CN100417321C - 游离细胞植入法培育有核珍珠的方法 - Google Patents

游离细胞植入法培育有核珍珠的方法 Download PDF

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Abstract

游离细胞植入法培育有核珍珠，本发明涉及有核珍珠育珠方法，需要解决有核珍珠育珠珍珠质不均匀分布，产生污珠、尾巴珠、疵珠的问题，提高育珠质量。本发明的技术方案包括采用河蚌的外套膜外表皮，其特征是采用酶解法获得外套膜外表皮细胞，调整细胞浓度5×105到1×106之间；将以0.1mg/mL多聚赖氨酸处理过的珠核置于游离外套膜细胞悬液中培养粘附，使细胞粘附于珠核表面；取0.2mL游离细胞悬液植入到育珠蚌体内，接着将粘附细胞的珠核植入育珠蚌体内，最后补加0.2mL细胞悬液；经过植入手术处理过的育珠蚌在水面下20cm竖直吊养培育，本发明适于培育有核珍珠。

Description

游离细胞植入法培育有核珍珠的方法
技术领域：
本发明涉及有核珍珠育珠方法。
背景技术
珍珠是珍珠贝体内珍珠囊的一种分泌产物，而珍珠囊是珍珠贝外套膜的上皮细胞受到刺激以后急剧增殖逐渐包围刺激原而形成，因此珍珠贝的外套膜在珍珠形成中起着重要的作用。人工珍珠培育技术就是将珍珠贝外套膜组织块单独或与由贝壳或其它物质制成的珠核一起植入珍珠贝体内形成无核珍珠或有核珍珠。人工无核珍珠的质量与有核珍珠相比，有核珍珠形成时间短，质量较好，但早期人工有核珍珠采用的直接插核法较难形成珍珠囊，成珠极少，不利于大规模的生产。
近来，淡水有核珍珠育珠主要采用珍珠贝的外套膜植片方法，植片切割成1mm2左右小片，但由于手术操作过程中外套膜小片是贴附于珠核一侧，外表皮细胞在移行增殖过程中不能均匀的包裹珠核，而使珠核的小片贴附处有较多的外表皮细胞堆积，随着珍珠质的分泌和沉积，就会造成珍珠质的不均匀分布，容易产生污珠、尾巴珠等各种疵珠。
发明内容
本发明需要解决有核珍珠育珠珍珠质不均匀分布，产生污珠、尾巴珠等各种疵珠的问题，提供一种提高育珠质量的方法。
本发明的技术方案包括采用河蚌的外套膜外表皮，其特征是采用酶解法获得外套膜外表皮细胞，调整细胞浓度5×105到1×106之间；将以多聚赖氨酸处理过的珠核置于游离外套膜细胞悬液中培养粘附，使细胞粘附于珠核表面；取0.2ml游离细胞悬液植入到育珠蚌体内，接着将粘附细胞的珠核植入育珠蚌体内，最后补加0.2ml细胞悬液；经过植入手术处理过的育珠蚌在水面下20cm竖直吊养培育。
本发明由于采用游离细胞植入法培育出的珍珠比较圆滑，与传统无核插片法育珠和有核小片插入法育珠相比，不但质量提高，而且本方法育珠可任意选择形状，而无核插片法育珠是无法达到的；有核小片插入法育珠其插入小片往往贴附珠核的一侧，上皮细胞在移行增殖过程中，不能均匀的包裹珠核，致使在小片的贴附处有较多的上表皮细胞堆积，随着珍珠质的分泌和沉积，就会造成珍珠质的不均匀分布而在小片贴附处形成疤痕或尾巴，造成各种疵珠或劣珠；本方法由于细胞是均匀贴附在珠核上，避免了出现疤痕或尾巴珠的疵珠；无核插片法育珠的时间一般为3年左右，而本方法育珠的时间可缩短到1年内完成，育珠的吐核率比小片插入法降低10-20％；本方法通过酶消化一次性获得大量游离细胞，具有简便、规范，适于工业化生产的优点。
具体实施方式
本发明采用1龄或1龄以内健康、活力强的小蚌，于浓度为0.01％的新洁尔灭中暂养2～3小时，用手术刀切开小蚌闭壳肌，用蒸馏水反复冲洗外套膜，并剪去外套膜色线边，用酒精棉球擦去粘液，再以撕膜法分离出河蚌的外套膜外表皮，浸泡到0.01％的高锰酸钾溶液中消毒10min，然后在超净工作台上用1000U/mL青霉素+1000U/mL链霉素清洗液进行清洗，再用灭菌的平衡盐溶液D-Hanks反复冲洗4-5次，将外套膜外表皮剪成1mm2的小块，于0.25％胰酶中37℃下消化30min后，用300目绢网过滤去除多余组织块，以完全培养基终止胰酶作用和分散细胞，并用血球计数板对细胞悬液细胞数进行计数，调整细胞悬液浓度的细胞数在5×105到1×106之间；
挑选珠核，洗涤后灭菌处理，以0.1mg/mL多聚赖氨酸处理过夜，于超净工作台上无菌干燥，平衡盐溶液D-Hanks冲洗；经处理的珠核置于游离外套膜细胞悬液中培养粘附，使细胞贴附于珠核表面；
选择健壮的2龄和3龄育珠蚌，洗刷体表并暂养于清水中；然后用经过消毒处理的通道针在育珠蚌外套膜上开口，并制造通道，向通道中先滴加0.2mL细胞悬液，将粘附细胞的珠核移植到育珠贝体内，后于通道中再滴加0.2mL细胞悬液；经过手术处理过的育珠蚌在水面下20cm竖直吊养培育。
为了降低蚌的死亡率，植入珠核采用一蚌2～6核的方式，左右两侧各插1～3颗珠核。

Claims (2)

1. 游离细胞植入法培育有核珍珠的方法，用1龄或1龄以内健康、活力强的小蚌分离出河蚌的外套膜外表皮，其特征是外套膜外表皮浸泡到0.01％的高锰酸钾溶液中消毒10min，然后在超净工作台上用1000U/mL青霉素+1000U/mL链霉素清洗液清洗，再用灭菌的平衡盐溶液D-Hanks冲洗4-5次，将外套膜外表皮剪成1mm2的小块，于0.25％胰酶中37℃下消化30min后，用300目绢网过滤去除多余组织块，以完全培养基终止胰酶作用和分散细胞，调整细胞悬液浓度的细胞数在5×105到1×106之间；挑选珠核，洗涤后灭菌处理，以0.1mg/mL多聚赖氨酸处理过夜，无菌条件下干燥，平衡盐溶液D-Hanks冲洗待用；经处理的珠核置于游离外套膜细胞悬液中培养粘附，使细胞粘附珠核表面；选择健壮的2龄和3龄育珠蚌，洗刷体表并暂养于清水中；然后用经过消毒处理的通道针在育珠蚌外套膜上开口，并制造通道，向通道中先滴加0.2mL细胞悬液，再将粘附细胞的珠核移植到育珠贝体内，后于通道中再滴加0.2mL细胞悬液；经过手术处理过的育珠蚌在水面下20cm竖直吊养培育。
2. 根据权利要求1所述的游离细胞植入法培育有核珍珠的方法，其特征是植入珠核采用一蚌2～6核的方式，左右两侧各插1～3颗珠核。
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三角帆蚌外套膜细胞培养与组织培养的比较. 施志仪，李巍，李松荣，楼允东.上海水产大学学报，第11卷第1期. 2002
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注射法培育三角帆蚌有核珍珠的研究. 钱伟平，许梓荣，张明霞，施妙琴.浙江农业学报，第14卷第2期. 2002
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马氏珠母贝外套膜组织培养的条件和方法初探. 王爱民，苏琼，阎冰，陈晓汉，刘汀.广西科学院学报，第11卷第3&4期. 1995
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马氏珠母贝珍珠囊体外培养及插囊育珠. 王爱民，阎冰，苏琼，叶力.广西科学，第7卷第1期. 2000
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Assignee: Wang Lung Fishing Wuhu Co., Ltd.

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