KR20120112506A - 치수세포의 배양 및 보존용 발거치의 이송 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 치수세포의 생체 내의 기능을 손상시키지 않고, 치수세포의 배양 및 보존용 발거치를 이송하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명에 따른 치수세포의 채취 방법은 발거치의 표면에 직선적인 홈을 넣는 공정, 상기 발거치를 홈을 따라서 분할하고 치수를 노출시키는 공정, 및 상기 발거치를 배치에 담궈 세포의 보존에 적합한 온도로 유지한 상태로 수송하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.

Description

치수세포의 배양 및 보존용 발거치의 이송 방법{METHOD FOR CULTURING DENTAL PULP CELLS AND METHOD FOR TRANSPORTING EXTRACTED TOOTH FOR PRESERVATION}

본 발명은 치수세포의 배양 및 보존용 발거치의 이송 방법에 관한 것으로서, 특히 치수세포를 포함한 치수를 가진 발거치의 이송에 있어서의 해당 세포의 보존성 향상에 관한 것이다.

예전에는 수혈에 의해 알려진 바와 같이, 채취된 세포를 이용하여 상처나 질병 및 사고 등으로 손실된 조직이나 장기를 재생시키는 재생 의료의 연구 개발은 활발히 실시되어 왔다. 최근 재생 의료가 목표로 하는 구체적인 프로세스는, 미분화된 상태의 세포인 간세포를 채취하고, 이것을 체외에서 배양하여, 경우에 따라서는 분화시킨 후, 환부로 이식하여 재생을 촉진하는 것이다. 여기서 사용되는 간세포로서는 배성 간세포(ES 세포)와 체성 간세포가 알려져 있다.

배성 간세포는 높은 증식능과 다분화능을 가진 배(胚) 유래의 세포이지만, 재생 의료로의 이용에 관해서는 수정란을 이용하는 것에 의한 윤리적 문제나, 이식에 의한 거절 반응의 문제 등이 아직 남아 있다.

한편, 체성 간세포는 배성 간세포 보다 분화능은 한정되어 있지만, 비교적 미분화된 상태로 생체의 여러 가지 조직에 존재하므로, 자기(自己)의 세포를 채취 배양하여 치료에 이용하는 것이 가능해진다. 따라서, 체성 간세포는 이의 이용에 있어서 배성 간세포와 같은 윤리면이나 거절 반응의 문제를 갖고 있지 않으므로 무엇보다도 재생 치료에 있어서의 실용화가 진행되고 있다.

이제까지 체성 간세포는 골수, 근육, 신경, 간장, 췌장, 소장 등 대부분의 조직으로 인식되고 있지만, 간엽계 조직(피부, 뼈, 연골, 치아, 신경, 혈관, 심근 등)으로의 분화가 가능한 간엽계 간세포는 그 유용성으로 인해 현재 가장 재생 의료로의 응용이 기대되고 있다. 이와 같은 간엽계 간세포를 포함하는 조직으로서는 골수를 비롯하여 치수, 지방 조직, 재대혈 등이 알려져 있다. 그러나, 상기 조직으로부터의 간세포의 채취는 예를 들면 골수에서는 골수 천자(穿刺)에 의한 골수 채취 수술을 요하고, 지방 조직으로부터의 채취는 지방 흡인 수술이 수반되어 실시되는 등 채취 대상이 고통 등의 리스크를 지는 경우가 있었다. 또한, 제대혈의 채취는 거의 고통을 수반하지 않지만, 엄격한 채취 조건을 만족하는 설비 시설이 필요하고, 또한 채취 기회가 출산시뿐이라는 제한이 있다.

따라서, 이들 조직에 비해 매우 낮은 리스크로 채취할 수 있는 치수 간세포의 이용이 제안되어 있다(특허문헌 1 및 2). 즉, 치수 간세포를 포함하는 치수세포는 종래 치과 의료 시설에 있어서 의료 폐기물로서 처리되어 온 사랑니나 유치 등의 발거치에서 채취 가능하므로 수집이 용이하고, 배양 방법이나 보존 방법이 확립되어 있는 점에 있어서도 실용성이 높은 것이 시사되어 있다.

일본 특허공보 제4125241호 일본 공개특허공보 제2004-201612호

그러나, 일반적으로 재생 의료에 사용할 목적으로 채취?배양된 간세포는 실제로 치료에 이용될 때까지 동결 보존을 필요로 하고 있다. 그러나, 개인이 간세포를 최적 조건으로 장기간 보존하는 것은 도저히 현실적이지 않으므로, 현재 채취 간세포의 배양?보존 처리 및 보존 그 자체는 당연히 세포 보관 설비를 구비한 기관에 위탁되는 경우가 많다. 따라서, 당연히 치수 간세포의 경우는, 각 치과 의료 시설에서 발거된 치아가 상기 시설에서 세포 보관 기관으로 이송되고, 배양?보존 처리가 실시되기까지 간세포를 생존시켜 두는 것이 필요해진다.

그러나, 발거치로부터 매우 미량밖에 채취되지 않는 치수 간세포를 더 확실히 활용하기 위해, 생체 내와 동일한 높은 증식능을 유지한 상태 그대로 치수 간세포를 세포 보관 기관까지 이송하는 기술은 알려져 있지 않다. 이 때문에 상기 기관에서 세포의 채취?보존 처리를 실시하는 단계에서, 이미 간세포에 기능적 손상이 가해져 있을 가능성이 있었다. 즉, 상기와 같은 시스템의 경우, 준비나 수송 등을 위해, 치아가 발거되고 나서 치수세포의 적출, 배양 및 보존 처리를 실시하기까지 24 시간 내지 48 시간 정도를 요하지만, 이와 같은 시간을 거친 발거치에서는 완전한 치수세포를 확보하는 것이 어려웠다. 특히 영구치의 경우, 보존액에 담궈 이송해도 보존액이 상아질에 둘러싸이고, 치수까지 충분히 침투하지 않으므로, 치수세포는 매우 단시간밖에 보존할 수 없다. 따라서, 발거치로부터 미리 치수세포를 가진 치수를 적출하고, 보존액에 담궈 이송하는 것을 생각할 수 있지만, 기술이나 설비가 다른 각 치과 의료 시설에 있어서, 미량으로 취급하기 어려운 치수를 안정된 품질로 처리하는 것은 실질적으로 불가능하다고 생각된다.

본 발명은 상기 문제를 감안하여 이루어진 것으로서, 치수세포의 생체 내의 기능을 손상시키지 않고, 치수세포의 배양 및 보존용 발거치를 이송하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위해 본 발명자들이 예의 검토를 실시한 결과, 발거치의 치수를 노출시키는 특정 처리를 실시하고 나서, 보존 상태로 하여 수송함으로써치수 간세포에 재생 의료에 필요한 정상적인 기능을 유지시킨 채, 치수를 포함하는 발거치를 이송하는 것이 가능한 것을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명에 따른 치수세포의 배양 및 보존용 발거치의 이송 방법은 발거치의 표면에 직선적인 홈을 넣는 공정, 상기 발거치를 홈을 따라서 분할하여 치수를 노출시키는 공정, 및 상기 발거치를 배지에 담그고 세포의 보존에 적합한 온도로 유지한 상태에서 수송하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 방법에서는 상기 직선적인 홈이 발거치의 치관(齒冠)으로부터 치근(齒根)에 걸친 종단선을 따라서 상기 발거치의 측면으로부터 중심을 향해 홈이 형성된 것인 바람직하다.

또한, 상기 방법에서는 상기 직선적인 홈이 발거치의 치관부 교합면의 분할선을 따라서 상기 발거치의 상면으로부터 중심을 향해 형성된 것이 바람직하다.

또한, 상기 방법에서는 상기 수송에 따른 시간이 48 시간 이내인 것이 바람직하다.

또한, 상기 방법에서는 상기 발거치가 영구치로서, 치수 미처치의 매복치, 과잉치 또는 편의 발거치인 것이 바람직하다.

또한, 상기 방법에서는 상기 직선적인 홈의 길이가 5 mm 내지 10 mm, 폭이 0.5 mm 내지 1.5 mm, 깊이가 2 mm 내지 4 mm인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에 따른 치수세포의 배양 및 보존용 발거치의 이송 방법은, 후계 영구치 치근이 2/3 이상 형성된 발거 유치를 배지에 담그고, 세포의 보존에 적합한 온도로 유지한 상태로 수송하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 방법에서는 상기 수송에 따른 시간이 48 시간 이내인 것이 바람직하다.

본 발명에 의하면, 치수 간세포를 포함하는 치수를 가진 발거치를 세포 보관 기관 등으로의 이송에 필요한 24 시간 내지 48 시간 동안, 생체 내의 기능을 손상시키지 않고 유지할 수 있다. 이것에 의해, 발치 후에도 생체 내에 가까운 상태 그대로 치수 간세포의 배양?보존 처리까지 실시하는 것이 가능해지므로, 발거치로부터 매우 미량밖에 채취되지 않은 치수 간세포를 효율적으로 재생 의료로 활용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 방법에 의한 (A) 유치, (B) 영구치의 치수세포의 증식 곡선이다.
도 2는 본 발명의 방법에 의한 (A) 유치, (B) 영구치의 치수세포의 ALP 염색상이다.
도 3은 본 발명의 방법에 의한 (A) 유치, (B) 영구치의 치수세포의 SA-β-gal 염색상이다.
도 4는 본 발명의 방법에 의한 치수세포의 배양 세포의 염색체상이다.
도 5는 본 발명의 방법에 의한 치수세포의 배양 세포의 염색체상이다.

본 발명은 예를 들면, 각지의 치과 의료 시설에서 발거된 치아로부터 수득되는 치수에 존재하고, 치수 간세포를 포함하는 치수세포를 세포 보관 기관에서 배양?보존 처리하고, 필요시에 재생 의료로 이용하는 모델에 있어서, 치과 의료 시설에서 세포 보관 기관으로 수송되는 동안, 치수의 생세포수나 그 기능을 보존해두기 위한 이송 방법을 제공하는 것이다. 치수 중의 미량의 세포를 확실히 배양?보존에 이용하는 견지에서, 본 발명은 기술이나 설비에 관계없이 어떠한 치과 의료 시설이라도 용이하게 실시 가능하고, 또한 안정된 세포 유지 효과를 발휘할 수 있다.

또한, 당연히 본 발명에 따른 방법은, 전술한 치과 의료 시설에서 세포 보관 기관에 이르는 이외의 세포의 이송에 적용할 수도 있다.

이하, 본 발명의 방법의 바람직한 실시형태에 대해 설명한다.

본 발명에 사용하는 발거치는 치수를 갖는 것이면 유치라도 영구치라도 좋고, 통상, 치과 의료 시설에 있어서 치과 처치적으로 발거된 것을 이용할 수 있다. 또한, 자연 발치라도 치아의 상태가 하기 조건에 합치하는 것으로서, 또한 후술하는 발거치의 처리를 신속히 실시하는 것이 가능하면 사용할 수 있다.

특히 치수 간세포의 이용에 적합한 발거치로서는, 다음과 같은 상태의 것을 예로 들 수 있다.

유치로서는, 미처치 치아, 수복 치아 중 어느 것을 이용하는 것도 가능하지만, 치수 절단이나 발수 등의 치수 처리가 실시된 것은 바람직하지 않다.

또한, 동요(動搖)가 인식되는 유치에 대해서는, 우식이 없고, 후계 영구치 치근이 2/3 이상 형성되어 있는 것이 바람직하다. 우식이 있고, 근첨성 치주염(Per) 등이 발생한 것은, 정상적인 치수의 채취를 할 수 없으므로 바람직하지 않다.

또한, 동요가 인식되지 않는 유치에 대해서도, 마찬가지로 우식이 없고, 후계 영구치 치근이 2/3 이상 형성되어 있는 것이 바람직하다. 그러나, 우식이 있어도 진행이 C1(에나멜질 우식) 또는 C2(상아질 우식)에 그치고, 후계 영구치 치근의 2/3 이상의 형성이 인식되는 것에 대해서는 적합하게 이용할 수 있다. 한편, 우식에 의해 치수염이 발병한 것은 바람직하지 않다.

영구치로서는, 이른바 사랑니인 매복치, 과잉치, 편의 발거치 등으로서 발치 가능한 것이 적합하지만, 유치와 마찬가지로 치수 처리된 것이나 치수가 병에 걸린 것은 바람직하지 않다.

발치 처리 등에 의해 치아에 손상이나 결손이 발생한 경우에도, 그것이 에나멜질이나 상아질에 그치는 등, 후술하는 발거치의 처리의 수행에 영향을 미치지 않는 것인 한 문제없이 사용할 수 있다.

계속해서, 발거치의 처리에 대해 구체적으로 설명한다.

상기 발거치는, 필요에 따라서 표면을 청식(淸拭)?소독하고, 표면에 직선적인 홈을 설치한다. 이 홈은 다음 공정에서 치아를 분할할 때의 가이드가 되므로, 상기 홈을 따라서 치아를 분할했을 때, 치아의 중심에 있는 치수가 노출되는 위치 및 방향으로 형성할 필요가 있다.

분할시의 치수의 노출이 가능한 한, 홈의 형성 위치 및 방향은 제한되지 않지만, 예를 들면 다음과 같은 실시형태를 들 수 있다.

(예 1)

발거치의 치관으로부터 치근에 걸친 종단선을 따라서, 상기 발거치의 측면으로부터 중심을 향해 홈을 형성한다. 발거치의 측면의 상기 종단선의 위치는 상기 종단선을 따르는 홈이 상기 발거치의 중심을 향해 파지는 한 한정되지 않는다.

(예 2)

발거치의 치관부 교합면의 분할선을 따라서, 상기 발거치의 상면으로부터 중심을 향해 홈을 형성한다. 이 때, 홈이 되는 분할선이 교합면의 대략 중심을 통과하는 것이 바람직하지만, 홈이 발거치의 중심을 향해 파지는 한 상기 분할선의 위치는 문제가 되지 않는다.

상기 홈은 가능한 한 길고, 깊게 형성하는 것이 바람직하다. 홈의 길이 및 폭은, 상기 홈을 가이드로 한 분할을 가능하게 하는 정도이면 좋고, 발거치의 크기나 홈을 설치하는 부위에 따라서 길이 5 mm 내지 10 mm, 폭 0.5 mm 내지 1.5 mm의 범위로 적절히 조절하는 것이 바람직하다. 또한, 홈의 깊이는 에나멜질로부터 상아질에 이르는 정도로 하고, 치아의 중심을 향해 2 mm 내지 4 mm의 범위로 하는 것이 바람직하다. 홈이 너무 깊으면, 치수세포가 으스러지는 경우가 있으므로 주의를 요한다.

또한, 상기 홈 형성은 예를 들면 주수(注水)하에 다이아몬드 포인트를 이용하여 실시할 수 있다.

본 발명에 따른 방법에서는 발거치에 상기와 같이 홈을 설치한 후, 상기 홈을 따라서 치아를 분할한다. 발거치는 상기 홈이 치수가 위치하는 중심을 향해 적절히 파여 있으면, 상기 홈을 따라서 2 개로 나눌 수 있다. 즉, 미리 전술한 공정에 있어서 적절한 홈을 넣어 두는 것에 의해, 견고한 치아를 기술이나 설비에 관계없이 용이하게 분할하는 것이 가능해진다.

발거치를 분할하는 수단은 특별히 제한되지 않지만, 통상, 헤벨 등을 홈에 삽입하고, 홈을 따라서 눌러 개방하여 치아를 2 분할할 수 있다. 어려운 경우는 각형상 끌 등을 홈에 삽입하여, 나무 망치 등으로 두드려 2 분할해도 좋다.

미리 설치한 홈을 따라서 발거치를 적절히 분할하면, 그 내부 중앙에 존재하는 치수가 노출된다. 이 때, 노출된 치수에는 기구 등을 접촉시키지 않는 것이 바람직하다.

또한, 치아의 분할 수에도 제한은 없지만, 치수를 노출시키는 데에는 2 분할로 충분하다고 생각된다. 단, 한번의 분할로 치수가 충분히 노출되지 않은 경우에는, 필요에 따라서 홈의 형성 공정에서 다시 고칠 필요가 있다.

분할한 발거치는 세포용 배지 또는 보존액에 담그고, 세포의 보존에 적합한 온도를 유지한다. 이와 같은 상태로 수송함으로써 발거치 내의 치수에 존재하고, 치수 간세포를 포함하는 치수세포는 원래 갖고 있는 모든 기능(생리 활성) 및 이의 생세포수를 48 시간 이내 동안 거의 완전히 유지할 수 있다. 세포의 보존에 적합한 저(低)온도는 대사 활성을 억제한 상태로 세포를 생존시킬 수 있는 온도를 의미하며, 일반적으로 4 ℃ 내지 8 ℃, 바람직하게는 4 ℃이다.

사용하는 배지 또는 보존액은 세포 배양이나 세포 보존에 일반적으로 사용되는 것이면 좋고, 특히 바람직하게는 α-MEM 배지(20 % FBS, 100 μM L(+)-아스코르빈산, 페니실린(50 u/ml)/스트렙토마이신(50 ㎍/ml))이다.

이와 같은 배지 또는 보존액을 배양용 캡 부착 튜브 등에 넣고, 이것에 치수가 노출된 분할 발거치를 담궈 캡을 조이고, 세포의 보존에 적합한 온도(예를 들면, 4 ℃)를 유지한 상태로 수송하는 것이 바람직하다.

또한, 발거치가 유치이고, 치근부가 흡수되어 있는 경우는 배지나 보존액이 치수까지 침투하기 쉽다. 따라서, 유치에 관해서는 상기한 치아에 홈을 형성하는 공정 및 분할하는 공정을 생략하고, 발거 유치를 전술한 바와 같이 세포용 배지 또는 보존액에 담그고, 저온으로 유지하는 것만으로 수송할 수도 있다. 이 경우도 치수세포는 24 시간 내지 48 시간 동안 거의 완전한 상태로 보존된다.

물론 영구치와 마찬가지로, 유치에 홈의 형성 및 분할 처리를 실시해도 좋다.

상기 순서로 이송된 발거치 중의 치수 간세포를 포함하는 치수세포(치수)는 바람직하게는 세포 보관 시설에 있어서 적절한 조건하에서 발거치로부터 적출되고, 공지된 세포 처리 방법에 따라서 배양?보존 처리가 이루어진 후, 장기간 보존된다. 보존한 치수세포는 필요시에 취출하여 재생 의료 등에 이용할 수 있다. 또는, 보존한 치수세포에 iPS화 등의 기술을 실시하고, 의료나 연구에 이용하는 것도 가능하다.

실시예

이하, 본 발명의 실시예를 나타내지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되지 않는다.

우선, 본 발명의 방법에 의한 발거치(유치?영구치)의 이송(보존)예를 나타낸다.

〈이송(보존)예〉

유치

우식이 없고 후계 영구치 치근이 2/3 이상 형성된 동요 유치, 또는 에나멜질 내지 상아질에 국한된 우식이 있고 후계 영구치 치근이 2/3 이상 형성된 비동요 유치를 치과적으로 발거했다. 발거 후 α-MEM 배지를 채운 무균 튜브에 넣어 저온(4 ℃)으로 냉장하고, 수송 시간을 포함하여 24 시간 보존했다.

영구치

우식이 없고, 치수 미처리의 매복치, 과잉치 또는 편의 발거치를 치과적으로 발거했다. 발거 후, 치아의 측면 중앙 위치에 치관 상단으로부터 근첨(根尖)에 걸쳐 다이아몬드 포인터를 이용하여 홈을 만들었다. 홈의 깊이는 상아질까지로 했다.

그 후, 홈을 따라서 헤벨로 치아를 2 개로 종단하고, 치수를 노출시켰다. 분할한 치아는 α-MEM 배지를 채운 무균 튜브에 넣어 4 ℃로 냉장하고, 수송 시간을 포함하여 24 시간 보존을 실시했다.

상술한 이송(보존)예를 실시한 유치 및 영구치의 치수세포를 하기 순서로 배양?보존하고, 그 기능의 유지에 관해 검토했다.

〈배양 방법〉

1. 치수의 채취

상기 이송(보존)예의 발거치(발치로부터 24 시간)를 멸균 샤아레상에 두고 사진을 찍었다. 그 후, 핀셋과 리머를 사용하여 치수를 취출했다. 치수를 취출한 치아는 사진을 찍고, 포르말린 고정했다.

치수를 회수하여, 100×g 4 ℃, 20 sec 원심한 후, 상청(上淸)을 제거하여 린스용 PBS를 10ml 첨가하고, 이것을 다시 원심하는 린스 공정을 3 회 반복했다.

상청을 제거하여 효소 분해용 배지를 2ml 첨가하고, 37 ℃에서 1 시간(30 분에 1 회 혼합) 처리하고, 이것을 2000 rpm(4 ℃)에서 5 분간 원심했다.

상청을 제거하여 α-MEM 배지를 5 ml 첨가하고, 2000 rpm(4 ℃)으로 5 분간 원심했다. 그 후, 상청을 제거하고 α-MEM 배지를 5 ml 첨가하여 세포수를 카운트하고, 수득된 치수세포를 T-25 플라스크에 파종했다.

또한, 상기 효소 분해용 배지는 α-MEM 배지(α-MEM: 395 ml, FCS: 100 ml, 200 mM 아스코르빈산: 250 μl, PS: 5 ml의 혼합액) 7.5 ml, DispaseII(2.4 U/ml, Roche사제) 2.5 ml, 콜라게나제(와코준야쿠사제) 30 mg의 혼합액이다.

2. 치수세포 배양

상기 공정 후, 배지를 2 일에 1 회 교환하고, 컨플루언트가 되면 하기 계대 (繼代) 조작을 실시했다.

또한, 파종 1 일 후와 계대 전에 세포의 사진을 촬영했다.

3. 계대

배양 세포를 PBS(-)로 2 회 린스 후, 0.05 % 트립신/EDTA를 1 ml 첨가하여 다시 린스하고, 37 ℃하에서 5 분간 인큐베이트했다.

그 후, 새로운 α-MEM 배지를 5 ml 첨가하여 현탁하고, 1000 rpm(4 ℃)으로 5 분간 원심했다. 상청을 제거하고, 새로운 배지에 현탁하여 10 ㎝ 디쉬에 파종하고, 배양했다(계대 2대째).

또한, 계대 2대째를 3일 이상 배양한 배지를 10 ml 채취하여 -20 ℃로 보존해둔 것을 바이러스 검사의 검체로 했다.

이상의 조작을 반복함으로써, 계대 3 대째 내지 10 대째도 동일하게 하여 수득했다.

4. 스토크의 작성

각 계대의 스토크는 다음과 같이 수득했다.

상기 계대 조작 후에 세포수를 카운트하고, 1000 rpm(4 ℃)으로 5 분간 원심했다. 그 후, 상청을 제거하여 1 바이알당 세포수가 1×10⁶cells/ml 이상이 되도록 셀뱅커 Ⅱ를 첨가하여 현탁했다. 이것을 1 바이알당 1 ml씩 분주(分注)하고, 바이알을 BIO FREEZING VESSEL에 넣어 -80 ℃로 2 일간 둔 후, 액체 질소로 옮겼다.

상기 방법으로 배양한 3?7?10 계대째의 치수세포를 하기 방법으로 시험했다.

〈증식 곡선의 작성〉

디쉬상에서 배양하고 있는 세포를 PBS(-)로 2 회 세정 후, 추가로 0.05 % 트립신/10 mM EDTA를 1 ml 첨가하여 세정했다. 그 후, 37 ℃하에서 5 분간 인큐베이트하고, 세포가 디쉬에서 벗겨진 것을 확인하면, 배지를 첨가하여 현탁했다. 세포 현탁액을 1000 rpm(4 ℃)으로 5 분간 원심하여, 상청을 제거하면 다시 배지를 첨가하여 현탁하고, 1000 rpm(4 ℃)으로 5 분간 원심했다.

그 후, 세포를 새로운 배지에 현탁하여, 세포수를 카운트했다.

5.4×10⁵cells의 세포를 9.5 ml의 배지에 현탁하고, 24 웰플레이트의 12 웰에 500 μl/웰로 분주했다. 그 후, 각 웰에 배지를 500 μl씩 첨가하여, 1 ml/웰로 했다.

이것을 37 ℃, 5 % CO₂ 인큐베이터로 배양하고, 24 시간마다 2 웰씩 세포수를 카운트했다. 카운트는 세포 증식이 플래토에 도달하기까지 실시하여, 도 1에 도시한 증식 곡선을 수득했다.

도 1의 (A)는 유치, (B)는 영구치의 치수세포의 증식 곡선이다. 상기 유치, 영구치 모두 전술한 이송(보존)예로 수득한 것이며, 치수세포의 배양은 상기 배양 방법에 의한다.

도 1에 도시한 바와 같이, 사용한 영구치, 유치의 모든 치수세포도 10 계대까지 거의 동등한 증식능을 유지하고, 일반적인 치수세포(발치 후 즉시 배양한 것)의 증식 곡선에 비해서도 이상은 인식되지 않았다.

또한, 본 발명에 따른 이송 방법을 실시하지 않고, 발치 후 보존액을 바르는 것만으로 24 시간 이내로 상기 배양을 실시한 것에 대해서도 동일한 시험을 실시한 바, 영구치에 대해서는 증식능이 상당히 저하하고 있고, 계대 수를 늘릴때마다 그 정도는 현저했다.

따라서, 본 발명에 의해, 간세포를 포함하는 치수세포의 증식능을 유지한 채로 발거치를 이송하는 것이 가능하다.

〈알칼리 포스타제(ALP) 염색〉

디쉬상에서 배양하고 있는 세포를 PBS(-)로 2 회 세정 후, 추가로 0.05 % 트립신/10 mM EDTA를 1 ml 첨가하여, 세정했다. 그 후, 37 ℃하에서 5 분간 인큐베이트하고, 세포가 디쉬에서 벗겨진 것을 확인하면, 배지를 첨가하여 현탁했다. 세포 현탁액을 1000 rpm(4 ℃)으로 5 분간 원심하여, 상청을 제거하면, 다시 배지를 첨가하여 현탁하고, 1000 rpm(4 ℃)으로 5 분간 원심했다.

그 후, 세포수를 카운트하고, 6 웰플레이트에 1×10⁵ cells/웰로 파종하여 하룻밤 배양했다.

배양 후, 세포를 PBS로 1 회 세정하고, 2 ml의 4 % PFA로 3 분 고정하여, PBS로 2 회 세정했다. 그 후, 1 ml의 검출 버퍼(1M Tris-HCl(pH 9.5): 50 ml, 3M NaCl: 16.67 ml, 1M MgCl: 25 ml, B, W: 408.33 ml의 혼합액)를 첨가하여, 2 분 두었다.

검출 버퍼를 흡취(吸取)하고, 발색액(검출 버퍼: 5 ml, NBT: 16.5 μl, BCIP: 16 μl) 500 μl를 첨가하고, 차광하여 2 시간 둔 후, 웰의 세포를 증류수로 5 분간 세정했다.

각 웰에 4 % PFA/PBS를 700 μl 첨가하고, 실온에서 10 분간 인큐베이트했다. 그 후, 4 % PFA/PBS를 제거하여, PBS(-)로 3 회 린스했다.

계속해서 IMMU-MOUNT를 각 웰에 3 방울 첨가하고, 커버 글라스를 씌워 실온 보존했다.

도 2의 (A)는 유치, (B)는 영구치의 치수세포의 ALP 염색상이다. 상기 유치, 영구치 모두 전술한 이송(보존)예로 수득한 것이며, 치수세포의 배양은 상기 배양 방법에 의한다.

알칼리 포스타제(ALP)는 골아세포의 마커로서 이용되고, 뼈 형성을 나타내는 세포는 자색으로 염색되는(ALP 양성 세포) 것이 알려져 있다.

도 2에 도시한 바와 같이, 사용한 영구치, 유치의 모든 치수세포에도 ALP 양성 세포가 인식되었다. ALP 양성 세포는 계대수의 증가에 따라서 감소가 보였지만, 계대에 의해 세포의 총 수 자체는 증가했다. 이 때문에, 이들 치수세포는 정형 외과 질환(골절 등의 뼈 수복 등)에 있어서 충분히 유용하다고 생각된다. 또한, 이 결과는 별도로 실시한 일반적인 치수세포(발치 후 즉시 배양한 것)에 의한 것으로 손색이 없었다.

또한, 본 발명에 따른 이송 방법을 실시하지 않고 발치 후 보존액을 바르는 것만으로 24 시간 이내에 상기 배양을 실시한 것에 대해서도 동일한 시험을 실시한 바, 영구치에 대해서는 ALP 양성 세포수 및 세포의 총 수가 도 2의 (B)에 비해 매우 적은 것을 알았다.

따라서, 본 발명에 의해 간세포를 포함하는 치수세포의 뼈 재생능을 유지한 채로 발거치를 이송하는 것이 가능하다.

〈세포 노화의 측정(SA-β-gal 염색)〉

디쉬상에서 배양하고 있는 세포를 PBS(-)로 2 회 세정 후, 추가로 0.05 % 트립신 10mM/EDTA를 1 ml 첨가하여, 세정했다. 그 후, 37 ℃하에서 5 분간 인큐베이트하고, 세포가 디쉬에서 벗겨진 것을 확인하면, 배지를 첨가하여 현탁했다. 세포 현탁액을 1000 rpm(4 ℃)으로 5 분간 원심하고, 상청을 제거하면 다시 배지를 첨가하여 현탁하고, 1000 rpm(4 ℃)으로 5 분간 원심했다.

그 후, 세포를 새로운 배지에 현탁하여, 세포수를 카운트하고, 1×10⁵ cells/웰이 되도록 6 웰플레이트에 파종한 후, 37 ℃, 5 % CO₂로 24 시간 인큐베이트했다.

배지를 빼고 PBS(-)로 린스하고, 각 웰에 4 % PFA/PBS를 700 μl 첨가하고, RT에서 10 분간 인큐베이트했다. 그 후, 4 % PFA/PBS를 제거하여, PBS(-)로 3 회 린스했다.

SA-β-gal 용액을 각 웰에 700 μl 첨가하고, 실온에서 하룻밤 인큐베이트하고, 염색된 세포를 현미경으로 체크하여 촬영했다.

SA-β-gal 용액을 빼고, PBS(-)로 린스를 2 회 실시한 후, 각 웰에 4 % PFA/PBS를 700 μl 첨가하고, 실온에서 10 분간 인큐베이트했다. 그 후, 4 % PFA/PBS를 제거하고, PBS(-)로 3 회 린스했다.

계속해서, IMMU-MOUNT를 각 웰에 3 방울 첨가하고, 커버 글라스를 씌워 실온 보존했다.

도 3의 (A)는 유치, (B)는 영구치의 치수세포의 SA-β-gal 염색상이다. 상기 유치, 영구치 모두 전술한 이송(보존)예에서 수득한 것이고, 치수세포의 배양은 상기 배양 방법에 의한다.

SA-β-gal은 세포의 노화 마커로서 이용되고, 세포 분열이 정지된 노화 세포는 청색으로 염색되는(SA-β-gal 양성 세포) 것이 알려져 있다.

도 3에 도시한 바와 같이, 사용한 영구치, 유치의 모든 치수세포에도 SA-β-gal 양성 세포는 인식되지 않고, 그 결과는 계대를 겹쳐도 변하지 않았다. 이 때문에, 이들 치수세포에서는 계대에 의해 증식능의 변화가 적고 안정된 배양이 가능하며 충분히 유용하다고 생각된다. 또한, 그 결과는 별도로 실시한 일반적인 치수세포(발치 후 즉시 배양한 것)에 의한 것으로 손색이 없었다.

또한, 본 발명에 따른 이송 방법을 실시하지 않고, 발치 후 보존액을 바르는 것만으로 24 시간 이내에 상기 배양을 실시한 것에 대해서도 동일한 시험을 실시한 바, 영구치에 대해서는 SA-β-gal 양성 세포가 인식되었다.

따라서, 본 발명에 의해, 간세포를 포함하는 치수세포의 높은 증식능을 유지한채로 발거치를 이송하는 것이 가능하다.

〈염색체의 분석〉

상기 이송(보존)예에 의한 여성의 영구치 및 남성의 유치 유래의 사람 치수세포 각 일례를 상기 배양 방법으로 배양한 것에 대해, 염색체수를 분석했다. 각각의 배양 세포 50 개에 대해 염색체수의 분석 결과를 하기 표 1 및 표 2에 나타낸다. 구체적인 분석 방법은 다음과 같이 했다.

10대 계대한 치수세포보다 염색체 표본을 제작하고, 김자 염색하여, 염색체수를 결정 후, 상기 표본을 Quinacrine-Hoechst 염색으로 분염(分染)했다. 표준 핵형에 기초하여 염색체를 분류하여, 핵형 분석을 실시했다.

도 4는 상기 표 1의 염색체수 46 개의 대표예, 도 5는 상기 표 2의 염색체수 46 개의 대표예이다.

상기 표 1의 염색체수 46 개의 세포를 Q 분석법에 의해 10개 분석한 결과, 도 4에 대표되는 바와 같이, 모두 XX형이었다. 또한, 상기 표 2의 염색체수 46 개의 세포를 동일하게 분석한 바, 도 5에 도시한 바와 같이 모두 XY형이었다.

상기 표 1, 표 2 및 도 4, 도 5에 도시한 바와 같이, 분석된 사람 치수세포의 염색체수는 거의 모든 세포에서 정상인 46개였다.

따라서, 본 발명에 따른 이송 방법은 치수세포의 염색체수의 변이를 유기(誘起)하지 않는 것이 명확하다.

Claims (8)

1. 발거치의 표면에 직선적인 홈을 넣는 공정,
   상기 발거치를 홈을 따라서 분할하여 치수를 노출시키는 공정, 및
   상기 발거치를 배지에 담그고 세포의 보존에 적합한 온도로 유지한 상태로 수송하는 공정
   을 포함하는 치수세포의 배양 및 보존용 발거치의 이송 방법.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 직선적인 홈이 발거치의 치관으로부터 치근에 걸친 종단선을 따라서 상기 발거치의 측면으로부터 중심을 향해 홈을 형성시키는 치수세포의 배양 및 보존용 발거치의 이송 방법.
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 직선적인 홈이 발거치의 치관부 교합면의 분할선을 따라서 상기 발거치의 상면으로부터 중심을 향해 형성된 치수세포의 배양 및 보존용 발거치의 이송 방법.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 수송에 따른 시간이 48 시간 이내인 치수세포의 배양 및 보존용 발거치의 이송 방법.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 발거치는 영구치로서, 치수 미처치의 매복치, 과잉치 또는 편의 발거치인 치수세포의 배양 및 보존용 발거치의 이송 방법.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 직선적인 홈의 길이가 5 mm 내지 10 mm, 폭이 0.5 mm 내지 1.5 mm, 깊이가 2 mm 내지 4 mm인 치수세포의 배양 및 보존용 발거치의 이송 방법.
7. 후계 영구치 치근이 2/3 이상 형성된 발거 유치를 배지에 담그고, 세포의 보존에 적합한 온도로 유지한 상태로 수송하는 공정을 포함하는 치수세포의 배양 및 보존용 발거치의 이송 방법.
8. 제 7 항에 있어서,
   상기 수송에 따른 시간이 48 시간 이내인 치수세포의 배양 및 보존용 발거치의 이송 방법.

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