CN101243178A - 用于治疗cns疾病的分离细胞和包含这种细胞的细胞群 - Google Patents

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Abstract

提供一种分离的人细胞及其细胞群，其包含至少一种星形胶质细胞表型和至少一种间充质干细胞表型，其中所述间充质干细胞表型不是星形胶质细胞表型。

Description

用于治疗CNS疾病的分离细胞和包含这种细胞的细胞群
发明领域和背景
本发明涉及可用于治疗CNS疾病的细胞及其细胞群。
Parkinson病是一种年龄相关性疾病，特征在于中脑黑质中产多巴胺的神经元的进行性损失，其又导致运动功能的进行性损失，这通过诸如震颤、僵化和运动失调的症状表现出来。
当前用于PD的治疗策略集中于恢复多巴胺的损耗，一般通过施用多巴胺前体L-DOPA(L-3-4-二羟基苯丙氨酸)。L-DOPA(多巴胺的血脑屏障(BBB)穿透前体)成功地增加了多巴胺的合成和释放。但是，随着疾病演进，可用于由前体合成多巴胺的多巴胺能神经元减少，并且随着L-DOPA诱发的运动障碍的出现，治疗的有效性下降。采用多巴胺激动剂、单胺氧化剂抑制剂或COMT抑制剂的其它治疗也表现出部分改善，但它们不能阻止疾病演进。
业已表明细胞移植是修复和替换失去多巴胺能的神经元的替代治疗选项。为使此细胞置换疗法起作用，植入的细胞必须在受损伤的组织中在功能上和结构上存活和整合。
最近已提议将干细胞用作Parkinson病细胞置换疗法中的细胞源。干细胞具有以未分化态在体内存在和自我更新的能力。它们不限于对起源组织特异性的细胞类型，所以它们能够响应于来自其它组织的局部环境信号分化。这种自我更新和分化的能力在治愈疾病方面具有巨大的治疗潜力。
在Parkinson病中，干细胞置换策略基于以下想法：多巴胺(DA)神经传递的恢复受到随时间变化整合入剩余组织并产生长期功能性组织的细胞移植物的影响。有两种处理用于在PD中移植的干细胞的方法。在第一种方法中，在移植前，细胞在体外分化为多巴胺能神经元。这使相关细胞得以标准化和质量控制。第二种方法包括移植未分化干细胞，这些未分化干细胞被认为在移植入纹状体或黑质之后在体内分化为多巴胺能神经元。
理论上，用于PD中的细胞疗法的DA神经元可由4种不同来源的干细胞制备：胎儿多巴胺能神经元、神经干细胞、胚胎干细胞和骨髓干细胞。
骨髓包含两种主要的干细胞群：造血干细胞(HSC)和有时称为骨髓基质细胞的间充质干细胞(MSC)。
已表明分化后的大鼠BMSC表达酪氨酸-羟化酶(TH)、胆碱乙酰转移酶和β-III微管蛋白[Woodbury，D.等，J Neurosci Res.69(6)：908-17，2002]。通过将小鼠BMSC纹状体内注射1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)小鼠PD模型中证实了小鼠BMSC在PD中的临床治疗潜力。移植的细胞存活并表达TH。而且已表明在移植后35天转棒实验改善[Li，Y.等，Neurosci Lett.316(2)：67-70，2001]。
本发明人的美国专利申请20050265983讲述了合成人多巴胺的MSC，其在诱导神经元分化后表达表征中脑DA神经元的神经元标记和转录因子。
作为对其中移植细胞必须存活并具有形态学、电生理学和功能性多巴胺能特性的细胞置换策略的替代，细胞疗法可以恢复或重建纹状体的正常解剖学(连通性)和生理学(适宜的突触性接触和功能)为目标。
神经营养因子(NTF)是调节神经元细胞的存活、功能保持和表型发育的分泌性蛋白。NTF水平的改变涉及触发神经元中的程序性细胞死亡，并因此促成Parkinson病和其它神经退化病的发病。
其中一种用于多巴胺能神经元的最有效NTF叫做神经胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)。已知其促进黑质中的多巴胺能神经元存活、促进神经突生长、增加细胞体大小以及还提高TH水平。GDNF属于一个与TGF-β超家族相关的蛋白家族，目前由4种神经营养因子组成：GDNF、Neurturin(NTN)、Persephin和Artemin/Neublastin。这些因子已知用作细胞增殖和分化的调节物。
神经祖细胞(ST14A)的分析揭示，GDNF过度生产可能与涉及轴突发芽、神经突生长、棘形成、囊泡运输和突触可塑性的基因上调有关[Pahnke J等，Exp Cell Res.297(2)：484-94，2004]。还已经表明，GDNF的神经保护活性借助于其对抗氧化酶系统(例如谷胱甘肽过氧化酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性)的活化[Chao CC，Lee EH.Neuropharmacology，38(6)：913-6，1999]。
多种细胞类型生产GDNF，包括神经胶质细胞(少突神经胶质细胞和星形胶质细胞)、成神经细胞瘤和成胶质细胞瘤细胞系。近来已表明在补加20％胎牛血清的DMEM中培养的、传至第6代的大鼠BMSC表达GDNF和NGF[Garcia R等，Biochem Biophys Res Commun.316(3)：753-4，2004]。
GDNF合成可由生长因子、激素、细胞因子和神经递质调节。例如，肿瘤坏死因子-α或白介素-1诱导成胶质细胞瘤细胞释放GDNF。毛喉素或cAMP引起成神经细胞瘤和成胶质细胞瘤这两种细胞系释放的GDNF增加。这些细胞包含神经递质受体，这些受体使得神经递质能够在应力条件下调节生长因子的生产。
业已表明，将GDNF直接施用至脑中在多种PD动物模型有效。另外，细胞在移植前接触GDNF已证明是有益的。例如，在移植前嫁接400,000个胎儿多巴胺能神经元显著改善受损大鼠的转动行为[Mehta V等，J Neurosurg.1999年4月；90(4)：804-6]。
已使用多种方法帮助将GDNF施用入脑中，包括渗透泵、胶囊和微球。用于GDNF传递的另一种方法是体内基因治疗。经由遗传工程表达GDNF并移植入MPTP受损小鼠中的骨髓间充质细胞能够保护黑质神经元以及纹状体纤维[Park，K.，Neurosci.Res.40：315-323，2001]。
几个研究已表明，MSC在体外接触不同因子后改变其表型，表现出神经元和神经胶质标记[Kopen，G.C.等，Proc Natl Acad USA.96(19)：10711-6，1999；Sanchez-Ramos等，Exp Neurol.164(2)：247-56.2000；Woodbury，D.，J Neurosci Res.61(4)：364-70，2000；Woodbury，D.等，J Neurosci Res.69(6)：908-17，2002；Black，LB.，Woodbury，D.BloodCells Mol Dis.27(3)：632-6，2001；Kohyama，J.等，Differentiation.68(4-5)：235-44，2001；Levy，Y.S.J Mol Neurosci.21(2)：121-32，2003]。
但是，这些研究中没有一个表明人MSC能够分泌显著水平的神经营养因子。
因此，对能够合成用于治疗神经变性病的神经营养因子(例如GDNF)的可移植细胞存在着公认的需要，获得这些细胞应当是非常有益的。
发明概述
按照本发明，提供一种分离的人细胞，其包含至少一种星形胶质细胞表型和至少一种间充质干细胞表型，其中所述间充质干细胞表型不是星形胶质细胞表型。
按照本发明的另一方面，提供一种分离的人细胞，其包含至少一种间充质干细胞表型和至少一种星形胶质细胞结构表型，其中所述间充质干细胞表型不是星形胶质细胞结构表型。
按照本发明的又一方面，提供一种分离的人细胞，其包含至少一种间充质干细胞表型和至少一种星形胶质细胞功能表型，其中所述间充质干细胞表型不是星形胶质细胞功能表型。
按照本发明的又一方面，提供一种分离的人细胞，其包含至少一种间充质干细胞表型，并表达至少一种神经营养因子，其中所述表达是间充质干细胞中所述神经营养因子的基础表达的至少2倍高。
按照本发明的另一方面，提供一种含人细胞的分离细胞群，其中：
(i)至少N％的人细胞包含至少一种星形胶质细胞表型；
(ii)至少M％的人细胞包含至少一种间充质干细胞表型，所述间充质干细胞表型不是星形胶质细胞表型；和
(iii)至少一种人细胞同时包含至少一种星形胶质细胞表型和至少一种间充质干细胞表型；
其中M和N各自独立地选自1-99。
按照本发明的又一方面，提供一种含人细胞的分离细胞群，其中：
(i)至少N％的人细胞表达至少一种神经营养因子，其中所述表达是间充质干细胞中所述神经营养因子的基础表达的至少2倍高；
(ii)至少M％的人细胞包含至少一种间充质干细胞表型；和
(iii)至少一种人细胞表达至少一种神经营养因子和至少一种间充质干细胞表型；
其中M和N各自独立地选自1-99。
按照本发明的又一方面，提供一种含人细胞的分离细胞群，其中：
(i)至少N％的人细胞包含至少一种星形胶质细胞结构表型；
(ii)至少M％的人细胞包含至少一种间充质干细胞表型，所述间充质干细胞表型不是星形胶质细胞结构表型；和
(iii)至少一种人细胞同时包含至少一种星形胶质细胞结构表型和至少一种间充质干细胞表型；
其中M和N各自独立地选自1-99。
按照本发明的又一方面，提供一种含人细胞的分离细胞群，其中：
(i)至少N％的人细胞包含至少一种星形胶质细胞功能表型；
(ii)至少M％的人细胞包含至少一种间充质干细胞表型，所述间充质干细胞表型不是星形胶质细胞功能表型；和
(iii)至少一种人细胞同时包含至少一种星形胶质细胞功能表型和至少一种间充质干细胞表型；
其中M和N各自独立地选自1-99。
按照本发明的又一方面，提供一种产生星形胶质细胞样细胞的方法，该方法包括在含血小板衍生生长因子(PDGF)和人神经调节素1-β1的分化培养基中孵育间充质干细胞，由此产生星形胶质细胞样细胞。
按照本发明的又一方面，提供一种产生星形胶质细胞样细胞的方法，该方法包括在含至少一种分化剂的培养基中孵育间充质干细胞，所述至少一种分化剂选自血小板衍生生长因子(PDGF)、人神经调节素1-β1、FGF2、EGF、N2、IBMX和cAMP，由此产生星形胶质细胞样细胞。
按照本发明的又一方面，提供一种治疗CNS疾病或障碍的方法，该方法包括给有需要的个体施用治疗有效量的星形胶质细胞样细胞，由此治疗CNS疾病或障碍。
按照本发明的又一方面，提供星形胶质细胞样细胞CNS疾病或障碍的用途。
按照本发明的又一方面，提供一种药用组合物，其含作为活性物质的权利要求1、2、3、4、5、6、7或8中任一项的任一种细胞或细胞群和药学可接受载体。
按照以下描述的本发明优选实施方案的其它特征，所述细胞未被遗传操作。
按照所述优选实施方案的其它特征，至少一种星形胶质细胞表型是结构表型。
按照所述优选实施方案的其它特征，至少一种星形胶质细胞表型是功能表型。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述细胞还包含星形胶质细胞功能表型。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述星形胶质细胞功能表型不是所述间充质干细胞表型。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述细胞还包含星形胶质细胞结构表型。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述细胞还包含星形胶质细胞结构表型。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述星形胶质细胞结构表型不是所述间充质干细胞表型。
按照所述优选实施方案的其它特征，星形胶质细胞结构表型是细胞大小、细胞形状、细胞器大小和细胞器数量。
按照所述优选实施方案的其它特征，星形胶质细胞结构表型是至少一种星形胶质细胞标记的表达。
按照所述优选实施方案的其它特征，星形胶质细胞标记是结构标记。
按照所述优选实施方案的其它特征，星形胶质细胞标记是内部标记。
按照所述优选实施方案的其它特征，星形胶质细胞功能表型是至少一种神经营养因子的表达，其表达水平是间充质干细胞中所述神经营养因子的基础表达的至少2倍高。
按照所述优选实施方案的其它特征，至少一种神经营养因子选自：神经胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)、神经生长因子(NGF)、脑衍生的神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3(NT-3)、神经营养因子-4/5、Neurturin(NTN)、Persephin、脑衍生的神经营养因子(BDNF)、artemin(ART)、睫状神经营养因子(CNTF)、胰岛素生长因子-I(IGF-1)和Neublastin。
按照所述优选实施方案的其它特征，至少一种神经营养因子是GDNF。
按照所述优选实施方案的其它特征，星形胶质细胞标记选自S100β、胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)、谷氨酰胺合成酶、GLT-1和GLAST。
按照所述优选实施方案的其它特征，GDNF的分泌受IL-1β和/或卡麦角林调节。
按照所述优选实施方案的其它特征，孵育的持续时间为约48小时。
按照所述优选实施方案的其它特征，PDGF的浓度为约5ng/ml。
按照所述优选实施方案的其它特征，人神经调节素1-β1的浓度为约50ng/ml。
按照所述优选实施方案的其它特征，分化培养基还包含L-谷氨酰胺、二丁酰环腺苷酸和异丁基甲基黄嘌呤IBMX。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述方法还包括在所述孵育之前在一种另外的培养基中培养细胞，由此使所述细胞倾向于分化为星形胶质细胞样细胞。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述另外的培养基包含人表皮生长因子(hEGF)和人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)。
按照所述优选实施方案的其它特征，hEGF的浓度为约20ng/ml。
按照所述优选实施方案的其它特征，hbFGF的浓度为约20ng/ml。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述另外的培养基还包含L-谷氨酰胺、胰岛素、孕酮、腐胺、硒和转铁蛋白。
按照所述优选实施方案的其它特征，培养的持续时间为约48小时。
按照所述优选实施方案的其它特征，间充质干细胞如下获得：(a)在能够维持和/或扩增间充质干细胞的增殖培养基中培养含间充质干细胞的细胞群；和(b)由步骤(a)产生的细胞选择间充质干细胞。
按照所述优选实施方案的其它特征，通过收获表面粘附细胞实施步骤(b)。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述方法还包括给个体施用能够内源合成至少一种神经递质的干细胞。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述CNS疾病或障碍是神经变性疾病或障碍。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述CNS疾病或障碍选自运动障碍、分离性障碍、心境障碍、情感障碍、成瘾障碍和痉挛性障碍。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述神经变性疾病选自Parkinson病、多发性硬化、癫痫、肌萎缩性侧索硬化、中风、自身免疫性脑脊髓炎、糖尿病性神经病、青光眼神经病、Alzheimer病和Huntingdon病。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述细胞是自体细胞。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述细胞是非自体细胞。
本发明通过提供能够分泌神经营养因子的细胞及其细胞群成功克服了目前已知做法的缺点。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域一般技术人员的通常理解相同的含义。尽管与本文所述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料可用于实施或检验本发明，但以下描述的方法和材料尤为适宜。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都整体在此引入作为参考。要是有抵触，以包括定义在内的专利说明书为准。另外，所述材料、方法和实施例仅是阐述性的，无限制意图。
附图简述
本文仅通过实施例并参照附图描述本发明。现在要具体地详细谈到附图，要强调的是，显示的细节仅作为实例和用于说明性论述本发明优选实施方案的目的，提供这些细节是为了提供一般认为最有用和最容易理解的本发明原则和概念方面的描述。就此而言，没有尝试展现出比基本理解本发明所需更详细的本发明结构性细节，说明书连带附图使本领域技术人员更易于理解怎样能实施本发明的几种形式。
在附图中：
图1A-B是5天分化的和未分化的人MSC的光学显微镜图象。分化的人MSC显示出星形胶质细胞样形态，例如典型的星形样结构。(光学显微镜)。
图2A-D是5天分化(图2B-D)的和未分化(图2A)的人MSC的扫描电子显微镜图象。分化的人MSC表现出星形胶质细胞样形态。
图3A-B是图示分化的人MSC中的星形胶质细胞标记表达的显微照片。用抗S100β(图3A)和抗谷氨酰胺合成酶(图3B)对分化的人hBMSc进行免疫染色。细胞核使用DAPI染色(蓝色)。
图4A-B是图示分化的人MSC中的星形胶质细胞标记神经胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)表达的条图。用抗GFAP对分化的人hBMSc进行免疫染色，细胞核使用DAPI染色(蓝色)(图4A)。图4B是图示分化的人MSC的细胞提取物中的GFAP水平的条图，所述GFAP水平通过使用引物SEQ ID NO：11和12的实时PCR分析。
图5是图示与未分化的人MSC相比在分化的人MSC中的神经营养因子转录物的量的条图。对细胞提取物进行GDNF(SEQ ID NO：3和4)、NGF(SEQ ID NO：9和10)和BDNF(SEQ ID NO：5和6)转录物的实时PCR测定。
图6A-B是图示分化的人MSC上的GDNF表达的显微照片和条图。用抗GDNF对分化的人hBMSc进行免疫染色。细胞核使用DAPI染色(蓝色)(图6A)。图6B表明，用抗GDNF阳性染色的细胞数约为30％(*P＜0.05，n＝3，每n的平均细胞计数＝415.5±37.5)。通过检验3个独立培养物的15个视野估计GDNF细胞数。这些样品中的总细胞数通过计数DAPI染色的细胞核确定，结果表示为阳性细胞百分率的平均值±SEM。
图7是图示分化的人MSC中的细胞中GDNF存在量的条图。通过ELISA测定分化的hBMSc的细胞提取物中的GDNF产量。结果为3个独立实验的平均值±S.D.。在p＜0.05(*)的情况下与对照相比差异是显著的。在开始分化48小时后将分化的细胞与卡麦角林(130pg/ml)和IL-1β(100pg/ml)温育24小时。
图8A-D是图示分化的人MSC分泌的GDNF、BDNF和NGF的量的条图。图8A图示了卡麦角林(130pg/ml)和IL-1β(100pg/ml)的48小时温育对GDNF分泌的影响。在分化72小时后收集培养基，并使用ELISA分析。结果为3个独立实验的平均值±S.D.。在p＜0.05(*)的情况下与对照相比差异是显著的。还测定了分化细胞培养基的GDNF(图8B)和NGF(图8C)。(捐赠者#14-2、#8-10或#H1-2-7)。蓝色条棒指示分化后的分泌，红色条棒指示分化前的分泌。图8D图示了48小时分化对3个不同捐赠者的MSC中的BDNF分泌的影响。
图9是图示MSC分化后的谷氨酸转运体GLAST和GLT-1的表达的条图。通过对由在无血清培养基中生长的hBMSc和星形胶质细胞分化的hBMSc提取的总RNA进行实时PCR评价这些谷氨酸转运体的表达。用于GLAST的引物是SEQ ID NO：7和8，用于GLT-1的引物是SEQ ID NO：13和14。样品还用于GAPDH的PCR扩增，使得可以定量分析以任意单位表示的PCR产物(对独立的培养物进行的三份平行检测的平均值±SEM)。通过用于多重比较的单因素anova继之以Newman-Keul检验进行统计学分析。*(p＜0.05)表示与保持在无血清培养基中的细胞有显著差异。
图10是图示hBMSC的星形胶质细胞分化之前和之后的谷氨酸转运体功能活性的条图。检测并对比在无血清培养基中生长的细胞与在分化培养基中生长的hBMSC中的[3H]d-天冬氨酸摄取(20nm)。显示的数据是对3个独立培养物进行的三份平行检测的平均值±SEM。通过用于多重比较的单因素anova继之以Newman-Keul检验进行统计学分析(p＜0.05)。
图11是图示移植星形胶质细胞分化的hBMSc的6-OHDA受损大鼠的行为改善的线图。大鼠在受损后6周移植注射入同侧纹状体中的5×105个细胞。以每60分钟的平均转动数记录阿朴吗啡(0.15mg/kg，皮下)诱导的转动行为。移植大鼠在移植后75天的转动表现出明显(p＜0.05)下降。
图12是图示移植星形胶质细胞分化的hBMSc的6-OHDA受损大鼠的转动测定改善的条图。在相同大鼠中于移植后95天观察转棒性能(在转棒上的秒数)。移植大鼠表现出显著(p＜0.05)改善(在Friedmananova之后的多重比较检验，P＜0.05)。
图13是图示移植星形胶质细胞分化的hBMSc的6-OHDA受损大鼠的灵敏运动功能改善的条图。在移植后100天进行吃葵花籽测试。在5分钟时间段内移植星形胶质细胞的大鼠打开和吃葵花籽要比盐水治疗小鼠快得多。结果是在之后两天进行的两个实验的平均值±SEM。
图14A-E是移植星形胶质细胞分化的hBMSc的6-OHDA受损大鼠的细胞的共焦显微图象。在移植后110天，处死动物，进行组织学研究。图14A图示了DAPI染色。图14B图示了人核抗原染色。图14C图示了GFAP染色。图14D是全部3种染色的合并(merge)。免疫染色和共焦显微研究揭示，对人抗原为阳性的细胞达25％也是GFAP阳性的。
图15是一幅线图，表明移植入ALS小鼠腓肠肌中的星形胶质细胞分化的BMSC延迟疾病发作，并改善这些小鼠在转棒上的运动性能(n＝8，p＜0.05)。
图16是一幅线图，表明移植入ALS小鼠腓肠肌中的星形胶质细胞分化的BMSC延迟体重下降。
图17A-C是移植星形胶质细胞分化的hBMSc的ALS小鼠细胞的共焦显微图象，表明移植入ALS小鼠腓肠肌中的星形胶质细胞分化的BMSC在移植后存活110天。
优选实施方案的描述
本发明涉及可移植入患者中以便治疗众多神经变性病的细胞及其细胞群。
参考附图和后附描述可更好地理解本发明的原则和实施。
在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，要理解的是，本发明未将其应用限于在以下描述中陈述的或实施例例举的细节。本发明可以有其它实施方案，或者能够以多种方式实施或进行。另外，要理解的是，本文使用的用语和术语用于描述目的，不应被看作限制性的。
神经营养因子(NTF)是调节神经元细胞的存活、功能维持和表型发育的分泌性蛋白。NTF水平的改变涉及触发神经元中的程序性细胞死亡，并因此促使Parkinson病和其它神经变性病发病。
其中一种用于多巴胺能神经元的最有效NTF叫做神经胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)。已知其促进黑质中的多巴胺能神经元存活、促进神经突生长、增加细胞体大小以及还提高TH水平。
但是，一般来说禁止直接使用神经营养因子，尤其是禁止直接使用GDNF，因为它们不能通过血脑屏障，在系统注射后不能正确分布。因此，必须开发其它策略，以便利用它们的治疗特性。
在简化本发明以便实施时，本发明人发现，在特定培养条件下，间充质干细胞(MSC)可分化为具有能够分泌神经营养因子的星形胶质细胞表型的细胞。此结果被表明是捐赠者和传代非依赖性的。因此，本发明人已表明，这些分化的MSC可用于在移植后治疗神经变性病患者。
本发明人已表明，按照新的两步法分化的MSC表现出星形胶质细胞样形状(图1A-B和2A-D)，并伴随出现星形胶质细胞标记(图3A-B和4A-B)。这些星形胶质细胞样细胞被证实表达(图5)和分泌(图8A-D)显著水平的GDNF、BDNF和NGF。而且，D2-受体激动剂卡麦角林和IL-1还上调NTF产量(图7和图8A)。另外，星形胶质细胞样细胞具有谷氨酸清除机制(图10)。
在移植入6-OHDA受损大鼠(一种Parkinson大鼠模型)的纹状体和ALS转基因小鼠的足部肌肉之后，细胞存活，并改善了通过转棒实验检验的行为缺陷以及阿朴吗啡诱导的转动行为(图11-17A-C)。
因此，按照本发明的一个方面，提供一种产生星形胶质细胞样细胞的方法，该方法包括在含血小板衍生生长因子(PDGF)和人神经调节素1-β1的分化培养基中孵育间充质干细胞，由此产生星形胶质细胞样细胞。
本文使用的用语“星形胶质细胞样细胞”指含至少一种星形胶质细胞表型的细胞，所述表型使该细胞在体内介导星形胶质细胞活性，即支持神经元。
这些表型在下文进一步描述。
术语“间充质干细胞”或“MSC”可交互用于未终末分化的成体细胞，这些细胞可分裂，产生为两个干细胞的细胞，或者不可逆地分化，产生间充质细胞谱系细胞。本发明的间充质干细胞可为同源的或异源的，但优选同源的。
按照本发明该方面的优选实施方案，间充质干细胞未被遗传操作(即未用表达构建物转化)，以产生本文描述的细胞和细胞群。
要认识到的是，本发明的细胞可来源于任何干细胞，但优选不来源于ES细胞。
间充质干细胞可分离自各种组织，包括但不限于骨髓、外周血、血液、胎盘和脂肪组织。由外周血分离间充质干细胞的方法描述于Kassis等[Bone Marrow Transplant.2006年5月；37(10)：967-76]。由胎盘组织分离间充质干细胞的方法描述于Zhang等[Chinese MedicalJournal，2004，117(6)：882-887]。分离和培养脂肪组织、胎盘和脐血间充质干细胞的方法描述于Kern等[Stem Cells，2006；24：1294-1301]。
按照本发明该方面的优选实施方案，间充质干细胞为人源的。
骨髓可通过抽吸分离自个体的髂嵴。低密度BM单核细胞(BMMNC)可通过FICOL-PAGUE密度梯度分离。为了获得间充质干细胞，含间充质干细胞(例如BMMNC)的细胞群可在能够保持和/或扩增细胞的增殖培养基中培养。按照一个实施方案，所述群接种在聚苯乙烯塑料表面上(例如在烧瓶中)，通过去除非粘附细胞分离间充质干细胞。备选地，可使用间充质干细胞标记通过FACS分离间充质干细胞(参见下文表1)。
优选地，MSC是至少50％纯化的，更优选地是至少75％纯化的，再更优选地是至少90％纯化的。
在分离后，通常如下扩增细胞：如下文实施例1所述在能够先体外后体内保持和/或扩增分离细胞的增殖培养基中培养。增殖培养基可为DMEM、α-MEM或DMEM/F12。优选地，增殖培养基是DMEM。优选地，增殖培养基还包含SPN、L-谷氨酰胺和血清(例如胎牛血清或马血清)，例如描述于以下实施例部分的实施例1。
可通过在分化培养基中孵育MSC实现向星形胶质细胞样细胞的分化，所述分化培养基例如为描述于美国专利第6,528,245号和Sanchez-Ramos等，(2000)；Woodburry等，(2000)；Woodburry等，(J.Neurisci.Res.96：908-917，2001)；Black和Woodbury(Blood Cells Mol.Dis.27：632-635，2001)；Deng等，(2001)，Kohyama等，(2001)，Reyes andVerfatile(Ann.N.Y.Acad.Sci.938：231-235，2001)和Jiang等，(Nature418：47-49，2002)的那些培养基。
BMSc在其于“分化培养基”中孵育前优选在一种“另外的培养基”中孵育至少24小时，优选48小时。在“分化培养基”中的孵育延续至少24小时，优选至少48小时。
分化培养基(包括另外的分化培养基)可为DMEM或DMEM/F12，优选为DMEM。适宜的“另外的培养基”可为能够使细胞倾向于星形胶质细胞分化的任何生长培养基，例如补加表皮生长因子hEGF(例如20ng/ml)和/或碱性成纤维细胞生长因子(例如20ng/ml)的生长培养基。优选地，另外的培养基还包含N2补加物(胰岛素、孕酮、腐胺、硒和转铁蛋白)。
本发明的分化培养基优选包含血小板衍生生长因子(例如5ng/ml)和人神经调节素1-β1(例如50ng/ml)。“分化培养基”优选包含分化剂，例如IL-1β和/或dbcAMP。
优选地，分化培养基还包含SPN、L-谷氨酰胺、补加物(例如N2或B27)、抗生素(例如IBMX)和血清(例如胎牛血清、胎牛血清或马血清)。
按照本发明的另一方面，间充质干细胞在含至少一种分化剂的培养基中孵育，以便产生本发明的星形胶质细胞样细胞。分化剂的实例包括但不限于血小板衍生的生长因子(PDGF)、人神经调节素1-β1、FGF2、EGF、N2补加物、IBMX和cAMP。
分化培养基(包括另外的分化培养基)还可包含其它物质，例如神经营养因子(例如BDNF、CNTF、GDNF、NTN、NT3或LIF)、激素、生长因子(例如GGF2、TGF-β3、TGF-α、FGF-8和bFGF)、维生素、激素如胰岛素、孕酮以及其它因子，诸如sonic hedgehog、骨形态发生蛋白、毛喉素、视黄酸、抗坏血酸、腐胺、硒和转铁蛋白。
示例性分化培养基描述于下文的实施例1。
按照本文所述方法获得的细胞群通常是非同源的。
因此，按照本发明的另一方面，提供一种分离的人细胞群，其中：
(i)至少N％的细胞包含至少一种星形胶质细胞表型；
(ii)至少M％的细胞包含至少一种间充质干细胞表型，所述间充质干细胞表型不是星形胶质细胞表型；和
(iii)至少一种人细胞同时包含所述至少一种星形胶质细胞表型和所述至少一种间充质干细胞表型；其中M和N各自独立地选自1-99。
本文使用的术语“分离的”指已由其体内位置(例如骨髓、神经组织)取出的细胞群。优选地，分离细胞群基本没有在其体内位置存在的其它物质(例如其它细胞)。
本文使用的用语“星形胶质细胞表型”指星形胶质细胞特有的(例如独有的)结构和/或功能参数，这些参数可用于区分本发明的分化MSC和未分化MSC。星形胶质细胞表型可包含单个或众多可用于区分本发明的分化MSC和未分化MSC的特征。
要认识到的是，功能参数可与结构参数重叠，例如存在分泌性囊泡。
优选地，功能性星形胶质细胞表型包括以未分化人间充质干细胞中的神经营养因子基础表达至少2倍高的水平表达神经营养因子的能力。
本文使用的术语“表达”指合成和/或分泌以上提及的神经营养因子。因为神经营养因子在细胞外部发挥其作用，所以优选地，神经营养因子的分泌在本发明所述群的细胞中增加。按照一个优选的实施方案，相比于在未分化人间充质干细胞中分泌的神经营养因子量，所述分泌增加到至少2倍，甚至更优选增加到5倍。
本文使用的用语“神经营养因子”指对脑神经系统起作用的细胞因子，包括对神经元的生长、分化、功能维持和/或存活作用。神经营养因子的实例包括但不限于：神经胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)，GenBank登录号L19063、L15306；神经生长因子(NGF)，GenBank登录号CAA37703；脑污生的神经营养因子(BDNF)，GenBank登录号CAA62632；神经营养因子-3(NT-3)，GenBank登录号M37763；神经营养因子-4/5；Neurturin(NTN)，GenBank登录号NP_004549；神经营养因子-4，GenBank登录号M86528；Persephin，GenBank登录号AAC39640；脑衍生的神经营养因子(BDNF)，GenBank登录号CAA42761；artemin(ART)，GenBank登录号AAD13110；睫状神经营养因子(CNTF)，GenBank登录号NP_000605；胰岛素生长因子-I(IGF-1)，GenBank登录号NP_000609；和Neublastin，GenBank登录号AAD21075。
功能性星形胶质细胞表型的其它实例是加入IL-1β和卡麦角林之后增强神经营养因子的表达和/或分泌。
星形胶质细胞通过利用高亲和性谷氨酸转运体清除谷氨酸而在维持低胞外谷氨酸浓度方面起重要作用。因此，本发明所述群的细胞的另一种功能性星形胶质细胞表型可为增加的谷氨酸转运体活性。这些谷氨酸转运体的活性可通过检测标记的天冬氨酸(例如来自细胞培养基的[3H]-d-天冬氨酸摄取)来分析。
如上文所述，本发明所述细胞群的一定百分率的细胞可另外地或替代地包含结构性星形胶质细胞表型。
结构性星形胶质细胞表型的实例包括细胞大小、细胞形状、细胞器大小和细胞器数量。因此，星形胶质细胞结构表型包括圆形核、“星形”体和许多末端作为血管足板位于CNS小血管上的长突起(参见图1A-B和2A-D)。结构性星形胶质细胞表型的其它实例可见于以下材料：Reynolds和Weiss，Science(1992)255：1707-1710；Reynolds，Tetzlaff和Weiss，J.Neurosci(1992)12：4565-4574；和Kandel等，Principles ofNeuroscience，第3版，(1991)，Appleton & Lange，Norwalk，Conn。这些结构表型可使用显微技术(例如扫描电子显微镜)分析。抗体或染料可用于突显分辨性特征，以便帮助分析。
结构性星形胶质细胞表型还可包含星形胶质细胞标记的表达。
本文使用的用语“星形胶质细胞标记”指在星形胶质细胞中选择性或非选择性表达的多肽。星形胶质细胞标记可在细胞表面或内部表达。星形胶质细胞标记的实例包括S100β、神经胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)、谷氨酰胺合成酶、GLAST和GLT1。
如上文所述，所述细胞群的一定百分率的细胞包含至少一种间充质干细胞表型，此表型在典型的星形胶质细胞中不存在。这些干细胞表型通常是结构性的。例如，本发明的细胞可显示出与间充质干细胞相似的形态(梭样形态)。替代地或另外地，本发明细胞可表达间充质干细胞特有的但对天然星形胶质细胞非典型的标记(例如表面标记)。间充质干细胞表面标记的实例包括但不限于CD105+、CD29+、CD44+、CD90+、CD34-、CD45-、CD19-、CD5-、CD20-、CD11B-和FMC7-。其它间充质干细胞标记包括但不限于酪氨酸羟化酶、巢蛋白和H-NF。
本发明的细胞群还包含同时表现出星形胶质细胞表型和间充质干细胞表型的细胞。间充质干细胞表型优选不和星形胶质细胞表型相同。因此，如表3所示，已证实本发明细胞群的细胞表达间充质干细胞标记酪氨酸羟化酶、CD90和H-NF，这3种标记已知在星形胶质细胞中不表达。
优选地，当细胞同时包含上文所述星形胶质细胞表型和间充质干细胞表型时，其星形胶质细胞表型是星形胶质细胞独有的。所述细胞可包含星形胶质细胞独有的单个星形胶质细胞表型(例如星形形态)或组合表现出星形胶质细胞独有表型的非独有星形胶质细胞表型的组合。
按照本发明的一个实施方案，本发明所述群的任一种细胞的星形胶质细胞表型都尽可能地接近天然星形胶质细胞。因此，如在以下实施例部分中的阐述，按照本发明方法分化的细胞表现出星形胶质细胞样形状(图1A-B和2A-D)，并伴有星形胶质细胞标记的存在(图3A-B和4A-B)；表达(图5)和分泌(图8A-D)显著水平的GDNF、BDNF和NGF；包含受D2-受体激动剂卡麦角林和IL-1进一步上调的NTF生产(图7和图8A)；以及具有谷氨酸清除机制(图10)。
可根据预期需要提高或降低含星形胶质细胞表型的细胞百分率。因此，例如，细胞群可富集具有特定星形胶质细胞表型(例如表达GDNF)的细胞。这可通过使用对星形胶质细胞标记特异性的抗体的FACS实现。这些星形胶质细胞标记的实例如上文所述。如果细胞标记是内部细胞标记，则优选FACS分析包含可容易地穿透细胞并可容易地在检测后被洗出细胞的抗体或其片段。根据富集程度和终产物需要的细胞表型，FACS处理可使用相同或不同的标记重复很多次。
按照本发明该方面的另一个实施方案，细胞群可富集同时含星形胶质细胞表型和间充质干细胞表型的细胞，使得产生均一细胞群。
因此，按照本发明的又一方面，提供一种分离的人细胞，其包含至少一种星形胶质细胞表型和至少一种间充质干细胞表型，其中所述间充质干细胞表型不是星形胶质细胞表型。
一旦分化和任选地分离，可检验所述细胞的(在培养物中)的星形胶质细胞表型(例如分泌功能性神经营养因子的能力)。可使用生物化学分析方法，例如免疫测定、蛋白质印迹和以下实施例部分的实施例1中所述的实时PCR，或通过酶活性生物测定，比较分析培养物的星形胶质细胞表型。
根据星形胶质细胞表型，本发明的细胞和细胞群可用于治疗特定疾病或障碍。细胞群可在分化后直接使用，或者可以如上文所述针对特定星形胶质细胞表型富集。如在下文表1中所概述的，某些神经营养因子或神经营养因子组已显示出对治疗特定疾病特别有益。例如，分泌NGF、BDNF、FGF和GDNF的本发明细胞应特别适于治疗Parkinson病。
表1
  疾病   星形胶质细胞表型   参考文献
  Parkinson病   NGF、BDNF、FGF、GDNF   Walker DG等，Brain Res 1998；794：181-7Lorigados L等，Rev Neurol 1998；26：744-8.Mogi M等，Neurosci Lett 1994；180：147-50.Howells DW等，Exp Neurol 2000；166：127-35.Beck KD等，Nature 1995；373：339-41.Tomac A等，Nature 1995；373：335-9.Gash DM等，Nature 1996；380：252-5.Choi-Lundberg DL，Science 1997；275：838-41.Bozzi Y，Borrelli E.Eur J Neurosci 1999；11：1275-84.Chauhan NB等，Soc Neurosci Abstr 1998；24：1465.Chauhan NB等，Neurology 1999；52：A212-213.
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  中风   FGF、BDNF   Wu D；Neuro Rx.2005年1月；2(1)：120-8.
业已提出，星形胶质细胞可通过代谢多巴胺降低神经元中的氧化应力，因为它们表达单胺氧化酶-B和儿茶酚-O-甲基-转移酶。另外，还已提出，星形胶质细胞能够通过谷胱甘肽依赖性机制防止NO产生的神经毒性(Chen等，2004，Curr Drug Targets.2005年11月；6(7)：821-33)。因此，含清除功能和/或表达多巴胺代谢酶的本发明细胞还可能适于治疗Parkinson病。
由于谷氨酸转运体的清除或减少不充分，所以已提出谷氨酸兴奋毒性为ALS的病因[Bendotti 2001等，J Neurochem，79(4)：737-746，2001]。因此，显示出提升的谷氨酸转运体活性的本发明细胞还可能适于治疗ALS。
因此，按照本发明的另一方面，提供一种治疗CNS疾病或障碍的方法。
本文使用的用语“CNS疾病”指可用本发明细胞治疗的中枢神经系统的任何障碍、疾病或病症。
因此，这些细胞可用于制备药物(又称为药用组合物)，由此将此药物配制成制剂用于治疗CNS疾病或障碍。
可用本文所述细胞有益地治疗的CNS疾病或障碍的代表性实例包括但不限于疼痛障碍、运动障碍、分离性障碍、心境障碍、情感障碍、神经变性疾病或障碍和痉挛性障碍。
这些病症的更具体实例包括但不限于Parkinson病、ALS、多发性硬化、Huntingdon病、自身免疫性脑脊髓炎、糖尿病性神经病、青光眼神经病、黄斑变性、动作性震颤和迟发性运动障碍、恐慌、焦虑、抑郁、醇中毒、失眠、躁狂行为、Alzheimer病和癫痫。
在本文描述的任一种方法中，细胞可得自任何自体或非自体(即同种异体或异种)人捐赠者。例如，细胞可分离自人尸体或捐赠受试者。
可使用各种移植方法将本发明的细胞施用给待治疗个体，移植方法的性质取决于移植部位。
术语或用语“移植”、“细胞置换”或“嫁接”在本文可交互使用，指将本发明的细胞导入靶组织。所述细胞可来自接受者，或者来自同种异体或异种捐赠者。
细胞可嫁接入中枢神经系统或心室腔中，或硬膜下嫁接到宿主脑表面上。成功移植的条件包括：(i)植入体的存活力；(ii)移植物在移植部位的保留；和(iii)在移植部位的最小量的病理反应。将各种神经组织(例如胚胎脑组织)移植入宿主脑中的方法描述于：“Neural graftingin the mammalian CNS(哺乳动物CNS中的神经移植)”，Bjorklund和Stenevi编辑，(1985)；Freed等，2001；Olanow等，2003)。这些方法包括脑实质内移植，即通过在宿主脑中注射或沉积组织实现的宿主脑内移植(与脑外部或脑实质外移植相比)，以便在移植时和脑实质相对置。
脑实质内移植可使用两种方法实现：(i)将细胞注射入宿主脑实质中或(ii)通过手术方法制作一个腔，以暴露宿主脑实质，然后将移植物沉积入腔中。两种方法都在移植时在移植物和宿主脑组织之间提供实质沉积，两种方法都有利于移植物和宿主脑组织之间的解剖学整合。如果需要移植物变成宿主脑的一个组成部分并存活宿主一生，那么这一点就特别重要。
备选地，移植物可置于室(例如心室)中，或置于硬膜下，即在宿主脑表面上，在该处其通过插入软脑膜或蛛网膜和软脑膜之间与宿主脑实质分开。移植至室可如下实现：注射捐赠者细胞，或在基质如3％胶原蛋白中培养细胞，以形成一块固体组织，然后可将固体组织植入室中，以防止移植物移位。对于硬膜下移植，可在硬脑膜中做一个裂缝后将细胞注射到脑表面周围。可通过钻一个孔并刺穿硬脑膜，以允许微量注射器的针插入，对宿主脑的选定区域进行注射。微量注射器优选在立体定位架中固定，并选择三维立体定位图谱，用于将针放置于脑或脊髓中的预期位置。还可将细胞导入脑的壳核、下橄榄核、海马皮质、纹状体、黑质或尾核区以及骨髓。
还可将细胞移植入组织的健康区域。在某些情况下，损伤组织的确切位置可能是未知的，细胞可随意地移植入健康区域。在其它情况下，优选可将细胞施用给健康区域，由此避免对该区域的任何进一步损伤。无论何种情况，在移植后细胞都优选迁移到受损区域。
对于移植，将细胞悬浮液抽到注射器中，并施用给麻醉的移植接受者。可使用该方法进行多次注射。
因此，细胞悬浮方法允许将细胞移植入脑或脊髓中的任何预定部位，相对无创伤，允许在几个不同部位或相同部位使用相同细胞悬浮液同时进行多重移植，并容许来自不同解剖学区域的细胞混合物。多种移植物可由多种细胞类型的混合物和/或插入到细胞中的转基因混合物组成。优选地，每次移植导入约104至约108个细胞。
对可优选用于脊髓移植的腔中移植，通过取出覆在脑上的骨，并用诸如明胶海绵的材料止血，由接近中枢神经系统(CNS)外表面的区域取出组织，以形成移植腔，如Stenevi等(Brain Res.114：1-20.，1976)所述。可使用抽吸建立腔。然后把移植物置于腔中。可使用细胞或固体组织移植物注射将1个以上的移植物置于相同腔中。优选地，本发明细胞的移植部位由待治疗的CNS疾病和细胞中包含的星形胶质细胞表型(例如分泌的特定神经营养因子)指示。例如，优选将分泌GDNF的细胞植入Parkinson病患者的黑质中。
因为非自体细胞在给予机体时可能诱导免疫反应，所以已开发出几种方法降低再注射非自体细胞的可能性。这些方法包括抑制受体免疫系统或在移植前将非自体细胞囊化在免疫屏障半透膜中。
囊化技术一般分类为包含小球载体的微囊化和包含较大平板和中空纤维膜的大尺度囊化(macroencapsulation)(Uludag，H.等，Technology of mammalian cell encapsulation.Adv Drug Deliv Rev.2000；42：29-64)。
制备微胶囊的方法是本领域已知的，包括例如公开于以下的那些方法：Lu MZ等，Cell encapsulation with alginate andalpha-phenoxycinnamylidene-acetylated poly(allylamine)(用藻酸盐和α-苯氧基亚肉桂基-乙酰化的聚(丙烯胺)包囊细胞).Biotechnol Bioeng.2000，70：479-83，Chang TM和Prakash S.Procedures formicroencapsulation of enzymes，cells and genetically engineeredmicroorganisms(酶、细胞和基因工程改造的微生物的微包囊方法).Mol Biotechnol.2001，17：249-60，以及Lu MZ等，A novel cellencapsulation method using photosensitive poly (allylaminealpha-cyanocinnamylideneacetate)(用光敏聚(丙烯胺α-氰基亚肉桂基乙酸盐(或酯)包囊细胞的新方法).J Microencapsul.2000，17：245-51。
例如，通过复合修饰的胶原蛋白和2-甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)、甲基丙烯酸(MAA)和甲基丙烯酸甲酯(MMA)的三聚合物壳，产生2-5μm厚度的囊体，制备微囊体。此微囊体可用另外的2-5μm三聚合物壳进一步囊化，以便赋予带负电荷的光滑表面，并最小化血浆蛋白吸附(Chia，S.M.等，Multi-layered microcapsules for cell encapsulationBiomaterials.2002 23：849-56)。
其它微囊体基于一种海洋生物多糖藻酸盐(Sambanis，A.Encapsulated islets in diabetes treatment.Diabetes Technol.Ther.2003，5：665-8)或其衍生物。例如，可通过在氯化钙存在下在聚阴离子藻酸钠和具有聚阳离子盐酸聚(亚甲基-共-胍)的硫酸纤维素钠之间聚合电解质复合制备微囊体。
要理解的是，在使用较小囊体时，细胞囊化被改善。因此，当将囊体尺寸由1mm减小至400μm时，囊化细胞的质量控制、机械稳定性、扩散特性和体外活性改善(Canaple L.等，Improving cellencapsulation through size control.J Biomater Sci Polym Ed.2002；13：783-96)。而且，发现具有小至7nm的良好控制的孔径、特制的表面化学和精细的微观结构的纳米孔径生物囊体成功地将微观环境与细胞免疫隔离(Williams D.Small is beautiful：microparticle andnanoparticle technology in medical devices.Med Device Technol.1999，10：6-9；Desai，T.A.Microfabrication technology for pancreatic cellencapsulation.Expert Opin Biol Ther.2002，2：633-46)。
免疫抑制剂的实例包括但不限于氨甲蝶呤、环磷酰胺、环孢霉素、环孢菌素A、氯喹、羟基氯喹、柳氮磺胺吡啶(sulphasalazopyrine)、金盐、D-青霉胺、来氟米特、咪唑硫嘌呤、阿那白滞素、英利昔单抗(
Figure A20068002958700311
)、依那西普、TNFα阻断剂、靶向炎性细胞因子的生物剂和非甾族抗炎药物(NSAID)。NSAID的实例包括但不限于乙酰水杨酸、水杨酸胆碱镁、双氟尼酸、水杨酸镁、双水杨酯、水杨酸钠、双氯芬酸、依托度酸、非诺洛芬、氟比洛芬、消炎痛、酮洛芬、酮咯酸、甲氯胺苯酸钠、萘普生、nabumetone、保泰松、吡罗昔康、舒林酸、托美汀、醋氨酚、布洛芬、Cox-2抑制剂和曲马多。
在本文所述的任一种方法中，细胞可自身单独施用，或优选作为还含药学可接受载体的药用组合物的一部分施用。
本文使用的“药用组合物”指本文描述的一种或多种化学缀合物和其它化学组分(例如药学适宜的载体和赋形剂)的制剂。药用组合物的用途是利于将化合物施用给受试者。
下文的术语“药学可接受的载体”指不对受试者产生显著刺激且不废除所施用化合物的生物活性和特性的载体或稀释剂。载体的非限制性实例是丙二醇、盐水、乳浊液以及有机溶剂与水的混合物。
本文的术语“赋形剂”指加入到药用组合物中以进一步利于化合物施用的惰性物质。赋形剂的非限制性实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和淀粉类型、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
按照本发明的一个优选实施方案，药用载体是一种水性盐水溶液。
配制和施用药物的技术可见于“Remington′s PharmaceuticalSciences，”Mack Publishing Co.，Easton，PA，最新版，其在此引入作为参考。
适宜的施用途径包括直接施用到目标组织或器官中。因此，例如，细胞可如上文所述直接施用到脑中，或如下下文实施例3中所述直接施用到肌肉中。
对于本发明方法使用的任何制剂，开始可由体外和细胞培养测定估计治疗有效量或剂量。优选地，在动物模型中配制剂量，以获得期望的浓度或滴度。此信息可用于更精确地确定在人中的有用剂量。
本文描述的活性成分的毒性和治疗效力可通过标准体外药学方法在细胞培养物或实验动物中确定。例如，6-OHDA-受损小鼠可用作Parkinson病的动物模型。另外，葵花籽实验可通过挑战动物在特定时间段内打开葵花籽用于测试灵敏运动功能的改善。
转基因小鼠可用作Huntingdon疾病模型，所述转基因小鼠包含增加数目的CAG重复序列，在纹状体和大脑皮质的神经元中具有huntingtin蛋白和泛素的核内包含体，但在脑干、丘脑或脊髓中没有，这与在所述疾病中的神经元细胞损失部位紧密匹配。
含SOD-1突变的转基因小鼠可用作ALS疾病的模型。
通过切断海马伞单侧横切的隔海马途径模拟Alzheimers病中失去的隔海马途径的胆碱能缺乏。因此，含此受损的动物模型可用于测试用于治疗Alzheimers病的本发明细胞。
可在施用本发明细胞后分析(如在实施例2和3中一样)动物的存活和转动行为(例如在转棒上)。
由这些体外和细胞培养测定以及动物研究获得的数据可用于配制一系列在人中使用的剂量。剂量可根据使用的剂型和使用的施用途径改变。可根据患者病症由个体医师选择正确的制剂、施用途径和剂量，(参见例如Fingl等，1975，载于“The Pharmacological Basis ofTherapeutics”，第1章，第1页)。例如，Parkinson病患者可依据症状监测指示对治疗积极反应的改善的运动机能。
对于注射，药用组合物的活性成分可配制在水性溶液中，优选配制在生理相容性缓冲液中，例如Hank溶液、Ringer溶液或生理盐水缓冲液。
剂量和间隔可单独地调整至足以有效调节植入细胞的神经递质合成的活性成分水平。获得期望作用必须的剂量取决于施用的个体特征和途径。检测测定可用于确定血浆浓度。
根据要治疗的病症的严重性和反应性，给药可为单次或多次施用，治疗过程持续几天至几周，或实现病况的减轻。
当然，要给予的组合物的量取决于要治疗的个体、侵染的严重性、施用方式、主治医师的判断等。施用的剂量和时间要对小心和持续监测的个体改变状况作出反应。例如，基于监测指示给受治疗的Parkinson病患者施用足以减轻疾病症状的细胞量。
本发明的细胞可与用于治疗神经退化病的治疗剂如神经节苷脂、抗生素、神经递质、神经激素、毒素、促突起分子以及抗代谢物和神经递质分子前体如L-DOPA共给予。另外，本发明的细胞可与能够合成神经递质的其它细胞共给予。这些细胞描述于本发明人的美国专利申请第20050265983号。
在移植后，本发明的细胞优选在患病部位存活一段时间(例如至少6个月)，以便观察到治疗作用。如在实施例2中所述，本发明的细胞在移植后16周时在6-OHDA受损小鼠脑半球中显示存活，并在移植后110天时在转基因ALS小鼠模型中显示存活。
本文使用的术语“约”指±10％。
在检验以下无限制意图的实施例时，本发明的其它目标、优势和新特征对本领域一般技术人员将变得显而易见。另外，如上文描述和以下权利要求部分中要求保护的本发明的各种实施方案和方面的每一个都可在以下实施例中找到实验支持。
实施例
现在援引以下实施例，这些实施例连同以上描述一起以非限制性方式阐述本发明。
一般来说，本文使用的命名法和在本发明中使用的实验室方法包括分子学、生物化学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中被充分阐述。参见例如“Molecular Cloning：A laboratory Manual(分子克隆：实验指南)”Sambrook等，(1989)；“Current Protocols inMolecular Biology(现代分子生物学实验指南)”I-III卷，Ausubel，R.M.等，(1994)；Ausubel等，“Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验指南)”，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，“A Practical Guide to Molecular Cloning(实用分子克隆指南)”，John Wiley & Sons，New York(1988)；Watson等，“Recombinant DNA(重组DNA)”，Scientific American Books，NewYork；Birren等(编辑)“Genome Analysis：A Laboratory Manual Series(基因组分析：实验室手册系列)”，1-4卷，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York(1998)；陈述于美国专利第4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057号的方法；“Cell Biology：A Laboratory Handbook(细胞生物学：实验室手册)”，I-III卷Cellis，J.E.编辑，(1994)；Freshney的“Culture of Animal Cells-A Manual ofBasic Technique(动物细胞培养：基本技术手册)”，Wiley-Liss，N.Y.(1994)，第3版；“Current Protocols in Immunology(现代免疫学指南)”I-III卷Coligan J.E.编辑，(1994)；Stites等(编辑)，“Basic and ClinicalImmunology(基础和临床免疫学)”(第8版)，Appleton & Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(编辑)，“Selected Methods inCellular Immunology(细胞免疫学精选方法)”，W.H.Freeman and Co.，New York(1980)；可用的免疫测定详尽描述于专利和科学文献，参见例如美国专利第3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521；“Oligonucleotide Synthesis(寡核苷酸合成)”Gait，M.J.编辑，(1984)；“Nucleic Acid Hybridization(核酸杂交)”Hames，B.D.，和Higgins S.J.编辑，(1985)；“Transcription and Translation(转录和翻译)”Hames，B.D.，和Higgins S.J.编辑，(1984)；“Animal Cell Culture(动物细胞培养)”Freshney，R.L编辑，(1986)；“Immobilized Cells and Enzymes(免疫的细胞和酶)”IRL Press，(1986)；“A Practical Guide toMolecular Cloning(实用分子克隆指南)”Perbal，B.，(1984)以及“Methods in Enzymology(酶学方法)”1-317卷，Academic Press；“PCR Protocols：A Guide To Methods And Applications(PCR技术实验指南)”，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak等，“Strategiesfor Protein Purification and Characterization - A Laboratory CourseManual(蛋白质纯化与鉴定实验指南)”CSHL Press(1996)；所有这些文献都如同其在本文完整陈述一样引入作为参考。其它一般性文献贯穿本文件提供。其中的方法一般被认为是本领域众所周知的，提供它们是为了方便读者。其中包含的所有信息都在此引入作为参考。
实施例1
星形胶质细胞分化的BMSC的特征
材料和方法
人BMSC的分离和培养：由知情同意的健康成人捐赠者的后髂嵴收集骨髓抽吸液(10-30ml)。通过FICOL-PAGUE密度梯度(1.077g/ml)分离低密度BM单核细胞(BMMNC)，并用HBSS清洗。接着，将细胞接种在聚苯乙烯塑料烧瓶的生长培养基中。生长培养基由补加15％胎牛血清(FCS)、2mM L-谷氨酰胺、100μg/ml链霉素、100U/ml青霉素、12.5单位/ml制霉菌素(SPN)的dulbecco改良型eagle培养基组成。以培养基置换去除非粘附细胞。在汇合后，胰蛋白酶化粘附层，再接种，生长至汇合，并在实验前传代2-6次。生长培养基一周更换两次，细胞保持于37℃的湿润5％CO2温育箱中。
星形胶质细胞分化：为诱导星形胶质细胞分化，将1×106个细胞在10mm皿中生长。用预分化培养基置换细胞达48小时(DMEM，补加SPN、2mM L-谷氨酰胺、20ng/ml人表皮生长因子hEGF(R&D，Systems，Minneapolis，MN)、20ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)和N2补加物(胰岛素5μg/ml、孕酮20nM、腐胺100μM、硒30nM、转铁蛋白100μg/ml)。在48小时后，将预分化培养基更换为分化培养基，(DMEM，补加SPN、2mM L-谷氨酰胺、1mM二丁酰环腺苷酸dbcAMP、0.5mM异丁基甲基黄嘌呤IBMX(Sigma-Aldrich，St.Louis，Missouri，USA)、5ng/ml人血小板衍生生长因子PDGF(peprotech)和50ng/ml人神经调节素1-β1 NRG1-β1-GGF-2)。在某些实验中，在分化开始后24小时将IL-1β(100pg/ml)或卡麦角林(130pg/ml)加入培养基中。
免疫细胞化学：对于免疫化学分析，细胞在12mm圆形聚-L-赖氨酸包被的玻璃盖玻片上生长。在实验结束时，去除培养基，细胞用多聚甲醛4％(体积/体积)于室温固定20分钟，此后用0.25％TritonX-100(体积/体积)的0.1M PBS溶液透化20分钟。通过将细胞在含5％正常山羊血清(NGS)和1％牛血清白蛋白(BSA)(Sigma)的0.1M PBS溶液中于37℃温育1小时封闭非特异性结合。随后，将细胞在含0.25％Triton X-100(体积/体积)、5％NGS和1％BSA的0.1M PBS溶液中与一抗温育，所述一抗即兔抗神经胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)1∶100(DAKO)、兔抗-GDNF 1∶100(Santa Cruz Biotechnology Inc.，SantaCruz，California，USA)、小鼠抗人核h-Nuc 1∶30、兔抗谷氨酰胺合成酶1∶200(Sigma-Aldrich，St.Louis，Missouri，USA)、小鼠抗S100β 1∶200(Sigma-Aldrich，St.Louis，Missouri，USA)。对于GDNF染色，加入山羊抗兔生物素化(1∶200)二抗达1小时，随后加入链霉抗生物素蛋白-Alexa-488缀合的山羊抗兔IgG抗体1∶200(Molecular Probes，Eugene，OR，USA)。对于其它染色，将Alexa-488缀合的山羊抗兔IgG抗体1∶200和罗丹明-Rx-缀合的1∶200(Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA，USA)在含0.25％Triton X-100(体积/体积)、5％NGS和1％BSA的0.1M PBS溶液中稀释，并于室温应用1小时。用核染料DAPI 1∶200(Sigma，Aldrich)染色核5分钟。在用PBS淋洗3次后，制剂在Antifaiding(Sigma，Israel)中封装，并使用配备CCD照相机的荧光显微镜检查(T.I.L.L.photonics，Martinsried，Germany)。激发波长(对于Alexa 488、DAPI和Alexa 568分别为488、405和568nm)使用配备单色器的氙灯(T.I.L.L. photonics，Martinsried，Germany)产生。数字图象使用适宜的滤光片获得，并使用TILLvisION软件合并。
GDNF和BDNF分析：在上述分化方法结束时，由平板收集上清液，收获细胞并计数。使用GDNF或BDNF免疫测定系统(Promega)按照生产商的方法定量细胞裂解物和培养上清液中的GDNF或BDNF的量。450nm的吸光度记录在微板读数器(BioRad Model 550)上，读数值用于产生GDNF或BDNF标准曲线。GDNF标准曲线在15.6和1,000pg/ml之间是线性的。ELISA结果按照106个细胞/板计算。
细胞计数评价：为了确定表达特定抗原的阳性细胞数，仔细检查每个样品的3个独立培养物的15个视野收集数据。这些样品中的MSC总数通过计数DAPI-染色的细胞核测定，结果表示为针对GDNF、谷氨酰胺合成酶或S100β的阳性细胞的百分率。
mRNA的制备：如Chomczynski和Sacchi(Anal Biochem162：156-159，1987)所述分离总RNA。细胞用200μl溶液D(4M硫氰酸胍、25mM柠檬酸钠、0.5％十二烷基肌氨酸钠、0.1M 2-巯基乙醇)裂解。随后，加入0.1体积的2M乙酸钠(pH4)、1体积苯酚(饱和的)和0.2体积的氯仿∶异戊醇(49∶1)。使样品于4℃沉降30分钟，然后于4℃以10,000×g离心20分钟。将上部的水相与2体积乙醇混合，于-20℃使RNA过夜沉淀。最终的RNA沉淀用75％乙醇清洗，风干。将沉淀溶解在DEPC-处理的水中。使用ND-1000分光光度计(Nano-drop)化学计量测定RNA量。通过检测OD260/OD280比率证实RNA量。RNA储存于-80℃，直至使用。
实时定量逆转录聚合酶链反应：目标基因的实时定量PCR在ABIPrism 7700测序系统(Applied biosystems)中进行，使用Sybr green PCRmaster mix(Applied biosystems)和以下引物：GAPDH有义引物5′-CGACAGTCAGCCGCATCTT-3′(SEQ ID NO：1)、GAPDH反义引物5′-CCAATACGACCAAATCCGTTG-3′(SEQ ID NO：2)、GDNF有义引物5′-TCAAATATGCCAGAGGATTATCCTG-3′(SEQ ID NO：3)、GDNF反义引物5′-GCCATTTGTTTATCTGGTGACCTT-3′(SEQ IDNO：4)：BDNF有义引物5′-AGCTCCGGGTTGGTATACTGG-3′(SEQID NO：5)、BDNF反义引物5′-CCTGGTGGAACTTCTTTGCG-3′(SEQID NO：6)、GLAST有义引物5′-AGAATGAGCTACC GGGAAGTCA-3′(SEQ ID NO：7)、GLAST反义引物5′-CTAGCGCCGCCATTCCT-3′(SEQ ID NO：8)、NGF有义引物5′-C ATGCTGGACCCAAGCTCA-3′(SEQ ID NO：9)、NGF反义引物5′-GACATTACGCTATGCACCTCAGTG-3′(SEQ ID NO：10)、GFAP有义引物TAGAGGGCGA GGAGAACCG-3′(SEQ ID NO：11)、GFAP反义引物5′GTGGCCTTCTGACACAGACTTG-3′(SEQ ID NO：12)、GLT-1有义引物5′-TTGGCTCAGAGGAACCCAAG-3′(SEQ ID NO：13)、GLT-1反义引物5′-CAGGATGACACCAAACACCGT-3′(SEQ IDNO：14)、S100β有义引物5′-GGGTGAGACAAGGAAGAGGATG-3′(SEQ ID NO：15)、S100β反义引物5′-GCTTGTGCTTGTCTCCCTCC-3′(SEQ ID NO：16)、谷氨酰胺合成酶有义引物5′-CGAAGGCCTGCAGAGACC-3′(SEQ ID NO：17)、谷氨酰胺合成酶反义引物5′-AGGGTATACTCCTGCTCCATGC-S′(SEQ ID NO：18)。GAPDH基因用作进行转录谱分析的有效参比‘持家’基因。
对于定量，以一式两份进行实时定量PCR(qPCR)。对于每个样品，在相同PCR反应板的单独孔中进行qPCR扩增，该反应板还包含扩增的各个基因的标准曲线和无模板对照(NTC)。确定各个引物对的最佳实验参数(杂交温度、延伸温度和引物浓度)。对于每个基因，检验在解链曲线分析中的单峰评价PCR产物的特异性。
在含1μl上述cDNA、1μl每种3′和5′引物(终浓度均为500nmol/L)、10μl AbsoluteTM QPCR
Figure A20068002958700391
Green ROX Mix和8μl DEPC水的20μl总体积中进行PCR。
扩增程序是40个循环，每个循环为90℃、15秒后接60℃、1分钟。如在ABI prism 7700测序系统的用户公告#2(10/2001更新)中的说明，使用ddCT法进行目标基因对GAPDH的定量计算。
逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)：在含1.3μM寡-dT12-18(Sigma，USA)、生产商提供的1×缓冲液、10mM DTT、20μM dNTP和RNA酶抑制剂(RNAguard，amersham pharmacia biotech，UK)的混合物中使用10U酶RT-superscript II(Gibco-BRL，MD，USA)对0.5μg RNA样品进行RT-PCR。于42℃进行2小时逆转录。在含2μl RT、1×缓冲液(Takara，Japan)、200μM dNTP、1μM每种引物和5U单位Taq聚合酶(Takara，Japan)的混合物中用特异性引物进行目标基因的PCR，接着在热循环仪中进行25-30个循环：94℃、30秒；55℃退火30秒，于72℃进行45秒的DNA延伸。在这些实验条件下观察扩增的线性。
按照本发明的方法对未分化的hBMSC和分化的BMSC进行RT-PCR。对比两种细胞类型之间的基因表达和星形胶质细胞中的表达(由文献获得的信息)。优选序列详述于下文的表2。
表2
  基因   5′引物   3′引物   NCBI
CD90   ctagtggaccagagccttcgSEQ ID NO：19   gccctcacacttgaccagttSEQ ID NO：20 NM6288
CD34   aaggagcagggagcatacSEQ ID NO：21   tgcatgtgcagactcctttcSEQ ID NO：22 NM1773
CD133   gatgcagaacttgacaacgSEQ ID NO：23   acacagtaagcccaggtagtSEQ ID NO：24 NM006017
巢蛋白   ccagaaactcaagcaccacSEQ ID NO：25   ttttccactccagccatccSEQ ID NO：26 X65964
H-NF   aaagcaccaaggactcactSEQ ID NO：27   ttctcagacttctccaccacSEQ ID NO：28 NM021076
TH   gaggggaaggccgtgctaaaSEQ ID NO：29   gaggcgcacgaagtactccaSEQ ID NO：30 NM000360
NGFR   ctacggctactaccaggatgSEQ ID NO：31   ctggctatgaggtcttgttcSEQ ID NO：32 NM002507
GDNF   tcaaatatgccagaggattatcctgSEQ ID NO：33   gccatttgtttatctggtgaccttSEQ ID NO：34 NM199231.1
NGF   catgctggacccaagctcaSEQ ID NO：35   gacattacgctatgcacctcagtgSEQ ID NO：36 NM002506.2
IGF1   tcagctcgctctgtccgtgSEQ ID NO：37   ttgcgttcttcaaatgtacttcctSEQ ID NO：38 NM000618
BDNF   agctccgggttggtatactggSEQ ID NO：39   cctggtggaacttctttgcgSEQ ID NO：40 NM1707323
CNTF   cctgactgctcttacggaatcctatSEQ ID NO：41   cccatccgcagagtccagSEQ ID NO：42 NM0006142
GFAP   tagagggcgaggagaaccgSEQ ID NO：43   gtggccttctgacacagacttgSEQ ID NO：44 NM003054
S100b   gggtgagacaaggaagaggatgSEQ ID NO：45   gcttgtgcttgtctccctccSEQ ID NO：46 NM006272.1
  NT3神经营养因子   gacttcagagaacaataaactcgtggSEQ ID NO：47   tgccaattcatgttcttccgSEQ ID NO：48   NM002527.3
GLAST   agaatgagctaccgggaagtcaSEQ ID NO：49   ctagcgccgccattcctSEQ ID NO：50 Nm004172.3
GLUL   cgaaggcctgcagagaccSEQ ID NO：51   agggtatactcctgctccatgSEQ ID NO：52 NM02065.4
GLT1   ttggctcagaggaacccaagSEQ ID NO：53   caggatgacaccaaacaccgtSEQ ID NO：54 D85884
GAPDH   cgacagtcagccgcatcttSEQ ID NO：55   ccaatacgaccaaatccgttgSEQ ID NO：56 NM002046
扫描电子显微镜：细胞用2.5％戊二醛的磷酸盐缓冲液(pH 7.2)固定，以相同缓冲液清洗，并用2％OsO4后固定。固定的第三步使用鞣酸和盐酸胍溶液进行。三重固定的细胞在分级乙醇溶液中脱水。然后使用分级Freon溶液将乙醇更换为Freon-112。风干细胞，用金包被，并使用Jeol 840扫描电子显微镜检查。
谷氨酸摄取：对胰蛋白酶化的分化细胞进行谷氨酸转运体的功能表征。通过检测在含Na+的缓冲液中于37℃温育6分钟后的[3H]-d-天冬氨酸(20nM)摄取估测转运速度。谷氨酸转运体的比活表示为每mg蛋白量的摄取速度。
结果
按照本发明方法分化的hBMSc得到了类似星形胶质细胞的卫星样形态，而单独地在无血清培养基中生长的对照细胞表现出hBMSc的扁平成纤维细胞样形态特征(图1A-B)。还使用扫描电子显微镜分析了分化细胞，证实了其特有的星形胶质细胞卫星形态(图2A-D)。
还使用采用典型星形胶质细胞标记的免疫荧光分析进一步证实了细胞的星形胶质细胞表型。如在图3A-B中所示，形态学变化伴有对S100β(星形胶质细胞Ca+通道的亚基)和谷氨酰胺合酶(GS)(代谢谷氨酸的独特星形胶质细胞酶)的阳性免疫染色。另外，细胞对神经胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)阳性染色(图4A)。
免疫细胞化学染色数据的定量揭示，针对S100β、GFAP和GS的阳性细胞百分率在20-30％的范围内。
为进一步证实星形胶质细胞标记的表达，进行实时PCR分析。如在图4B中所示，GFAP转录物被上调10-20倍。S100β和GS转录物显示出相似值。
因为已知星形胶质细胞分泌神经营养因子(NTF)，所以分析GDNF、NGF和BDNF等NTF的mRNA水平。实时PCR分析揭示，星形胶质细胞分化的hBMSc表达大量NTF转录物，相比之下在无血清培养基中生长的MSC中存在少量或没有这些转录物(图5)。用抗GDNF进行免疫染色揭示，30％的培养细胞被所述抗体阳性染色(图6A-B)。
采用特异性抗体的ELISA测定用于定量NTF的生产和分泌。在细胞提取物(图7)和生长培养基(图8A)中测试GDNF生产的检测结果。尽管在培养的MSC和成神经细胞瘤细胞系(用雷沙吉兰处理的SH-SY5Y)中检测到基础水平的GDNF生产，但在培养基中仅在分化的MSC中检测到GDNF。
而且，在加入已知上调GDNF的因子IL-1β和卡麦角林后检测到显著增强的GDNF生产和分泌。此现象支持分化细胞作为星形胶质细胞响应的观点。比较几个捐赠者中的分泌的GDNF和NGF的水平，可以看出分泌水平在69-140pg GDNF/106个细胞之间(图8B)和356-875pgNGF/106个细胞之间(图8C)变化。
星形胶质细胞通过经高亲和性谷氨酸转运体清除谷氨酸和通过谷氨酰胺合成酶分解代谢谷氨酸而在保持低胞外谷氨酸浓度方面起重要作用。因此，使用用于谷氨酸转运体和谷氨酰胺合成酶表达的RT-PCR分析来分析分化细胞。在星形胶质细胞分化的hBMSc中发现高表达的GLT-1/EAAT-2转录物(图9)。以来自分化细胞而不是来自MSC的培养基的3H-谷氨酸摄取显示谷氨酸转运体的活性(p＜0.005)(图10)。
进行更详细的RT-PCR分析，以便确定本发明的细胞表达哪种间充质细胞标记和哪种星形胶质细胞标记。还将两种细胞类型中的基因表达与星形胶质细胞中的基因表达对比(由文献获得的信息)。结果概述于下文的表3。
表3
 基因   hMSc   DIF   星形胶质细胞
 CD90   +   +   -
 CD34   -   -   -
 CD133   -   -   -
 巢蛋白   ++   +   +/+++/-
 H-NF   +   +   -
 TH   +   +   -
 NGFR   +   +   +++
 GDNF   +   ++   +++
 NGF   +   +++   +++
 IGF1   +   ++   +++
 BDN   +   ++   +++
 CNTF   ND   ND   +++
 GFAP   +   +++   +++
 S100b   +   ++   +++
 NT3神经营养因子 + + +++
 GLAST   +   ++   +++
 GLUL   +   ++   +++
 GLT1   +   ++   +++
 GAPDH   +   +   +
因此，可以看出，本发明的分化细胞显示出与间充质干细胞和星形胶质细胞均不同的特定表型。例如，本发明的细胞表达CD90、酪氨酸羟化酶和H-NF，这可将它们与星形胶质细胞区分开。另外，本发明的细胞表达高水平的神经营养因子和星形胶质细胞标记，这将它们与间充质干细胞区分开。
实施例2
纹状体内移植星形胶质细胞样分化的hBMSc
改善受损大鼠的运动机能
为了研究本发明细胞的可能治疗潜力，将按照本发明方法分化的HBMSC移植入既建Parkinson病大鼠模型中。
材料和方法
动物：雄性Sprague-Dawley大鼠(Harlan，Israel)重220-280g，用于6-OHDA-受损实验。所有动物都圈养在标准条件下：恒温(22±1℃)、湿度(相对湿度，30％)、12小时昼：12小时夜循环以及自由获取食物和水。手术步骤在Rabin Medical Center和Tel Aviv University，Tel Aviv，ISRAEL的动物管理委员会监督下进行。
6-OHDA受损：大鼠用350mg/kg水合氯醛腹膜内麻醉，并关在立体定位架(Stoelting，USA)中。使用带有26号针的Hamilton 10μl注射器将氢溴酸6-OHDA(12μg/6μl溶解在抗坏血酸-盐水中)单侧注射入动物的左纹状体的两个部位(每个部位6μl，处于两个深度)中。基于立体定位图谱(Paxinos & Watson，1986)的注射坐标如下：(1)AP：距前囟+0.5mm，L：-2.5mm侧面至中间，V：-6.5mm腹侧至硬脑膜表面，和(2)AP：-0.5mm，L：-3.7mm，V：-6.0mm。在注射完成时，套管原地再停留3分钟，然后以1mm/分钟拔出，以防止真空。
转动行为的检测：在大脑内注射6-OHDA后14天检验受损大鼠的转动行为。在皮下注射DA激动剂阿朴吗啡(Sigma，0.15mg/kg，溶解在生理盐水中)后1小时在自动化转动检测装置中监测运动不对称。阿朴吗啡诱导对侧转动行为至原先的受损侧，因为纹状体DA受体由于6-OHDA受损而变成高度敏感的。具有每分钟转动5次的旋转速度的大鼠被看作是既建PD模型，用于移植实验。该实验广泛用作纹状体中多巴胺损耗的可靠指示。
移植：在6-OHDA受损后6周，将PD模型大鼠分为2组：1个对照组和1个实验组。对照组中的大鼠(n＝7)注射0.9％盐水。实验组中的大鼠(n＝6)移植产生GDNF的细胞。在移植前收集hBMSC星形胶质细胞样细胞，并以5×105个有活力细胞/5μl重悬在盐水中。将细胞通过10μl Hamilton注射器的26号针以两个深度立体定向注射入左纹状体中的一个部位(每个深度2.5μl)。用于注射的坐标如下：(1)AP：+1.0mm，L：+3.0mm，V：-5.0mm；和(2)AP：+1.0mm，L：+3.0mm，V：-4.1mm，牙齿勾杆组件处于耳间线水平。在操作后，如上所述每两周对动物进行一次转动测试。对于人MSC移植，通过每天皮下注射Sandimune(10mg/kg/天；Novartis)免疫抑制动物。
转棒：在移植后3个月测试转棒任务的性能。所述任务的组成为3次连续实验，其中大鼠被放置于转棒上并努力(直至16RPM)防止它们自己跌下加速的转棒。每次实验持续达最多2分钟。实验之间的间隔是30秒。结果由每周两次的测试获得。
向日葵测试：该测试的目的是要求动物达到在5分钟的最大时间段内打开葵花籽。为了进行测试，不给予动物过量食物，在开始监测前3天仅以45mg/gk/天供应动物。训练动物3天，在第4和第5天进行检测。将动物放置于空笼中，提供葵花籽达5分钟。检测打开并吃下的葵花籽数。[Gonzalez C，KoIb B.A comparison of different modelsof stroke on behavior and brain morphology(不同打击模型对行为和脑形态影响的对比).E.J.Neuroscience 18(1950-1962)，2003]。
免疫组织化学：在移植后16周，对对照和治疗组进行免疫染色。用水合氯醛(350mg/kg腹膜内)深度麻醉大鼠，并用65ml冷盐水经心脏灌注，之后以250ml冷4％多聚甲醛的0.1mol/l PBS溶液(pH7.4)灌注。取出脑，置于4％PFA/PBS中达48小时，接着在20％蔗糖/PBS中冷保护48小时，然后冷冻在干冰上的异戊烷中。在冷冻切片机上将脑的连续冠状切片切成20μm厚度。切片用PBS清洗3次，随后在5％正常马血清(Biological Industries)的PBS溶液中封闭1小时。随后，在含抗人细胞核(1∶30；小鼠单克隆；Chemicon International，Temecula，CA，USA)、抗GDNF(1∶200；兔多克隆，Santa Cruz)和抗GFAP(1∶100，兔DAKO)的一抗的相同溶液中温育切片24小时。然后用PBS清洗切片3次，并于室温与二抗接触1小时，所述二抗为：偶联罗丹明的山羊抗小鼠IgG(1∶500；Jackson Immuno Research Laboratories Inc.，WestGrove，PA，USA)和偶联Alexa-488的山羊抗兔IgG(1∶500 MolecularProbes，Eugene，OR，USA)。用核染料DAPI 1∶200(Sigma)染色细胞核5分钟。最后，切片用0.1M PBS淋洗，并用95％甘油覆盖。通过去掉(i)一抗，(ii)二抗，以及(iii)一抗和二抗，进行对照免疫染色实验。
结果
将6-羟基多巴胺纹状体内注射到大鼠脑中，以在纹状体中诱导温和的多巴胺能神经元损伤。在注射导致同侧旋转的阿朴吗啡后3周检测受损程度。将星形胶质细胞样细胞(5×105个)移植入基于其转动性能而预先选择的大鼠的同侧纹状体中。在移植后60、75和105天检测移植大鼠和盐水注射大鼠中的药理学诱导的转动行为。在实验当中，两组都每日注射环孢霉素，以防止移植排斥。如在图11中所示，移植大鼠(n＝8)中阿朴吗啡诱导的转动在移植后75天时由平均160次转动/小时下降至60次转动/小时的基线，移植后105天时下降至50次转动/小时(68％和75％的下降，p＜0.05)。对照组(n＝8)在基线每小时转动155次，在105天后转动140次(无显著下降)。
移植后95天，进行非药理学转棒实验，以便提供运动缺损的直接检测结果。移植星形胶质细胞样细胞的动物能够在加速转棒上比对照走更长的时间段(图12)。
还对动物进行吃葵花籽测试。在移植后100天时，评价动物在限定时间内(参阅方法)打开葵花籽的能力。移植动物在5分钟内打开44个葵花籽，相比之下对照在相同时间内打开44个(p＜0.05)(图13)。
在移植后110天，处死动物，并进行组织学研究，以便鉴别和表征移植细胞。抗人核抗原和抗GFAP的抗体用于鉴别移植的分化细胞(图14A-E)。免疫染色和共焦显微镜研究揭示，对人抗原阳性的细胞达25％对GFAP也是阳性的。这些结果表明，星形胶质细胞样细胞能够恢复纹状体中的多巴胺缺损，并可能有益于其它神经变性病。
实施例3
肌内移植星形胶质细胞样的分化的hBMSc
改善转基因ALS小鼠模型的运动机能
材料和方法
动物模型：TgN(SOD 1-G93 A)1Gur转基因小鼠(Gurney 1994)的种群得自Jackson Laboratory(USA)。小鼠在CSJLF1繁育，在1月龄时通过PCR分析对子代进行基因表型分析，使用以下PCR引物：hSOD1上游引物(SEQ ID NO：19)5′CTAGGCCACAGAATTGAAAGATCT3′；hSOD1下游引物(SEQ IDNO：20)5′GTAGGTGGAAATTCTAGCATCATCC3′；IL2上游引物(SEQ ID NO：21)5′CATCAGCCCTAATCCATCTGA3′；IL2下游引物(SEQ ID NO：22)5℃GCGACTAACAATCAAAGTGA3′。退火温度是53℃，PCR产物为236 bp(hSOD1)、324 bp(IL2)。用于本研究的小鼠直至3月龄时都是健康的，在4-5月龄之间变成完全瘫痪的。动物实验由特拉维夫大学批准和监督。
细胞移植和行为：在第40天时，将0.5×106个人星形胶质细胞分化细胞(如在实施例1中所述制备)移植入两条腿的腓肠肌内。通过转棒装置以加速转动每两周一次评价运动性能。
组织病理学评价：在110天时处死小鼠，将腿置于4℃的4％多聚甲醛的0.1M磷酸缓冲液pH 7.4中。制作石蜡块，用抗人抗原抗体免疫染色。
统计学分析：当涉及两个以上组别时，通过ANOVA和事后Dunnett检验进行比较。如果数据不正常分布，则使用非参数检验(Mann-Whitney U-检验)比较结果。数据以平均值±s.e.m.表示。
结果
星形胶质细胞分化细胞(0.5×106)在第40天移植入hmSOD小鼠(n＝8)的肌肉(脚)中。用盐水注射平行组。另外，野生型小鼠(n＝8)和mhSOD Tg小鼠(n＝8)用作阳性和阴性对照。
由第40天直至死亡(120-140天)每两周一次在转棒上(参见M&M)进行行为评价。由图15可见，运动性能的下降(即ALS症状)在移植细胞的小鼠中被显著延迟。
检测动物体重，并在移植组和对照组之间对比，进行统计学分析。对照组显示出明显高于移植组的体重下降(p＜0.05)(图16)。
在第110天用抗人核抗原抗体进行的组织学研究，结果表明移植细胞存活(图17A-C)。
要认识到的是，为明晰起见而在单独的实施方案背景下描述的本发明的某些特征，还可以在单个实施方案中组合提供。相反地，简言之，在单个实施方案背景下描述的本发明的多种特征，也可单独地或以任何适宜的子组合提供。
尽管已描述了本发明及其具体实施方案，但显然，许多改变、修改和变更对本领域技术人员是显而易见的。因此，意味着包含所有这些改变、修改和变更，只要它们属于所附权利要求的精神和广泛范围。本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请都通过引用整体结合到本说明书中，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请具体地和单独地引入本文作为参考。另外，本申请中引用或标出的任何参考文献都不应被解读为认可这些参考文献可用作本发明的现有技术。
序列表
<120>用于CNS疾病治疗的分离细胞及包含其的细胞群
<130>31988
<160>56
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>单链DNA寡核苷酸
<400>1
cgacagtcag ccgcatctt            19
<210>2
<211>21
<212>DNA
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<220>
<223>单链DNA寡核苷酸
<400>2
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<400>4
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<213>人工序列
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<223>单链DNA寡核苷酸
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<223>单链DNA寡核苷酸
<400>35
gacattacgc tatgcacctc agtg      24
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<223>单链DNA寡核苷酸
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catgctggac ccaagctca            19
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<223>单链DNA寡核苷酸
<400>37
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<223>单链DNA寡核苷酸
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<223>单链DNA寡核苷酸
<400>40
agctccgggt tggtatactg g        21
<210>41
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>单链DNA寡核苷酸
<400>41
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<220>
<223>单链DNA寡核苷酸
<400>56
cgacagtcag ccgcatctt       19

Claims (48)

1. 一种分离的人细胞，所述人细胞包含至少一种星形胶质细胞表型和至少一种间充质干细胞表型，其中所述间充质干细胞表型不是星形胶质细胞表型。
2. 一种分离的人细胞，所述人细胞包含至少一种间充质干细胞表型和至少一种星形胶质细胞结构表型，其中所述间充质干细胞表型不是星形胶质细胞结构表型。
3. 一种分离的人细胞，所述人细胞包含至少一种间充质干细胞表型和至少一种星形胶质细胞功能表型，其中所述间充质干细胞表型不是星形胶质细胞功能表型。
4. 一种分离的人细胞，所述人细胞包含至少一种间充质干细胞表型，并表达至少一种神经营养因子，其中所述表达是间充质干细胞中所述神经营养因子的基础表达的至少2倍高。
5. 一种含人细胞的分离细胞群，其中：
(i)至少N％的所述人细胞包含至少一种星形胶质细胞表型；
(ii)至少M％的所述人细胞包含至少一种间充质干细胞表型，所述间充质干细胞表型不是星形胶质细胞表型；和
(iii)至少一种所述人细胞同时包含所述至少一种星形胶质细胞表型和所述至少一种间充质干细胞表型；
其中M和N各自独立地选自1-99。
6. 一种含人细胞的分离细胞群，其中：
(i)至少N％的所述人细胞表达至少一种神经营养因子，其中所述表达是间充质干细胞中所述神经营养因子的基础表达的至少2倍高；
(ii)至少M％的所述人细胞包含至少一种间充质干细胞表型；和
(iii)至少一种所述人细胞同时表达所述至少一种神经营养因子和所述至少一种间充质干细胞表型；
其中M和N各自独立地选自1-99。
7. 一种含人细胞的分离细胞群，其中：
(i)至少N％的所述人细胞包含至少一种星形胶质细胞结构表型；
(ii)至少M％的所述人细胞包含至少一种间充质干细胞表型，所述间充质干细胞表型不是星形胶质细胞结构表型；和
(iii)至少一种所述人细胞同时包含所述至少一种星形胶质细胞结构表型和所述至少一种间充质干细胞表型；
其中M和N各自独立地选自1-99。
8. 一种含人细胞的分离细胞群，其中：
(i)至少N％的所述人细胞包含至少一种星形胶质细胞功能表型；
(ii)至少M％的所述人细胞包含至少一种间充质干细胞表型，所述间充质干细胞表型不是星形胶质细胞功能表型；和
(iii)至少一种所述人细胞同时包含所述至少一种星形胶质细胞功能表型和所述至少一种间充质干细胞表型；
其中M和N各自独立地选自1-99。
9. 权利要求1、2、3、4、5、6、7或8中任一项的分离的人细胞和分离的细胞群，其中所述细胞未被遗传操作。
10. 权利要求1或5的分离的人细胞或细胞群，其中所述至少一种星形胶质细胞表型是结构表型。
11. 权利要求1或5的分离的人细胞或细胞群，其中所述至少一种星形胶质细胞表型是功能表型。
12. 权利要求2或7的分离的人细胞或细胞群，其中所述细胞还包含星形胶质细胞功能表型。
13. 权利要求12的分离的人细胞或细胞群，其中所述星形胶质细胞功能表型不是所述间充质干细胞表型。
14. 权利要求3或8的分离的人细胞或细胞群，其中所述细胞还包含星形胶质细胞结构表型。
15. 权利要求4或6的分离的人细胞或细胞群，其中所述细胞还包含星形胶质细胞结构表型。
16. 权利要求14或15的分离的人细胞或细胞群，其中所述星形胶质细胞结构表型不是所述间充质干细胞表型。
17. 权利要求2、7、10、14或15中任一项的分离的人细胞或细胞群，其中所述星形胶质细胞结构表型是细胞大小、细胞形状、细胞器大小和细胞器数量。
18. 权利要求2、7、10、14或15中任一项的分离的人细胞或细胞群，其中所述星形胶质细胞结构表型是至少一种星形胶质细胞标记的表达。
19. 权利要求18的分离的人细胞或细胞群，其中所述星形胶质细胞标记是表面标记。
20. 权利要求18的分离的人细胞或细胞群，其中所述星形胶质细胞标记是内部标记。
21. 权利要求3、8、11或12中任一项的分离的人细胞或细胞群，其中所述星形胶质细胞功能表型是至少一种神经营养因子的表达，所述表达的水平是间充质干细胞中所述神经营养因子的基础表达的至少2倍高。
22. 权利要求4、6或21中任一项的分离的人细胞或细胞群，其中所述至少一种神经营养因子选自：神经胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)、神经生长因子(NGF)、脑衍生的神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3(NT-3)、神经营养因子-4/5、Neurturin(NTN)、Persephin、脑衍生的神经营养因子(BDNF)、artemin(ART)、睫状神经营养因子(CNTF)、胰岛素生长因子-I(IGF-1)和Neublastin。
23. 权利要求22的分离的人细胞或细胞群，其中所述至少一种神经营养因子是GDNF。
24. 权利要求18的分离的人细胞或细胞群，其中所述星形胶质细胞标记选自S100β、神经胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)、谷氨酰胺合成酶、GLT-1和GLAST。
25. 权利要求23的分离的人细胞或细胞群，其中所述GDNF的分泌受IL-1β和/或卡麦角林调节。
26. 一种产生星形胶质细胞样细胞的方法，所述方法包括在含血小板衍生生长因子(PDGF)和人神经调节素1-β1的分化培养基中孵育间充质干细胞，由此产生星形胶质细胞样细胞。
27. 权利要求26的方法，其中所述孵育的持续时间为约48小时。
28. 权利要求26的方法，其中所述PDGF的浓度为约5ng/ml。
29. 权利要求26的方法，其中所述人神经调节素1-β1的浓度为约50ng/ml。
30. 权利要求26的方法，其中所述分化培养基还包含L-谷氨酰胺、二丁酰环腺苷酸和异丁基甲基黄嘌呤IBMX。
31. 权利要求26的方法，所述方法还包括在所述孵育之前在一种另外的培养基中培养细胞，由此使所述细胞倾向于分化为星形胶质细胞样细胞。
32. 权利要求31的方法，其中所述另外的培养基包含人表皮生长因子(hEGF)和人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)。
33. 权利要求32的方法，其中hEGF的浓度为约20ng/ml。
34. 权利要求32的方法，其中hbFGF的浓度为约20ng/ml。
35. 权利要求31的方法，其中所述另外的培养基还包含L-谷氨酰胺、胰岛素、孕酮、腐胺、硒和转铁蛋白。
36. 权利要求31的方法，其中所述培养的持续时间为约48小时。
37. 权利要求26的方法，其中所述间充质干细胞如下获得：
(a)在能够维持和/或扩增所述间充质干细胞的增殖培养基中培养含所述间充质干细胞的细胞群；和
(b)从步骤(a)产生的细胞中选择所述间充质干细胞。
38. 权利要求37的方法，其中步骤(b)通过收获表面粘附细胞实施。
39. 一种产生星形胶质细胞样细胞的方法，所述方法包括在含至少一种分化剂的培养基中孵育间充质干细胞，所述至少一种分化剂选自血小板衍生生长因子(PDGF)、人神经调节素1-β1、FGF2、EGF、N2、IBMX和cAMP，由此产生星形胶质细胞样细胞。
40. 一种治疗CNS疾病或障碍的方法，所述方法包括给有需要的个体施用治疗有效量的星形胶质细胞样细胞，由此治疗CNS疾病或障碍。
41. 星形胶质细胞样细胞的用途，所述用途用于治疗CNS疾病或障碍。
42. 权利要求40的方法，所述方法还包括给所述个体施用能够内源合成至少一种神经递质的干细胞。
43. 权利要求40或41的方法或用途，其中所述CNS疾病或障碍是神经变性疾病或障碍。
44. 权利要求40或41的方法或用途，其中所述CNS疾病或障碍选自运动障碍、分离性障碍、心境障碍、情感障碍、成瘾障碍和痉挛性障碍。
45. 权利要求43的方法或用途，其中所述神经变性疾病选自Parkinson病、多发性硬化、癫痫、肌萎缩性侧索硬化、中风、自身免疫性脑脊髓炎、糖尿病性神经病、青光眼神经病、Alzheimer病和Huntingdon病。
46. 权利要求40或41的方法或用途，其中所述细胞是自体细胞。
47. 权利要求40或41的方法或用途，其中所述细胞是非自体细胞。
48. 一种药用组合物，所述药用组合物含作为活性物质的权利要求1、2、3、4、5、6、7或8中任一项的任一种细胞或细胞群和药学可接受载体。
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