CN113454456A - 用于治疗、预防和/或延缓神经退行性疾病以及神经元和神经胶质退化的空多孔颗粒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过例如扫描电镜测量的直径为0.1～1000μm的空多孔颗粒，其可用于诊断、预防和/或延缓神经退行性疾病，或用于预防和/或延缓神经元和神经胶质的退化中。本发明还涉及一种鉴定用于诊断的生物标志物的方法。

Description

用于治疗、预防和/或延缓神经退行性疾病以及神经元和神经 胶质退化的空多孔颗粒
技术领域
本发明涉及通过扫描电镜测量的直径为0.1～1000μm的空多孔颗粒(emptyporous particles)，其用于诊断、预防和/或延缓神经退行性疾病，或用于预防和/或延缓神经元和神经胶质的退化。本发明还涉及一种鉴定用于诊断的生物标志物的方法。
背景技术
异常蛋白质团聚体的形成是神经退行性疾病(NDDs)如阿尔茨海默症(AD)、帕金森病(PD)、亨廷顿病、皮克病和肌萎缩侧索硬化症(ALS)的关键因素。这些团聚体干扰细胞功能和体内平衡，导致突触和神经元的渐进性损失。最近的发现表明，在这些条件下疾病进展的潜在因素之一是突变/致病蛋白的细胞间繁殖，类似于朊病毒蛋白的细胞间转移。支持这一机制的实验结果出现在阿尔茨海默症(AD)中的β-淀粉样蛋白和τ-淀粉样蛋白(例如Goedert等人,Propagation of Tau Aggregates and Neurodegeneration.Annu RevNeurosci.2017.0725；40:189-210.doi:10.1146/annurev-neuro-072116-031153.Review)，PD中的α-突触核蛋白(例如Wong YC,Krainc D.α-synuclein toxicityin neurodegeneration:mechanism and therapeutic strategies.Nat Med.2017.02.07；23(2):1-13.doi:10.1038/nm.4269.Review)和ALS(包括SOD1)中各种形式的突变蛋白(例如Fatima等人,Spread of pathology in amyotrophic lateral sclerosis:assessmentof phosphorylated TDP-43along axonal pathways.Acta NeuropatholCommun.2015.07.28；3:47.doi:10.1186/s40478-015-0226-y)。因此，防止突变/致病蛋白的细胞间转移可能是对抗NDDs进展的一种有吸引力的治疗策略。
介孔二氧化硅颗粒作为用于治疗剂配方的稳固且可调的递送平台是有吸引力的。其作为药物递送载体的应用已经在药物制剂、控制药物释放和诊断学等领域取得了诸多进展。WO2012/004291公开了负载有形态生成素并与干细胞共移植的介孔二氧化硅颗粒(MSPs)有助于小鼠胚胎干细胞(ESCs)向运动神经元(MN)祖细胞分化。用胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和/或睫状神经营养因子(CNTF)的肽模拟物进行的后续治疗显著促进了移植小鼠的存活和其ESC衍生的运动神经元祖细胞向功能性感受态的运动神经元细胞的特异性分化。此外，从这种共移植递送系统中释放的模拟物产生了从植入部位开始的梯度，该梯度刺激了分化中的运动神经元轴突的定向生长。
最近的研究表明，负载于MSP的模拟物在小鼠背根发生撕脱伤后诱导感觉轴突的再生，进一步证实了所述模拟物在体内实验条件下的实用性和生物相容性(Hoeber等人,ACombinatorial Approach to Induce Sensory Axon Regeneration into the DorsalRoot Avulsed Spinal Cord.Stem Cells Dev.2017.07.15；26(14):1065-1077.doi:10.1089/scd.2017.0019.Epub 2017.05.31)。
纳米粒子也显示出隔离生物分子和固定蛋白质的潜力。无毒的水凝胶共聚物纳米粒子被证明能有效地隔离和中和有毒的磷脂酶A2(O'Brien J,Lee SH,Onogi S,SheaKJ.Engineering the Protein Corona of a Synthetic Polymer Nanoparticle forBroad-Spectrum Sequestration and Neutralization of VenomousBiomacromolecules.J Am Chem Soc.2016.12.28；138(51):16604-16607.doi:10.1021/jacs.6b10950.Epub 2016.12.16)。
纳米粒子也称为为纳米海绵，由包覆红细胞膜的聚合物核组成，能够有效地结合来自几种致病细菌菌株的穿孔毒素(Hu CM,Fang RH,Copp J,Luk BT,Zhang L.Abiomimetic nanosponge that absorbs pore-forming toxins.NatNanotechnol.2013.05；8(5):336-40.doi:10.1038/nnano.2013.54.Epub 2013.04.14)。二氧化硅纳米粒子易于吸附体内的蛋白质和其他生物分子，并显示出吸附RNA结合蛋白的高亲和力(Klein G,MathéC,Biola-Clier M,Devineau S,Drouineau E,Hatem E,MarichalL,Alonso B,Gaillard JC,Lagniel G,Armengaud J,Carrière M,Chédin S,Boulard Y,Pin S,Renault JP,Aude JC,Labarre J.RNA-binding proteins are a major target ofsilica nanoparticles in cell extracts.Nanotoxicology.2016.12；10(10):1555-1564.Epub2016.10.25)。突变的RNA结合蛋白及其团聚体与肌萎缩侧索硬化症的发病机制有关(例如，Fatima等人，Acta Neuropathol Commun.2015.07.28；3:47.doi:10.1186/s40478-015-0226-y))。介孔二氧化硅颗粒(MSP)在体外显示出对游离脂肪酸的有效掺入(Valenstein等人,Functional mesoporous silica nanoparticles for the selectivesequestration of free fatty acids from microalgal oil.ACS Appl MaterInterfaces.2012.02；4(2):1003-9.doi:10.1021/am201647t.Epub 2012.02.03)。口服特定孔径的MSP可诱导大鼠体重减轻和血脂降低，这可能是由参与肠道脂质吸收的隔离酶/生物活性分子造成的结果(Kupferschmidt等人,Large pore mesoporous silica inducedweight loss in obese mice.Nanomedicine(Lond).2014.07；9(9):1353-62.doi:10.2217/nnm.13.138.Epub 2014.01.7)。
US 2018/0256747公开了使用颗粒来结合并抑制生物分子，以用于预防和/或治疗神经退行性疾病的用途。所述颗粒具有结合到颗粒内表面或外表面的固定化试剂(例如，肿瘤坏死因子(TNF))，从而使试剂可以选择性地结合生物分子。
WO 2012/013617公开了一种分子印迹聚合物(MIP)，其具有针对淀粉样肽或其异构体的C-端或N-端表位，使得该分子印迹聚合物可以选择性地结合体液(如脑脊液)中存在的淀粉样肽的可溶性部分。
WO 2012/145428公开了一种装置，借此至少一种蛋白酶结合到该装置的载体上。所述载体可以是多孔颗粒。
Garcia-Bennett等人(Stem Cells Transl Med,2013,2(11),906-915页)和WO2012004291公开了负载肽模拟物的颗粒在干细胞分化(例如胚胎干细胞(ESCs))中的用途，所述分化通过颗粒与胚胎干细胞(ESCs)的共移植来进行。负载有肽模拟物和上述共移植物的颗粒对体积和神经突起的生长具有积极的影响。结果表明，没有负载的、移植了胚胎干细胞的颗粒对胚胎干细胞的分化没有影响。这些文献没有记载使用多孔颗粒预防神经退行性疾病或延缓此类疾病的发作的内容。
预防和/或延缓受影响的神经系统中异常蛋白质团聚体的形成和繁殖的需求不断增长，从而预防和/或延缓神经退行性疾病。随着普通人群年龄的增长，上述疾病的发病率，尤其是阿尔茨海默病，预计会增加。目前，全世界有3000多万人患有NDDs，并且这些疾病没有治愈方法，也没有令人满意的方法来预防和/或延缓这些疾病的发作。
发明内容
本发明的目的是至少部分克服上述问题，并提供一种用于预防和/或延缓神经元和神经胶质退化，特别是运动神经元和神经退行性疾病退化的改进产品。
这个目的是通过用于预防和/或延缓神经退行性疾病的直径为0.1～1000μm(如通过扫描电镜测量)的空多孔颗粒来实现的。该目的还通过用于延缓神经退行性疾病发作的直径为0.1～1000μm(如通过扫描电镜测量)的空多孔颗粒来实现。该目的通过用于预防和/或延缓神经元和神经胶质的退化的直径为0.1～1000μm(如通过扫描电镜测量)的空多孔颗粒来实现。一方面，该用途涉及神经元和神经胶质退化的治疗或神经退行性疾病的治疗。
一方面，该用途涉及延缓神经退行性疾病的进展。在一些方面，神经退行性疾病选自阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、亨廷顿氏病(HD)、路易体痴呆(DLB)、进行性核上性麻痹(PSP)、多系统萎缩(MSA)、皮质基底变性(CBD)、额颞叶痴呆(FTD)、脊髓小脑共济失调(SCA)病和脊髓性肌萎缩或其他神经退行性疾病。一方面，所述神经退行性疾病是肌萎缩侧索硬化症。
一方面，不要求采用干细胞的共移植。另一方面，空颗粒没有表面结合的分子或试剂，例如肿瘤坏死因子(TNF)、蛋白酶或淀粉样肽。
结果表明，通过注射空多孔颗粒或含有模拟物的多孔颗粒给药显著延缓了SOD1突变小鼠的病程。
已经发现，空多孔颗粒会延缓疾病的发作，如肌萎缩侧索硬化症。在小鼠模型中，通过握力测试测得，所述颗粒将肌肉力量的损失所用的时间缩短了20天。在同一模型中，显示了在单独施用空多孔颗粒后，动物存活率提高了25％，在施用负载有肽模拟物(以下称为模拟物)的颗粒后，动物存活率提高了12％。
一方面，本文所定义的空多孔颗粒用于将肌萎缩侧索硬化症患者的存活率提高至少12％或至少25％。
上面提到的一些疾病，如AD和HD，其特征是异常的蛋白质聚集。因此，有理由假设这些疾病的发作或进展可以通过使用空的多孔二氧化硅颗粒来延缓。
不希望被任何理论所束缚，空多孔颗粒的效果可能是由空多孔颗粒从脊髓液和/或中枢神经系统实质的细胞外隔室中摄取物质/生物分子引起的。空多孔颗粒的效果也可能是由细胞内物质/生物分子的摄取/吸收/隔离引起的。有毒物质/生物分子可以是导致哺乳动物疾病或疾病进展的分子。多孔颗粒可以隔离生物(活性)分子并固定酶和蛋白质。这种生物分子的去除可以预防和/或延缓或延迟神经退行性疾病的发作，如阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症、帕金森病等。
一方面，通过例如扫描电镜测量的直径为0.1～1000μm的空多孔颗粒用于隔离SOD1、TDP-43、τ(tau)蛋白和影响神经元和神经胶质退化的其他生物分子。一方面，所述空多孔颗粒的用途是隔离SOD1。
在另一个方面，通过例如扫描电镜测量的直径为0.1～1000μm的空多孔颗粒用于隔离SOD1、TDP-43、淀粉样β蛋白、α-突触核蛋白、τ蛋白、ELAVL4、FUS和其他有助于神经退行性疾病如阿尔茨海默氏病(AD)、帕金森氏病(PD)、亨廷顿氏病、皮克氏病、多发性硬化(MS)和肌萎缩侧索硬化症(ALS)或其他神经退行性疾病)进展的生物分子。一方面，所述空多孔颗粒的用途是隔离SOD1。
在另一个方面，在使用全部或至少一部分负载有营养因子(例如胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和/或睫状神经营养因子(CNTF)的肽模拟物)的颗粒治疗哺乳动物之前、期间或之后，通过例如扫描电镜测量的直径为0.1～1000μm的空多孔颗粒用于隔离SOD1、TDP-43、淀粉样β蛋白、α-突触核蛋白、τ蛋白、ELAVL4、FUS和其他有助于神经退行性疾病进展的生物分子。这些因子可以与干细胞一起施用。一方面，所述空多孔颗粒的用途是隔离SOD1。
在另一个方面，通过例如扫描电镜测量的直径为0.1～1000μm的空多孔颗粒用于在使用干细胞治疗哺乳动物之前、期间或之后隔离SOD1、TDP-43、淀粉样β蛋白、α-突触核蛋白、τ蛋白、ELAVL4、FUS和其他有助于神经退行性疾病进展的生物分子。一方面，所述空多孔颗粒的用途是隔离SOD1。
一方面，空多孔颗粒用于预防和/或延缓哺乳动物的NDDs，由此在使用全部或至少一部分载有营养因子的颗粒治疗哺乳动物之前、期间或之后施用空颗粒，所述营养因子选自胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和/或睫状神经营养因子(CNTF)和/或干细胞的肽模拟物。一方面，至少50w/w％的颗粒被负载。另一方面，在使用负载或部分负载的颗粒治疗哺乳动物之前施用空颗粒。在另一方面，通过在脑脊液、脑或脊髓实质中注射来施用空颗粒。
在另一方面，空多孔颗粒用于预防和/或延缓哺乳动物的NDDs，由此在使用全部或至少一部分负载营养因子的颗粒治疗哺乳动物之前、期间或之后施用空颗粒，所述营养因子选自胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和/或睫状神经营养因子(CNTF)的肽模拟物。一方面，至少50w/w％的颗粒被负载。另一方面，在使用负载或部分负载的颗粒治疗哺乳动物之前施用空颗粒。在另一方面，通过在脑脊液、脑或脊髓实质中注射来施用空颗粒。
一方面，空颗粒是纳米多孔和/或介孔二氧化硅颗粒。另一方面，空颗粒是介孔二氧化硅颗粒。在另一方面，空颗粒是无定形二氧化硅颗粒。
一方面，空颗粒的直径为0.1～500μm，或为0.1～250μm，或为0.1～100μm，或为0.2～50μm，或为0.3～25μm，或为0.3～20μm，或为0.3～12μm，或为0.3～6μm。一方面，空颗粒的直径为0.1到0.25μm。这个范围特别适合于通过注射器进行注射。
一方面，空颗粒的直径小于1mm或小于0.2μm。颗粒可以穿透细胞，且引发或延长疾病的物质或生物分子的细胞内摄取可以进一步提高空颗粒预防和/或延缓神经退行性疾病的效率。具有不同尺寸的空颗粒的组合可用于本发明，以确保SOD1、TDP-43、淀粉样β蛋白、α-突触核蛋白、τ蛋白、ELAVL4、FUS和其他有助于神经退行性疾病进展的生物分子的细胞外和细胞内的摄取/吸收/隔离。
在另一方面，空多孔颗粒具有0.1～5cm3/g，或0.2～3cm3/g的孔体积，如通过氮吸附等温线测量并使用BET(Brunauer-Emmett-Teller)模型计算得到的孔体积。
在另一方面，空多孔颗粒的平均孔径为1～250nm，或者在2～50nm，如通过氮吸附等温线测量的并使用BET(Brunauer-Emmett-Teller)模型计算得到的孔体积和孔径，优选2～30nm，或者5～25nm。
在另一方面，空颗粒是介孔二氧化硅颗粒，其孔径为1～100nm，孔体积为0.1～3cm3/g，表面积在40～1500m2/g。
在又一方面，空颗粒具有0.3～20nm的孔径、0.5～1.5cm3/g的孔体积和50～800m2/g的表面积。
一方面，空颗粒是亲水的，并且具有末端羟基-OH的表面化学性质。这种表面化学性质允许通过氢键和静电相互作用与生物分子进行化学结合。
在又一方面，空颗粒具有疏水的表面化学性质，其通过疏水性相互作用促进生物分子的吸附。
一方面，空多孔颗粒或多孔二氧化硅颗粒被生物素化。在另一方面，空多孔颗粒或多孔二氧化硅颗粒用化学官能团进行化学改性，所述化学官能团包括-COOH、-NH3、OCH3、-OCH2CH3。
一方面，空多孔颗粒通过具有末端羟基-OH的表面化学性质，或具有疏水性的表面化学性质，或具有包括-COOH、-NH3、OCH3、-OCH2CH3或其混合物的化学官能团而被化学改性。也可以使用具有不同化学改性的颗粒混合物。
一方面，通过例如扫描电镜测量的直径为0.1～1000μm的空多孔颗粒用于诊断神经退行性疾病。在患有某种疾病的哺乳动物的颈和/或脊髓液中可以鉴定出某些化合物，例如蛋白质。通过施用不负载的或负载有培养液的多孔颗粒，并在一段时间(例如1～36h)后后回收一部分颗粒，在所述颗粒存在于颈椎和/或脊髓液期间，已经负载于颗粒中的化合物可以被鉴定并因此用于诊断所述特定疾病。
本发明还涉及一种鉴定用于诊断和/或治疗诸如肌萎缩侧索硬化症之类的神经退行性疾病的生物标志物的方法，包括或由以下步骤组成：
a)将本文定义的空多孔颗粒施用到脑脊液中；
b)经过一段时间(例如1～36h)后，从脑脊液中回收一部分所述多孔颗粒；
c)确定在所述多孔颗粒存在于脑脊液期间，生物分子已被负载于多孔颗粒中；
d)确定化合物是否可以用作生物标志物。
施用是指在体内施用以及在体外将空颗粒加入从哺乳动物回收的脑脊液中。因此，该方法可以在体内和体外进行。
因此，本发明进一步涉及一种鉴定用于诊断和/或治疗NDDs(如ALS)的生物标志物的方法，包括或由以下步骤组成：
a)将本文定义的空多孔颗粒加入到从哺乳动物回收的脑脊液中；
b)经过一段时间(例如1～36h)后，从脑脊液中回收一部分所述多孔颗粒；
c)确定在所述多孔颗粒存在于脑脊液期间，生物分子已被负载于多孔颗粒中；
d)确定化合物是否可以用作生物标志物。
因此，空多孔颗粒可以在相对低的成本下以简单、有效和高效的方法用于诊断NDD。“一部分”是指施用或添加的颗粒的一部分，例如99w/w％或更少。
本发明的一个方面涉及通过上述方法获得的一种或多种生物标志物。空颗粒允许识别新的生物标志物，这可能有助于NDDs的诊断和治疗。
多孔颗粒可以根据许多方法进行制造。一方面，多孔颗粒可以使用二氧化硅源制造，例如硅酸盐如四乙氧基硅烷(TEOS)，或者硅酸盐如硅酸钠，或者与孔隙导向剂或成孔剂或模板剂(如表面活性剂或聚合物)组合。在另一方面，多孔颗粒通过溶胶-凝胶法制造，例如
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法，或者通过喷雾干燥法制造。在另一方面，颗粒可以通过溶胶-凝胶法制造，该方法包括二氧化硅前体溶液与不可混溶的有机溶液、油或液体聚合物的缩合反应，其中通过搅拌或喷射溶液形成液滴，随后通过改变pH和/或蒸发水相使二氧化硅凝胶化。
一方面，颗粒包括改性表面。所述表面可以是化学改性的表面，例如通过蚀刻。该表面可以是涂覆表面。涂覆可用于将生物活性化合物如模拟物粘附到颗粒表面。一方面，用功能化试剂涂覆颗粒。
一方面，多孔颗粒通过包括或由以下步骤组成的方法制造：
-提供空多孔二氧化硅颗粒，
-任选地用一种或多种模拟物负载到所获得的整个或至少一部分颗粒上，和/或
-任选地用一种或多种附加试剂负载到全部或至少一部分颗粒上。
一方面，培养液负载于全部或至少一部分空颗粒中或空颗粒表面。培养液是一种缓冲溶液，其具有适于通过注射给药的生理pH。可以负载5～99w/w％的空颗粒，或者10～90w/w％的空颗粒，或者25～75w/w％的空颗粒。
在另一个方面，一种或多种模拟物负载于全部或至少一部分空颗粒中或空颗粒表面，而非固定地结合到颗粒表面。该模拟物可选自包含或由胶质原纤维蛋白和Cintrofin组成的组。可以负载5～99w/w％的空颗粒，或者10～90w/w％的空颗粒，或者25～75w/w％的空颗粒。
负载有一种或多种模拟物的颗粒被认为增加了运动神经元的神经突起生长。负载模拟物的颗粒被认为可以提高脊髓液胚胎干细胞或衍生的SOD1 MNs或SOD1G93AMNs中的运动神经元密度。与对照(未治疗)相比，负载有一种或多种模拟物的颗粒被认为提高了100％的神经元和神经胶质、或MNs或衍生的SOD1 MNs或SOD1G93AMNs的存活率。
一方面，一种或多种附加试剂负载于颗粒中或颗粒上。一种或多种试剂可以选自生长因子、pH调节剂、抗生素、抗炎药物和免疫抑制剂。
本发明还涉及一种药物组合物，其包含多个如上定义的空多孔颗粒或由多个如上定义的空多孔颗粒组成，以及溶剂，例如注射溶液或水，和任选的药学上可接受的添加剂，所述药物组合物用于预防和/或延缓神经退行性疾病，例如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、皮克氏病、多发性硬化和肌萎缩侧索硬化症。一方面，神经退行性疾病是肌萎缩侧索硬化症。
整个或至少一部分空颗粒可以负载有培养液，和/或一种或多种模拟物和/或附加试剂。组合物的pH为5～8，或6～7，或约6.8。可以负载5～99w/w％的空颗粒，或者10～90w/w％的空颗粒，或者25～75w/w％的空颗粒。
一方面，包含或由所述负载的多孔颗粒和溶剂以及任选的药学上可接受的添加剂组成的药物组合物可用于延长一种或多种模拟物和/或附加试剂的释放。
在另一个方面，所述空颗粒通过注射来施用在脑脊液、脑或脊髓实质中。一方面，不建议进行静脉施用。
在另一个方面，药物组合物通过注射施用在脊髓和/或颈液中。在又一个方面，药物组合物通过注射施用在脊髓液中。在另一个方面，药物组合物通过注射施用在颈液中。
本发明还涉及如上定义的药物组合物的给药剂量方案，其中药物组合物通过注射每月至少一次施用在脑脊液或脑或脊髓实质中。一方面，如上定义的药物组合物可以通过鞘内注射到第三和第四椎骨的脊髓实质中来给药，以防止或延缓支配横膈膜的MNs的退化，并因此防止或延缓负责呼吸的MNs的退化。
一方面，如上定义的药物组合物在一个月、两个月、三个月或四个月中至少一次通过注射施用在脑脊液、脑或脊髓实质中。
本发明还涉及上述任何地方定义的空颗粒在给药方案中的应用，其中颗粒至少每一、二、三或四个月给药一次。
附图说明
现在将通过对本发明不同实施例的描述并参考附图更详细地解释本发明。
图1示出了用于隔离生物分子和负载模拟物的空介孔二氧化硅颗粒的扫描电子显微镜(SEM)图像。所述颗粒由1～10μm大小的团聚体(由几个500nm大小的初级颗粒组成)组成。
图2示出了使用Micromeritics's TriStar II 3020通过氮气(N2)吸附-解吸技术获得的空介孔二氧化硅颗粒的孔径分布。使用密度泛函理论(DFT)模型确定孔径为23nm。测定纳米多孔二氧化硅的BET(Brunauer-Emmett-Teller)表面积为722m2/g。
图3示出了用空介孔二氧化硅颗粒或模拟物负载的介孔颗粒的治疗延长了ALS突变SOD1G93A小鼠模型的存活时间。SOD1G93A和SOD1G93A的同窝出生崽畜的疾病末期(确定为当动物侧卧时无法在20s内自行恢复)的年龄，所述同窝出生崽畜注射了负载有模拟物(MesoMIM)(0.1μg/μl颗粒)或空颗粒(Meso)(0.1μg/μl颗粒)的介孔颗粒。得到了平均年龄±标准差。
图4示出了用空介孔二氧化硅颗粒或模拟物负载的介孔颗粒或bNCSCs(干细胞)的治疗延长了ALS突变SOD1G93A小鼠模型的重量进展。注射了负载有模拟物(MesoMIM)(0.1μg/μl颗粒)，或负载有空颗粒(Meso)(0.1μg/μl颗粒)或负载有bNSCs(～13,000个细胞/μl)的介孔颗粒的SOD1G93A的同窝出生崽畜。得到了平均年龄±标准差。
图5示出了注射有空中孔颗粒或注射有负载模拟物的中孔颗粒或注射有指定年龄的bNCSCs细胞的SOD1G93A的平均后肢握力的图。结果为平均值±标准差。
图6示出了注射有空中孔颗粒或注射有负载模拟物的中孔颗粒或注射有指定年龄的bNCSCs细胞的SOD1G93A的平均前肢握力的图。结果为平均值±标准差。
图7示出了将多孔二氧化硅颗粒与从Tg(SOD1*G93A)1Gur/J小鼠(4只小鼠)和WTblac6小鼠(4只小鼠)获得的脊髓提取物温育后获得的颗粒未结合部分和颗粒结合部分的mSOD-1和TDP-43免疫印迹，随后进行颗粒结合部分和颗粒未结合部分的分离。
具体实施方式
定义和测量方法
如本文所用，术语“疾病”旨在包括紊乱、病症或其任何等同症状。
术语“负载”是指生物活性化合物可以负载到颗粒中和/或颗粒表面上，而不与颗粒固定地结合。
如本文所用，术语“实质上”或“大约”指的是围绕所提到的数字的值的偏差，例如实质上或大约5意味着该值可以为4～6。
如本文所用，术语“涂覆”是指表面的覆盖，其可以包括孔的堵塞或不堵塞。
术语“延缓释放”是指生物活性化合物的任何非立即释放，即30min内至少80％的化合物未释放。
如本文所用，术语“患者”指哺乳动物，例如人。
如本文所用，术语“至少一部分”是指整个空颗粒的至少50w/w％，或至少75w/w％，或至少90w/w％。
在本说明书的上下文中，术语“治疗”也包括“预防”，除非有相反的具体指示。术语“治疗性的”和“治疗性地”应该进行对应的翻译。本发明上下文中的术语“治疗”还包括施用有效量的本发明化合物，以减轻先前存在的疾病状态，急性或慢性，或复发状态。这一定义还包括用于预防复发的预防性治疗和用于慢性疾病的持续治疗。
如本文所用，术语“可选的”或“可选地”意味着随后描述的事件或情况可以但不需要发生，并且该描述包括事件或情况发生的情况和不发生的情况。
如本文所用，术语“模拟物”是指设计用于模拟肽的小的蛋白质样链。它们通常来源于对现有肽的修饰，或通过设计模拟肽的类似系统，如肽和β肽。不管采用哪种方法，被改变的化学结构被设计成有利地调节分子性质，例如稳定性或生物活性。在从现有肽开发药物样的化合物中，这种方式可以发挥作用。
如本文所用，术语“延缓”是指疾病发作的延迟。
如本文所用，术语“颈和/或脊髓液”指脑脊液、脑或脊髓实质。
如本文所用，术语“神经细胞”或“神经元细胞”是指中枢神经系统(CNS)中的所有细胞，如神经元和神经胶质，如星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞。
汞(Hg)侵入是测量孔隙度的标准方法。在这种方法中，汞在施加的压力下被推入孔隙中。然而，孔径下限为3.2nm左右，若低于该下限，则汞不能渗透。对于孔径为1～50nm的中尺度范围内的多孔材料，氮(N2)吸附通常用于估计孔径和孔体积。氮吸附技术用于测量多孔材料的有效表面积。使用经验模型计算孔体积和孔径。BET(Brunauer-Emmett-Teller)和BJH(Barrett,Joyner andHalenda)模型用于计算二氧化硅颗粒孔隙的孔隙率。
扫描电子显微镜(SEM)可以用来提供多孔颗粒的图像。颗粒的直径可以用扫描电镜测定。
空多孔颗粒可以通过二氧化硅物种和有机模板剂(例如阳离子表面活性剂，例如具有不同碳链长度的烷基三甲基铵模板)和抗衡离子(例如十六烷基三甲基氯化铵(CTA+C1或CTAC)或十六烷基三甲基溴化铵(CTA+Br或CTAB))或非离子物种(例如二嵌段和三嵌段聚合物物种，例如聚环氧乙烷和聚环氧丙烷的共聚物，例如Pluronic 123表面活性剂)的协同自组装来制造。介孔颗粒的形成发生在二氧化硅前体的水解和缩合之后，该二氧化硅前体可以包括烷基硅酸盐，例如溶液或硅酸钠溶液中的正硅酸四乙酯TEOS或正硅酸四甲酯TMOS。介孔二氧化硅的粒度可以通过加入合适的添加剂来控制，例如无机碱、醇(包括甲醇、乙醇、丙醇)和有机溶剂(如丙酮)，它们影响二氧化硅物质的水解和缩合。孔径可以通过反应混合物的水热处理来控制，例如加热到100℃或甚至更高，以及添加以有机油和液体形式的溶胀剂来膨胀表面活性剂胶束模板剂。在二氧化硅基质冷凝后，所述模板表面活性剂可以通过煅烧除去，通常在500℃～650℃的温度下煅烧数小时，这一过程烧掉了有机模板剂，产生多孔二氧化硅基质。或者，也可以通过提取和用合适的溶剂如有机溶剂或酸性或碱性溶液洗涤来除去模板剂。
空多孔颗粒可以通过溶胶-凝胶法制造，该方法包括二氧化硅前体溶液(例如硅酸钠或二氧化硅纳米颗粒的水悬浮液作为乳液)与不可混溶的有机溶液、油或液体聚合物的缩合反应，其中通过例如搅拌或喷射溶液形成液滴，随后通过改变pH和/或蒸发水相使二氧化硅凝胶化。这里空颗粒的多孔性是由于不可混溶的第二相的存在或蒸发过程中二氧化硅纳米颗粒的堵塞而产生的。可通过加热诱导二氧化硅基质冷凝和洗涤除去不可混溶的第二相来进一步处理空颗粒。此外，可通过煅烧处理空颗粒以强化二氧化硅基质。
空多孔颗粒可以通过在硼硅酸盐玻璃(例如SiO2-B2O3-Na2O)中发生的相分离过程制造为多孔玻璃，随后通过溶胶-凝胶过程对形成的物相之一进行液体提取；或者简单地通过烧结玻璃粉进行制造。在热处理期间，通常在500℃和760℃可产生互穿结构，这是由富钠硼酸盐相和二氧化硅相的旋节分解造成的。
多孔空颗粒可以使用热解法制造。在该方法中，通过在氧-氢火焰中燃烧四氯化硅产生熔融二氧化硅的微小液滴来生产气相二氧化硅，这些液滴融合成三维二级颗粒中的无定形二氧化硅颗粒，然后这些颗粒聚集成三级颗粒。所得粉末具有极低的堆积密度和高表面积。
例如通过扫描电镜测量的空多孔颗粒的直径可以为0.1～1000μm，或者为0.1～500μm，或者为0.1～250μm，或者为0.2～50μm，或者为0.3～25μm，或者为0.3～20μm，或者为0.3～12μm，或者为0.3～6μm。所述空颗粒可能具有纳米和/或介孔结构。
空颗粒可以具有1～100nm，或1～80nm，或2～50nm，或2～25nm，或5～15nm，或基本上12nm的孔径。
空颗粒的孔体积可以为0.1～3cm3/g，或者为0.2～2cm3/g，或者为0.5～1.5cm3/g，或者为0.7～1.2cm3/g，或者为0.5～1.0cm3/g，或者基本上为8.5cm3/g。
空颗粒可以具有0.1～1000μm的直径、1～100nm的孔径、0.1～3cm3/g的孔体积和40～1500m2/g的表面积。空颗粒可以具有0.3～20nm的孔径、0.5～1.5cm3/g的孔体积和50～800m2/g的表面积。说明书中使用的空颗粒可以具有上述间隔范围的任意组合。
空多孔颗粒可能具有不同的形状。空颗粒的形状可以由上述方法控制，并且可以是球形、伪球形、圆柱形、陀螺形、棒条形、纤维形、核壳形状或它们的混合物。空多孔颗粒可以基本为球形或伪球形。
空多孔颗粒可以是多孔二氧化硅颗粒。二氧化硅可以是任何形式的二氧化硅。二氧化硅可以是可生物降解的和/或可溶解的。二氧化硅的示例是无定形二氧化硅或合成无定形二氧化硅。
空多孔颗粒可以通过包括或由提供二氧化硅颗粒的步骤组成的方法制造，优选通过溶胶-凝胶法或喷雾干燥法制造。
-分离空颗粒：分离可以通过空气分级机、或旋风分离、或淘洗、或使用一个或多个筛子的沉降和/或筛分来完成。
培养液可以负载于全部或至少一部分空颗粒中或颗粒表面上。这种液体的示例可以是任何具有约6.8的生理pH的缓冲液体，适用于哺乳动物，例如人。给药可以通过注射进行。
附加化合物，例如一种或多种模拟物或附加试剂，或它们的任何组合，可以负载于全部或至少一部分空颗粒中或颗粒表面上，而非固定地结合到颗粒表面。固定结合是指试剂或模拟物永久附着在颗粒表面。
其他模拟物的示例可以是Gliafin和/或Cintrofin。
一种或多种附加试剂的示例可以是生长因子、pH调节剂、稳定剂、抗生素、抗炎药物和/或免疫抑制剂。
可以使用不同的技术来负载空颗粒，例如溶剂蒸发、浸渍、喷雾干燥、熔融、超临界CO2负载或冷冻干燥等。溶剂蒸发包括将生物活性化合物的浓缩溶液与二氧化硅颗粒结合，然后在进一步处理之前除去溶剂和/或干燥样品。
多孔二氧化硅颗粒的负载量可以为约5w/w％或更多，或约15w/w％、20w/w％、25w/w％、30w/w％、40w/w％、50w/w％、75w/w％、80w/w％、85w/w％、90w/w％。
空多孔颗粒可以被生物素化。空多孔颗粒可以通过具有末端羟基-羟基的表面化学性质、或具有疏水性表面化学性质、或具有包括-COOH、-NH3、OCH3、-OCH2CH3或其混合物的化学官能团而被化学改性。也可以使用具有不同化学改性的颗粒混合物。
表面改性可以在负载前进行。表面改性可以是化学改性，例如蚀刻。蚀刻可以通过将二氧化硅颗粒在碱中煮沸，然后在酸中煮沸以在颗粒的外表面上形成-S-OH键来完成。合适的碱的示例可以是氢氧化钾溶液、氢氧化钠溶液或氨水溶液。合适的酸的示例可以是硝酸、盐酸和硫酸。
多孔颗粒可被配制成适于给哺乳动物如人施用的颗粒型药物组合物。该组合物可以包含或由多个多孔颗粒以及溶剂组成，所述溶剂例如水或适于给哺乳动物施用的生物可接受的液体，所述溶剂的生理pH约为6.8(生理pH)。该组合物可以进一步包含或由药学上可接受的添加剂组成。合适的药物组合物的选择和制备的常规程序描述于，例如，"Pharmaceuticals-The Science of Dosage Form Designs",M.E.Aulton,ChurchillLivingstone,1988。
该药物组合物可用于控制或延长释放负载在多孔颗粒中或颗粒表面上的一种或多种模拟物或附加试剂或其任意组合。缓释是指在标准溶出度试验(如FDA Paddle Method(USP apparatus 2))开始后的30min内从颗粒中释放的负载成分少于50％。
医疗用途
如结果所示，B6/SJC背景下(B6SJL-TgN-SOD1-G93A-1Gur)的10周龄小鼠在以下情况下接受颈髓左侧(C3-C4)的双重或三重颈内椎板切除术注射(2μl)。注射空纳米颗粒或含有模拟物的纳米颗粒显著延缓了SOD1突变小鼠的病程。
通过扫描电镜测量的直径为0.1～1000μm的空多孔颗粒，或如上定义的药物组合物，可用于治疗、预防和/或延缓神经元和神经胶质的退化。
空多孔颗粒或药物组合物可以通过注射施用在脊髓和/或颈液中。该组合物可以注射到脊髓液或颈液中的任何地方。空颗粒可以通过注射施用到脑脊液或脑或脊髓实质中。该组合物可以通过注射施用到第三和第四椎骨的脊髓液中。
如上定义的空多孔颗粒或药物组合物可用于预防和/或延缓神经退行性疾病(NDDs)，所述神经退行性疾病选自阿尔茨海默氏病(AD)、帕金森氏病(PD)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、亨廷顿氏病(HD)、路易体痴呆(DLB)、进行性核上性麻痹(PSP)、多系统萎缩(MSA)、皮质基底变性(CBD)、额颞叶痴呆(FTD)、脊髓小脑共济失调(SCA)疾病和脊髓性肌萎缩症或其他NDDs。
如上定义的空多孔颗粒或药物组合物可用于隔离SOD1、TDP-43、淀粉样β蛋白、α-突触核蛋白、τ蛋白、ELAVL4、FUS和其他影响神经元和神经胶质退化的生物分子。
如上定义的空多孔颗粒或药物组合物可用于隔离SOD1、TDP-43、淀粉样β蛋白、α-突触核蛋白、τ蛋白、ELAVL4、FUS和其他有助于神经退行性疾病(NDDs)进展的生物分子，所述神经退行性疾病选自阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、亨廷顿氏病(HD)、路易体痴呆(DLB)、进行性核上性麻痹(PSP)、多系统萎缩(MSA)、皮质基底变性(CBD)、额颞叶痴呆(FTD)、脊髓小脑共济失调(SCA)疾病和脊髓性肌萎缩症或其他NDDs。
如上定义的空多孔颗粒或药物组合物可用于在使用至少部分负载营养因子的多孔颗粒治疗哺乳动物之前、期间或之后隔离SOD1、TDP-43、淀粉样β蛋白、α-突触核蛋白、τ蛋白、ELAVL4、FUS和其他有助于神经退行性疾病进展的生物分子，例如胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和/或睫状神经营养因子(CNTF)和/或干细胞的肽模拟物。
如上定义的空多孔颗粒或药物组合物可用于在使用干细胞治疗哺乳动物之前、期间或之后隔离SOD1、TDP-43、淀粉样β蛋白、α-突触核蛋白、τ蛋白、ELAVL4、FUS和其他有助于神经退行性疾病进展的生物分子。
所述空多孔颗粒可用于预防和/或延缓哺乳动物的NDDs，由此在用负载营养因子的颗粒治疗哺乳动物之前、期间或之后注射所述空颗粒，所述营养因子选自胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和/或睫状神经营养因子(CNTF)和/或干细胞的肽模拟物。可以在所述治疗之前注射空颗粒。可首先通过注射空颗粒来治疗哺乳动物，随后(在1～24h内)通过注射至少部分负载营养因子的颗粒来治疗，所述营养因子选自胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和/或睫状神经营养因子(CNTF)和/或干细胞的肽模拟物。或者，可以通过注射空颗粒和注射至少部分负载营养因子的颗粒来同时治疗哺乳动物，所述营养因子选自胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和/或睫状神经营养因子(CNTF)和/或干细胞的肽模拟物。或者，可以首先通过注射至少部分负载营养因子的颗粒来治疗哺乳动物，所述营养因子选自胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和/或睫状神经营养因子(CNTF)和/或干细胞的肽模拟物，随后(在1～24h内)通过注射空颗粒来治疗。这些颗粒可以通过注射施用到脑脊液或脑或脊髓实质中。
药物组合物给药的剂量方案可以是通过注射施用在脊髓液中，至少每月一次，或至少每两个月一次，或至少每三周一次，或每两周一次，或每周一次。
神经退行性疾病的诊断
所述空多孔颗粒可用于诊断神经退行性疾病，所述神经退行性疾病选自阿尔茨海默氏病(AD)、帕金森氏病(PD)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、亨廷顿氏病(HD)、路易体痴呆(DLB)、进行性核上性麻痹(PSP)、多系统萎缩(MSA)、皮质基底变性(CBD)、额颞叶痴呆(FTD)、脊髓小脑共济失调(SCA)障碍和脊髓性肌萎缩，或其他神经退行性疾病。
空多孔颗粒可用于以下方法：
鉴定用于诊断和/或治疗NDDs如ALS的生物标志物，包括以下步骤：
a)将如上定义的由扫描电镜测量的直径为0.1～1000μm的空多孔颗粒施用到脑脊液中；
b)经过一段时间(例如1～36h)后，从脑脊液中回收一部分所述多孔颗粒；
c)确定在所述多孔颗粒存在于脑脊液期间，生物分子已被负载于多孔颗粒中；
d)确定化合物是否可以用作生物标志物。
步骤b)中的时间可以是1～24h或1～72h。
如上所述，整个或至少一部分空颗粒可以负载有培养液。
给药(施用)是指在体内给药以及在体外将空颗粒加入到从哺乳动物回收的脑脊液中。
因此，步骤a)可以是将本文所定义的空多孔颗粒加入到体外从哺乳动物获取的脑脊液中。
所鉴定的生物标志物可用于诊断、预防、治疗和/或延缓NDDs(如ALS)，或选自阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、亨廷顿氏病(HD)、路易体痴呆(DLB)、进行性核上性麻痹(PSP)、多系统萎缩(MSA)、皮质基底变性(CBD)、额颞叶痴呆(FTD)、脊髓小脑性共济失调(SCA)障碍和脊髓性肌萎缩的NDDs。
实验
介孔二氧化硅颗粒的合成
将作为模板剂的Pluronic 123(三嵌段共聚物，EO20PO70EO20，Sigma-Aldrich)(4g)和作为溶胀剂的1,3,5-三甲基苯(TMB)(均三甲苯，Sigma-Aldrich)(3.3g)溶解在127ml蒸馏的H2O和20ml盐酸(HCl，37％，Sigma-Aldrich)中，同时在室温(RT)下搅拌3天。在加入9.14ml TEOS(正硅酸四乙酯，Sigma-Aldrich)之前，将溶液预热至40℃。混合物以500rpm的速度再搅拌10min，然后在40℃保持24h，然后在100℃的烘箱中再水热处理24h。最后，将混合物过滤、洗涤并在室温下干燥。煅烧产物以除去表面活性剂模板剂和溶胀剂。煅烧通过以1.5℃/min的加热速率加热至600℃并在600℃保持6h，然后冷却至环境条件来进行。所得产品是由纳米多孔二氧化硅颗粒组成的白色粉末。
肽模拟物的合成
使用固相Fmoc保护法合成分别衍生自睫状神经营养因子(148-DGGLFEKKLWGLKV-161；UniProtKB entry no.P26441)和胶质细胞系源性神经营养因子(153-ETMYDKILKNLSRSR-167；UniProtKB entry no.Q07731)的Cintrofin和Gliafin肽，通过高效液相色谱估计纯度至少为80％。所有的肽由Schafer-N AS(丹麦哥本哈根，http://www.schafer-n.com)合成，均为由四个单体偶联到赖氨酸骨架上组成的树枝状大分子。在生物素化肽的合成过程中，只有N端氨基酸是生物素标记的氨基酸。因此，每个四聚体树状大分子包含四个生物素残基。
负载肽模拟物Gliafin和Cintrofin。
肽模拟物通过浸渍于水中进行负载。将介孔二氧化硅颗粒(50mg)加入0.5ml浓度为8.87mg/ml的水溶液中，并在4℃下搅拌16h。将介孔二氧化硅颗粒(25mg)加入浓度为4.4mg/ml的0.4ml Cintrofin水溶液中，并在4℃搅拌16h。两种溶液中的水在大气条件下蒸发。肽的负载量通过热重分析(PerkinElmer)来确定。扫描从20℃到900℃以20℃/min的加热速率进行。插入式(plug-in)气氛是干燥空气(流速，20ml/min)。样品重量从5mg到10mg不等。Cintrofin和Gliafin的介孔(mesopore)负载效率分别为8.3％和11.8％。
颗粒溶液的制备
溶液是在实验开始的当天制备的。
介孔颗粒溶液的分散
通过将等体积的溶剂或注射溶液混合到介孔二氧化硅颗粒的干粉中，获得1μg/μl浓度的混合物。混合物被充分混合。将100μl最终溶液放入无菌注射管中。
模拟物溶液
1μg/μl各自浓缩的Gliafin、Cintrofin负载的介孔二氧化硅颗粒溶液按上述方法制备得到。将每个试管中的100μl溶液加入到无菌试管中，并加入900μl溶剂。所得混合物被充分混合。将100μl最终溶液放入无菌注射管中。每种模拟物的最终浓度为0.1μg/μl。
小鼠注射和存活率
在79天(约10周)时，B6/SJL背景下的(B6SJL-TgN-SOD1-G93A-1Gur)小鼠在手术开始时用3％异氟醚麻醉，所述异氟醚的浓度随时间逐渐降低直到0.8％，流速为500-480ml/min。在左侧颈脊髓上进行部分椎板切除术，并在脊髓节段左侧的腹侧角内进行双重或三重颈内注射C3-C4。三组均进行2μl颈内注射；空多孔二氧化硅颗粒(0.1μg/μl)，模拟组(Gliafin，Cintrofin负载的介孔二氧化硅颗粒，0.1μg/μl)，bNCSCs(边界帽神经嵴干细胞，约13,000细胞/μl)。将一个10μl的带有点式AS针的Hamilton注射器连接到微型注射泵控制器(Micro 4，WPI)上，设定的输注速度为4μl/min。
对于存活实验，注射了模拟物或边界帽神经嵴干细胞(bNCSCs)的SOD1G93A小鼠总是与注射空颗粒的同窝小鼠进行比较。疾病发作时间被回顾性地确定为小鼠达到体重峰值的时间。早期疾病是指去神经支配诱导的肌肉萎缩导致最大体重减少10％的时候。终末期是由瘫痪严重到动物侧卧时不能在20秒内恢复正常确定的，这是SOD1突变小鼠常用的终点，也符合内盖夫本·古里安大学动物管理和使用委员会(Animal Care and UseCommittee of Ben-Gurion University of the Negev)的要求。
握力测试采用阿美特克(Ametek)的查狄伦(Chatillon)测力装置进行，各组成员的测量包括两次测量(前肢牵拉和全肢牵拉)。从手术前两周开始，每周进行两次测量。
细胞死亡分析
将细胞与所示模拟物在合适的无血清生长培养基中于37℃孵育，收获，用PBS洗涤两次，通过碘化丙啶染色和流式细胞术分析细胞死亡情况。
神经突起与存活之间的神经突起生长交点的确定
采用神经突起长度的体视学评估以评估培养基中细胞的神经突起生长如前所述进行(
Figure BDA0003221529980000161
LC,Ralets I,Hartz BP,Bech M,Berezin A,Berezin V,
Figure BDA0003221529980000162
A,BockE.Asimple procedure for quantification of neurite outgrowth based onstereological principles.J Neurosci Methods.2000.07.31；100(1-2):25-32)。每个细胞的总神经突起长度是通过计算神经突起和无偏计数框的测试线的交叉点的数量来估计的，该无偏计数框叠加在通过常规计算机辅助显微镜获得的细胞培养物图像上。每个细胞的神经突起的绝对长度(L)随后通过描述神经突起交叉点的数量和所用测试线的垂直距离d的关系的方程L＝(πd/2)I从每个细胞的神经突起交叉点的数量(l)来估计。
使用ALS小鼠模型(突变SOD1转基因的小鼠杂合子)进行体内实验。此外，还测试了所选模拟物对神经突起生长、MN密度和存活率的影响。
用空纳米颗粒、模拟物或bNCSCs治疗延长了突变SOD1G93A小鼠的存活时间
研究了注射含模拟物的介孔二氧化硅颗粒或直接注射bNCSCs对SOD1突变小鼠的病程的影响。为了做到这一点，使用突变的SOD1转基因杂合的B6SJL-TgN-SOD 1-G93A-1Gur(SOD 1G93A)小鼠。这些小鼠发展为进行性运动神经元疾病，中位生存期为128.9±9.1天(Gurney等人，1994)。给79天大的小鼠注射含有模拟物(n＝10)的纳米颗粒或空纳米颗粒(n＝10)(图1)。通过确定体重减轻的开始(其反映了去神经支配诱导的肌肉萎缩)，对疾病发作和早期疾病进展进行简单而客观的测量。
令人惊讶的是，尽管通过注射负载模拟物的介孔二氧化硅颗粒延长了疾病末期的时间(140±5天)(图2)，但注射空纳米颗粒具有最强的存活效果(158±4天)(图1)，证明这些多孔颗粒改善了疾病的进程。
此外，还测试了边界帽神经嵴干细胞(bNCSCs)影响病程的能力。向SOD1G93A小鼠注射bNCSCs细胞延长了存活时间(142±3.5天)(图2)，延长程度与负载模拟物的纳米颗粒相似。
这种空多孔颗粒的强烈效果可以从握力的测量结果中清楚地观察到。与模拟组或bNCSC组相比，空多孔颗粒组在第137天表现出来自后肢(28.8g)(图3)和前肢(49.61g)(图4)的牵拉强度显著增强(p＝≤0.01，多重t检验)。总体而言，与其他组(模拟物或bNCSCs)相比，空多孔颗粒组在疾病发展的第133天(29g)、第137天(28.8g)和第151天(19.16)前肢表现出显著改善(p＝≤0.01，多重t检验)(图4)。这些结果表明，注射空颗粒的小鼠主要保持前肢的肌肉力量。这可以用支配运动神经元的前肢靠近注射部位来解释(C3-C4)。
介孔二氧化硅颗粒隔离包括被认为是NDDs印记的蛋白质的蛋白质/肽
通过在缓冲液(210mM甘露醇、70mM蔗糖、10mM Tris、pH 7.4和一种蛋白酶抑制剂)中均质化，离心(12,000g，10min)从四只12周龄小鼠、突变型SOD1-G93A-B6SJL-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J小鼠(4只小鼠)和WT blac6小鼠(4只小鼠)获得脊髓提取物。将来自SOD1*G93A和wt小鼠的无线粒体上清液(50μg蛋白质)与10μg MSPs颗粒(37℃，300rpm)一起孵育5h，然后离心(12,000g，10min)。将获得的上清液(未结合部分)进行免疫印迹。用10mM Tris、50mM氯化钠、pH 7.4洗涤获得的介孔二氧化硅颗粒小球，并将所得小球重悬于50升裂解缓冲液(100mM Tris-HCl、pH 8.0、5mM DTT 4％SDS和蛋白酶抑制剂混合物)中，在50℃下以300rpm钟孵育15min，离心(20min，12,000g)以获得结合部分。对未结合部分和结合的部分进行SDS-PAGE，并使用指示的抗体进行免疫印迹(图5)。
结果表明，多孔颗粒吸收蛋白质(如突变的SOD1和TDP-43)的能力强。我们预计这些颗粒会吸收其他蛋白质，尽管它们的实体尚未被确认。利用蛋白质组学和生物信息学分析，我们期望鉴定出被MSPs吸收的关键蛋白质，从而消除它们与ALS和其他NDDs的病理状况相关的毒性作用。这些蛋白质/因子可用作早期检测的生物标志物和/或作为新药靶点。
在细胞培养物中存在空颗粒(Ivert等人,Ivert P,Otterbeck A,Panchenko M,Hoeber J,Vasylovska S,Zhou C,Garcia Bennett A,Kozlova EN.The Effect ofMesoporous Silica Particles on Stem Cell Differentiation.J Stem Cell ResTher.2017；2(3):73-78.DOI:10.15406/jsrt.2017.02.00063)的情况下，神经元延伸(神经突起生长)的发展和重塑通过使用前述的体视学方法追踪神经突起及其分支来确定(Ronn等人,A simple procedure for quantification of neurite outgrowth based onstereological principles.J Neurosci Methods.2000.07.31；100(1-2):25-32.)。
本发明不限于所公开的实施例，而是可以在以下权利要求的范围内变化和修改。

Claims (19)

1.空多孔颗粒，所述空多孔颗粒具有0.1～1000μm的直径且用于预防和/或延缓哺乳动物中神经退行性疾病(NDDs)的退化。
2.根据权利要求1所述的空多孔颗粒，其中所述神经退行性疾病选自阿尔茨海默氏病(AD)、帕金森氏病(PD)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、亨廷顿氏病(HD)、路易体痴呆(DLB)、进行性核上性麻痹(PSP)、多系统萎缩(MSA)、皮质基底变性(CBD)、额颞叶痴呆(FTD)、脊髓小脑共济失调(SCA)病和脊髓性肌萎缩。
3.根据权利要求1所述的空多孔颗粒，其中所述神经退行性疾病是肌萎缩侧索硬化症。
4.根据权利要求1所述的空多孔颗粒，所述空多孔颗粒用于预防和/或延缓哺乳动物神经元和神经胶质的退化。
5.根据前述权利要求中任一项所述的空多孔颗粒，所述空多孔颗粒用于预防和/或延缓哺乳动物的神经退行性疾病，由此在用全部或至少一部分负载有营养因子的颗粒治疗哺乳动物之前、期间或之后施用所述空颗粒，所述营养因子选自胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和/或睫状神经营养因子(CNTF)和/或干细胞的肽模拟物。
6.根据前述权利要求中任一项所述的空多孔颗粒，所述空多孔颗粒用于预防和/或延缓哺乳动物的神经退行性疾病，由此在用全部或至少一部分负载有营养因子的颗粒治疗哺乳动物之前、期间或之后施用所述空颗粒，所述营养因子选自胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和/或睫状神经营养因子(CNTF)的肽模拟物。
7.根据前述权利要求中任一项所述的空多孔颗粒，其中所述空颗粒是介孔二氧化硅颗粒。
8.根据前述权利要求中任一项所述的空多孔颗粒，其中所述空颗粒是介孔二氧化硅颗粒，所述介孔二氧化硅颗粒具有1～100nm的孔径、0.1～3cm3/g的孔体积和40～1500m2/g的表面积。
9.根据前述权利要求中任一项所述的空多孔颗粒，其中所述空颗粒具有0.3～20nm的孔径、0.5～1.5cm3/g的孔体积和50～800m2/g的表面积。
10.根据前述权利要求中任一项所述的空多孔颗粒，其中所述空颗粒的直径为0.1～500μm，或为0.1～250μm，或为0.1～100μm，或为0.2～50μm，或为0.3～25μm，或为0.3～20μm，或为0.3～12μm，或为0.3～6μm。
11.根据前述权利要求中任一项所述的空多孔颗粒，其中所述空颗粒是生物素化的。
12.根据前述权利要求中任一项所述的空多孔颗粒，其中所述空颗粒通过注射施用在脑脊液、脑或脊髓实质中。
13.根据前述权利要求中任一项所述的空多孔颗粒，其中培养液负载于整个或至少一部分空颗粒中或颗粒表面上，并且所述培养液是具有适于通过注射给药的生理pH的缓冲溶液。
14.根据前述权利要求中任一项所述的空多孔颗粒，其中一种或多种模拟物负载于整个或至少一部分空颗粒中或颗粒表面上，而非固定地结合到颗粒表面，并且模拟物选自Gliafin和Cintrofin。
15.空多孔颗粒，所述空多孔颗粒具有0.1～1000μm的直径且用于诊断神经退行性疾病。
16.根据前述权利要求中任一项所述的空多孔颗粒，所述空多孔颗粒用于诊断和/或治疗神经退行性疾病(例如肌萎缩侧索硬化症)的生物标志物的鉴定方法，包括以下步骤：
a)将根据权利要求1～13中任一项所述的空多孔颗粒施用到脑脊液(CSF)中；
b)在一段时间(例如1～36h)后，从脑脊液中回收一部分所述多孔颗粒；
c)确定在所述多孔颗粒存在于脑脊液期间，生物分子已被负载于多孔颗粒中；
d)确定化合物是否可以用作生物标志物。
17.根据前述权利要求中任一项所述的空多孔颗粒，所述空多孔颗粒用于诊断和/或治疗神经退行性疾病(例如肌萎缩侧索硬化症)的生物标志物的鉴定方法，包括以下步骤：
a)将根据权利要求1～13中任一项所述的空多孔颗粒添加到从哺乳动物取出的脑脊液中；
b)在一段时间(例如1～36h)后，从脑脊液中回收一部分所述多孔颗粒；
c)确定在所述多孔颗粒存在于脑脊液期间，生物分子已被负载于多孔颗粒中；
d)确定化合物是否可以用作生物标志物。
18.根据权利要求16或17所述的方法制备得到的生物标志物。
19.一种药物组合物，其包含多个根据权利要求1～14中任一项所述的空多孔颗粒以及溶剂和任选的药学上可接受的添加剂，其中所述组合物通过注射施用在脑脊液、脑或脊髓实质中，每月至少一次。
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