CN113846057A - 一种牙髓干细胞培养基及其制备方法 - Google Patents

一种牙髓干细胞培养基及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种牙髓干细胞培养基，包括基础培养基和添加剂，添加剂由以下原料组成：胰岛素、卟啉、金纳米棒、苦参素、小球藻生长因子、黄体酮、亚硒酸钠、谷氨酰胺。培养基中添加苦参素和小球藻生长因子可以促进细胞进行有丝分裂，提高细胞增殖活性，显著提高牙髓干细胞的增殖速度，减少细胞老化，在短时间内实现牙髓干细胞的大量扩增。添加金纳米棒增加了牙髓干细胞的贴壁性，提高细胞增殖过程的稳定性，有助于细胞保持活性。上述成分协同作用可在段时间内实现牙髓干细胞的大量扩增，为牙髓干细胞的科研及临床应用提供保障。本发明还提供了一种牙髓干细胞培养基的制备方法，在基础培养基中添加添加剂各成分制备得到，过程简便，易于操作。

Description

一种牙髓干细胞培养基及其制备方法
技术领域
本发明涉及干细胞领域，尤其涉及一种牙髓干细胞培养基及其制备方法。
背景技术
干细胞是一种能不断自我更新，具有多种发育潜能，存在于胚胎、成体器 官或组织中的未分化或分化程度很低的细胞。牙髓干细胞作为间充质干细胞的一种类型，是从成人的牙齿的牙髓组织中，分离出来的一种成体干细胞。牙髓干细胞是一种具有高度增殖和多向分化能力的间充质干细胞。牙髓干细胞除了在牙科组织工程中具有良好的应用前景，还被广泛应用在再生医疗领域。相比于胚胎干细胞，牙髓干细胞没有伦理的问题，也没有免疫排斥，不存在致瘤性等问题。所以牙髓干细胞是一种很好的潜在的临床应用细胞材料。
原代培养的牙髓干细胞多来自于智齿或者因正畸需要拔除的年轻恒牙，尽管牙间充质干细胞来源广泛，但单个个体获取的原代干细胞数量有限，牙髓中干细胞含量较低，很难满足临床细胞治疗对细胞数量的需求。因此，体外大规模的扩增培养以获得足够的细胞数量是牙髓干细胞临床应用的前提。目前牙髓干细胞培养体系主要采用含动物源胎牛血清的培养基，动物源胎牛血清在一定程度上有可能引起人体免疫排斥反应，增加了牙髓干细胞临床应用的风险。部分牙髓干细胞培养基不添加胎牛血清，但是选择添加人AB血清，如专利201710596515.6中添加了5%-10%的人AB血清，人AB血清为采用AB血型正常人血液为原料，经无菌采集、分离、微孔过滤后而成。因原料来自人血，虽然对原料血浆进行了相关病原体的筛查，并在生产工艺中加入了去除和灭活病毒的措施，但理论上仍存在传播某些已知和未知病原体的潜在风险，临床使用时应权衡利弊。因此研究一种不添加外源性血清且成分明确的牙髓干细胞培养基很有必要。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于本发明提供一种牙髓干细胞培养基，成分安全，不添加外源血清，对牙髓干细胞的增殖有明显的促进作用。
本发明的目的之二在于提供一种牙髓干细胞培养基的制备方法。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种牙髓干细胞培养基，包括基础培养基和添加剂，所述添加剂由以下原料组成：胰岛素、卟啉、金纳米棒、苦参素、小球藻生长因子、黄体酮、亚硒酸钠、谷氨酰胺。
进一步地，所述添加剂各组分的终浓度为：胰岛素1-5μg/mL、卟啉1.8-2.5ng/mL、金纳米棒2.2-3.5ng/mL、苦参素8.5-10.5ng/mL、小球藻生长因子5.3-7.8 ng/mL、黄体酮5.0-7.5μg/mL、亚硒酸钠2-5μg/mL、谷氨酰胺5-10μg/mL、。
进一步地，所述添加剂中各组分的终浓度为：胰岛素3μg/mL、卟啉2.2ng/mL、金纳米棒3ng/mL、苦参素9.2ng/mL、小球藻生长因子6.4ng/mL、黄体酮6μg/mL、亚硒酸钠3.5μg/mL、谷氨酰胺8μg/mL、。
进一步地，所述基础培养基为α-MEM培养基。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
上述牙髓干细胞培养基的制备方法，包括以下步骤：取α-MEM培养基加入苦参素、金纳米棒、小球藻生长因子、卟啉、黄体酮、亚硒酸钠、谷氨酰胺、胰岛素，搅拌均匀，经滤膜过滤除菌，得到牙髓干细胞培养基。
进一步地，采用0.22μm的滤膜过滤除菌。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明的培养基中添加苦参素和小球藻生长因子可以促进细胞进行有丝分裂，提高细胞增殖活性，显著提高牙髓干细胞的增殖速度，减少细胞老化，缩短细胞培养周期，在短时间内实现牙髓干细胞的大量扩增。本发明培养基中还添加金纳米棒，研究发现金纳米棒的添加增加了牙髓干细胞的贴壁性，提高细胞增殖过程的稳定性，有助于细胞保持活性。上述成分协同作用提高牙髓干细胞的增殖效率，可在短时间内实现牙髓干细胞的大量扩增，为牙髓干细胞的科研及临床应用提供保障。
2、本发明的培养基成分明确，不含外源性血清及动物来源的蛋白成分，具有高效、安全、稳定的特点，适合牙髓干细胞的大规模培养。
3、本发明还提供了一种牙髓干细胞培养基的制备方法，在基础培养基中添加添加剂各成分制备得到，过程简便，易于操作。
附图说明
图1为本发明实施例1至3，对比例1至5提供的培养基在用于牙髓干细胞培养后细胞密度的统计结果图。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例1
一种牙髓干细胞培养基，包括α-MEM培养基和添加剂，添加剂由以下原料组成：胰岛素、卟啉、金纳米棒、苦参素、小球藻生长因子、黄体酮、亚硒酸钠、谷氨酰胺；添加剂中各组分的终浓度为：胰岛素3μg/mL、卟啉2.2ng/mL、金纳米棒3ng/mL、苦参素9.2ng/mL、小球藻生长因子6.4ng/mL、黄体酮6μg/mL、亚硒酸钠3.5μg/mL、谷氨酰胺8μg/mL。
一种牙髓干细胞培养基的制备方法，包括以下步骤：取α-MEM培养基加入苦参素、金纳米棒、小球藻生长因子、卟啉、黄体酮、亚硒酸钠、谷氨酰胺、胰岛素，搅拌均匀，经0.22μm滤膜过滤除菌，得到牙髓干细胞培养基。
实施例2
一种牙髓干细胞培养基，包括α-MEM培养基和添加剂，添加剂由以下原料组成：胰岛素、卟啉、金纳米棒、苦参素、小球藻生长因子、黄体酮、亚硒酸钠、谷氨酰胺；添加剂中各组分的终浓度为：胰岛素1μg/mL、卟啉1.8ng/mL、金纳米棒2.2ng/mL、苦参素8.5ng/mL、小球藻生长因子5.3 ng/mL、黄体酮5.0μg/mL、亚硒酸钠2μg/mL、谷氨酰胺5μg/mL。
该牙髓干细胞培养基的制备方法和实施例1相同。
实施例3
一种牙髓干细胞培养基，包括α-MEM培养基和添加剂，添加剂由以下原料组成：胰岛素、卟啉、金纳米棒、苦参素、小球藻生长因子、黄体酮、亚硒酸钠、谷氨酰胺；添加剂中各组分的终浓度为：胰岛素5μg/mL、卟啉2.5ng/mL、金纳米棒3.5ng/mL、苦参素10.5ng/mL、小球藻生长因子7.8 ng/mL、黄体酮7.5μg/mL、亚硒酸钠5μg/mL、谷氨酰胺10μg/mL。
该牙髓干细胞培养基的制备方法和实施例1相同。
对比例1
对比例1提供一种牙髓干细胞培养基，和实施例1的区别为：省去苦参碱，其余均和实施例1相同。
对比例2
对比例2提供一种牙髓干细胞培养基，和实施例1的区别为：省去小球藻生长因子，其余均和实施例1相同。
对比例3
对比例3提供一种牙髓干细胞培养基，和实施例1的区别为：省去小球藻生长因子，将苦参素的用量调整为15.6ng/mL，其余均和实施例1相同。
对比例4
对比例4提供一种牙髓干细胞培养基，和实施例1的区别为：省去苦参素，将小球藻生长因子的用量调整为15.6ng/mL，其余均和实施例1相同。
对比例5
对比例5提供一种牙髓干细胞培养基，和实施例1的区别为；省去金纳米棒，其余均和实施例1相同。
试验例
取在液氮中冷冻保存3个月的牙髓干细胞，在37℃水浴中迅速解冻复苏，离心去除冻存液，加入PBS清洗细胞两次，分别用实施例1至3，对比例1至5中的培养基重悬细胞，在T75培养瓶中进行培养，细胞密度为6×104个/cm2，在37℃，5%CO2的培养箱中进行培养，24h后进行全量换液，此后连续培养7天，每3天全量换液，在培养第7天采用台盼蓝染色法统计细胞密度，结果如图1所示。
由图1可以看出实施例1至3中细胞密度增加显著，说明细胞增殖速度快，在短时间内能收获大量的牙髓干细胞。对比例1至5中调整了培养基的组成，在经过相同的培养时间后细胞密度不及实施例1至3，说明调整培养基的组成后对细胞的增殖活性产生一定的影响。
实施例1至2中分别省去苦参碱、小球藻生长因子中的一种，由图1可以看出细胞密度和实施例1至3相比下降显著。对比例3中在省去小球藻生长因子后增加了苦参素的用量，细胞密度低于对比例1中仅省去小球藻生长因子制备的培养基，说明增加苦参素的用量对提高细胞密度没有帮助，反而会因为苦参素用量的增加，导致细胞的密度降低。同样的，对比例4中省去了苦参素，增加了小球藻生长因子的用量，和对比例2中仅仅省去苦参素的培养基相比，细胞密度有一定的增长，但是还是远远低于实施例1至3，这是因为本发明在培养基中添加小球藻生长因子和苦参素协同作用，提高牙髓干细胞的增殖速度，减少细胞老化，缩短细胞培养周期，在短时间内没实现牙髓干细胞的大量扩增。对比例5中省去了金纳米棒，细胞的密度也有一定的下降，这是因为金纳米棒的添加增加了牙髓干细胞的贴壁性，提高细胞增殖过程的稳定性，有助于细胞保持活性，进而提高增殖效率。
取在液氮中冷冻保存3个月的牙髓干细胞，在37℃水浴中迅速解冻复苏，离心去除冻存液，加入PBS清洗细胞两次，分别用实施例1至3，对比例5中的培养基重悬细胞，接种于6孔板中，在37℃，5%CO2的培养箱中培养，观察牙髓干细胞的贴壁时间，结果如表1所示。
表1
样品 细胞贴壁时间（h）
实施例1 44
实施例2 46
实施例3 45
对比例5 63
由表1可以看出实施例1至3中牙髓干细胞的贴壁时间小于对比例5中细胞的贴壁时间。对比例5中省去了金纳米棒，由此可知看出金纳米棒的添加增加了牙髓干细胞的贴壁性，有助于细胞快速增殖。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种牙髓干细胞培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加剂，所述添加剂由以下原料组成：胰岛素、卟啉、金纳米棒、苦参素、小球藻生长因子、黄体酮、亚硒酸钠、谷氨酰胺。
2. 根据权利要求1所述牙髓干细胞培养基，其特征在于，所述添加剂各组分的终浓度为：胰岛素1-5μg/mL、卟啉1.8-2.5ng/mL、金纳米棒2.2-3.5ng/mL、苦参素8.5-10.5ng/mL、小球藻生长因子5.3-7.8 ng/mL、黄体酮5.0-7.5μg/mL、亚硒酸钠2-5μg/mL、谷氨酰胺5-10μg/mL、。
3.根据权利要求2所述牙髓干细胞培养基，其特征在于，所述添加剂中各组分的终浓度为：胰岛素3μg/mL、卟啉2.2ng/mL、金纳米棒3ng/mL、苦参素9.2ng/mL、小球藻生长因子6.4ng/mL、黄体酮6μg/mL、亚硒酸钠3.5μg/mL、谷氨酰胺8μg/mL、。
4.根据权利要求1至3任一项所述牙髓干细胞培养基，其特征在于，所述基础培养基为α-MEM培养基。
5.如权利要求4所述牙髓干细胞培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：取α-MEM培养基加入苦参素、金纳米棒、小球藻生长因子、卟啉、黄体酮、亚硒酸钠、谷氨酰胺、胰岛素，搅拌均匀，经滤膜过滤除菌，得到牙髓干细胞培养基。
6.根据权利要求5所述牙髓干细胞培养基的制备方法，其特征在于，采用0.22μm的滤膜过滤除菌。
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