神经系统的大部分细胞和组织、以及几种非神经细胞类型，如心血管系统的平滑肌细胞、皮肤中的色素细胞、软骨、结缔组织、角膜上皮和牙髓。尽管神经嵴起源的迁移后出生后干细胞具有有限的发育潜力，它们维持了类似于胚胎对应物的功能表征和分化成广谱细胞类型的能力(Le Douarin等人,2004,2007,2008；Dupin等人,2007；LeDouarin&Dupin,2003,2012)。
体外IDPSC经历均匀分化成为神经元和胶质细胞。人IDPSC的体内移植显示在包括神经元的不同组织中的密集植入。与基于不同胚胎起源的中轴骨和附件骨(骨髓和回肠嵴)中的那些相比，神经元分化命运基于口面部骨的表观遗传“记忆”，包括牙髓。上颌骨、下颌骨、包括牙槽骨(即牙本质、牙髓和牙周韧带)，专一由神经嵴细胞形成，而中轴骨和附件骨由中胚层发育。因此，IDPSC具有神经再生和神经保护的潜力。
Logan A等人描述了细胞应产生多种NTF(神经营养因子)以产生对神经保护的协同作用。因此，重要的是hIDPSC细胞表达并释放多种NTF。最近的公开报道了牙髓干细胞(DPSC)在神经支持中起作用的旁分泌机制的证据，其中许多NTF的基因表达，如NGF(神经生长因子)、BDNF和NT3，结果表明相比hBMSC(骨髓来源的MSC)或hAMSC(脂肪组织来源的MSC)，hIDPSC更显著促进轴索切断的(axotomised)RGC的神经保护和神经发生(Mead B等人，2013；Mead B等人,2014；Martens W等人，2013)。对于视网膜治疗，提示玻璃体内移植的DPSC是比BMSC更适合的细胞类型(Mead B等人，2014)。这些研究使用采用胰蛋白酶从成年大鼠酶促来源的DPSC(＝SHED)。
此外，这通过最近的研究结果得到了加强，所述研究使用脊髓损伤啮齿类动物模型，通过在附近直接硬脑膜移植将SHED直接移植至病变部位，其中，通过细胞自主和旁分泌神经再生活性，SHED在神经保护和神经再生方面优于三种人皮肤成纤维细胞系(Sakai等人,2012)。这些研究使用了使用胶原酶从未成熟和成年智齿中酶促来源的培养的DPSC。在DPSC移植期间，还采用环孢菌素处理动物用于免疫抑制。
全身施用干细胞的安全
除非移植是自体植入，否则宿主的免疫系统总是存在攻击被移植物的风险。即使是匹配良好的同种异体移植也需要免疫抑制预处理。干细胞移植仍然如此。
为了避免宿主的免疫系统攻击移植的细胞，治疗性干细胞群应该不是免疫原性的。免疫原性是同种异体干细胞在移植后面对宿主免疫系统时引发免疫应答的能力(SchuS等人，2012)。将具有不匹配的主要组织相容性复合物(MHC)的NPC移植到具有小鼠肝炎病毒诱导的CNS脱髓鞘的小鼠中导致T细胞浸润和NPC排斥增加(Weinger JG等人，2012)。然而，最近的证据支持未分化的成体干细胞具有免疫豁免状态，并且能够逃避同种异体排斥的正常过程的可能性(Bifari F等人，2010)。如果细胞缺乏MHC的表达，则细胞群可能具有免疫豁免状态。例如，干细胞群的人白细胞抗原(HLA)基本上是阴性的，在人中的免疫原性不会发生，人白细胞抗原是MHC的人的形式。因此，缺乏HLA-DR是IDPSC的质量控制表征，是用于全身细胞疗法而不需要对患者进行毒性免疫抑制预处理的细胞的基本标志物。
干细胞移植的另一个风险是肿瘤发展的风险增加，尤其是对于未分化的细胞，因为这些细胞具有分化成其它细胞类型的潜力。多能干细胞，尤其是hESC和iPSC细胞能够形成类似于体外胚状体和体内畸胎瘤的球体。所有目前可用的应用多能细胞的技术都具有致瘤性风险。某些基因的表达和缺乏表达降低了能够全身施用干细胞群的风险。
Nanog是与维持内细胞团块的多能细胞和胚胎干细胞的形成相关的转录因子。Nanog是白血病抑制因子(LIF)和转录非依赖因子-3(STAT-3)的活化因子。它受OCT4和SOX2调节，转而通过与各自的启动子基因区域结合而正调节OCT4、SOX2及其自身的表达(Boyer等人，2005；Loh等人，2006；Li，2010)。总之，这三种转录因子在防止多能干细胞分化中起重要作用(Boyer等人，2005)。以前，采用OCT3/4、SOX2、NANOG的转染细胞核足以诱导成体体细胞的多能性(iPSC的创建)，然后导致胚胎干细胞理论表征的完整模式：分化为体内200种细胞类型、无限扩增、更新潜力、胚体形成、畸胎瘤形成。畸胎瘤形成是细胞疗法中安全的主要威胁。然而，在核中不存在nanog表达是确定干细胞群是否适合全身施用的基本安全标志物。在体内缺乏未分化的干细胞的致瘤性需要在核中不存在nanog。因此，表达非活性nanog(即位于细胞质中的nanog)的未分化的干细胞在体内也缺乏致瘤性。
适合全身施用的干细胞群的另一个重要安全标志物是p53的表达。这种蛋白在多细胞生物体中至关重要，它可以调节细胞周期，从而通过作为肿瘤抑制因子发挥作用来防止癌症。
ABCG2蛋白表达也是安全标志物，表明干细胞群适合全身施用。ATP结合盒(ABC)、ABCG2蛋白(BCRP)表达是MSC未分化群表型的重要决定因素。ABCG2可以作为来自不同的来源的未分化的干细胞的标志物，因为随着分化其表达急剧下调。值得注意的是，在AD病例和对照中在组织病理学层面证实阿尔茨海默病(AD)的ABCG2转运蛋白主动转运Aβ。全基因组关联研究(Bertram L等人，2007)已经涉及已经鉴定出调节AD风险的基因，包括ABCA7中的遗传变体，一种ABC基因的变体。结论是ABCA7表达的增加降低了AD风险，尽管AD期间ABCA7表达的增加不足以阻止疾病进展(Jared B等人，2014)。
因此，本发明的药物组合物的一些实施方案包括来自神经嵴起源的组织的干细胞，其表达至少一种选自ATP结合盒亚家族G成员2(ABCG2)、非活性nanog、p53和SOX2的安全标志物。在一些方面，至少一种安全标志物选自ATP结合盒亚家族G成员2(ABCG2)、非活性nanog和p53。IDPSC具有ABCG2和p53的高表达，但非活性nanog和SOX2的低表达。例如，当至少一种安全标志物是ABCG2或p53时，药物组合物的干细胞的至少75％、80％、85％、90％、95％或98％表达至少一种安全标志物。在另一个方面，如果至少一种安全标志物是非活性nanog或SOX2，不超过30％、25％、20％、15％、10％、5％或5％的干细胞表达至少一种安全标志物。在一些方面，药物组合物的干细胞共表达ABCG3、p53、非活性nanog和SOX2，其中至少75％的干细胞表达ABCG2，至少75％的干细胞表达p53，不超过5％的干细胞表达非活性nanog，以及不超过30％的干细胞表达SOX2。
药物组合物的另一个实施方案包括来自神经嵴起源的组织的干细胞，其表达至少一种神经上皮干细胞标志物，选自脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养素-3(NT3)、神经营养素-4(NT4)、神经营养素-5(NT5)和p75。在一些方面，干细胞具有高表达的至少一种神经上皮干细胞标志物。例如，至少75％、80％、85％或90％的细胞表达至少一种神经上皮干细胞标志物。在一些实施方案中，药物组合物的干细胞共表达BDNF、NT3、NT4、NT5和p75。
在一些方面，这些实施方案的药物组合物包含来自神经嵴起源的组织的干细胞，其是HLA-DR阴性的。药物组合物的干细胞对于某些MSC标志物也可以是阴性的，MSC标志物选自c-Myc、KLf-4和REX-1。在优选的实施方案中，药物组合物的干细胞是HLA-DR、c-Myc、KLf-4和REX-1阴性的。
药物组合物的不同的实施方案也可以组合。例如，药物组合物可包含来自神经嵴起源的组织的干细胞，其表达至少一种选自ABCG2、非活性nanog和p53的安全标志物，并进一步表达至少一种选自BDNF、NT3、NT4、NT5和p75的神经上皮干细胞标志物。作为另一个示例，药物可以包含来自神经嵴起源的组织的干细胞，其表达至少一种选自BDNF、NT3、NT4、NT5和p75的神经上皮干细胞标志物，同时进一步表达至少一种选自ABCG2、非活性nanog、p53和SOX2的安全标志物。
使用药物组合物的方法
本发明提供治疗神经疾病和病症的方法，其包括将本发明的药物组合物全身施用至受试者。在一些实施方案中，这些治疗神经疾病和病症的方法促进神经发生并且在神经退行性疾病的模型中是保护性的。在一些实施方案中，全身施用干细胞群，如通过IV施用，导致细胞直接递送至脑。在一些方面，通过干细胞群自我分化和/或活化固有干细胞的迁移和分化而发生神经发生。在一些方面，神经发生优选是多巴胺相关的。
在所述方法的一些实施方案中，通过穿过血/脑屏障(BBB)并诱导神经发生的干细胞来治疗神经疾病或病症。在一些方面，干细胞在穿过BBB后直接移植到脑实质中，包括纹状体。在一些实施方案中，诱导的神经发生是多巴胺相关的。例如，通过干细胞的自我分化或外源性干细胞对固有干细胞的迁移和分化的活化而发生多巴胺相关的神经发生。在一些方面，主要在脑室下区(SVZ)发生多巴胺相关的神经发生。
在一些实施方案中，所述方法还包括测量受试者中DA受体的量。在一些实施方案中，测量受试者中DA受体的量包括使受试者成像以检测DA受体。在所述方法的最优选实施方案中，由多巴胺受体D2介导神经发生，因此在一些实施方案中，测量的DA受体是受体D2。
在所述方法的一些实施方案中，药物组合物提供神经保护。例如，为全身神经保护提供了高基础水平的神经营养和免疫保护因子表达和药物组合物干细胞的释放模式。在一些方面，药物组合物的这些干细胞是IDPSC。
神经疾病和病症包括例如自闭症、精神分裂症、癫痫、中风和局部缺血、神经退行性疾病或病症、运动疾患或惊厥疾患。神经退行性疾病或病症可以是例如帕金森病、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化(ALS)、中风、自身免疫性脑脊髓炎、糖尿病性神经病变、青光眼性神经病变、阿尔茨海默病和亨廷顿氏病。运动疾患包括例如妥瑞综合征(Tourettesyndrome)、肌萎缩侧索硬化(ALS)、进行性延髓麻痹、脊髓性肌萎缩症(SMA)、脊髓灰质炎后综合征(PPS)。惊厥疾患包括例如癫痫。
在一些实施方案中，用于治疗神经疾病和病症的方法支持在诊断患有早期HD的受试者中的天然神经保护机制。在其它实施方案中，用于治疗神经疾病和病症的方法修复了在诊断患有PD的受试者中损失的DA神经元。
本发明还提供了使用该药物组合物作为有HD风险的受试者的预防性疗法的方法。
在一个实施方案中，本发明涉及用于向受试者全身施用以治疗神经病症的药物组合物，其包含来自神经嵴起源的组织的未分化的干细胞，所述细胞表达至少一种选自ATP结合盒亚家族G成员2(ABCG2)、非活性nanog和p53的安全标志物。在某些方面，非活性nanog是主要定位于未分化的干细胞的细胞质表达的nanog。在另一个方面，当至少一种标志物是ABCG2或p53时，至少75％的未分化的干细胞表达至少一种标志物。在另一个方面，当至少一种生物标志物是nanog时，不超过5％的未分化的干细胞表达至少一种标志物。
在一些实施方案中，未分化的干细胞表达ABCG2、非活性nanog和p53。在一个方面，至少75％的未分化的干细胞表达ABCG2，至少75％的未分化的干细胞表达p53，并且不超过5％的未分化的干细胞表达非活性nanog。在另一个方面，未分化的干细胞进一步表达SOX2，并且其中不超过30％的未分化的干细胞表达SOX2。在另一个方面，未分化的干细胞进一步表达至少一种选自脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养素-3(NT3)、神经营养素-4(NT4)、神经营养素-5(NT5)和p75的神经上皮干细胞标志物。
在其它实施方案中，未分化的干细胞表达BDNF、NT3、NT4、NT5和p75。在一个实施方案中，本发明涉及用于向受试者全身施用以治疗神经病症的药物组合物，其包含来自神经嵴起源的组织的未分化的干细胞，至少一种选自BDNF、NT3、NT4、NT5和p75的神经上皮干细胞标志物。
在某些方面，未分化的干细胞表达BDNF、NT3、NT4、NT5和p75。在其它方面，未分化的干细胞进一步表达至少一种选自ABCG2、非活性nanog、p53和SOX2的安全标志物。在某些方面，非活性nanog是主要定位于未分化的干细胞的细胞质表达的nanog。
在其它实施方案中，当至少一种标志物是ABCG2或p53时，至少75％的未分化的干细胞表达至少一种标志物。在某些方面，未分化的干细胞是HLA-DR阴性的。在一个实施方案中，神经嵴起源的组织是牙髓。在其它方面，来自神经嵴起源的组织的未分化干细胞是未成熟的牙髓干细胞(IDPSC)。
在另一个方面，本发明提供治疗神经疾病或病症的方法包括向受试者全身施用药物组合物，所述药物组合物包含来自神经嵴起源的组织的未分化的干细胞，所述干细胞表达至少一种选自ABCG2、非活性巢蛋白和p53的安全标志物。在一些方面，药物组合物的未分化的干细胞进一步表达至少一种选自BDNF、NT3、NT4、NT5和p75的神经上皮干细胞标志物。
在另一个实施方案中，本发明涉及治疗神经疾病或病症的方法，其包括向受试者全身施用药物组合物，所述药物组合物包含来自神经嵴起源的组织的未分化的干细胞，所述干细胞表达至少一种选自BDNF、NT3、NT4、NT5和p75的神经上皮干细胞标志物。
在某些实施方案中，药物组合物的未分化的干细胞还表达至少一种选自ABCG2、非活性巢蛋白、p53和SOX2的安全标志物。
在其它方面，受试者静脉内施用药物组合物。在一些实施方案中，由穿过血/脑屏障并诱导神经发生的未分化干细胞群治疗神经疾病或病症。在一个方面，由未分化的干细胞通过多巴胺相关的神经发生诱导神经发生来治疗神经疾病或病症。在另一个方面，多巴胺相关的神经发生是通过未分化的干细胞的自我分化或由未分化的干细胞活化固有干细胞的迁移和分化。
在某些实施方案中，药物组合物的未分化干细胞提供神经营养因子和免疫保护因子。在其它实施方案中，药物组合物的未分化干细胞提供全身神经保护。在一个实施方案中，未分化的干细胞是受试者自体的和/或同种异体的。
在某些方面，神经疾病或病症是神经退行性疾病或病症。神经退行性疾病或病症可选自帕金森病(PD)、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化(ALS)、中风、自身免疫性脑脊髓炎、糖尿病性神经病变、青光眼性神经病变、阿尔茨海默病和亨廷顿氏病(HD)。
在一些方面，所述方法包括向受试者全身施用药物组合物，其中受试者被诊断患有早期HD，其支持受试者中的天然神经保护机制。在其它方面中，所述方法包括向受试者全身施用药物组合物，其中受试者被诊断患有PD，其修复受试者中损失的多巴胺能神经元。在另一个实施方案中，神经疾病或病症选自自闭症、精神分裂症、中风和局部缺血。在其它实施方案中，神经疾病或病症选自运动疾患和惊厥疾患。
在某些方面，向受试者施用单次施用的药物组合物。在一个实施方案中，向受试者施用单次静脉内注射药物组合物。在其它实施方案中，向受试者施用第一次和第二次施用的药物组合物。
在其它实施方案中，向受试者施用第一次和第二次静脉内注射的药物组合物。在一些方面，在第一次施用或静脉内注射后的至少7天进行药物组合物的第二次施用或静脉内注射。
在一个方面，所述方法还包括测量受试者中DA受体的量。在另一个方面，所述方法包括测量受试者中DA受体的量，其包括使受试者成像以检测DA受体。在一个方面，DA受体是受体D2。
通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例不应解释为限制性的。贯穿本申请中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容以及附图出于所有目的通过引用整体并入本文。
实施例
实施例1：早期和晚期收获IDPSC的表征以及从早期和晚期收获IDPSC衍生神经和胶质细胞
早期和晚期收获IDPSC的表征
为了表征hIDPSC的性质，从早期(n＝8)和晚期(n＝4)收获(表1)，进行间充质标志物CD13、CD105、CD73、CD90、CD44的流式细胞术分析。采用2×105个细胞进行FACS实验。采用PBS(不含钙和镁)洗涤细胞两次，并加入检验的抗体在室温下持续15分钟。然后采用冷的PBS洗涤细胞两次，并采用Becton-Dickinson流式细胞仪分析。分别在575nm、53nm和600nm发射波长下检测PE(FL2)、FITC(FL1)、APC(FL4)的荧光。
表1.FACS实验中使用的细胞的列表
来自早期和晚期收获的细胞均表达高水平的间充质标志物。两个群均为HLA-DR和HLA-ABC抗原表达阴性，这允许这些细胞群的同种异体移植。两个群对于间充质干细胞标志物具有双免疫阳性(如CD13和CD44等)，并且表达巢蛋白、P75(CD271)、神经上皮干细胞标志物和神经生长因子(NGF)(参见图1和图2A-2L和表2)，并且它们对CD146和HLA-ABC呈阴性。
在DP组织和外植体培养物的多次收获后，IDPSC表现出形成集落的能力(图3)。集落形成测定(CFU-F)在T20P3以一式三份进行，使用480个接种在各板中的细胞，在第8天出现多个集落，并在每个板中形成大约100个集落(图3)。集落形成能力是干细胞的主要表征之一。因此，我们得出结论，当使用所公开的多次收获器官和组织外植体方法获得细胞时，这种能力得以维持。此外，如图4所示，评价LP IDPSC的增殖活性，这些细胞表现出非常高的增殖率。
表2.通过FACS分析比较来源自相同供体的hIDPSC的细胞标志物表达。
表2比较了源自相同供体的hIDPSC的不同收获的细胞标志物表达(即，H0P3＝第一次收获；H13P3＝晚期收获；H16P9＝最后的收获)。晚期收获的群的NGF水平高于早期收获的群。还在细胞中检验了三磷酸腺苷结合盒(ABC)转运蛋白的表达。ABC转运蛋白参与极其多样的底物穿过生物膜的主动转运。这些转运蛋白通常涉及多药耐药性的发展，并且还涉及许多生理和自我平衡过程，包括脂质转运、细胞迁移和分化。此外，有证据表明ABC转运蛋白可作为干细胞的表型标志物和功能调节因子(Bunting 2002)。早期和晚期收获群表达ABCB1蛋白、MDR1基因的产物，但在晚期收获表达更高。根据Islam等人(2005)，ABCB1在人胎儿神经干/祖细胞(hNSPC)中表达。
FACS分析显示IDPSC的LP(批次#11)包含约80％表达BDNF和DARPP32的细胞，而EP的这些标志物是阴性的(数据未显示)，以及非常低数量的表达D2的细胞(图3)。为了进一步表征hIDPSC早期和晚期收获，使用ELISA确定在介质中BNDF的量表示总脑源性神经营养因子(BDNF)水平(表3)。根据制造商的方案(R&D Systems，Minneapolis，MN)，使用人BDNFQuantikine ELISA试剂盒定量BDNF水平。将来自不同收获的细胞(1×106)接种在75cm塑料瓶中。接种后约4天收获上清液。结果表示为BDNF浓度。BDNF在所有细胞亚群中分泌，但在晚期收获中水平高4-10倍。
表3.早期和晚期收获的hIDPSC总BDNF水平
批次号 收获(H)和传代(P)数 BDNF水平(pg/ml)
11 H0 P3 13
24 H10 P2 154
26 H13 P3 43
与其它MSC的比较显示hIDPSC分泌更多的BDNF。
1×106hIDPSC分泌的BDNF的平均水平为6589pg，比分泌BNDF的其它类型的MSC高许多倍，如2014年Gothelf等人的MSC(Clin Transl Med.2014 3:21)。Gothelf等人通过在介质中孵育BM-MSC 72小时将骨髓来源的MSC(BM-MSC)诱导分化成分泌神经营养因子的细胞(BM-MSC-NTF)，所述介质含有1mM二丁酰环15AMP(cAMP)、20ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)、5ng/ml人血小板来源生长因子(PDGF-AA)和50ng/ml人调节蛋白β1(Heregulinβ1)。尽管诱导介质几乎使BDNF分泌加倍(827pg BNDF/106BM-MSC与1640pgBNDF/106BM-MSC-NTF细胞相比)，hIDPSC仍然比BM-MSC-NTF分泌多四倍的BDNF。因此，hIDSPC比经诱导而分泌神经营养因子的骨髓来源MSC具有更大的神经保护潜力。
Oct4、Nanog、Sox2和p53的表达
如文献中所描述的(Jiang等人，2002；Guillot等人，2007)，已知MSC一般以低水平表达多能标志物如Oct4、Nanog和Sox2。我们显示，与人胚胎干细胞以及甚至从hIDPSC获得的诱导多能干细胞相比，hIDPSC表达非常低水平的这种标志物(参见图5)。更重要的是，我们表明了hIDPSC表达高水平的p53。肿瘤抑制基因p53是公知的主要调节因子，有助于防止癌症。阻断p53通路极大地提高了将分化的细胞转化为诱导多能干细胞的容易性和效率(Dolgin，2009)。
从早期和晚期收获IDPSC衍生神经和胶质细胞
神经元系统由两类神经前体细胞组成：分化为神经元的神经元NPC和分化为胶质的胶质NPC。神经元和胶质NPC均起源自相同的神经外胚层前体。还提出了第三类神经前体细胞神经成胶质细胞(neuroglioblast)。第三类细胞包括放射状胶质细胞，其也可以作为神经元前体，并且仅在神经发生之后晚期，它们才转向专一产生星形胶质细胞。
区分细胞疗法中的细胞群是神经元NPS还是胶质NPC的能力对于开发治疗神经退行性疾病的有效细胞疗法策略是极其重要的，所述神经退行性疾病主要涉及胶质和神经元的损伤或损失。可以通过诱导这些细胞分化，检验已知细胞群分化成神经元或胶质的潜力。
根据先前描述的方案(Kerkis等人，2006)，通过在早期(P2)和晚期传代(P7)的EP(早期群)和LP(晚期群)IDPSC中诱导神经元分化来检验EP和LP的IDPSC产生神经元和胶质细胞的能力(图6)。7天后，收集细胞并分别使用GFAP(胶质纤维酸性蛋白)和β-III-微管蛋白抗体通过流式细胞术分析。在EP(B-E，左)和LP(B-E，右)之间表达这些标志物的细胞数量存在显著差异，这是在牙髓(DP)收获方案之后建立的。在另一个方面，在酶促消化后获得的不同传代(P2和P7)之间未检测到两种蛋白表达的显著差异(图6)。令人惊讶的是，IDPSC可以是神经元和胶质NPC。早期DP收获(EP IDPSC)导致分离主要定型(commit)为胶质分化的神经祖细胞，而晚期DP收获(LP IDPSC)导致分离主要定型为神经元分化的神经祖细胞。
因此，DP收获对于建立具有发展成神经元和胶质的潜力的NPC群是重要的。SHED是人乳牙的干细胞，不能归类为早期群或晚期群，因为它们是从不具有DP收获的牙髓细胞中分离的干细胞。单一SHED群包含神经元定型的而非胶质定型的祖细胞。在Miura等人(2003)中，SHED的神经元分化导致β-III-微管蛋白、GAD和NeuN的表达增加，而巢蛋白、GFAP、CNP酶和NFM的表达在诱导分化后保持相同(参见Miura的图4I)。
实施例2.CD146和CD13在早期阶段(EP)和晚期阶段(LP)hIDPSC中的表达
在EP-hIDPSC和LP-hIDPSC中通过流式细胞术分析CD146和CD13表达。图7中的结果显示CD13在52％的EP-hIDPSC和95％的LP-hIDPSC中表达。这些结果表明，体外DP收获和hIDPSC传代产生增加表达CD13且缺乏CD146表达的hIDPSC的量。
实施例3.IDPSC和SHED的比较
来自不同来源(例如骨髓和脂肪组织)的MSC对不同刺激的应答不同(Fraser JK等人，2006)。培养条件(例如，补充有人血清或胎牛血清(FCS)或无血清的介质)也可能影响甚至相同起源的MSC的分化潜力(Lindroos等人，2011；Lizier等人，2012)。分化效率的差异很可能极大地反映了MSC群的异质性(即不同亚群的存在)(Ho等人，2008；Tormin等人，2009；Mareddy等人，2009；Rada等人，2011)。不同群使用的不同分离和培养方案可能解释了具有不同分化潜力的特定MSC亚群的优势(Ho等人，2008；Pevsner-Fischer等人，2011；Rada等人，2011)。
SHED和IDPSC具有不同的分离方法，来自不同的干细胞龛。因此，SHED和IPSC也具有不同的干细胞标志物的表达(见表4)并不令人惊讶。SHED起源于血管周环境，通过免疫组织化学染色发现STRO-1和CD146阳性细胞位于屑髓(remnant pulp)的血管周围。使用FACS，仅有一小部分(9％)离体扩增的SHED对STRO-1抗体染色呈阳性。
表4.SHED和IDPSC之间的差异
诱导分化的要求在SHED和IDPSC之间也是不同的。例如，为了诱导神经元分化，SHED需要EGF 20ng/ml(BD Bioscience)、FGF 40ng/ml(BD Bioscience)和3％大鼠血清。它们需要四周的神经诱导培养，以显示神经形态和增加神经元标志物的表达。
部分由于这些差异，在神经发生方面IDPSC优于SHED。在一项研究中，将SHED注射到免疫功能不全的小鼠的海马体齿状回中。数据表明SHED能够在小鼠海马体中存活超过10天并表达NFM，其也由未分化的SHED表达(Miura等人，2003)。在另一项研究中，将预分化的SHED(由EGF和bFGF的组合在体外7天创建的SHED来源的球)移植到帕金森病大鼠中。将细胞悬液(200000/μL)注射到大鼠的2个DA耗尽的纹状体部位(每个部位2.5μL)。观察到适度分化成DA神经元(Wang等人，2010)。在第三项研究中，SHED被注射到出生后第5天小鼠的受损脑中，所述受损脑是在围产期缺氧局部缺血(HI)中所诱导的，具有高的神经缺陷和死亡率。环孢菌素A用于保护植入的细胞免受异种宿主免疫应答，然而移植后8周植入的SHED没有或很少的细胞分化成神经元、少突胶质细胞或星形胶质细胞(Yamagata等人2013)。
所有三个实验的共同主题是SHED与环孢菌素A一起施用。环孢菌素A显示降低大鼠局部缺血性脑梗塞的尺寸，并且在创伤性脑梗塞的啮齿类动物模型中防止突触功能障碍和细胞死亡，以及在亨廷顿氏病中防止纹状体神经元的线粒体功能障碍(Matsomoto等人，1999；Albensi等人，2000；Leventhal等人，2003)。因此，在帕金森病大鼠和HI中观察到的益处不能完全归因于SHED，也不能完全归因于环孢菌素A干预。
实施例4.与其它用于治疗神经病症的治疗性干细胞进行比较
如表5所示，来自Avita International LTD的hIDPSC优于市场上或临床试验中的其它治疗性干细胞。Avita International LTD的hIDPSC具有良好的安全谱，免疫原性风险低、生产成本低，因为它们可以低温保存。
表5.修改自Maxim Research的比较表
实施例5.用于无菌IV注射的IDPSC(Cellavita)的分析证明书
用于IV注射到动物模型中的IDPSC代表性批次的分析证明书(表6)证实了IDPSC的表征结果。
表6
实施例6.鉴定安全的全身施用干细胞疗法的参数
IDPSC显示Oct4核定位(图8A-B)。虽然大多数IDPSC在细胞的细胞质中具有Nanog(图8C-D)，但很罕见的细胞也表现出核定位。在IDPSC中Sox2的细胞内定位主要是核(图8E-G)，尽管几种细胞也可以显示细胞质定位。有趣的是，当在两个子细胞中均观察到Nanog和Sox2表达时，我们可以观察到对称分裂(图8D-F)，并且在分裂后子细胞不表达这些标志物或失去干细胞特征以及变成不太有效的祖细胞或分化的细胞时，观察到不对称分裂(图8E-F)。
我们的数据表明，与多能干细胞相比，IDPSC被分类为MSC或成体干细胞。Nanog的细胞内定位表明该蛋白大部分是非活性的。这是多能干细胞和成体干细胞之间的显著差异，成体干细胞表达多能干细胞标志物。这些细胞比经典的MSC更不成熟，可以分化成更广泛的成熟细胞，但由于Nanog的非活性状态，它们不能产生畸胎瘤。我们关于对称和不对称分裂的数据明确地表明这些细胞模拟不对称神经干细胞分裂(图9)。
畸胎瘤的形成是确定任何多能细胞如胚胎或诱导多能干细胞(ES和iPS细胞)的多能性的基本工具。在我们的研究中使用了建立的用于评价细胞畸胎瘤形成能力的一致方案，类似于最近Gropp等人在2012年公开的方案。我们和最近公开的方法基于将确定数量的未分化小鼠或人ES和iPS细胞以及基质(Matrigel)，皮下共同移植到免疫缺陷小鼠中。当使用106个细胞(不同于Gropp等人，2012，其使用105个细胞)的小鼠ES细胞和人iPS细胞时，我们的方法显示出高度可重复性和有效性。在100％的病例中，我们在大量动物和长期随访(长达6个月)中观察到畸胎瘤的形成。我们还将这些方法用于其它成体MSC的生物安全分析，如来源自乳牙的牙髓、脐带和脂肪组织的那些。
畸胎瘤测定的主要标准
我们评价了畸胎瘤测定的下一个标准：敏感性和定量性；确定细胞数和单细胞悬液产生；关于多能细胞标志物表达和核型的研究细胞的免疫表型；将研究细胞与基质共同移植。将细胞皮下(s.c)移植到NOD/SCID小鼠中，这允许简单的监测畸胎瘤的发展。
从4个月(约16周)监测肿瘤的发展。畸胎瘤的组织学标准是多能细胞分化为来源自三个胚层的细胞。这种研究通常由病理学家进行。
对于成体/间充质干细胞，考虑了细胞注射部位中正常组织完整性的任何类型或任何变化。
畸胎瘤标准的应用
A.实验系统(S)：
a.小鼠胚胎干细胞
b.小鼠3T3成纤维细胞，永久性小鼠细胞系Balbc 3T3细胞系，克隆A31
c.人iPS-IDPSC
d.人ES细胞
e.人IDPSC
我们在不同的研究中使用上述方法来表征由我们建立的不同小鼠ES细胞系多能性，和证实在高的25次或更多次传代时ES细胞的多能性，以及表征从小鼠ES细胞系获得的亚克隆(Sukoyan等人，2002；Carta等人，2006；Kerkis等人，2007；Lavagnolli等人，2007；Hayshi等人，2010)。
此外，在我们的小组最近的公开中(-Braga等人，2011)，该方法用于表征来源自未成熟牙髓干细胞(IDPSC)的iPS细胞的多能性。在该公开中，人IDPSC用作iPS-IDPSC的对照。我们显示iPS-IDPSC形成了良好的畸胎瘤，其组织起源于所有三个胚层，而hIDPSC不能产生任何类型的畸胎瘤或任何其它类型的赘生物(neoplasm)。此外，iPS-IDPSC在核中表达Nanog，而hIDPSC不表达。
结果
公开的用于分离未成熟牙髓干细胞(IDPSC)群的多次收获外植体样培养物，导致在至少15次传代期间，表达胚胎干细胞标志物Oct-4、Nanog、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81以及几种间充质干细胞标志物，同时维持干细胞的正常核型和扩增速率特征。在从这些细胞获得的亚克隆中维持这些标志物的表达。此外，在体外，可以在化学上确定的培养条件下诱导这些细胞经历均匀分化而成为平滑肌和骨骼肌、神经元、软骨和骨。重要的是提及IDPSC，其虽然具有小尺寸，细胞器中细胞质贫乏，这不同于表现典型间充质-成纤维细胞样形态的初始多能细胞。因此，IDPSC是间充质类型的，其与上皮型的ES和iPS细胞不同(图8)。MSC和ES或iPS细胞之间的主要区别是MSC正在迁移和塑料锚定(plasticanchoring)，它们合成细胞外基质并且是无细胞连接的细胞。
B.实验系统：
a.早期(n＝10)和晚期传代(n＝10)的IDPSC三种不同的原代培养物
b.人原代成纤维细胞
此外，该方法使用来自骨髓、肝脏、卵黄囊、尿囊和羊膜液的狗胎儿干细胞进行验证，所述胎儿干细胞也表达多能标志物。
IDPSC由MSC群组成，其具有表达多能标志物的可变数量的干细胞(1-25％的细胞)(Lizier等人，2012)。将这些细胞移植到NOD/SCID小鼠(n＝20)中，并从4个月(约16周)监测肿瘤的发展。考虑了细胞注射部位中正常组织完整性的任何类型的变化。该方案适用于IDPSC群，尤其是关于所用细胞数量，其基于20％的表达多能标志物的IDPSC而计算的。在我们先前采用ES和iPS细胞的检验中，我们使用了106个细胞，而为了检验IDPSC和对照细胞的致畸性，使用5×106个细胞。4个月后，即使在宏观上，未观察到肿瘤，处死小鼠并从如脑、肺、肾、脾、肝的不同器官获得冷冻切片，并由病理学家进行分析。
尽管在所有研究的器官中发现都存在IDPSC的DNA，但未观察到肿瘤形成或任何形态变化。
实施例7.鉴定干细胞疗法的有效全身施用的参数
建立适合的干细胞群的细胞培养条件。
培养条件，如培养介质和粘附表面，可以影响细胞的基因表达。这些基因包括ABCG2和波形蛋白，这两种基因可以表明培养的细胞用于治疗用途的适合性，尤其是如本发明的全身细胞系统。检验的最适合的培养介质形式是DMEM/F12基础介质，其补充有5-10-15％的FBS、抗生素和谷氨酸盐，并且应该在不含粘附层的条件下培养细胞(例如不具有细胞外基质(ECM)或支架)，从而细胞直接粘附在培养皿或塑料珠上。采用上皮生长介质条件生长的细胞变成上皮样细胞。使用不同的无异种介质将需要生长因子补充剂以及选择适合的ECM涂层，其可用于将当前细胞放大到3D培养条件，包括生物反应器如Terumohollofiber生物反应器、具有珠子的Eppendorf-New Brunswick生物反应器等。ABCG2表达与细胞未分化状态的关联显示在图10和图11中，表明了一旦ABCG2由于培养介质或涂层变化而不表达，则细胞具有明显更多的成纤维细胞或上皮细胞样形态。另一个令人惊讶的发现是，现有技术中常规用于维持或诱导胚胎干细胞的典型介质，即Dulbeccos改良Eagle介质(DMEM)无血清介质KOSR(KSFM)，不利于产生或维持来源自hDPSC的多能细胞。如图11所示，使用具有和不具有纤连蛋白的支架/ECM基质涂层或支架的该介质导致hIDPSC分化成成纤维细胞样(图11)或上皮样细胞。与单独使用Dulbeccos改良Eagle介质(DMEM)相比，发现Dulbeccos改良Eagle介质(DMEM)或Neurobasal介质(NB)如果补充有B27并且任选地补充有FGF和/或EGF，则导致神经元样谱系的形成。用于分化成神经谱系细胞的示例性方案也已在先前的专利申请中描述，例如，国际申请第PCT/IB14/59850号和美国专利申请第14/2140,016号。
分化为角膜细胞
材料与方法
去上皮化的羊膜作为用于hIDPSC细胞培养的潜在的含纤连蛋白的支架
从供体胎盘获得羊膜(AM)并储存在-8℃(Covre JL等人2011)。在使用AM之前，将其在室温下解冻并在PBS中洗涤三次。接下来，从硝酸纤维素膜上移除AM并再次洗涤。为了去除上皮细胞，将AM与EDTA一起孵育2小时。然后，机械地去除上皮细胞。去除上皮细胞后，AM变得透明。将完全透明的AM转移到衬垫(inserts)上(Covre JL等人2011和Melo GB等人2007)。
IDPSC培养
从乳牙的牙髓中分离人IDPSC(2n＝46，XX)，并且按照先前所述进行表征(Kerkis等人，2006)。将hIDPSC维持在Dulbecco改良Eagle介质(DMEM)/Ham's F12(1：1；Invitrogen，Carls-bad，CA)中，其补充15％胎牛血清(FBS；Hyclone，Logan，UT)、100单位/mL青霉素(Gibco，Grand Island，NY)、100μg/mL链霉素(Gibco)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco)和2mM非必需氨基酸(Gibco)。每天更换培养介质，每3天替换一次细胞。在它们达到80％汇合后，将它们在无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS；Gibco；0.01M，pH7.4)中洗涤两次，用0.25％胰蛋白酶/EDTA(Invitrogen)酶促处理，并接种到先前制备的羊膜上。
培养介质
为了选择在AM上培养IDPSC的最佳培养介质，我们检验了以下培养介质：A)第一种是补充有激素上皮介质(SHEM)，Dulbecco改良Eagle介质/Ham's F-12营养混合物的组合(DMEM/F12；Invitrogen,Gibco Cell Culture,Port-land,OR；1:1)，其含有1.05mM钙，补充有5μg/ml结晶牛胰岛素(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)、30ng/ml霍乱毒素(Calbiochem，San Diego，CA)、2ng/ml表皮生长因子(EGF，R&D Systems，Inc.，Minneapolis，MN)、0.5％二甲基亚砜(DMSO，Sigma Aldrich)、0.5μg/ml氢化可的松、5ng/ml亚硒酸钠和5μg/ml脱铁运铁蛋白，并补充10％胎牛血清(FBS)。所有试剂均获自Invitrogen Corporation(GrandIsland，NY)，除了文中指示的那些。B)第二种是角质形成细胞无血清介质(KSFM)，其含有0.09mM钙，补充有30mg/ml垂体牛提取物、0.2ng/ml EGF、10％FBS和氨苄青霉素/链霉素。C)第三种是Epilife介质(Cascade Biologics，Portland，OR)，其含有0.06mM钙，补充有1％“人角膜生长补充剂”(Cascade Biologics)，其含有0.2％垂体牛提取物、5g/ml牛胰岛素、0.18mg/ml氢化可的松、5μg/ml牛转铁蛋白、0.2ng/ml EGF、加入有1％青霉素G钠(青霉素G钠10000g/ml、硫酸链霉素25mg/ml、在0.85％NaCl中的两性霉素B)，以及5％FBS。D)敲除介质。
抗体
小鼠抗人单克隆抗体：ABCG2(Chemicon)以及细胞质/核单克隆抗体：小鼠抗细胞角蛋白3/12(K3/12)(RDI，Flanders，NJ，USA)，其与人和兔反应。如所述的(Kerkis等人，2006)获得小鼠抗人IDPSC抗体，并且我们在先前的研究中成功地使用了它们(Fonseca等人，2009；Monteiro等人，2009)。
免疫荧光染色
细胞在玻璃盖玻片上生长至70％汇合，并且在AM上生长，在PBS(Gibco)中洗涤并采用4％多聚甲醛(Sigma)固定过夜。将盖玻片在含有20mm Tris-HCl pH 7.4(Vetec,Duquede Caxias,RJ,巴西)、0.15m NaCl( Reagent, Paulo,SP,巴西)和0.05％Tween-20(Sigma)的tris缓冲盐水(TBS)中洗涤三次。使用0.1％Triton X-100进行透化，持续15分钟(Santa Cruz Biotechnology)。将细胞洗涤三次，并在PBS pH 7.4(Gibco)中的5％牛血清白蛋白(Sigma)中孵育30分钟。在不同稀释度(ABCG2和K3/12(1：100)和抗hIDPSC(1：1000))的每个玻片上加入一抗1小时，将其在室温下孵育。在TBS中洗涤(三次)后，将细胞在黑暗中与缀合异硫氰酸荧光素(FITC)的第二抗小鼠抗体孵育1小时，所述稀释度为1：500。将显微镜玻片安装在具有4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的抗荧光衰减封片剂(antifade solution,Vectashield mounting medium,Vector Laboratories,Hercules,CA,USA)中，并使用共聚焦显微镜进行分析。将对照反应物与PBS一起孵育而不是一抗，然后洗涤并与各自的第二抗体孵育。所有实验以一式三份进行。
结果
生长在塑料基质上不同培养介质中的IDPSC中未分化的LSC和分化的角膜细胞蛋白的表达
分析了ABCG2蛋白(ATP结合盒亚家族G成员2)的表达模式，ABCG2蛋白通常用于LSC表征，以及CK3(细胞角蛋白3)和编码I型中间丝链的细胞角蛋白12，二者均在角膜上皮细胞中表达。图12描述了当在不同的培养介质中培养7天期间，IDPSC在研究的蛋白的表达方面具有差异应答。当在SHEM、KSFM、Epilife和DMEM/KO中培养时，在塑料表面上生长的IDPSC不表达ABCG2(图10A1-A4)，当它们在基础培养介质中培养时，该蛋白仅在IDPSC中表达(图10A5)。有趣的是，在SHEM和DMEM/KO中培养的IDPSC在七天后它们的形态将从成纤维细胞样(图10A5)变化为上皮样(图10B2和B4)并且开始表达CK3/12，而在Epilife和KSFM和DMEM/F12中培养的IDPSC没有开始表达K3/12(图10B1、B3、B5)。
在AM上在不同培养介质中生长的IDPSC中未分化的LSC和分化的波形蛋白标志物的表达
接下来，在7天期间在AM上生长的IDPSC中验证这些标志物和另外的波形蛋白的表达(图11)。当在该介质中生长并且与Epilife组合时细胞在AM上的粘附性低，由于细胞存活很低(低于50％)，则在该研究中排除了Epilife。在所有样品中观察到波形蛋白表达(图11A-A3)，其在DMEM/F12和SHEM中培养的IDPSC中呈阳性(图11A和A2)，并且在KSFM和DMEM/KO中培养的IDPSC显示弱阳性(图11A2和A3)。对于在SHEM和DMEM/F12中培养的IDPSC，ABCG2抗体显示强免疫阳性(图11B和B1)，在KSFM中培养的IDPSC中不表达(图11B2)，并且在DMEM/KO中培养的IDPSC显示弱免疫反应性(图11B3)。IDPSC不与在DMEM/F12和KSFM中培养的IDPSC反应(图11C和C4)，并且当在SHEM和DMEM/KO中培养时，显示出与K3/12非常弱的免疫阳性(图11C1和C3)。
实施例8.临床前药理学研究
图12总结了临床前药理学研究，其旨在检测试验用药品CELLAVITATM(干细胞)的不同临床应用。尽管进行了许多研究以调查细胞对不同适应症的药理学功效，但它们都证明了产品以及所建议的静脉内施用的安全谱。
实施例9.产品描述和说明
表7描述了CELLAVITATM(干细胞)说明。
表7：药物产品发布专著
分析程序
安全QC-支原体检验
根据制造商的方案，采用内部RT-PCR检验(EZ-PCR Biological Industries，以色列)，在hIDPSC培养期间定期进行支原体检验。
安全表征-核型分析
已经进行了核型分析以表明核型稳定性，并且该数据已经公开(Kerkis等人，2006；Braga，2011；Lizier等人，2012)。
安全和同一性QC-细胞表面抗原的流式细胞术分析
采用针对不同表面抗原标志物的单克隆抗体进行细胞表面标志物的免疫染色：HLA-DR-FITC、CD44-FITC、CD45-APC、CD105-PE、CD73-FITC、CD90-APC(eBioscience CA，USA)、SOX2–PE、巢蛋白-PE、β-III微管蛋白-APC、NGF-PE(R&D systems，MN，USA)。2×105个细胞用于FACS实验。采用PBS(不具有Ca和Mg)洗涤细胞两次，并悬浮在50μl PBS中。然后将细胞与抗体在室温下孵育15分钟。采用PBS洗涤细胞两次，并采用Becton-Dickinson流式细胞仪分析。分别在575nm、530nm和600nm发射波长处检测PE(FL2)、FITC(FL1)、APC(FL4)的荧光。
活性生物测定QC-ELISA测定
根据制造商的方案(R&D Systems，MN，USA)，通过使用人BDNF Quantikine ELISA试剂盒定量BDNF水平。
将来自不同收获的1×106个细胞接种在75-cm2塑料瓶中。接种后约4天收获上清液。结果表示为BDNF浓度。
批次分析
表8描述了批次号001H1-30/P1-5/F分析。
表8：批次号001H1-30/P1-5/F
稳定性
Avita对hIDPSC稳定性进行了非GMP、非GLP研究。为此目的，建立了单主细胞库，其可以减轻最终批次的变异性。它由5个批次组成，每个批次来源自一个个体的牙髓。如图13所描述的产生细胞。图14显示了hIDPSC稳定性研究的时间表。
研究了来源自低温保存前4批次的hIDPSC的干细胞标志物表达、细胞增殖动态和分化能力，以及注射入裸鼠后在不同器官中的迁移和生物分布。CELLAVITATM(干细胞)显示，在标准培养条件下，来自四个独立批次的第6代的这些细胞表达间充质干细胞(MSC)的表面标志物，如CD105、CD73和CD13。然而，它们缺乏CD45、CD34、CD14、CD43和HLA-DR的表达。这些细胞能够经自发和在体外诱导分化成为成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞、肌肉细胞以及在体外成为神经元。移植到正常小鼠后，这些细胞在肝、脾、脑和肾等中显示出显著的移植。
稳定性程序开发
过去的经验显示，当在-192℃下低温保存时，初始细胞Poll(原代细胞)及其最终混合物(在P5扩增和混合所有转移之后)都是稳定的。
实施例10.亨廷顿氏病动物模型实验
亨廷顿氏病(HD)——作为神经退行性的模型。
亨廷顿氏病(HD)是一种遗传性的脑疾病，其损害某些脑细胞。这种疾病会损害脑中的一些神经细胞，导致这些脑的区域的功能退化和逐渐损失功能。这可以影响运动、认知(知觉、意识、思考、判断)和行为。存在典型的不自主运动称为舞蹈病，其表现为肌肉自发和短暂的收缩。这种症状存在于超过90％的患有该疾病的患者中。随着时间的推移，患者的自主运动变得更缓慢，并且他们在保持平衡时显示严重的困难。经常注意到语言表达(构音障碍)和食物吞咽(吞咽困难)的困难。患者还可能出现肌肉僵硬、痴呆和精神疾患，如抑郁症和妄想症。
HD和神经元细胞损失。
HD的表征在于，在基底神经节中的中型多棘神经元、主要是GABA能神经元的进行性损失。此外，HD与严重的纹状体D1和D2受体损失相关，并且考虑到最近报道了多巴胺受体D2的失调作为模型小鼠中亨廷顿氏病病理学的灵敏的量度(Crook等人,2012；Chen等人,2013)。HD在新纹状体(neostriatum)中变得最为突出，新纹状体通常称为纹状体，其还包括尾状核和壳。在尸检分析期间显示95％的HD脑中的纹状体萎缩，平均体积降低58％(Lange等人，1976；Vonsattel和DiFiglia，1998)。在HD患者中也观察到大脑皮质中体积损失高达29％、丘脑中28％、以及端脑白质中29-34％(De la Monte等人，1988)。此外，与健康对照脑相比，在HD患者中，总脑体积降低了19％(Halliday等人，1998)。
免疫系统和HD。
现今，关于神经炎症在几种神经退行性疾病的发展中的关键作用存在一致的证据。有力提示在HD中炎症对神经退行性的贡献。因此，通过小鼠模型和有症状的以及症状发生前的患者中细胞因子如IL-6的升高表达，明确证明了HD中免疫系统的活化。HD中通过小胶质细胞和星形胶质细胞发生CNS先天免疫细胞的活化，小胶质细胞和星形胶质细胞直接参与几种神经退行性疾病的发病机制。
HD和神经生长因子。
一些研究表明野生型htt蛋白增加CNS细胞中脑源性神经营养因子(BDNF)的表达，而突变的htt蛋白导致脑源性神经营养因子(BDNF)的下调，导致神经营养支持不足和神经元细胞死亡(Zuccato等人，2001)。
Cellavita hIDPSC在临床前模型中的使用
在先前的公开中使用不同的HD的化学模型(喹啉酸，QA；3-硝基丙酸，3-NP)和遗传模型(R6/2-J2；N171-82Q，R6/2)。我们在我们的非限制性实施例中使用通过全身施用3-NP的经典HD样症状诱导模型。临床前安全评价的主要目标是：1)鉴定人的初始安全剂量和随后的剂量递增方案；2)鉴定毒性潜在的靶器官和研究这种毒性是否可逆；3)鉴定临床监测的安全参数；4)鉴定大鼠脑中的IDPSC。
我们的研究中的HD是采用3-NP诱导的，它是一种不可逆的琥珀酸脱氢酶抑制剂，可以抑制克雷伯氏循环(Krebs cycle)和复合物II，并且对大鼠和灵长类动物全身施用3-NP，可以产生选择性纹状体病变，这是一种继发性兴奋毒性机制的结果[95-96]。这些病变准确地复制了HD患者中观察到的许多运动和神经病理学症状。全身施用3-NP导致纹状体NADPH-心肌黄酶和大胆碱能神经元的差异保留(sparing)，电子传递链中纹状体GABA能神经元活性的显著损失。
我们在我们的临床前研究中使用了雄性、起始体重在300克到350克之间的3月龄的Wistar大鼠。每天腹膜内注射20mg/kg的3-NP(Sigma-Aldrich)诱导HD持续4天。根据已经由Kerkis及其同事(2006)建立的方案分离人IDPSC。将细胞扩增至第4代。细胞对MSC标志物如CD105、CD90和CD73；周细胞标志物如CD146；和神经嵴干细胞标志物如CD271具有免疫阳性。细胞对CD45(血细胞标志物)和HLA II(主要组织相容性复合物：人白细胞抗原II类分子)是阴性的。所有程序都是在专门从事神经系统疾病的兽医在场和监督下进行的。
A.采用3-NP诱导的HD实验大鼠模型中hIDPSC的短期作用。
为了观察IDPSC在纹状体和其它脑室中的追踪和生物分布，它们先前采用Vybrant(绿色染料，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA；V12883)染色。采用3-NP酸进行HD诱导24小时后，静脉内(尾静脉)移植总共1×106个IDPSC，4天后(中试研究)或35天后(组I研究)使动物安乐死。收集脑用于组织学和免疫组织化学分析(图15和16)。
为评价由3-NP诱导的神经退行性过程和IDPSC移植对实验组中该过程的作用，使用在图17中的全局生物标志物。
结果：中试研究
图18表明纹状体和皮质实质组织中的hIDPSC植入。使用特异性抗人细胞核抗体(棕色)和抗hIDPSC抗体(绿色)通过免疫组织化学评价组织。hIDPSC与人MSC产生的标志物CD73(红色)共定位，因此产生黄色。(2)通过免疫染色染成棕色的纹状体GABA能神经元来标记神经发生诱导作用，以及(3)由高放大倍数显示的纹状体神经元中受体D2(棕色)的表达显示DA神经元破裂(burst)，而(4)棕色的胶原蛋白1显示出由3-NP模拟HD样纹状体病变所损伤的区域。
采用3-NP酸诱导HD后，小鼠显示出与人HD症状类似的功能和解剖学特征：
1.大多数动物的纹状体有病变。
2.所有接受3-NP的动物显示体重减轻、嗜睡、以及在HD诱导后4天表现出抑郁症状。
3.IDPSC移植后4天，采用IDPSC治疗和对照组(未治疗)的动物重量无显著差异。
4.两组都表现出嗜睡和抑郁的行为。
5.在IDPSC移植后4天，它们分布在前脑-纹状体的整个皮质下部分(图19)。
此时，hIDPSC显示抗IDPSC抗体CD73和CD105的双阳性免疫染色，表明移植后4天大部分细胞仍然未分化。hIDPSC主要定位于纹状体的实质并靠近毛细血管(图20)。
因此，通过IV移植到由3-NP诱导的HD大鼠中的IDPSC能够穿过BBB并迁移到病变区域。这些细胞在实质和毛细血管周围表现出显著的植入。移植后4天，细胞仍然未分化；然而，也观察到一些表现神经元样形态的人细胞。
结果：组I研究
该研究的目的是在IV注射后30天鉴定大鼠脑中的IDPSC。在IDPSC注射后30天，在皮质中观察到它们，并且主要在靠近毛细血管的纹状体中观察到，典型的脑周细胞定位(图21)。从大鼠脑获得的额外连续切片表明定位于实质中的IDPSC的神经元样形态(图22)。出乎意料地，在脑室下区(SVZ)中发现了IDPSC，脑室下区被认为是成体脑中神经元的干细胞龛(图23)。获得的其它令人惊讶的地出乎意料的结果是，接受hIDPSC移植的大鼠中强烈产生DARPP32阳性神经元。相反，这在对照组中未观察到(图24)。值得注意的是，多巴胺和cAMP调节的磷蛋白Mr 32kDa(DARPP-32)初始被鉴定为纹状体中多巴胺和蛋白激酶A(PKA)的主要靶标。通过不同的神经递质、神经调节因子、神经肽和类固醇激素，在多个脑区域中，DARPP-32磷酸化状态的调节提供了将到达多巴胺受体(dopaminoceptive)神经元的信息进行整合的机制(Svenningsson等人，2004)。HD与严重的纹状体D1和D2受体损失相关，并且考虑到最近报道了多巴胺受体D2的失调作为模型小鼠中亨廷顿氏病病理学的灵敏的量度(Crook等人，2012；Chen等人，2013)，因此我们使用该标志物来评价IDPSC在3-NP诱导的大鼠中的可能作用。
令人惊讶的是，我们观察到与未处理组相比，接受IDPSC的大鼠中受体D2表达的显著差异，可以在对照动物的纹状体中观察到一些受体D2细胞的表达。因此，我们提出用于该蛋白表达的三个评分系统(图25)，其也可以量化。
B.采用3-NP诱导的HD实验大鼠模型中hIDPSC的长期作用。
我们进行了两组新实验(组II和III)，其遵循下一个实验设计(图26)，并且针对几次IDPSC移植和升高的细胞数。观察的临床标志物包括重量减轻和运动退化程度。运动退化的程度可以通过检测HD中的肌张力障碍、嗜睡、后肢无力、腹侧和侧卧位(recumbancy)、或indh的上调(即，运动性能缺陷的上调)来确定。图27显示用于评价运动退化的示例性评分系统。诱导HD后所有研究动物的临床评价示于表9中。图28-31显示了中试研究、组II研究和组III研究中动物的重量变化。在长期研究中，采用IDPSC治疗的动物比未治疗的动物具有更高的体重。
表9.使用3-NP诱导HD后所有四组实验的临床评价总结。
实施例11.亨廷顿氏病的3-硝基丙酸(3-NP)大鼠模型
伦理问题
所有研究均由巴西圣保罗的圣保罗大学核能与能源研究所(Instituto dePesquisas Energéticas e Nucleares-IPEN)伦理委员会批准。关于实验动物的维护、照护和处理的方案符合所有巴西现行立法和国际公认的规范和方案。所有操作实验动物的工作人员均完全被认证为工作人员研究员/技术人员，并根据巴西现行规定接受过使用实验科学目的动物的适合的培训。
主要目标
该研究组检验了hIDPSC在亨廷顿氏病的3-NP化学模型中的神经保护和/或神经组织重塑作用。
动物模型
线粒体毒素3-硝基丙酸(3-NP)的全身施用用作啮齿类动物和非人灵长类动物中亨廷顿氏病的化学模型，并已用于检验潜在的药物疗法。3-NP是一种不可逆的线粒体琥珀酸脱氢酶(SDH)抑制剂，主要在纹状体和GABA能中型多棘投射神经元和多棘中间神经元中引起细胞死亡。由于其能够穿过血脑屏障，可以全身施用3-NP，引起纹状体或整个纹状体的选择性神经退行性。根据药物方案，3-NP施用可以模拟亨廷顿氏病的不同阶段。腹膜内注射两3-NP剂量会导致小鼠出现疾病早期阶段的运动机能亢进的症状，而四剂量或更多剂量会导致疾病晚期阶段的活动减退(Beal等人，1993；Brouillet等人，1995；Yang等人，2008；Borlogan等人，1997)。
应注意的是，与转基因相比，3-NP处理的动物(化学模型)具有重要的限制。在3-NP模型中，纹状体病变可在10-12天后自发再生，因为存在正常的固有神经元前体并且缺乏提供恒定神经退行性的遗传背景。因此，在自发神经再生之前可以观察到实验组和对照组之间的运动和功能改善的差异。
hIDPSC移植的简要方案
重量350-450g的Lewis大鼠(n＝124)每天一次腹膜内(IP)注射20mg/kg的3-NP，持续4天。将动物在光/暗循环下保持12小时，并自由获取食物和水。IP注射3-NP至大鼠以诱导脑损伤。接下来，将它们麻醉，以及每只动物尾静脉注射一或三剂量，每剂量为在250μl盐水溶液中的1x106个hIDPSC或者在300μl盐水溶液中的1x107个hIDPSC，其分别对应于0.35x106和3.5x106/kg。间隔30天施用多剂量(图32)。
每个处理组与仅接受盐水溶液的对照组(“未处理”)配对。因此，将动物分成五组，如表10所示。
表10.本研究中使用的动物的组和数量。
功能分析
半定量神经量表
使用改编自Ludolph等人(1991)的定量神经量表，每个实验组的一名盲法观察者每周两次评价行走能力。该量表测量平坦木质表面上的大鼠的行走行为(评分为0-4)，如下：0：正常行为；1：一般缓慢；2：不协调和步态异常；3：上肢瘫痪或障碍、无法移动；4：无法离开卧位。
在基线时，两组中的所有大鼠(30只)表现出正常行为，在用3NP处理之前没有明显的步态异常，因此评分0。最后3NP施用(4天)结束3NP诱导，总共76只大鼠表现一般缓慢(评分1)；2只大鼠表现出难以移动(评分2)；20只大鼠表现出因前肢和后肢障碍而无法移动(评分3)；24只大鼠表现出伏卧位并因此死亡(评分4)。在24小时后HIDPSC移植，与采用3NP处理的大鼠相比，采用3NP+hIDPSC(两剂量)处理的大鼠表现更好。然而，在hIDPSC移植后5天，大鼠在HDPSC移植后表现出更好的改善。总共27只大鼠表现正常评分(评分0)。此外，20只大鼠表现评分1，3只评分2以及2只评分3，以及在HIDPSC移植后没有大鼠表现评分4(表12)。而对照组(3NP+盐水溶液)中38只大鼠表现评分1，1只评分2以及5只评分3和1只大鼠表现评分4(表11)。
表11.在3NP处理(4天)结束5天后的神经等级量表评分。对照组的大鼠评分(3NP+盐水溶液)。
组 评分0 评分1 评分2 评分3 评分4
GI 0 16 0 0 0
GII 0 9 0 3 0
GIII 0 10 0 1 0
GIV 0 3 1 1 1
合计 4 38 1 5 1
表12.在3NP处理(4天)结束5天后的神经等级量表评分。对处理组的大鼠进行评分(3NP+hIDPSC)。
组 评分0 评分1 评分2 评分3 评分4
GI 8 11 0 0 0
GII 10 3 0 1 0
GIII 7 3 0 0 0
GIV 2 3 3 1 0
合计 27 20 3 2 0
表13描述了3NP处理(施用4天)，在3NP诱导后1天和5天以及HIDPSC移植后对照组(3NP+盐水溶液)和hIDPSC组(3NP+hIDPSC移植)的神经评分。不具有步态异常的正常行为(评分0)；一般缓慢(评分1)；不协调和步态变化(评分2)；无法移动后肢或前肢(评分3)；以及无法离开卧位。最后一组最终死亡(评分4)。组1＝处理＝单次施用1×106个hIDPSC；组2＝处理＝3次施用1×106个hIDPSC；组3＝处理＝单次施用＝1×107个hIDPSC；组4＝处理＝3次施用1×107个hIDPSC。
表13.不同组大鼠的神经评分。
组织病理学和免疫组织学分析
在注射hIDPSC后7、30和90天进行组织病理学和免疫组织学分析；采用4％多聚甲醛(在PBS中制备，0.1mol/L)灌注动物。将组织片段在递减的乙醇系列(75、95和100％)中脱水，并使用0.1％甲酚紫的尼氏(Nissl)染色剂染色。使用两种抗体，如抗人核和抗hIDPSC(1：1000，Abcam Plc)来确定大鼠脑中hIDPSC的存在。为了评价hIDPSC的神经保护和神经修复作用，使用抗GABA能中型多棘神经元DARPP32(1：1000，Abcam Plc)、多巴胺D2(1：800)和BDNF(1：500)抗体。
hIPDSC植入大鼠脑
该研究最相关的发现之一是在皮质和纹状体中检测到hIDPSC，表明它们能够穿过血脑屏障并迁移到损伤部位(图33)。在图33中，光学切片表明在不同的焦深(A1-A4)存在用Vybrant(绿色)染色的IDPSC，核采用PI(红色)进行染色。细胞表现出毛细血管主要相关以及不同的形态类型：神经元样细胞和周细胞。在A2、A3和A4上，可以观察到沿着毛细血管的不同位置的两个周细胞，并且两者均表现类似的形态。在A4显示了轴突分支。神经元核用核仁点亮显示(light)，并且可以观察到与被强染色的周细胞核的差异。蓝色是共聚焦显微镜的人造色。显微镜采用落射荧光+数字干涉对比(DIC)，比例尺＝10μm。
此外，在hIDPSC施用后4天，一些细胞对特异性MSC抗体(抗CD73和抗CD105)呈阳性，表明此时一些细胞仍然未分化(图34)。然而，在同一阶段也观察到hIDPSC衍生的神经元样细胞和周细胞(来自微血管的血管周细胞)(图33)。
在图34中，光学切片表明采用Vybrant(绿色)染色的IDPSC，以及与抗IDPSC抗体(红色)阳性反应。两者的叠加产生黄色。细胞表现出接近毛细血管定位。使用MSC的两种标志物：CD73和CD105，表明与IDPSC的阳性反应。使用采用落射荧光+数字干涉对比(DIC)的共聚焦显微镜。比例尺＝A＝5μm；B＝10μm；C＝20μm；D＝5μm。
在hIDPSC移植后30天，在皮质中观察到一些hIDPSC，并且沿着毛细血管在纹状体中观察到大量细胞(图35)。从大鼠脑中获得的连续切片表明了定位于实质中的IDPSC的神经元样形态(图35)。此外，还观察到神经元样和成纤维细胞样细胞，证实hIDPSC经历分化(图36)。出乎意料地，IDPSC也发现在脑室下区(SVZ)，其被认为是成体脑中神经元的干细胞龛(图35)。
神经保护和神经修复作用
使用尼氏染色和DARPP32表达通过神经元损失确定3-NP诱导的纹状体病变(分别为图37和图38)。尼氏染色用于鉴定脑和脊髓中的神经元结构(图37)，而DARPP32是在GABA能神经元中表达并在健康哺乳动物的纹状体中普遍存在的细胞骨架标志物(图38)。使用这两种标志物，纹状体中的神经元损失评分如下：
·评分1(严重)：严重神经元损失，具有退化区域，侧纹状体中DARPP32免疫染色损失，中央纹状体中细胞很少或没有细胞；
·评分2(中度)：中度神经元损失，具有“暗神经元”(死亡或细胞凋亡神经元)和少量DARPP32+细胞；以及
·评分3(轻度)：无神经元损失和强的DARPP32免疫染色(Vis等人，2001)。
与对照(无3-NP或hIDPSC)相比，3-NP处理的动物在纹状体中显示完全或部分神经元损失。两个实验组(处理和未处理)相对于对照表现为纹状体中神经元损失的不同评分。然而，形态测定组织学分析显示大多数hIDPSC处理的动物具有评分3和2，而大多数未处理的动物(3-NP+盐溶液)具有2和1的神经元损失评分(图38)。没有动物具有可见的萎缩(图37和图38)。
图39描述了hIDPSC后大鼠纹状体中的神经元生长。施用hIDPSC在hIDPSC处理的动物中导致神经修复作用，(A)尼氏染色和(B)DARPP32表达。(C)与对照相比，在施用hIDPSC后显示神经元恢复的动物数量。大多数hIDPSC处理的动物(3-NP+hIDPSC)具有评分3和2(中度和轻度)，而大多数未处理的动物(3NP+盐水)具有评分2和1(严重和中度)。
我们还观察到，在hIDPSC处理的动物中DARPP32表达高于未处理的动物(图40)，表明神经元再生。图40中的光学切片表明神经元与DARPP32阳性地反应。
据报道，多巴胺受体D2的失调是模型小鼠中HD病理学的灵敏的量度(Crook等人，2012)。对于接受hIDPSC移植的大鼠中强烈产生DARPP32阳性神经元，获得了令人惊讶地出乎意料的结果。相反，在对照组中未观察到这种情况(图38)。值得注意的是，多巴胺和cAMP调节的神经元磷蛋白(DARPP-32)初始被鉴定为纹状体中多巴胺和蛋白激酶A(PKA)的主要靶标。通过不同的神经递质、神经调节因子、神经肽和类固醇激素，在多个脑区域中，DARPP-32磷酸化状态的调节提供了将到达多巴胺受体神经元的信息进行整合的机制(Svenningsson等人，2004)。HD与严重的纹状体D1和D2受体损失相关，并且考虑到最近报道了多巴胺受体D2的失调作为模型小鼠中亨廷顿氏病病理学的灵敏的量度(Crook等人，2012；Chen等人，2013)，因此我们使用该标志物来评价IDPSC在3-NP诱导的大鼠中的可能作用。
令人惊讶的是，我们观察到与未处理组相比，接受IDPSC的大鼠中受体D2表达的显著差异，可以在对照动物的纹状体中观察到一些受体D2表达的细胞(图41)。
在HD患者的小脑、尾壳核、纹状体和大脑皮质中观察到BDNF的mRNA和蛋白水平降低(Adachi等人，2014)。在目前的研究中，在hIDPSC施用后7和30天，在hIDPSC处理的动物的纹状体、尾状核、脑室下区观察到BDNF表达(图40)。脑室下区的BDNF表达表明hIDPSC促进神经发生。在未处理的动物(3-NP+盐水)中未观察到BDNF表达。
采用运动神经元标志物DARRP32观察到hIDPSC的共定位，提示hIDPSC分化成成熟神经元。在该HD的3-NP模型中，在hIDPSC施用后30天，在hIDPSC处理的动物的纹状体中检测到DARPP32表达(图41)。这些数据表明hIDPSC在体内分化成GABA能多棘神经元。应该注意的是，纹状体中神经递质和神经调节信号的整合在基底神经节功能中起着重要作用。此外，在GABA能中型多棘神经元对多巴胺和谷氨酸盐进行应答的整合中，DARPP32是关键的参与者(Fernandez等人，2006)。
组织学和免疫组织化学分析显示，hIDPSC能够穿过血脑屏障并到达受HD影响的不同区域，包括纹状体和皮质。形态测定组织学分析显示，与未处理的动物(3-NP+盐水)相比，大多数hIDPSC处理的动物在纹状体中显示出轻度神经元损失。此外，hIDPSC显示出神经保护和神经修复作用，如通过BDNF、DARPP32和D2受体表达的上调所显示的，它们在亨廷顿氏病中被下调(Van Dellen等人,2000；Crook和Housman,2012)。
表14.
安全
在实验期间，对于处理和未处理的动物记录以下生理参数：体重以及饲料和水摄入。在hIDPSC处理的动物中观察到的死亡比注射3NP的大鼠更少，表明hIDPSC施用是安全的。此外，结果提示，通过保护动物免受3-NP的神经毒性作用，hIDPSC施用改善了总体存活(表14)。
表14.存活动物对比死亡动物的数量。
评价hIDPSC安全的主要研究是HD的3-硝基丙酸(3-NP)大鼠模型研究。在该研究中，注射两种不同的细胞剂量：分别为1x106和1x107个细胞/移植或3x106个细胞/kg和3x107个细胞/kg。3-NP处理的大鼠接受单次IV注射细胞或以1个月的间隔的总共3次IV注射细胞。
在接受3×106个细胞/kg的3-NP诱导的动物中7只发生死亡，并且在接受3×107个细胞/kg的动物中5只发生死亡。在安慰剂组(不具有细胞移植的3-NP诱导)中，相同数量(12只)的动物死亡。所有死亡的大鼠均表现出极其严重的疾病表现；死亡发生在3-NP施用后5天内。重复的hIDPSC剂量没有发生额外的死亡。根据这些数据，所有早期死亡的可能原因是3-NP毒性。因为重复hIDPSC移植后没有发生死亡，这支持了hIDPSC移植的安全(表14)。
亨廷顿氏病患者尽管足够或高能量摄入，但经常表现出进行性体重减轻。体重减轻可能是能量代谢降低引起的3-NP神经毒性的指标(Saydoff等人，2003；Colle等人，2013)。在3-NP施用后4天，在3-NP处理的动物中未观察到显著的体重减轻。然而，在hDPSC移植后30天，与未处理组(3NP)相比，hDPSC组(1×106个细胞剂量)显示出显著的体重增加。因此，hIDPSC减弱体重减轻(p＝0.01)(图42)。
HD是一种临床上使人衰弱的疾病，没有可用的疗法来阻止或逆转疾病进展。许多疗法治疗HD的一个主要障碍是，它是一种神经退行性疾患，一些靶向全身递送的药物将无法达到靶标；药物通向脑由血脑屏障(BBB)调节。BBB是一种高选择性渗透屏障，可将循环血液与神经系统周围的细胞外液分开。因此，基于细胞疗法的治疗似乎需要绕过BBB的局部递送(即注射穿透选择性渗透屏障)，因为细胞一般不穿过BBB。
广泛的研究显示，hIDPSC具有间充质干细胞(MSC)属性，可以分泌免疫调节和神经营养因子。此外，验证的HD大鼠模型中的组织学和免疫组织化学分析显示hIDPSC能够穿过BBB并到达受HD影响的不同区域，包括纹状体和皮质。形态测定组织学分析显示，与未处理的动物相比，大多数hIDPSC处理的动物在纹状体中显示出轻度的神经元损失。此外，通过上调在亨廷顿氏病中被下调的BDNF、DARPP32和D2受体表达，hIDPSC显示出神经保护和神经修复作用(Van Dellen等人，2000；Crook和Housman，2012)。
最后，评价hIDPSC安全谱的研究显示它们不形成畸胎瘤，它们不表现出染色体畸变，并且它们能够形成人/小鼠嵌合体。由于研究提示hIDPSC在HD治疗中是安全有效的，我们建议使用hIDPSC治疗HD。
实施例12.hIDPSC对脑的神经保护作用。hIDPSC对全身施用(静脉内途径)后大鼠HD模型(由3-NP诱导)中BDNF表达的短期和长期作用。
介绍
神经营养因子，如脑源性神经营养因子(BDNF)，是中枢神经系统神经元功能的基本贡献者。BDNF在神经元存活和生长中起重要作用，其用作神经递质调节因子，参与神经元可塑性，这对学习和记忆是基本的。BDNF还支持神经系统中神经元的分化、成熟和存活，并显示出神经保护作用。BDNF刺激并控制神经干细胞(NSC)中新神经元的生长。在亨廷顿氏病中，BDNF水平降低与神经元损失相关。研究表明它们在患病脑中的可用性降低，因此提示它们在神经疾患特别是在HD中起重要作用。在非病理条件下，BDNF在皮质、黑质致密部、杏仁核和丘脑中合成。所有这些区域都为纹状体提供BDNF。在HD中，纹状体中BDNF的缺乏可能是由于大脑皮质中BDNF基因转录降低或BDNF囊泡转运降低(或两者)。在HD中观察到的BDNF表达的降低损害了多巴胺能神经元功能，这可能与HD运动障碍相关。因此，已经进行了许多研究以检查增加的BDNF水平是否可以帮助治疗HD(1-7)。
材料与方法
化学HD模型。重量350-450的Lewis大鼠每天一次腹膜内注射20mg/kg的3硝基丙酸(3-NP)(Sigma Aldrich)，持续4天。将动物在光/暗循环下保持12小时，并自由获取食物和水。注射3-NP至大鼠以诱导脑损伤。在3NP施用后，在皮质、海马体和纹状体中发生BDNF表达的降低。
hIDPSC移植。将动物麻醉并向尾静脉通过静脉内注射一剂量在200μL PBS(磷酸盐缓冲盐水)中的1x106个hIDPSC。对照动物仅以相同途径接受200μL PBS。
免疫组织化学使用抗人抗BDNF(Santa Cruz)抗体和免疫组织化学测定分析BDNF的表达。在细胞移植后4和30天处死采用3-NP诱导并采用hIDPSC或安慰剂处理的HD动物，分离脑并解剖各脑室，固定于在PBS中的4％多聚甲醛中并包括在石蜡中。使用常规技术将石蜡玻片脱蜡。然后，将玻片与氢氧化氨(Sigma-Aldrich)孵育10分钟，并在蒸馏水中洗涤4次，每次5分钟。使用pH 6.0的柠檬酸钠缓冲液(Sigma-Aldrich)在设定为95℃的水浴中持续35分钟进行玻片的抗原修复。采用过氧化氢(Sigma-Aldrich)封闭玻片15分钟，并在4℃下与兔多克隆抗人BDNF抗体(N-20)一起孵育过夜，所述抗体在BSA(Sigma-Aldrich)中以1：500稀释。然后，采用PBS冲洗玻片三次，每次5分钟，并加入在PBS中1：100稀释的抗兔AP(SC-2057)(两种抗体来自Santa Cruz Biotechnologies，Dallas，Texas，USA)在室温下40分钟。然后，将玻片在PBS中洗涤三次，每次5分钟。最后，应用permanent fast red系统(Abcam，Boston，MA，USA)产生棕色染色。采用苏木精(Sigma-Aldrich)对免疫染色的切片进行复染，以在光学显微镜下观察(Axio Observer；Zeiss,Jena,德国)。
结果
hIDPSC移植的短期作用：大鼠由3-NP刚诱导HD后以及在hIDPSC移植后4天的BDNF表达。
图43表明大鼠皮质(图43 1a和1b)和纹状体(称为NSC龛)(图43 1e和1f)中众多的BDNF阳性细胞(此处和进一步的棕色)。在海马体中观察到一些这些细胞(图43 1c和1d)。然而，这些细胞显示出与神经元祖细胞和未成熟神经元类似的形态。接受盐水溶液(PBS)的3-NP处理的动物未显示任何BDNF分泌细胞(图43 2a至2f)。
hIDPSC移植的长期作用：大鼠由3-NP刚诱导HD后以及在hIDPSC移植后30天的BDNF表达
图44表明皮质中众多形态上成熟的神经元，其分泌BDNF(图44 1a和1b)。在海马体中，还存在分泌BDNF的细胞(图44 1c和1d)，并且在纹状体中观察到许多表达BDNF的细胞(图44 1e和1f)。在对照组中，仍未观察到BDNF分泌(图44 2a至2f)。
结论
在本研究中，在皮质和纹状体中检测到许多细胞表达BDNF，但在每组由至少10只动物组成的四组中海马体中只有一些细胞表达BDNF。两组由3-NP动物组成，并且在hIDPSC移植后4天(图43)和30天(图44)分析BDNF表达。两对照组由仅接受PBS的3-NP动物组成，并分别在4(图43)和30天(图44)后进行分析。这些数据表明hIDPSC的神经保护作用，其通过移植后不久在3-NP处理的大鼠脑中通过固有大鼠干细胞诱导BDNF表达起作用，并且该作用影响固有大鼠NSC存活和分化成成熟神经元。此外，hIDPSC的移植在移植后30天提供神经元再生(图44)。
以前的研究将纹状体中的BDNF缺乏与HD发病机制紧密联系。目前，开发的治疗HD的药物能够改善症状并不会延缓疾病进展。因此，恢复纹状体中的纹状体BDNF水平可能对HD具有治疗潜力。实施例10和11还表明了在hIDPSC处理的HD动物中改善的行为表型。该结果支持表明BDNF表达可以克服在HD患者中观察到的功能缺陷6,7。
实施例13.狗的多发性硬化样犬瘟热病毒(CDV)疾病的兽医治疗
狗中的CDV是明确定义的病毒诱导的脱髓鞘模型，其病因类似于多发性硬化的病因。本文公开的实施例中显示的功能恢复提示IDPSC在CDV病理生理条件下诱导胶质细胞生成，其与我们先前在Cellavita方法培养的hIDPSC中p75神经营养因子受体(一种施万细胞(Schwann cell)标志物)的表达相关；或/和诱导免疫保护机制以提供功能恢复。测试了20多只狗，参见表中的结果。(本文没有显示类似的恢复结果，在IDPSC成功治疗的一些马中发现了类似麻疹样病毒疾病的症状)。
下面的表15简要显示大多数患者症状恢复；只有一名患者完全没有作用。大多数患者在第二次移植后有恢复症状，而一些患者在第一次移植后已经表现了恢复的趋势。超过90％在第3次移植后表现出部分恢复。约有50％在第三次移植后表现出完全恢复。
表15.IDSPC移植之前和之后20只狗的神经状况
表16.患者的描述和干细胞施用时间以及用于狗的细胞的量
实施例14.通过晚期群方法，多次收获器官和hIDPSC-CELLAVITATM(干细胞)产物的组织外植体培养的工业扩大的批量发布过程
术语
CELLAVITATM(干细胞)是最终制剂前的原材料(bulk material)。CELLAVITATM(干细胞)被称为原料药(Drug Substance，DS)。用于IV输注的CELLAVITATM(干细胞)被称为成品药(Drug Product，DP)。CELLAVITATM(干细胞)原料的加工起始于供体筛选和检验，以及在最终制剂和低温保存细胞储备之前结束。成品药的制备涉及用额外的赋形剂对CELLAVITAT(干细胞)原料进行制剂。
一般性质
在一个实施方案中，CELLAVITATM(干细胞)是表达神经嵴细胞/间充质干细胞/祖细胞标志物的干细胞，如CD13、CD105(内皮糖蛋白)、CD73、CD29(整联蛋白b-1)、CD44和巢蛋白(Kerkis等人，2009；Kerkis等人，2006)，其使用多次收获器官和组织外植体培养物获得。
在另一个实施方案中，CELLAVITATM(干细胞)是MSC样细胞，其具有这些细胞的所有基本性质。根据用于定义多能间充质基质细胞的最低标准来定义细胞，该标准由国际细胞疗法协会的间充质和组织干细胞委员会建立。该定义包括在标准培养条件下维持时呈现贴壁粘附(plastic-adherent)，表达CD105、CD73和CD90，缺乏CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79α或CD19和HLA-DR表面分子的表达，以及体外分化成成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞的能力(Dominici等人，2006)。
试验用药品CELLAVITATM(干细胞)的制造方法
只有6-12岁儿童的健康牙齿可用于培养CellavitaTM。按照欧洲委员会关于供体资格的指南(委员会指令2006/17/EC)的建议，儿童的法定监护人回答关于儿童健康的资格问卷，并收集血液样品进行血清学检验，以检测感染疾病。强制性检验包括HIV-1和HIV-2(抗HIV-1和抗HIV-2)、HTLV-1和HTLV-2、HBV(尤其是HBsAg，抗HBc)、HCV(尤其是抗HCV-Ab)和梅毒螺旋体(梅毒)的检测(委员会指令2006/17/EC)。
在天然损失或手术拔除后，仅收集不具有牙齿疾病如龋齿的健康牙齿。为了避免不必要的检验，只有牙齿具有可养活的牙髓的供体(在细胞培养两周后在实验室中确定的过程)被要求返回中心进行供体资格检验(血液收集)。
牙齿收集、容器、运输
在自发脱落后，立即将牙齿浸入在15mL无菌离心管中的由DMEM(Dulbecco改良Eagle介质)和500mM庆大霉素组成的3mL无菌运输溶液中。将牙齿储存在4℃并在48-72小时内处理。
髓分离和洗涤程序
将来自健康受试者的新脱落的乳牙在含有50％pen/strep溶液(100单位/mL青霉素、100单位/mL链霉素)和50％磷酸盐缓冲盐水(PBS)的无菌溶液中重复洗涤。借助无菌针从牙齿上移除牙髓。
选择活髓作为hIDPSC干细胞扩增的原料
将新鲜获得的牙髓(DP)在含有3％Pen/strep溶液(100单位/mL青霉素、100单位/mL链霉素)的溶液中洗涤。牙髓的初始铺板(plating)和活力检测在牙髓维持介质中进行，所述介质补充有15％胎牛血清(FBS，Hyclone)、100单位/mL青霉素、100单位/mL链霉素、2mML-谷氨酰胺和2mM非必需氨基酸。此程序通常需要一周时间。一旦DP被认为是可行的，就将其收获并且hIDPSC被传代。得到的hIDPSC在GTP条件下低温保存用于未来的临床研究。
建议制造过程的描述
在一个方面，生产过程包括图48中所示的步骤，其表明CELLAVITATM(干细胞)分离和批量制剂的初始过程。垂直途径显示牙髓机械转移(收获)早期群hIDPSC(5个收获前的牙髓中分离)和晚期群hIDPSC(5个收获后的牙髓中分离)的过程。水平途径显示细胞被重复传代替换时细胞培养的传统酶促方法。最终批次产品是从牙髓收获和传代(不超过5代)获得的hIDPSC的总和。
在另一方面，生产过程包括图48和/或图49中所示的步骤。生产过程包括CELLAVITATM(干细胞)分离和批量制剂。垂直途径显示对于早期群而言牙髓(DP)机械转移(收获)过程—分离自5个收获前牙髓的hIDPSC，以及对于晚期群而言—分离自5个收获后牙髓的hIDPSC；水平途径显示当细胞被重复传代替换时细胞培养的传统酶促方法。最终批次产品是从牙髓收获和传代(不超过5代)获得的hIDPSC的总和。
根据GMP规定，CELLAVITATM(干细胞)的生产在现有技术的洁净室设施中进行。在一个实施方案中，该生产过程遵循图50中概述的步骤。
hIDPSC收获
当在牙髓外植体周围检测到hIDPSC的半汇合集落形成时，将DP转移到新的细胞培养容器中，以在DP维持介质中继续生长。
hIDPSC传代
用无菌PBS洗涤hIDPSC，用TrypLE溶液移除并离心。将沉淀重悬于DP维持介质中，然后接种在组织培养瓶中(第1代-P1)。当细胞达到约80％汇合时，将它们传代至新瓶(第2代-P2)。将细胞在湿润的5％CO2孵箱中孵育。
冷冻前的安全检验
将来自P5的hIDPSC培养维持至少3-5天，以收集细胞条件介质用于无菌和支原体检验。
·无菌检验由ISO、GMP认证的方法进行。
·使用内部RT-PCR检验(EZ-PCR Biological Industries)且经ISO、GMP认证，进行支原体检验。
冷冻和储存
hIDPSC冷冻方案适用于标准冷冻贮藏方案，将来自P5的hIDPSC的转移到含有1mL冷冻介质的2mL低温保存瓶中，所述冷冻介质由90％FBS和10％DMSO(GMP/US药用级)组成。每瓶低温保存1x106个细胞。
将低温保存瓶置于填装有异丙醇的Nalgene Cryo 1℃冷冻容器内，并置于-80℃过夜。然后，将瓶转移到液氮储罐的气相中并记录它们的位置。
对照材料
表17描述了该过程，其用于对照材料。
表17对照材料
实施例15.体内致瘤性
畸胎瘤的形成是确定任何多能细胞如胚胎或诱导多能干细胞(ES和iPS细胞)的多能性的基本工具。改编自根据Gropp等人2012描述的方案的方案，被用于评价细胞的畸胎瘤形成能力。本文描述的方法基于将确定数目的未分化小鼠或人ES和iPS细胞以及Matrigel基质，皮下共同移植到免疫缺陷小鼠中。当使用106个细胞(不同于Gropp等人，2012，其使用105个细胞)的小鼠ES细胞和人iPS细胞时，所使用的新方法显示出高度可重复性和有效性。在100％的病例中，在大量动物和长期随访(长达6个月)中观察到畸胎瘤的形成。还将这些方法用于其它成体MSC类型的生物安全的评价，如来源自乳牙的牙髓、脐带和脂肪组织的那些。
我们观察了来自hIDPSC的诱导多能干细胞的衍生。通过畸胎瘤形成检验hIDPSC来源的iPS细胞的多能性，而人胚胎干(ES)细胞和hIDPSC用作对照。使用用于ES细胞的畸胎瘤产生的常规方案(Hentze等人，2009)。遵循该方案，每种细胞系106个细胞：hIDPSC-iPS细胞、ES细胞和hIDPSC，接种于4周龄雄性SCID的后腿肌肉中。在用hIDPSC-iPS细胞或ES细胞接种的动物中，在三个月后观察到畸胎瘤形成。然而，在本研究中用作阴性对照并接种于10只动物的hIDPSC在3个月后或6个月的随访后均未产生畸胎瘤。这些动物中的五只在一年内保持存活，甚至在此之后未观察到畸胎瘤形成。
组织学上，多能干细胞中的畸胎瘤形成需要来源自三个胚层的组织的发育。对于成体/间充质干细胞，考虑了移植部位正常组织完整性的任何变化。六个月后，处死采用hIDPSC接种并且不产生畸胎瘤的动物，并分析动物的脑、肺、肾、脾和肝的组织学标本。在所有上述器官中证实了来自hIDPSC的DNA的存在，但是未观察到肿瘤形成或观察到任何形态变化。因此，我们通过试验用药品CELLAVITATM(干细胞)建立了肿瘤形成和免疫排斥风险方面的安全的细胞再生。
另外，如上述在脊髓损伤、颅骨缺损、全缘干细胞缺陷(TLSCD)、肌肉营养不良和股骨头坏死(ONFH)动物模型中使用hIDPSC的研究中所显示的，未观察到畸胎瘤形成和/或免疫排斥风险(Costa等人,2008；Kerkis等人,2008；Monteiro等人,2009；Gomes等人,2010；Feitosa等人,2010；Almeida等人,2011)。
图51总结了额外的已公开的临床前研究，这些研究支持试验用药品CELLAVITATM(干细胞)的安全。
实施例16.畸胎瘤测定的主要标准
我们评价了畸胎瘤测定的下一个标准：敏感性和定量性；确定细胞数和单细胞悬液产生；关于多能细胞标志物表达和核型的研究细胞的免疫表型；将研究细胞与Matrigel基质共同移植。将细胞皮下(s.c)移植到NOD/SCID小鼠中，这允许简单监测畸胎瘤的发展。
从4个月(约16周)监测肿瘤的发展。畸胎瘤的组织学标准是多能细胞分化为来源自三个胚层的细胞。这种研究通常由病理学家进行。
对于成体/间充质干细胞，考虑了细胞注射部位中正常组织完整性的任何类型或任何变化。
畸胎瘤标准的应用
A.实验系统(S)：
a.小鼠胚胎干细胞
b.小鼠3T3成纤维细胞，永生小鼠细胞系Balbc 3T3细胞系，克隆A31
c.人iPS-IDPSC
d.人ES细胞
e.人IDPSC
我们在不同的研究中使用上述方法来表征由我们建立的不同小鼠ES细胞系多能性，和证实在高的25次或更多次传代的ES细胞的多能性，以及表征从小鼠ES细胞系获得的亚克隆(Sukoyan等人，2002；Carta等人，2006；Kerkis等人，2007；Lavagnolli等人，2007；Hayshi等人，2010)。
此外，在我们的小组最近的公开中(-Braga等人，2011)，该方法用于表征来源自未成熟牙髓干细胞(IDPSC)的iPS细胞的多能性。在该公开中，人IDPSC用作iPS-IDPSC的对照。我们显示iPS-IDPSC形成了良好的畸胎瘤，组织起源于所有三个胚层，而hIDPSC不能产生任何类型的畸胎瘤或任何其它类型的赘生物(neoplasm)。此外，iPS-IDPSC在核中表达Nanog，而hIDPSC不表达。
结果
公开的用于分离未成熟牙髓干细胞(IDPSC)群的多次收获外植体样培养物，导致在至少15次传代期间，表达胚胎干细胞标志物Oct-4、Nanog、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81以及几种间充质干细胞标志物，同时维持干细胞的正常核型和扩增速率表征。在从这些细胞获得的亚克隆中维持这些标志物的表达。此外，在体外，可以在化学上确定的培养条件下诱导这些细胞经历均匀分化成为平滑肌和骨骼肌、神经元、软骨和骨。重要的是提及IDPSC，其虽然具有小尺寸，细胞器中细胞质贫乏，这不同于表现典型间充质-成纤维细胞样形态的初始多能细胞。因此，IDPSC是间充质类型的，与上皮型的ES和iPS细胞不同。MSC和ES或iPS细胞之间的主要区别是MSC正在迁移和贴壁锚定(plastic anchoring)，它们合成细胞外基质并且是无细胞连接的细胞。
B.实验系统：
a.早期(n＝10)和晚期传代(n＝10)的IDPSC三种不同的原代培养物
b.人原代成纤维细胞
此外，该方法使用来自骨髓、肝脏、卵黄囊、尿囊和羊膜液的狗胎儿干细胞进行验证，所述胎儿干细胞也表达多能标志物。
IDPSC由MSC群组成，其具有表达多能标志物的可变数量的干细胞(1-25％的细胞)(Lizier等人，2012)。将这些细胞移植到NOD/SCID小鼠(n＝20)中，并从4个月(约16周)监测肿瘤的发展。考虑了细胞注射部位中正常组织完整性的任何类型的变化。该方案适用于IDPSC群，尤其是关于所用细胞数量，其是基于20％的表达多能标志物的IDPSC而计算的。在我们先前采用ES和iPS细胞的检验中，我们使用了106个细胞，而为了检验IDPSC和对照细胞的致畸性，使用5×106个细胞。4个月后，即使在宏观上，未观察到肿瘤，处死小鼠并从如脑、肺、肾、脾、肝的不同器官获得冷冻切片，并由病理学家进行分析。
尽管在所有研究的器官中发现都存在IDPSC的DNA，但未观察到肿瘤形成或任何形态变化。
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Claims (40)

1.一种药物组合物，其包含人未成熟牙髓干细胞(hIDPSC)，其中hIDPSC表达CD44和CD13。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述hIDPSC缺乏CD146、HLA-DR和HLA-ABC的表达。
3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中CD44和CD13的表达使得hIDPSC能够穿过血脑屏障(BBB)。
4.根据权利要求2或3所述的药物组合物，其中缺乏CD146、HLA-DR和/或HLA-ABC的表达防止免疫细胞排斥hIDPSC。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的药物组合物，其中所述hIDPSC表达BDNF和DARPP32。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的药物组合物，其中所述hIDPSC在多次传代后维持集落形成能力。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的药物组合物，其配制用于静脉内(IV)注射。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的药物组合物，其中所述hIDPSC分泌免疫调节和神经营养因子。
9.一种治疗神经疾病或病症的方法，其包括向受试者全身施用包含hIDPSC的药物组合物，其中hIDPSC表达CD44和CD13。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述hIDPSC缺乏CD146、HLA-DR和HLA-ABC的表达。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中将所述药物组合物静脉内施用于所述受试者。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，其中所述hIDPSC是受试者自体的和/或同种异体的。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的方法，其中所述神经疾病或病症选自帕金森病(PD)、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化(ALS)、中风、自身免疫性脑脊髓炎、糖尿病性神经病变、青光眼性神经病变、阿尔茨海默病和亨廷顿氏病(HD)。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述神经疾病或病症是亨廷顿氏病(HD)。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述受试者被诊断患有早期HD，并且向所述受试者施用所述hIDPSC以支持所述受试者中的神经保护机制。
16.根据权利要求13所述的方法，其中所述神经疾病或病症是帕金森病(PD)。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述受试者被诊断患有PD，并且向所述受试者施用所述hIDPSC以修复所述受试者中损失的多巴胺能神经元。
18.根据权利要求9至12中任一项所述的方法，其中所述神经疾病或病症选自自闭症、精神分裂症、中风、局部缺血、运动疾患和惊厥疾患。
19.根据权利要求9至18中任一项所述的方法，其中所述hIDPSC表达BDNF和DARPP32。
20.根据权利要求9至19中任一项所述的方法，其中通过穿过BBB的hIDPSC治疗所述神经疾病或病症。
21.一种防止受试者的中枢神经系统(CNS)中神经元损失的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含hIDPSC的药物组合物，其中所述hIDPSC表达CD44和CD13。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述药物组合物的施用是全身的。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述全身施用是静脉内或腹膜内的。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的方法，其中hIDPSC缺乏CD146、HLA-DR和HLA-ABC的表达。
25.根据权利要求21至24中任一项所述的方法，其中所述hIDPSC是受试者自体的和/或同种异体的。
26.一种促进受试者的CNS中神经元细胞生长和修复的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含hIDPSC的药物组合物，其中所述hIDPSC表达CD44和CD13。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述药物组合物的施用是全身的。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述全身施用是静脉内或腹膜内的。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的方法，其中hIDPSC缺乏CD146、HLA-DR和HLA-ABC的表达。
30.根据权利要求26至29中任一项所述的方法，其中所述hIDPSC是受试者自体的和/或同种异体的。
31.一种增加受试者的CNS中多巴胺和cAMP调节的神经元磷蛋白(DARPP-32)、多巴胺受体D2和/或脑源性神经营养因子(BDNF)的表达的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含hIDPSC的药物组合物，其中hIDPSC表达CD44和CD13。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述药物组合物的施用是全身的。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述全身施用是静脉内或腹膜内的。
34.根据权利要求31至33中任一项所述的方法，其中所述hIDPSC缺乏CD146、HLA-DR和HLA-ABC的表达。
35.根据权利要求31至33中任一项所述的方法，其中所述hIDPSC是所述受试者自体的和/或同种异体的。
36.一种包含表达CD44和CD13的hIDPSC的药物组合物，其用于治疗选自以下的神经疾病或病症：帕金森病(PD)、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化(ALS)、中风、自身免疫性脑脊髓炎、糖尿病性神经病变、青光眼性神经病变、阿尔茨海默病、亨廷顿氏病(HD)、自闭症、精神分裂症、中风、局部缺血、运动疾患和惊厥疾患。
37.包含表达CD44和CD13的hIDPSC的药物组合物用于治疗选自以下的神经疾病或病症的用途：帕金森病(PD)、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化(ALS)、中风、自身免疫性脑脊髓炎、糖尿病性神经病变、青光眼性神经病变、阿尔茨海默病、亨廷顿氏病(HD)、自闭症、精神分裂症、中风、局部缺血、运动疾患和惊厥失常。
38.包含表达CD44和CD13的hIDPSC的药物组合物在制备治疗选自以下的神经疾病或病症的药物中的用途：帕金森病(PD)、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化(ALS)、中风、自身免疫性脑脊髓炎、糖尿病性神经病变、青光眼性神经病变、阿尔茨海默病、亨廷顿氏病(HD)、自闭症、精神分裂症、中风、局部缺血、运动疾患和惊厥疾患。
39.人未成熟牙髓干细胞(hIDPSC)，其中hIDPSC表达CD44和CD13。
40.基本上如上文参考任何一个实施例或任何一个附图所述的hIDPSC、组合物或方法。
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