CN102725398B

CN102725398B - 用于培养及保存牙髓细胞的离体牙的移送方法

Info

Publication number: CN102725398B
Application number: CN201080057317.9A
Authority: CN
Inventors: 斋藤一郎; 大久保亮; 大友宏一
Original assignee: ADVANCED CENTER FOR TISSUE ENGINEERING Ltd; TSURUMI UNIVERSITY
Current assignee: Kidswell Bio Corp
Priority date: 2009-12-21
Filing date: 2010-12-14
Publication date: 2014-01-08
Anticipated expiration: 2030-12-14
Also published as: RU2499609C1; JP4918631B2; HK1171247A1; CN102725398A; JPWO2011078011A1; WO2011078011A1; KR20120112506A; KR101202076B1

Abstract

本发明的目的在于提供一种不损伤牙髓细胞在活体内的功能，移送用于培养及保存牙髓细胞的离体牙的方法。本发明的牙髓细胞的采集方法包括下列工序：在离体牙的表面添加直线形的槽；沿着槽分割所述离体牙，使牙髓露出；将所述离体牙浸入培养基，以维持在适合细胞保存的温度的状态下进行运送。

Description

用于培养及保存牙髓细胞的离体牙的移送方法

相关申请

本申请要求2009年12月2 1日在日本提出的日本专利申请2009-289090号的优先权，并将其内容引用到本申请中。

技术领域

本发明涉及用于培养及保存牙髓细胞的离体牙的移送方法，尤其涉及在具有含牙髓细胞的牙髓的离体牙的移送中，提高该细胞的保存性。

背景技术

自古以来，如同通过输血而被大家所熟知的那样，使用采集的细胞，使由于外伤或疾病以及事故等失去的组织或脏器再生的再生医疗的研究开发一直很活跃。近年来，再生医疗的具体过程以如下过程为目标：采集未分化状态的干细胞，将其在体外进行培养，根据不同情况使其分化后，移植到患处促使再生。作为用于这方面的干细胞，已知有胚胎干细胞（ES细胞）和成体干细胞。

胚胎干细胞是具有高增殖能力和多能性的源自胚胎的细胞，但是关于将其应用到再生医疗方面，还存在由于使用受精卵带来的伦理问题及因移植产生的排斥反应问题等。

另一方面，成体干细胞与胚胎干细胞相比，虽然限制了分化能力，但是由于以较未分化的状态存在于活体的各种组织中，因此可以采集、培养自身细胞，用于治疗。因此，成体干细胞在其应用方面不具有如胚胎干细胞那样的伦理方面及排斥反应的问题，因此，在再生医疗方面正在向实用化方面发展。

至今为止，虽然认为在骨髓、肌肉、神经、肝脏、脾脏、小肠等多个组织中存在成体干细胞，但由于能够向间叶组织（皮肤、骨、软骨、齿、神经、血管、心肌等）分化的间叶干细胞（mesenchymal stemcell）的有用性，因此现今最被期待用于再生医疗中。作为含有该间叶干细胞的组织，以骨髓为首，还已知有牙髓、脂肪组织、脐带血等。但是，由上述组织中采集干细胞时，采集对象往往要担负痛苦等风险，例如，骨髓需要进行基于骨髓穿刺的骨髓采集手术，从脂肪组织中的采集需要伴随吸脂手术来实施等。此外，虽然脐带血的采集几乎不伴有痛苦，但是需要配备满足严格采集条件的设备，并且采集的时机仅限于分娩时。

因此，提出了与这些组织相比，能够以极低的风险进行采集的牙髓干细胞的应用（专利文献1及2）。即，含牙髓干细胞的牙髓细胞可以采集自以往在医疗设施中作为医疗废弃物来处理的立事牙（智齿）或乳牙等离体牙，因此容易收集，在确立培养方法及保存方法方面也给出了高实用性的启示。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第4125241号公报

专利文献2：日本特开2004-201612号公报

发明内容

要解决的技术问题

但是，一般情况下，以用于再生医疗为目的进行采集、培养的干细胞需要冷冻保存，直至实际用于治疗时为止。但是，个人将干细胞在最佳条件下进行长期保存是完全不现实的事情，因此现在，对采集干细胞的培养、保存处理及保存，大多必然要委托给具备细胞保藏设备的机构。因此，在牙髓干细胞的情况下，在各牙科医疗机构拔除的牙在从该机构移送给细胞保藏机构，直至进行培养、保存处理为止的这段时间，显然需要使干细胞处于存活状态。

但是，为了更加切实地利用从离体牙中采集的仅极微量的牙髓干细胞，使其在维持同活体内一样高的增殖能力的状态下，将牙髓干细胞移送到细胞保藏机构的技术还未见报道。因此，在所述机构中进行细胞采集、保存处理的阶段，存在已经对干细胞造成功能损伤的可能性。即，在上述体制的情况下，由于进行准备及运输，从牙齿被拔除掉开始到取出牙髓细胞、进行培养及保存处理为止，需要24~48小时左右，但是难以从经过这样一段时间后的离体牙中确保完整的牙髓细胞。尤其是恒牙的情况下，即使浸渍于保存液中进行移送，但由于保存液被象牙质所包围，不能够充分浸透到牙髓，因此牙髓细胞只能够保持极短的时间。因此，能够想到预先从离体牙中取出带有牙髓细胞的牙髓，并浸渍到保存液中进行移送，但是在技术及设备存在差异的各医疗设施中，要将因微量而难以处理的牙髓以稳定的品质进行处理，实际上被认为是不可能的。

本发明是鉴于上述问题而完成的，其目的在于提供一种不损伤牙髓细胞在活体内的功能，移送用于培养及保存牙髓细胞的离体牙的方法。

技术方案

为了实现上述目的，本发明人进行了深入研究，结果发现通过对离体牙进行使牙髓露出的特定处理，然后以保存状态进行运送，能够在使牙髓干细胞保持再生医疗所需的正常功能的状态下，移送含牙髓的离体牙，至此完成了本发明。

即，本发明的用于培养及保存牙髓细胞的离体牙的移送方法，其特征为，其包括下列工序：在离体牙的表面添加直线形的槽；沿着槽分割所述离体牙，使牙髓露出；将所述离体牙浸入培养基，以维持在适合细胞保存的温度的状态进行运送。

并且，在所述方法中，所述直线形的槽优选为沿着从离体牙的齿冠至齿根的纵切线，从该离体牙的侧面向中心形成槽。

并且，在所述方法中，所述直线形的槽优选为沿着离体牙的齿冠部咬合面的分割线，从该离体牙的上面向中心形成。

并且，在所述方法中，所述运送所需时间优选为48小时以内。

并且，在所述方法中，所述离体牙为恒牙，优选为牙髓未经处理的阻生牙、多生牙或方便拔掉的牙。

并且，在所述方法中，所述直线形的槽的长度优选为5~10mm、宽度优选为0.5~1.5mm、深度优选为2~4mm。

此外，本发明的用于培养及保存牙髓细胞的离体牙的移送方法，其特征为，包括将形成2/3以上后继恒牙齿根的离体乳牙浸入培养基内，以维持在适合细胞保存的温度的状态进行运送的工序。

并且，在上述方法中，所述运送所需时间优选为48小时以内。

发明效果

根据本发明，将具有含牙髓干细胞的牙髓的离体牙向细胞保藏机构等移送所需的24~48小时期间，能够不损害并维持在活体内的功能。因而，在拔牙后能够保持接近活体内的状态直至进行牙髓干细胞的培养、保存处理，因此能够将从离体牙中采集的仅极微量的牙髓干细胞有效地应用于再生医疗。

附图说明

图1为根据本发明方法的（A）乳牙、（B）恒牙的牙髓细胞的增殖曲线。

图2为根据本发明方法的（A）乳牙、（B）恒牙的牙髓细胞的ALP染色质像。

图3为根据本发明方法的（A）乳牙、（B）恒牙的牙髓细胞的SA-β-gal染色质像。

图4为根据本发明方法的牙髓细胞的培养细胞的染色体像。

图5为根据本发明方法的牙髓细胞的培养细胞的染色体像。

具体实施方式

本发明提供一种例如在细胞保藏机构中对牙髓细胞进行培养、保存处理，必要时应用于再生医疗的这一模型中，在从齿科医疗机构运送到细胞保藏机构期间，用于保存牙髓的存活细胞数量及其功能的移送方法，所述牙髓细胞存在于从在各地齿科医疗机构被拔除的牙中得到的牙髓中，并含有牙髓干细胞。从将牙髓中的微量细胞切实地用于培养、保存的角度来看，本发明与技术、设备无关，在任何齿科医疗机构都可以容易地实施，并且可发挥稳定的细胞保持效果。

此外，本发明方法显然也能够适用于除所述的从齿科医疗机构送至细胞保藏机构以外的的细胞移送中。

下面，对本发明方法的优选实施方式进行说明。

本发明使用的离体牙，只要是具有牙髓的离体牙即可，可以是乳牙，也可以是恒牙。通常，可以使用在牙科医疗机构通过牙科处理来拔除掉的离体牙。并且即使是自然脱离的牙，只要牙的状态符合下述条件，并且能够迅速地进行后述的对离体牙的处理，就可以使用。

作为特别适合利用牙髓干细胞的离体牙可以例举如下状态的离体牙。

作为乳牙，可以使用未经过处理的牙、修复牙中的任何一种，但进行了牙髓切断及拔髓等处理的牙不优选。

并且，对于已被确认为摇动的乳牙，优选没有龋齿，且形成2/3以上后继恒牙齿根的离体牙。患有龋齿、根尖牙周炎（Per）等的离体牙，由于不能期望采集到正常的牙髓，因此不适合使用。

此外，对于没有被确认摇动的乳牙，同样优选没有龋齿，且形成2/3以上后继恒牙齿根的离体牙。但是，即使有龋齿，但进程停止在C1（珐琅质龋齿）或C2（象牙质龋齿）并确认形成2/3以上后继恒牙齿根的离体牙也可以使用。另一方面，因龋齿而发生牙髓炎的离体牙。

作为恒牙，适合使用作为所谓立事牙（智齿）的阻生牙、多生牙或方便拔掉的牙等可以拔掉的牙，但同乳牙一样，不优选经过牙髓处理的离体牙及牙髓患病的离体牙。

即使是因拔牙处理等出现牙损伤或缺损的情况下，只要该离体牙为停止在珐琅质或象牙质等不影响后述的离体牙处理，就没有问题，能够使用。

接下来，对离体牙的处理进行详细说明。

上述离体牙，根据需要对其表面进行擦拭、消毒，并在表面设置直线形的槽。由于该槽作为下一步工序中对牙齿进行分割时的向导，因此在沿着该槽对牙进行分割时，需要在位于牙齿中心的牙髓露出的位置及方向上形成。

在分割时应尽可能地露出牙髓，对于槽的形成位置及方向没有限制，例如可例举下述实施方式。

（例1）

沿着从离体牙的齿冠至齿根的纵切线，从该离体牙的侧面向中心形成槽。离体牙侧面上的所述纵切线的位置，只要沿该纵切线的槽可朝向该离体牙中心进行雕刻即可，没有限制。

（例2）

沿着离体牙的齿冠部咬合面的分割线，从所述离体牙的上面向中心形成槽。此时，成为槽的分割线优选通过咬合面的大致中心，但只要槽朝向离体牙中心进行雕刻，所述分割线的位置就不成为问题。

希望的是上述槽尽可能长、深地形成。槽的长度及宽度，只要是能够以该槽作为向导进行分割的程度即可，根据离体牙的大小及设置槽的部位，优选在长5~10mm、宽0.5~1.5mm的范围内进行适当调节。并且，槽的深度为从珐琅质至象牙质的程度，优选为向牙中心2~4mm的范围。如果槽过深，则牙髓细胞往往会破碎，因此需注意。

并且，所述槽的形成，例如可以在注水条件下，使用金刚石刻刀实施。

在本发明的方法中，在离体牙上按照上述方法设置槽后，沿着该槽对牙进行分割。如果所述槽朝向牙髓所在的中心进行适当雕刻，则离体牙沿着该槽能够正好切成两部分。即，通过预先在上述的工序中，添加适当的槽，则与技术及设备无关，能够使坚固的牙齿容易地进行分割。

对于分割离体牙的方法没有限制，通常，将牙根梃子等插入到槽中，沿着槽压开，从而能够将牙齿分为两个部分。困难的情况下，可以将角凿等插入到槽中，用木槌等敲打，可以分成两部分。

沿着预先设置的槽将离体牙进行适当的分割时，存在于其内部中央的牙髓会露出。此时，优选不使器具等与露出的牙髓接触。

此外，对牙齿的分割数量也没有限制，但对于使牙髓露出，可认为分成两部分已经足够。但是，在通过一次分割不能够使牙髓充分露出的情况下，根据需要，需要重新从形成槽的工序再次进行。

将分割后的离体牙浸渍于细胞用培养基或保存液中，并保持在适合保存细胞的温度下。通过在这种状态下进行运送，能够使存在于离体牙内的牙髓中的，含有牙髓干细胞的牙髓细胞在48小时以内几乎完全维持原有的全部功能（生理活性）及其存活细胞数。适合保存细胞的低温是指在抑制代谢活性的状态下，使细胞能够存活的温度，一般为4~8℃，最优选为4℃。

使用的培养基或保存液，只要是通常用于细胞培养及细胞保存中的即可，尤其优选α-MEM培养基（20%FBS、100μM L(+)-抗坏血酸、青霉素（50u/mL）/链霉素（50μg/mL）。

将这些培养基或保存液放入用于培养的带盖试管等中，将露出牙髓的分割离体牙浸渍到其中，并盖上盖子，以维持适合保存细胞的温度（例如4℃）的状态进行运送为优选。

此外，离体牙为乳牙，齿根部被吸收的情况下，培养基或保存液容易浸透到牙髓。因此，对于乳牙，也可以省略上述在牙齿上形成槽的工序及分割工序，仅按照上述方法将离体乳牙浸渍到细胞用培养基或保存液中，保持在低温下进行运送。这种情况下，牙髓细胞也能够几乎以完整的状态保存24~48小时。

当然，同样也可以像恒牙一样，在乳牙上形成槽及进行分割处理。

按照上述顺序进行移送的离体牙中的含牙髓干细胞的牙髓细胞（牙髓）优选在细胞保藏机构中，在适当的条件下从离体牙中取出，按照公知的细胞处理方法进行培养、保存处理后，长期保存。可以在必要时取出保存的牙髓细胞，用于再生医疗等。或者也可以对保存的细胞施以iPS化等技术，用于医疗或研究。

实施例

下面，表示本发明的实施例，但本发明并不限于这些实施例。

首先，表示根据本发明方法的离体牙（乳牙、恒牙）移送（保存）例。

<移送（保存）例>

乳牙

按照牙科的方法拔掉没有龋齿，且形成2/3以上后继恒牙齿根的摇动的乳牙或者有未达珐琅质仅限于象牙质的龋齿且形成2/3以上后继恒牙齿根的非摇动的乳牙。拔掉后放入充满α-MEM培养基的无菌试管中，在低温（4℃）下冷藏，包括运送时间保存24小时。

恒牙

按照牙科的方法拔掉没有龋齿，未处理牙髓的阻生牙、多生牙或方便拔掉的牙。拔掉后，使用金刚石刻刀在牙齿的侧面中央位置，从齿冠上端至根尖添加槽，槽的深度至象牙质。

然后，沿着槽使用牙根梃子将牙纵切为两部分，使牙髓露出。将分割后的牙放入充满α-MEM培养基的无菌试管中，在4℃下冷藏，包括运送时间保存24小时。

将进行了上述移送（保存）例的乳牙及恒牙的牙髓细胞按照下述顺序进行培养、保存，并对其功能的保持进行了研究。

<培养方法>

1.牙髓的采集

将上述移送（保存）例的离体牙（从拔牙开始24小时）在灭菌皿中拍摄照片。然后，使用镊子和钻孔器，取出牙髓。对取出牙髓的牙拍摄照片，用福尔马林固定。

回收牙髓，以100×g 4℃ 20sec进行离心后，去除上清液，加入10mL的冲洗用PBS，对其再次离心，反复进行3次这种冲洗工序。

去除上清液，加入2mL的酶解用培养基，在37℃下处理1小时（30分钟混合一次），将其在2000rpm（4℃）下离心5分钟。

去除上清液，加入5mL的α-MEM培养基，在2000rpm（4℃）下离心5分钟。然后，去除上清液，加入5mL的α-MEM培养基，对细胞数量进行计数，将获得的牙髓细胞接种至T-25烧瓶中。

并且，上述酶解用培养基为7.5mL的α-MEM培养基（α-MEM：395mL、FCS：100mL、200mM的抗坏血酸：250μL、PS：5mL的混合液），2.5mL的DispaseII（2.4U/mL、Roche公司生产），以及30mg的胶原酶（和光纯药公司生产）的混合液。

2.牙髓细胞培养

在上述工序后，2天更换一次培养基，融合后进行下一步的继代操作。

并且，在接种1天后及继代前拍摄细胞照片。

3.继代

使用PBS（—）对培养细胞进行2次冲洗后，加入1mL 0.05%的胰蛋白酶/EDTA进行再次冲洗，在37℃下进行5分钟孵育（incubater）。

然后，加入5mL新的α-EME培养基进行悬浮后，在1000rpm（4℃）下离心5分钟。去除上清液，悬浮于新的培养基中，接种到10cm的培养皿中，进行培养（继代第2代）。

并且，采集10mL将继代第2代培养了3天以上的培养基，并在-20℃下保存，将保存的液体作为病毒检查的检体。

通过重复上述操作，按照同样的方法获得继代第3代~第10代。

4.原种的制备

各继代的原种按照下述方法制备。

在上述继代操作后，对细胞数量进行计数，在1000rpm（4℃）下离心5分钟。然后，去除上清液，加入细胞库II（Cell Banker II）进行悬浮，使每瓶中的细胞数为1×10⁶细胞/mL以上。将其分别注入到小瓶中，每瓶注入1mL，将小瓶放入到生物冷冻容器（BIOFREEZING VESSEL）中，在-80℃下放置2天后，移入到液氮中。

将由上述方法培养的继代第3代、第7代、第10代的牙髓细胞按照下述方法进行试验。

<制作增殖曲线>

将在培养皿上培养的细胞用PBS（—）清洗2次后，加入1mL0.05%胰蛋白酶/10mM EDTA，洗净。然后，在37℃下进行5分钟孵育，确认细胞已从培养皿中剥离后，加入培养基进行悬浮。将细胞悬浮液在1000rpm（4℃）下离心5分钟，去除上清液后，再次加入培养基进行悬浮，在1000rpm（4℃）下离心5分钟。

然后，将细胞悬浮于新的培养基中，对细胞数量进行计数。

将5.4×10⁵数量的细胞悬浮于9.5mL培养基中，在24孔板的12个孔中以500μL/孔分别注入。然后，在各孔中分别加入500μL培养基，使其为1mL/孔。

将其在37℃，5%CO₂培养箱中培养，每24小时对2个孔中的细胞数量进行计数。计数直到细胞增殖达到稳定期为止，从而得到图1所示的增殖曲线。

图1中的（A）为乳牙、（B）为恒牙的牙髓细胞的增殖曲线。所述乳牙、恒牙均是通过上述移送（保存）例获得的。牙髓细胞的培养是根据上述培养方法进行的。

如图1所示，使用的恒牙、乳牙中的任意牙髓细胞，直至第10代为止均维持了几乎同等的增殖能力，与一般的牙髓细胞（拔牙后立即进行培养）的增殖曲线相比没有发现异常。

并且，对没有进行本发明的移送方法，而仅是在拔牙后浸入保存液中进行24小时以内上述培养的牙也进行了同样的试验，对于恒牙的增殖能力大幅度降低，每增加一次继代次数，其降低程度变得显著。

并且，根据本发明，能够在维持含干细胞的牙髓细胞的增殖能力的状态下，对离体牙进行移送。

<碱性磷酸酶（ALP）染色>

将在培养皿中培养的细胞用PBS（—）清洗2次后，进一步加入1mL 0.05%胰蛋白酶/10mM EDTA，洗净。然后，在37℃下进行5分钟孵育，确认细胞已从培养皿中剥离后，加入培养基进行悬浮。将细胞悬浮液在1000rpm（4℃）下离心5分钟，去除上清液，然后再次加入培养基进行悬浮，在1000rpm（4℃）下离心5分钟。

然后，对细胞数量进行计数，在6孔板中以1×10⁵细胞/孔进行接种，培养1夜。

培养后，将细胞用PBS清洗1次，用2mL 4%的PFA固定3分钟，用PBS清洗2次。然后，加入1mL的检测缓冲液（1M Tris-HCl（pH 9.5）：50mL、3M NaCl：16.67mL、1M MgCl：25mL、B，W：408.33mL的混合溶液），放置2分钟。

吸出检测缓冲液，加入500μL显色液（检测缓冲液：5mL、NBT：16.5μL、BCIP：16μL），避光放置2小时后，用蒸馏水清洗5分钟孔中的细胞。

在各个孔中加入700μL的4% PFA/PBS，在室温下孵育10分钟。然后，去除4% PFA/PBS，用PBS（—）冲洗3次。

接着，在各个孔中加入3滴IMMU-MOUNT，盖上盖玻片，在室温下保存。

图2中的（A）为乳牙、（B）为恒牙的牙髓细胞的染色质象。所述乳牙、恒牙，均是通过上述移送（保存）例获得的。牙髓细胞的培养是根据上述方法进行的。

碱性磷酸酶（ALP）用作成骨细胞的标记，已知表示骨形成的细胞被染成紫色（ALP阳性细胞）。

如图2所示，使用的恒牙、乳牙中的任意牙髓细胞均确认为ALP阳性细胞。虽然可看出ALP阳性细胞随着继代数的增加而减少，但通过继代，细胞的总数本身增加。因此，能够想到这些牙髓细胞在整形外科疾病（骨折等骨修复等）方面非常有用。并且，该结果不逊色于通过其它途径得到的通常的牙髓细胞（拔牙后立即进行培养的牙髓细胞）所带来的效果。

并且，对没有进行本发明的移送方法，而仅是在拔牙后浸入保存液中进行24小时以内上述培养的牙也进行了同样的试验，对于恒牙，可知ALP阳性细胞数量及细胞的总数明显少于图2（B）。

因此，根据本发明，能够在维持含干细胞的牙髓细胞的增殖能力的状态下，对离体牙进行移送。

<细胞老化的测定（SA-β-gal染色）>

然后，将细胞悬浮于新的培养基中，对细胞数量进行计数，在6孔板中以1×10⁵细胞/孔进行接种后，在37℃，5%CO₂下孵育24小时。

除去培养基，用PBS（—）冲洗，在各孔中加入700μL的4%PFA/PBS，在RT下孵育10分钟。然后，去除4% PFA/PBS、，用PBS（—）冲洗3次。

在各孔中加入700μL的SA-β-gal溶液，在室温下孵育1夜，在显微镜下对染色的细胞进行检查后摄影。

除去SA-β-gal溶液，用PBS（—）进行2次冲洗后，在各孔中加入700μL的4%的PFA/PBS，在室温下孵育10分钟。然后，去除4%PFA/PBS，用PBS冲洗3次。

接着，在各孔中加入3滴IMMU-MOUNT，盖上盖玻片，在室温下保存。

图3中的（A）为乳牙、（B）为恒牙的牙髓细胞的SA-β-gal染色质象。所述乳牙、恒牙均是通过上述移送（保存）例获得的，牙髓细胞的培养是根据上述方法进行的。

SA-β-gal用作细胞的老化标记，已知停止细胞分裂的老化细胞被染成蓝色（SA-β-gal阳性细胞）。

如图3所示，使用的恒牙、乳牙中任意的牙髓细胞均不被认为是SA-β-gal阳性细胞，即使重复继代，该结果也没有变化。由此能够想到在这些牙髓细胞中由继代带来的增殖能力的变化很小，能够进行稳定的培养，非常有用。并且，该结果不逊色于通过其它途径得到的通常的牙髓细胞（拔牙后立即进行培养的牙髓细胞）所带来的效果。

并且，对没有进行本发明的移送方法，而仅是在拔牙后浸入保存液中进行24小时以内上述培养的牙也进行了同样的试验，对于恒牙，已确认为SA-β-gal阳性细胞。

<染色体分析>

取根据上述移送（保存）例的源自女性恒牙及男性乳牙的人类牙髓细胞各1例，按照上述培养方法进行培养，分析其染色体数。对分别50个培养细胞的染色体数进行分析，分析结果如表1及表2所示。具体的分析方法如下。

将经过10代继代的牙髓细胞制成染色体标本，进行姬姆萨染色，确定染色体数量后，将该标本通过Quinacrine-Hoechst染色进行显带。基于标准核型对染色体进行分类，并进行核型分析。

表1

表2

图4为表1的46条染色体数的代表例，图5为表2的46条染色体数的代表例。

将表1的46条染色体数的细胞通过Q显带技术，对10个进行分析，结果为如图4中代表的那样，全部为XX型。并且，对表2的46条染色体数的细胞进行了同样的分析，结果如图5所示，全部为XY型。

如表1、2及4、5所示，分析得到的人类牙髓细胞的染色体数几乎在全部的细胞中，均为正常的46条。

因此，根据本发明的移送方法，显然不会引起牙髓细胞染色体数的变异。

Claims

1.一种用于保存牙髓细胞的离体牙的移送方法，其特征在于，其包括下列工序：

在离体牙的表面添加直线形的槽；

沿着槽分割所述离体牙，使牙髓露出；

将所述离体牙浸入培养基，以4～8℃保存的状态进行运送；

所述离体牙为恒牙；

所述直线形的槽的长度为5～10mm、宽度为0.5～1.5mm、深度为2～4mm。

2.根据权利要求1所述的用于保存牙髓细胞的离体牙的移送方法，其特征在于，所述直线形的槽是沿着从离体牙的齿冠至齿根的纵切线，从该离体牙的侧面向中心形成槽。

3.根据权利要求1所述的用于保存牙髓细胞的离体牙的移送方法，其特征在于，所述直线形的槽是沿着离体牙的齿冠部咬合面的分割线，从该离体牙的上面向中心形成。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的用于保存牙髓细胞的离体牙的移送方法，其特征在于，所述运送所需时间为48小时以内。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的用于保存牙髓细胞的离体牙的移送方法，其特征在于，所述恒牙为牙髓未经处理的阻生牙、多生牙或方便拔掉的牙。