JP4918631B2 - 歯髄細胞の培養及び保存用抜去歯の移送方法 - Google Patents
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Description
胚性幹細胞は、高い増殖能と多分化能を有する胚由来の細胞であるが、再生医療への利用に関しては、受精卵を用いることによる倫理的問題や、移植による拒絶反応の問題などが未だ残されている。
他方、体性幹細胞は、胚性幹細胞よりも分化能は限定されているが、比較的未分化な状態で生体の様々な組織に存在するため、自己の細胞を採取培養して治療に用いることが可能となる。したがって、体性幹細胞は、その利用において胚性幹細胞のような倫理面や拒絶反応の問題を孕んでいないことから、最も再生治療における実用化が進んでいる。
そこで、これらの組織に比べ極めて低リスクで採取できる歯髄幹細胞の利用が提案されている(特許文献1及び2)。すなわち、歯髄幹細胞を含む歯髄細胞は、従来しか医療施設において医療廃棄物として処理されてきた親知らず(智歯)や乳歯などの抜去歯より採取可能であることから収集が容易であり、培養方法や保存方法が確立されている点においても実用性が高いことが示唆されている。
本発明は上記問題に鑑みなされたものであり、歯髄細胞の生体内における機能を損ねることなく、歯髄細胞の培養及び保存用抜去歯を移送する方法を提供することを目的とする。
また、前記方法においては、前記直線的な溝が、抜去歯の歯冠から歯根にかけた縦断線に沿って、該抜去歯の側面から中心に向かって溝を形成されたものであることが好適である。
また、前記方法においては、前記直線的な溝が、抜去歯の歯冠部咬合面の分割線に沿って、該抜去歯の上面から中心に向かって形成されたものであることが好適である。
また、前記方法においては、前記輸送にかかる時間が48時間以内であることが好適である。
また、前記方法においては、前記抜去歯が永久歯であって、歯髄未処置の埋伏歯、過剰歯、又は便宜抜去歯であることが好適である。
また、前記方法においては、前記直線的な溝の長さが5〜10mm、幅が0.5〜1.5mm、深さが2〜4mmであることが好適である。
また、前記方法においては、前記輸送にかかる時間が48時間以内であることが好適である。
なお、当然のことながら、本発明にかかる方法は、前述した歯科医療施設から細胞保管機関に至る以外の細胞の移送に適用することもできる。
本発明に使用する抜去歯は、歯髄を有するものであれば乳歯であっても永久歯であってもよく、通常、歯科医療施設において歯科処置的に抜去されたものを用いることができる。また、自然抜歯であっても、歯の状態が下記条件に合致するものであって、さらに後述の抜去歯の処理を早急に行うことが可能であれば使用することができる。
特に歯髄幹細胞の利用に適した抜去歯としては、次の状態のものが挙げられる。
さらに、動揺の認められる乳歯については、う蝕がなく、後継永久歯歯根が2/3以上形成されているものが好適である。う蝕があって、根尖性歯周炎(Per)などが生じたものは、正常な歯髄の採取が望めないため好ましくない。
また、動揺の認められない乳歯についても、同様に、う蝕がなく、後継永久歯歯根が2/3以上形成されているものが好適である。しかし、う蝕があっても、進行がC1(エナメル質う蝕)又はC2(象牙質う蝕)に止まり、後継永久歯歯根の2/3以上の形成が認められるものについては好適に用いることができる。一方、う蝕により歯髄炎を発症したものは好ましくない。
抜歯処置などにより歯に傷や欠損が生じた場合であっても、それがエナメル質や象牙質に止まるなど、後述する抜去歯の処理の遂行に影響しないものである限り問題なく使用することができる。
上記抜去歯は、必要に応じて表面を清拭・消毒し、表面に直線的な溝を設ける。この溝は、次工程で歯を分割する際のガイドとなるため、該溝に沿って歯を分割した時に、歯の中心にある歯髄が露出するような位置及び方向で形成する必要がある。
分割時における歯髄の露出が可能である限り、溝の形成位置及び方向は制限されないが、例えば、次のような実施形態が挙げられる。
(例1)
抜去歯の歯冠から歯根にかけた縦断線に沿って、該抜去歯の側面から中心に向かって溝を形成する。抜去歯の側面における前記縦断線の位置は、該縦断線に沿った溝が、該抜去歯の中心に向けて彫られる限りは限定されない。
(例2)
抜去歯の歯冠部咬合面の分割線に沿って、該抜去歯の上面から中心に向かって溝を形成する。このとき、溝となる分割線が咬合面のおおよそ中心を通ることが好ましいが、溝が抜去歯の中心に向けて彫られる限りは前記分割線の位置は問題とならない。
なお、前記溝形成は、例えば、注水下にてダイヤモンドポイントを用いて行うことができる。
抜去歯を分割する手段は特に制限されないが、通常、ヘーベル等を溝に挿入し、溝に沿って押し開くことで歯牙を2分割することができる。難しい場合は、角ノミ等を溝へ挿入し、木槌等で叩いて2分割してもよい。
予め設けた溝に沿って抜去歯を適切に分割すると、その内部中央に存在する歯髄が露出される。この際、露出した歯髄には器具などを接触させないことが好ましい。
また、歯の分割数にも制限はないが、歯髄を露出させるには2分割で十分であると考えられる。ただし、一度の分割で歯髄が十分に露出されなかった場合は、必要に応じて溝の形成工程から再度やり直す必要がある。
使用する培地又は保存液は、細胞培養や細胞保存に一般的に使用されるものであればよく、特に好ましくはα−MEM培地(20%FBS、100μM L(+)−アスコルビン酸、ペニシリン(50u/ml)/ストレプトマイシン(50μg/ml))である。
このような培地又は保存液を培養用のキャップ付チューブ等に入れ、これに歯髄の露出した分割抜去歯を浸漬してキャップを締め、細胞の保存に適した温度(例えば、4℃)を維持した状態で輸送することが好ましい。
もちろん、永久歯と同様に、乳歯に溝の形成及び分割の処理を行ってもよい。
まず、本発明の方法による抜去歯(乳歯・永久歯)の移送(保存)例を示す。
<移送(保存)例>
乳歯
う蝕がなく、後継永久歯歯根が2/3以上形成された動揺乳歯、あるいは、エナメル質ないし象牙質に限局したう蝕があり、後継永久歯歯根が2/3以上形成された非動揺乳歯を歯科的に抜去した。抜去後α−MEM培地を満たした無菌チューブに入れて低温(4℃)で冷蔵し、輸送時間を含めて24時間保存した。
永久歯
う蝕がなく、歯髄未処置の埋伏歯、過剰歯又は便宜抜去歯を歯科的に抜去した。抜去後、歯の側面中央位に歯冠上端から根尖にかけてダイヤモンドポインタを用いて溝を入れた。溝の深さは象牙質までとした。
その後、溝に沿ってヘーベルで歯を二つに縦断し、歯髄を露出させた。分割した歯は、α−MEM培地を満たした無菌チューブに入れて4℃で冷蔵し、輸送時間を含めて24時間の保存を行った。
<培養方法>
1.歯髄の採取
前記移送(保存)例の抜去歯(抜歯から24時間)を滅菌シャーレ上において写真を撮った。その後、ピンセットとリーマーを使って、歯髄を取り出した。歯髄を取り出した歯は、写真を撮り、ホルマリン固定した。
歯髄を回収し、100×g 4℃ 20sec遠心した後、上清を除いてリンス用PBSを10ml加え、これを再度遠心するリンス工程を3回繰り返した。
上清を除いて酵素分解用培地を2ml加え、37℃にて1時間(30分に1回混ぜる)処理し、これを2000rpm(4℃)で5分間遠心した。
上清を除いてα−MEM培地を5ml加え、2000rpm(4℃)で5分間遠心した。その後、上清を除いてα−MEM培地を5ml加えて細胞数をカウントし、得られた歯髄細胞をT−25フラスコに播種した。
なお、上記酵素分解用培地は、α−MEM培地(α−MEM:395ml、FCS:100ml、200mMアスコルビン酸:250μl、PS:5mlの混合液)7.5ml、DispaseII(2.4U/ml、Roche社製)2.5ml、コラゲナーゼ(和光純薬社製)30mgの混合液である。
前記工程後、培地を2日に1回交換し、コンフルエントになったら次の継代操作を行った。
また、播種1日後と継代前に細胞の写真を撮影した。
培養細胞をPBS(−)で2回リンス後、0.05%トリプシン/EDTAを1ml加えて再度リンスし、37℃下で5分間インキュベートした。
その後、新しいα−MEM培地を5ml加えて懸濁し、1000rpm(4℃)で5分間遠心した。上清を除去し、新しい培地に懸濁して10cmディシュに播種し、培養した(継代2代目)。
なお、継代2代目を3日以上培養した培地を10ml採取して−20℃にて保存しておいたものをウイルス検査の検体とした。
以上の操作を繰り返すことにより、継代3〜10代目も同様にして得た。
各継代のストックは次のようにして得た。
前記継代操作後に細胞数をカウントし、1000rpm(4℃)で5分間遠心した。その後、上清を除去し、1バイアルにつき細胞数が1×106cells/ml以上になるようにセルバンカーIIを加えて懸濁した。これを1バイアルにつき1mlずつ分注し、バイアルをBIO FREEZING VESSELに入れて−80℃で2日間おいた後、液体窒素へ移した。
<増殖曲線の作成>
ディシュ上で培養している細胞をPBS(−)で2回洗浄後、さらに0.05%トリプシン/10mM EDTAを1ml加えて、洗浄した。その後、37℃下で5分間インキュベートし、細胞がディシュから剥がれた事を確認したら、培地を加えて懸濁した。細胞懸濁液を1000rpm(4℃)で5分間遠心し、上清を除いたら、再度培地を加えて懸濁し、1000rpm(4℃)で5分間遠心した。
その後、細胞を新しい培地に懸濁して、細胞数をカウントした。
5.4×105cellsの細胞を9.5mlの培地に懸濁し、24wellプレートの12wellに500μl/wellで分注した。その後、各wellに培地を500μlずつ加えて、1ml/wellとした。
これを37℃、5%CO2インキュベーターで培養し、24時間毎に2wellずつ細胞数をカウントした。カウントは細胞増殖がプラトーに達するまで行い、図1に示す増殖曲線を得た。
図1に示すように、使用した永久歯、乳歯のいずれの歯髄細胞も、10継代までほぼ同等の増殖能を維持し、一般的な歯髄細胞(抜歯後直ぐに培養したもの)の増殖曲線に比べても異常は認められなかった。
なお、本発明にかかる移送方法を行わず、抜歯後保存液につけるのみで24時間以内に上記培養を行ったものについても同様の試験を行ったところ、永久歯については増殖能がかなり低下しており、継代数を増す毎にその度合は顕著となった。
したがって、本発明により、幹細胞を含む歯髄細胞の増殖能を維持したままで抜去歯を移送することが可能である。
ディシュ上で培養している細胞をPBS(−)で2回洗浄後、さらに0.05%トリプシン/10mM EDTAを1ml加えて、洗浄した。その後、37℃下で5分間インキュベートし、細胞がディシュから剥がれた事を確認したら、培地を加えて懸濁した。細胞懸濁液を1000rpm(4℃)で5分間遠心し、上清を除いたら、再度培地を加えて懸濁し、1000rpm(4℃)で5分間遠心した。
その後、細胞数をカウントし、6wellプレートに1×105cells/wellで播種して一晩培養した。
培養後、細胞をPBSで1回洗い、2mlの4%PFAで3分固定し、PBSで2回洗った。その後、1mlの検出バッファー(1M Tris−HCl(pH9.5):50ml、3M NaCl:16.67ml、1M MgCl:25ml、B,W:408.33mlの混合液)を加え、2分置いた。
検出バッファーを吸い取り、発色液(検出バッファー:5ml、NBT:16.5μl、BCIP:16μl)500μlを加え、遮光して2時間置いた後、wellの細胞を蒸留水で5分間洗った。
各wellに4%PFA/PBSを700μl加え、室温で10分間インキュベートした。その後、4%PFA/PBSを除き、PBS(−)で3回リンスした。
続いてIMMU−MOUNTを各wellに3滴加え、カバーガラスを被せて室温保存した。
アルカリフォスターゼ(ALP)は骨芽細胞のマーカーとして用いられ、骨形成を示す細胞は紫色に染色される(ALP陽性細胞)ことが知られている。
図2に示すように、使用した永久歯、乳歯のいずれの歯髄細胞にもALP陽性細胞が認められた。ALP陽性細胞は継代数の増加に伴って減少がみられたが、継代により細胞の総数自体は増加した。このことから、これらの歯髄細胞は、整形外科疾患(骨折等の骨修復等)において十分に有用であると考えられる。また、この結果は、別途行った一般的な歯髄細胞(抜歯後直ぐに培養したもの)によるものに遜色なかった。
なお、本発明にかかる移送方法を行わず、抜歯後保存液につけるのみで24時間以内に上記培養を行ったものについても同様の試験を行ったところ、永久歯についてはALP陽性細胞数及び細胞の総数が図2(B)に比べ極めて少ないことが分かった。
したがって、本発明により、幹細胞を含む歯髄細胞の骨再生能を維持したままで抜去歯を移送することが可能である。
ディシュ上で培養している細胞をPBS(−)で2回洗浄後、さらに0.05%トリプシン10mM/EDTAを1ml加えて、洗浄した。その後、37℃下で5分間インキュベートし、細胞がディシュから剥がれた事を確認したら、培地を加えて懸濁した。細胞懸濁液を1000rpm(4℃)で5分間遠心し、上清を除いたら、再度培地を加えて懸濁し、1000rpm(4℃)で5分間遠心した。
その後、細胞を新しい培地に懸濁して、細胞数をカウントし、1×105cells/wellとなるように6wellプレートに播種したのち、37℃、5%CO2で24時間インキュベートした。
培地を抜いてPBS(−)でリンスし、各wellに4%PFA/PBSを700μl加え、RTで10分間インキュベートした。その後、4%PFA/PBSを除き、PBS(−)で3回リンスした。
SA−β−gal solutionを各wellに700μl加え、室温で一晩インキュベートし、染色された細胞を顕微鏡でチェックして撮影した。
SA−β−gal solutionを抜き、PBS(−)でリンスを2回行った後、各wellに4%PFA/PBSを700μl加え、室温で10分間インキュベートした。その後、4%PFA/PBSを除き、PBS(−)で3回リンスした。
続いてIMMU−MOUNTを各wellに3滴加え、カバーガラスを被せて室温保存した。
SA−β−galは細胞の老化マーカーとして用いられ、細胞分裂が停止した老化細胞は青色に染色される(SA−β−gal陽性細胞)ことが知られている。
図3に示すように、使用した永久歯、乳歯のいずれの歯髄細胞にもSA−β−gal陽性細胞は認められず、この結果は継代を重ねても変わらなかった。このことから、これらの歯髄細胞では、継代により増殖能の変化が少なく安定した培養が可能で十分に有用であると考えられる。また、この結果は、別途行った一般的な歯髄細胞(抜歯後直ぐに培養したもの)によるものに遜色なかった。
なお、本発明にかかる移送方法を行わず、抜歯後保存液につけるのみで24時間以内に上記培養を行ったものについても同様の試験を行ったところ、永久歯についてはSA−β−gal陽性細胞が認められた。
したがって、本発明により、幹細胞を含む歯髄細胞の高い増殖能を維持したままで抜去歯を移送することが可能である。
上記移送(保存)例による女性の永久歯及び男性の乳歯由来のヒト歯髄細胞各1例を上記培養方法で培養したものについて、染色体数を分析した。それぞれの培養細胞50個について染色体数の分析結果を表1及び表2に示す。具体的な分析方法は次の通りとした。
10代継代した歯髄細胞より染色体標本を作製し、ギムザ染色し、染色体数を決定後、該標本をQuinacrine−Hoechst染色にて分染した。標準核型に基づいて染色体を分類し、核型分析を行った。
染色体数(本) ≦44 45 46 47 48≦ 計
細胞数(個) 0 4 45 0 1 50
染色体数(本) ≦44 45 46 47 48≦ 計
細胞数(個) 2 3 45 0 0 50
表1の染色体数46本の細胞をQ分染法により10個分析した結果、図4に代表されるとおり、全てXX型であった。また、表2の染色体数46本の細胞を同様に分析したところ、図5に示すとおり、全てXY型であった。
表1、2及び図4、5に示すように、分析されたヒト歯髄細胞の染色体数はほぼ全ての細胞で正常な46本であった。
したがって、本発明にかかる移送方法は、歯髄細胞の染色体数の変異を誘起しないことが明らかである。
Claims (6)
- 抜去歯の表面に直線的な溝を入れる工程と、
前記抜去歯を溝に沿って分割し、歯髄を露出させる工程と、
前記抜去歯を培地に浸し、細胞の保存に適した温度に保持した状態で輸送する工程と、
を、含むことを特徴とする保存用抜去歯の移送方法。 - 前記直線的な溝が、抜去歯の歯冠から歯根にかけた縦断線に沿って、該抜去歯の側面から中心に向かって溝を形成されたものであることを特徴とする請求項1に記載の保存用抜去歯の移送方法。
- 前記直線的な溝が、抜去歯の歯冠部咬合面の分割線に沿って、該抜去歯の上面から中心に向かって形成されたものであることを特徴とする請求項1に記載の保存用抜去歯の移送方法。
- 前記輸送にかかる時間が48時間以内であることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の保存用抜去歯の移送方法。
- 前記抜去歯が永久歯であって、歯髄未処置の埋伏歯、過剰歯、又は便宜抜去歯であることを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の保存用抜去歯の移送方法。
- 前記直線的な溝の長さが5〜10mm、幅が0.5〜1.5mm、深さが2〜4mmであることを特徴とする請求項1〜5のいずれか記載の保存用抜去歯の移送方法。
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