CN107177546A - 一种人牙髓干细胞培养基及人牙髓干细胞的制备方法 - Google Patents

一种人牙髓干细胞培养基及人牙髓干细胞的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种人牙髓干细胞培养基及人牙髓干细胞的制备方法，属于干细胞制备技术领域。本发明提供的人牙髓干细胞培养基，以α‑MEM培养基为基础，包含体积百分含量为5％～10％的人AB血清、100μM抗坏血酸、2mM L‑谷氨酰胺、100U/ml青霉素钠和100mg/ml链霉素。本发明提供的培养基制备得到的牙髓干细胞产量高、无人体免疫排斥反应，为临床牙的修复与再生提供可靠的种子细胞。

Description

一种人牙髓干细胞培养基及人牙髓干细胞的制备方法
技术领域
本发明涉及干细胞制备技术领域，具体涉及一种人牙髓干细胞培养基及人牙髓干细胞的制备方法。
背景技术
干细胞是具有自我复制和多向分化能力的细胞，可以不断地自我更新，并在特定条件下分化成为一种或多种构成人体组织或器官的细胞，可使组织恢复再生能力，修复其功能。研究者在脱落乳牙的牙髓组织中发现一种新的成体干细胞，将其命名为乳牙牙髓干细胞，至今已有较多实验证明乳牙牙髓干细胞具有高度自我更新、克隆形成以及成骨分化的能力。
乳牙牙髓干细胞具有以下优势：1)取材方便，多取自自然脱落和拔除的滞留牙，对供者正常牙伤害较少；2)不受伦理限制，可进行自体移植治疗，最大限度降低免疫排斥和交叉感染的风险；3)具有较强的增殖能力和多向分化潜能。但牙髓中干细胞含量较低，必须在体外进行扩增，以获得足够的细胞数量来满足应用需求。目前牙髓干细胞培养体系主要采用含动物源胎牛血清的培养基，动物源胎牛血清在一定程度上有可能引起人体免疫排斥反应，增加了牙髓干细胞临床应用的风险。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人牙髓干细胞培养基及人牙髓干细胞的制备方法。本发明提供的培养基制备得到的牙髓干细胞产量高、无人体免疫排斥反应，为临床牙的修复与再生提供可靠的种子细胞。
本发明提供了一种人牙髓干细胞培养基，所述人牙髓干细胞培养基以α-MEM培养基为基础，包含体积百分含量为5％～10％的人AB血清、100μM抗坏血酸、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素钠和100mg/ml链霉素。
本发明还提供了基于上述技术方案所述培养基的人牙髓干细胞的制备方法，包括以下步骤：
1)将牙齿原料置于含有青霉素钠和硫酸链霉素的0.9％氯化钠溶液中进行清洗和消毒，得到消毒后的牙齿，所述牙齿原料为脱落的乳牙或智齿；
2)从步骤1)所述消毒后的牙齿中取出牙髓组织，置于无血清培养基中，将牙髓组织剪成组织块；
3)取步骤2)得到的组织块置于人牙髓干细胞培养基中进行培养，覆盖盖玻片；
4)在培养第4～6d时，更换培养基；在培养第10～12d时，半量换培养基；培养第15～18d时，细胞汇合率达到70～80％，进行传代培养，得到牙髓干细胞。
优选的是，所述牙齿原料为5～12岁儿童脱落的乳牙或18～29岁成人脱落的智齿。
优选的是，所述步骤1)的牙齿原料在清洗和消毒前将牙齿置于牙齿保存液中保存，保存的温度为2～8℃。
优选的是，所述牙齿保存液以DMEM培养基为基础，包括100U/ml青霉素钠和100mg/ml硫酸链霉素。
优选的是，所述步骤1)中青霉素钠在0.9％氯化钠溶液中的浓度为100U/ml，硫酸链霉素的在0.9％氯化钠溶液中的浓度为100mg/ml。
优选的是，所述步骤2)牙髓组织剪成1mm3的组织块；每8～10块组织块置于3～5ml人牙髓干细胞培养基中。
优选的是，所述步骤3)的培养在37℃、5％CO2，饱和湿度条件下进行。
优选的是，培养液完全充盈于盖玻片与组织块之间。
优选的是，所述步骤4)培养第4～6d时有细胞长出时，去掉盖玻片。
本发明提供了一种人牙髓干细胞培养基。本发明培养基中含有100U/ml的青霉素和100mg/ml的硫酸链霉素，对牙髓组织和细胞的损伤小，组织成活率高；本发明的人牙髓干细胞培养基中采用的人AB血清能够避免动物源血清等异源性污染，解决免疫排斥反应；100μM抗坏血酸，能促进牙髓干细胞外基质的形成，有利于牙髓干细胞的生长，培养的牙髓干细胞数量更多，活性更高，培养第10天细胞数量可达3.9×105，而常规培养体系培养的牙髓干细胞数量仅为2.2×105。实验结果表明，通过流式细胞术检测，本发明培养基培养的牙髓干细胞纯度高，牙髓干细胞表面标志CD73、CD90、CD105阳性表达率98％以上，阴性指标表达率低于2％。
附图说明
图1为本发明实施例3提供的流式细胞术检测牙髓干细胞表型结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种人牙髓干细胞培养基，所述人牙髓干细胞培养基以α-MEM培养基为基础，包含体积百分含量为5％～10％的人AB血清、100μM抗坏血酸、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素钠和100mg/ml链霉素。
在本发明中，所述人牙髓干细胞培养基优选包括10％的人AB血清。本发明的人牙髓干细胞培养基相比常规培养体系(含10％胎牛血清的α-MEM培养基)，采用人AB血清，能够避免动物源血清等异源性污染；本发明的人牙髓干细胞培养基含有100μM的抗坏血酸，能促进牙髓干细胞外基质的形成，有利于牙髓干细胞的生长，培养的牙髓干细胞数量更多，活性更高，培养第10天细胞数量可达3.9×105，而常规培养体系培养的牙髓干细胞数量仅为2.2×105。本发明所述人牙髓干细胞培养基只添加100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素两种抗生素，整个过程不采用75％酒精、甲硝唑、两性霉素等消毒试剂，本发明这两种抗生素的使用能够减少上述试剂对牙髓组织和细胞的损伤，提高组织成活率。
本发明还提供了基于上述技术方案所述培养基的人牙髓干细胞的制备方法，包括以下步骤：
1)将牙齿原料置于含有青霉素钠和硫酸链霉素的0.9％氯化钠溶液中进行清洗和消毒，得到消毒后的牙齿，所述牙齿原料为脱落的乳牙或智齿；
2)从步骤1)所述消毒后的牙齿中取出牙髓组织，置于无血清培养基中，将牙髓组织剪成组织块；
3)取步骤2)得到的组织块置于人牙髓干细胞培养基中进行培养，覆盖盖玻片；
4)在培养第4～6d时，更换培养基；在培养第10～12d时，半量换培养基；培养第15～18d时，细胞汇合率达到70～80％，进行传代培养，得到牙髓干细胞。
本发明将牙齿原料置于含有青霉素钠和硫酸链霉素的0.9％氯化钠溶液中进行清洗和消毒，得到消毒后的牙齿，所述牙齿原料为脱落的乳牙或智齿。在本发明中，所述牙齿原料优选为5～12岁儿童脱落的乳牙或18～29岁成人脱落的智齿。在本发明中，所述牙齿原料优选组织完整，无龋、无牙髓病和牙周病等。本发明在获得牙齿后，优选用生理盐水对牙齿表面进行处理。对牙齿表面进行处理后，本发明优选将牙齿原料置于牙齿保存液中进行保存，所述保存的温度为2～8℃，更优选为4℃。本发明对所述保存的装置没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的恒温保存装置即可，如恒温冰箱或恒温保存箱。在本发明中，所述牙齿保存液以DMEM培养基为基础，包括100U/ml青霉素钠和100mg/ml硫酸链霉素。在本发明中，所述青霉素钠在0.9％氯化钠溶液中的浓度优选为100U/ml，硫酸链霉素的在0.9％氯化钠溶液中的浓度优选为100mg/ml。在本发明中，所述清洗和消毒的时间优选为2～3min，所述清洗和消毒的作用为去除牙周软组织和血污。在本发明中，所述消毒的次数优选为1～3次，更优选为2次。
得到消毒后的牙齿后，从所述消毒后的牙齿中取出牙髓组织，置于无血清培养基中，将牙髓组织剪成组织块。在本发明中，所述步骤3)取出牙髓组织的方法包括以下步骤：将牙齿固定，去除牙釉质和牙本质，从牙髓腔中取出牙髓组织。在本发明，所述消毒后的牙齿优选采用无菌纱布进行包裹固定。本发明对去除牙釉质和牙本质的具体方法没有特殊的限定，具体的，本发明优选采取台虎钳将牙齿的牙釉质和牙本质钳开，钳开后，打开无菌纱布，优选采用灭菌的镊子从牙髓腔中取出牙髓组织。本发明的牙髓组织提取方法能够将牙齿内部结构全部展开，将牙齿内部的牙龈组织全部取出，相比于常规牙髓针提取法，获得的牙髓组织更多更完整，能够提高后期细胞培养的成功率。
本发明优选将取出后的牙髓组织装入无血清培养基中进行保存。本发明对所述无血清培养基没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的无血清培养基的常规市售产品即可。如：α-MEM培养基。发明将牙髓组织剪成1.0mm3的组织块，取剪碎后的组织块直接进行培养，与传统的酶消化法相比，操作简单，成本低廉，污染小，无杂质引入，能够更好地保持细胞活力。而常规酶消化法技术繁琐、成本昂贵，同时还存在对细胞的机械损伤和化学损伤，造成细胞培养周期很长，或者细胞培养失败。
得到组织块后，取步骤2)得到的组织块置于人牙髓干细胞培养基中进行培养，覆盖盖玻片。在本发明中，所述人牙髓干细胞培养基的体积为3～5ml。每3～5ml的人牙髓干细胞培养基中，优选放置8～10块组织块进行培养，在本发明中，所述组织块的大小为1mm3，本发明优选采用无菌眼科剪对其进行剪块。本发明在牙髓组织剪块后采用盖玻片对组织块进行压贴，由于牙髓组织块比较小，本发明方法能够更好地保证牙髓组织块贴壁，相比于传统的组织贴壁法，本发明的方法能够进一步保证组织更好贴壁，避免组织块漂浮，培养失败，本发明的方法能够完全保证组织块贴附，加速牙髓干细胞的萌出和生长，牙髓干细胞在培养第4～6天就有大量萌出，比常规的组织块培养法提前2～3天。
具体的，本发明在牙髓干细胞的培养过程中，优选选取培养皿进行培养，在培养皿中，滴加1滴培养基后，将牙科探针取组织块移入培养液滴中，每滴培养液加入8～10块组织块。本发明在培养液中加入组织块后，优选在培养液上覆盖盖玻片，轻轻加压，固定组织块。在本发明中，培养液完全充盈于盖玻片与组织块之间，避免气泡产生。在本发明中，所述牙髓干细胞的培养优选在37℃、5％CO2，饱和湿度条件下进行。
在本发明中，牙齿保存液、牙齿清洗和消毒液中只添加100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素两种抗生素，整个过程不采用75％酒精、甲硝唑、两性霉素等消毒试剂，本发明这两种抗生素的使用能够减少上述试剂对牙髓组织和细胞的损伤，提高组织成活率。
本发明在在培养第4～6d时，更换培养基；在培养第10～12d时，半量换培养基；培养第15～18d时，细胞汇合率达到70～80％，进行传代培养，得到牙髓干细胞。在本发明中，所述培养第4～6d时有细胞长出时，去掉盖玻片。本发明所述传代培养的条件没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的牙髓细胞常规传代培养方法即可。
本发明还提供了上述技术方案所述制备方法得到的牙髓干细胞在牙齿的修复和再生中的应用。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种人牙髓干细胞培养基及人牙髓干细胞的制备方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
在生物安全柜中放置2个10cm无菌培养皿，加入40ml含双抗(青霉素钠(100U/ml)，硫酸链霉素(100mg/ml))的0.9％氯化钠注射液。用无菌镊子取出采集瓶中的牙齿，放入到装有双抗和0.9％氯化钠注射液的培养皿中清洗和消毒2min，充分去除牙周软组织和血液，将消毒后的牙齿放入第二个培养皿中再消毒一次。
将清洗后的牙齿放在无菌纱布上，然后用纱布包裹牙齿，用台虎钳将牙齿的牙釉质和牙本质钳开，将无菌纱布打开，用镊子从牙髓腔内找出牙髓组织，将其装入含无血清培养基的EP管中。
在无血清培养基充分浸润条件下，用无菌眼科剪将牙髓组织剪成约1.0mm3大小的组织块。在直径6cm的培养皿的底壁滴加1滴培养基，培养体系为含5％人AB血清，100μM抗坏血酸，2mM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100mg/ml链霉素的α-MEM培养基。用牙科探针将组织碎块移入培养皿中的培养液滴中，使每滴培养液内含8小块组织。加入培养液放入培养箱中，于37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养。
在培养的第5天，更换培养基，当有细胞长出时，去掉盖玻片，在培养10天时培养基进行半量换液，培养至16天时，细胞汇合率达到72％时，进行传代培养。
结果：培养第10天可获得牙髓干细胞数量为2.6×105。流式细胞术检测结果显示牙髓干细胞表面标志CD73、CD90、CD105阳性表达率95％以上，阴性指标表达率低于5％。
实施例2
在生物安全柜中放置2个10cm无菌培养皿，加入40ml含双抗(青霉素钠(100U/ml)，硫酸链霉素(100mg/ml))的0.9％氯化钠注射液。用无菌镊子取出采集瓶中的牙齿，放入到装有双抗和0.9％氯化钠注射液的培养皿中清洗和消毒3min，充分去除牙周软组织和血液，将消毒后的牙齿放入第二个培养皿中再消毒一次。
将清洗后的牙齿放在无菌纱布上，然后用纱布包裹牙齿，用台虎钳将牙齿的牙釉质和牙本质钳开，将无菌纱布打开，用镊子从牙髓腔内找出牙髓组织，将其装入含无血清培养基的EP管中。
在无血清培养基充分浸润条件下，用无菌眼科剪将牙髓组织剪成约1.0mm3大小的组织块。在直径6cm的培养皿的底壁滴加1滴培养基，培养体系为含8％人AB血清，100μM抗坏血酸，2mM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100mg/ml链霉素的α-MEM培养基。用牙科探针将组织碎块移入培养皿中的培养液滴中，使每滴培养液内约含10小块组织。加入培养液放入培养箱中，于37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养。
在培养的第6天，更换培养基，当有细胞长出时，去掉盖玻片，在培养11天时培养基进行半量换液，培养至16天时，细胞汇合率达到80％时，进行传代培养。
结果：培养第10天可获得牙髓干细胞数量为3.1×105。流式细胞术检测结果显示牙髓干细胞表面标志CD73、CD90、CD105阳性表达率97％以上，阴性指标表达率低于3％。
实施例3
在生物安全柜中放置2个10cm无菌培养皿，加入40ml含双抗(青霉素钠(100U/ml)，硫酸链霉素(100mg/ml))的0.9％氯化钠注射液。用无菌镊子取出采集瓶中的牙齿，放入到装有双抗和0.9％氯化钠注射液的培养皿中清洗和消毒2min，充分去除牙周软组织和血液，将消毒后的牙齿放入第二个培养皿中再消毒一次。
将清洗后的牙齿放在无菌纱布上，然后用纱布包裹牙齿，用台虎钳将牙齿的牙釉质和牙本质钳开，将无菌纱布打开，用镊子从牙髓腔内找出牙髓组织，将其装入含无血清培养基的EP管中。
在无血清培养基充分浸润条件下，用无菌眼科剪将牙髓组织剪成约1.0mm3大小的组织块。在直径6cm的培养皿的底壁滴加1滴培养基，培养体系为含10％人AB血清，100μM抗坏血酸，2mM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100mg/ml链霉素的α-MEM培养基。用牙科探针将组织碎块移入培养皿中的培养液滴中，使每滴培养液内约含9小块组织。将消毒后的盖玻片缓慢覆盖于组织块上，轻轻加压，以固定组织块，依次将剩余组织块进行同样操作。加入培养液放入培养箱中，于37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养。覆盖时应注意使培养液完全充盈于盖玻片与组织块之间，切勿产生气泡。
在培养的第5天，更换培养基，当有细胞长出时，去掉盖玻片，在培养10天时培养基进行半量换液，培养至15天时，细胞汇合率达到70％时，进行传代培养。
结果：培养第10天可获得牙髓干细胞数量为3.9×105。流式细胞术检测牙髓干细胞表型结果如图1所示。流式细胞术检测结果显示牙髓干细胞表面标志CD73、CD90、CD105阳性表达率98％以上，阴性指标表达率低于2％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种人牙髓干细胞培养基，其特征在于，所述人牙髓干细胞培养基以α-MEM培养基为基础，包含体积百分含量为5％～10％的人AB血清、100μM抗坏血酸、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素钠和100mg/ml链霉素。
2.一种基于权利要求1所述培养基的人牙髓干细胞的制备方法，包括以下步骤：
1)将牙齿原料置于含有青霉素钠和硫酸链霉素的0.9％氯化钠溶液中进行清洗和消毒，得到消毒后的牙齿，所述牙齿原料为脱落的乳牙或智齿；
2)从步骤1)所述消毒后的牙齿中取出牙髓组织，置于无血清培养基中，将牙髓组织剪成组织块；
3)取步骤2)得到的组织块置于人牙髓干细胞培养基中进行培养，覆盖盖玻片；
4)在培养第4～6d时，更换培养基；在培养第10～12d时，半量换培养基；培养第15～18d时，细胞汇合率达到70～80％，进行传代培养，得到牙髓干细胞。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述牙齿原料为5～12岁儿童脱落的乳牙或18～29岁成人脱落的智齿。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)的牙齿原料在清洗和消毒前将牙齿置于牙齿保存液中保存，保存的温度为2～8℃。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述牙齿保存液以DMEM培养基为基础，包括100U/ml青霉素钠和100mg/ml硫酸链霉素。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中青霉素钠在0.9％氯化钠溶液中的浓度为100U/ml，硫酸链霉素的在0.9％氯化钠溶液中的浓度为100mg/ml。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)牙髓组织剪成1mm3的组织块；每8～10块组织块置于3～5ml人牙髓干细胞培养基中。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)的培养在37℃、5％CO2，饱和湿度条件下进行。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，培养液完全充盈于盖玻片与组织块之间。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4)培养第4～6d时有细胞长出时，去掉盖玻片。
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