CN107530312A - 用于治疗或预防神经退行性疾病的枪刀药素氧化物、其衍生物、相关化合物和激动剂 - Google Patents
用于治疗或预防神经退行性疾病的枪刀药素氧化物、其衍生物、相关化合物和激动剂 Download PDFInfo
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Abstract
本发明描述了枪刀药素氧化物(hypoestoxide)、其衍生物和相关化合物用于治疗和预防神经退行性疾病(例如,帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病)的新用途。更具体地,本发明涉及用于通过向患有神经退行性疾病的受试者施用枪刀药素氧化物、其衍生物和相关化合物或它们的组合来治疗各种神经退行性疾病,使得所述疾病的症状得到治疗或至少部分缓解的方法。此外,本发明进一步提供预防在倾向于随时间发展出神经退行性疾病的个体中发展神经退行性疾病的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年3月9日提交的美国临时专利申请号62/177,187的权益,后者通过引用整体并入本文。
发明领域
本发明总体上涉及枪刀药素氧化物(hypoestoxide)、其衍生物和与其相关的化合物。更具体地,本发明涉及使用枪刀药素氧化物、其衍生物、相关化合物或它们的组合来抑制患有神经退行性疾病的动物或人类受试者的大脑中α-突触核蛋白积聚的组合物和方法。
发明背景
α-突触核蛋白是诸如帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)、路易体痴呆、亨廷顿病、多发性硬化(MS)和多系统性萎缩等许多神经退行性疾病的主要病理学特征。对此,已证明人α-突触核蛋白转基因动物模型表现出PD样病理学改变和/或神经学改变,包括但不限于运动能力和协调性受损、自发性活动减少、精细运动技能改变以及感觉运动缺陷。
在许多神经退行性疾病如PD的治疗中,一个重要的挑战是,尽管血脑屏障对药物的通透性较差,但仍需通过血脑屏障向大脑递送治疗药物。已经为向大脑递送治疗药物作出了许多努力,包括局部侵入性递送、局部暴露于高强度聚焦超声和增强通透性。然而,这些现有的药物干预一直受到药物无效、耐药性、毒性和不良副作用的困扰。
在一些情况下,更具侵入性的治疗和手术治疗被用于治疗PD,包括丘脑切开术、苍白球化学破坏术和神经刺激。这些方法通常需要更长的恢复时间和密集的后续治疗。在一些情况下,更具侵入性的治疗可能导致未来发生并发症。由于这些先前方法的局限性,神经退行性疾病的治疗和预防受到限制。
除α-突触核蛋白沉积物外,神经炎症是PD的另一病理特征。参见Wake H等人,Trends Neurosci,36:209-17,2013。神经炎症由脑部常驻型免疫细胞——小胶质细胞引起。小胶质细胞可被各种类型的刺激物激活,从而导致神经炎症,包括全身炎症、脑损伤和缺血。最近的研究也表明细胞外α-突触核蛋白也可诱导小胶质细胞的激活。暴露于各种形式的重组α-突触核蛋白均可诱导小胶质细胞的激活。另外,α-突触核蛋白的神经元释放的寡聚形式经由与小胶质细胞表面上的TLR2和β1-整联蛋白相互作用来诱导小胶质细胞激活。
对此,已经在PD患者的大脑中发现了反应性小胶质细胞的积累,并且已经在PD患者的CSF和血浆中检测到炎性细胞因子如TNFα和IL6的水平升高。参见Hunot S等人,AnnNeurol 53 Suppl.3:S49-58,S58-60,2003。虽然有证据表明炎症在神经退行性疾病如PD和AD中发挥作用,但数据往往是相互矛盾的。
炎症是非常复杂的过程,具有许多分子和细胞水平上的组分和机制。参见Wyss-Coray和Mucke,Neuron,35(3):419-32,2002。虽然许多炎症反应是有害的,但一些特定的反应可能是有益的并且针对神经变性是保护性的。仍不确定将炎症抑制至何种程度可减轻神经退行性疾病,并且简单地抑制炎症并不一定提供治疗效果。例如,“在用包括皮质类固醇、双氯芬酸/米索前列醇、COX-2抑制剂和羟氯喹在内的多种强烈抑制炎症的化合物进行的治疗试验中,没有观察到对AD进展的显著效果。”见上。
在PD的情况下,使用非甾体抗炎药(NSAID)如阿司匹林可抑制神经变性过程,而用一些NSAID治疗则可能加剧该过程。NSAID是在穿过血脑屏障方面具有不同效力的异质性化学类别,这也许解释了研究之间的差异和有时相互矛盾的结果。为了预防疾病发作,NSAID的使用与男性中PD发病率的20%降低有关,但也与女性中PD发病率的20%增加有关。参见Esposito等人,Experimental Neurology,205:295-312,2007。因此,正如这篇综述文章的结论部分所述,“需要进一步阐明炎症在基底神经节病症的病理生理学中的作用,因为整体情况仍然令人困惑。使情况复杂化的是,炎症是一把‘双刃剑’,其可能作为有益的防御机制开始,但在某些时刻演变成有害且不可控的慢性反应。因此,理想的方法将会是抑制与神经炎症相关的有害影响,同时保留导致神经保护的炎症途径。”见上。
发明内容
以下公开了说明书的简要概述,以便提供对说明书的一些方面的基本理解。本概述并不是对说明书的全面综述。其并非旨在确定说明书的关键或重要要素,也并非旨在描述说明书的范围。其唯一目的在于以简化的形式公开说明书的一些概念,以作为后续公开的更详细描述的序言。
本发明旨在通过提出消除对手术干预的需要的药物来克服用于治疗各种神经退行性疾病的现有治疗和药物的缺点。本发明提供了对穿透血脑屏障的新型化合物的描述,以及用纯净形式或包含在天然植物来源中的枪刀药素氧化物(HE)、其衍生物和相关化合物治疗罹患PD或其他神经退行性疾病的宿主如人,从而改善这类病理状况的方法。特别值得注意的是,与用于治疗PD或其他神经退行性疾病的其他可用药物相比,枪刀药素氧化物具有非常低的毒性。参考化合物枪刀药素氧化物包括式(I):
此外,与枪刀药素氧化物有关的天然植物产物包括下式:
12-羟基二氢枪刀药素氧化物(12-hydroxydihydropoestoxide)
10-去乙酰氧基-12-羟基二氢枪刀药素氧化物
10-去乙酰氧基枪刀药素氧化物
12,18-二氢枪刀药素氧化物
可将有效量的式I至V中的一种或混合物施用于患病宿主,用于治疗和/或改善神经退行性疾病的至少一种症状。本发明的化合物还可与其他用于治疗和预防PD和其他神经退行性疾病的治疗剂联合使用。本发明进一步提供了预防和治疗方法,用于预防在具有指示随时间发展出PD或其他神经退行性疾病的可能性的阳性生物标志物的个体中发展PD。这样,本发明还旨在充当对存在风险的大群体的非常重要的预防性治疗。
本发明另外的目的和优点将在以下描述中部分阐述,或者可从本发明的实践或使用中习得。这些目的和优点可通过所附权利要求中详细记载的手段和组合而实现和获得。应当理解,以上的一般性说明和以下的详细说明仅仅是示例性和解释性的,并不应被视为对所请求保护的本发明的限制。
附图说明
本发明的某些方面可参考以下附图来理解:
图1A至图1F示出了对α-syn-tg小鼠的新皮质中大脑免疫细胞数目的分析。
图2A至图2E示出了用载体或HE治疗的非-tg小鼠和α-syn-tg小鼠的神经变性分析和行为测试的结果。
图3A至图3E示出了在HE施用后,α-syn-tg小鼠中的神经元和神经毡中α-突触核蛋白水平的降低。
图3F和图3G示出了生化分析的结果,证实了在小鼠PD模型中,枪刀药素氧化物的施用使α-突触核蛋白的积累减少。
具体实施方式
本发明涉及枪刀药素氧化物、其衍生物及其相关化合物和用于治疗和/或预防神经退行性疾病如PD的方法。对本领域技术人员显而易见的各种修改被认为在本发明的精神和范围之内。
定义
术语“示例性”在本文中用来指用作示例、实例或说明。本文中被描述为“示例性”的任何方面或设计不一定被解释为比其他方面更优选或有利。相反,“示例性”一词的使用旨在以具体的方式公开概念。如本申请中所用的,术语“或”旨在表示包容性的“或”,而不是排他性的“或”。此外,除非另有说明或上下文明确指向单数形式,否则本申请和所附权利要求中使用的冠词“一个”和“一”通常应被解释为指“一个或多个”或“至少一个”,因此包括单个组分以及混合物/组合。
如本文所用的术语“管理”包括预防已罹患特定疾病或病症的患者中该疾病或病症的复发,和/或延长已罹患该疾病或病症的患者保持缓解的时间。该术语包括调节疾病或病症的阈值、发展和/或持续时间,或改变患者对该疾病或病症的反应方式。
术语“预防”涉及在患者开始罹患特定疾病或病症之前采取的措施,该措施抑制或降低疾病或病症的严重程度。换句话说,该术语包括如本文所用的预防性。
如本文所用的术语化合物的“治疗有效量”是足以在疾病或病况的治疗或管理中提供治疗益处的量,或是足以延迟或最小化与疾病或病况相关的一种或多种症状的量。化合物的治疗有效量是指单独或与其他疗法组合时治疗剂的量,其在疾病或病况的治疗或管理中提供治疗益处。术语“治疗有效量”可包括改善总体疗法、减少或避免疾病或病况的症状或原因,或增强另一治疗剂的治疗功效的量。
如本文所用的术语“治疗”涉及在患者罹患特定疾病或病症时采取的措施,该措施降低该疾病或病症的严重程度,或延缓或减缓该疾病或病症的进展。
最后,如本文所用的术语“包括”具有与“包括但不限于”相同的含义。类似地,术语“诸如”具有与“诸如但不限于”相同的含义。
化合物
在优选的实施方案中,本发明提供了一种新型药物组合物,该组合物包含枪刀药素氧化物,包括来源于天然或合成来源的枪刀药素氧化物的混合物或衍生物。枪刀药素氧化物包括以下式I:
枪刀药素氧化物是从红斑枪刀药(Hypoestes rosea)(爵床科)分离的天然二萜。研究表明,枪刀药素氧化物可通过IκB激酶抑制来调节NF-κB的活性。因此,先前已经建议将枪刀药素氧化物作为潜在的抗炎和抗癌药物。枪刀药素氧化物的极性表面积为68.4平方埃,被认为对穿透血脑屏障以输送治疗药物非常好。因此,已使用小鼠模型检查了枪刀药素氧化物作为PD的抗神经炎症药物的效力。对此,枪刀药素氧化物的施用经由NF-κB活性的调节来改善PD小鼠模型中的神经炎症、神经变性和行为缺陷。
本发明的其他实施方案包括以下式II-V的化合物:
描述了式II至式V,并已通过诸如紫外分光光度法、质谱法、核磁共振波谱法等本领域已知的标准化学方法对其进行了表征。式II至式IV从灌木红斑枪刀药的提取物中分离,而式V则通过使用钯催化剂的催化氢化而从纯的枪刀药素氧化物制备。该反应如下式所示:
使用方法
本发明的实施方案提供了用于治疗和/或预防宿主(例如,动物或人)的神经退行性疾病的组合物(即,式I至式V)。本发明的另一实施方案提供了预防和/或治疗宿主的神经退行性疾病的方法。该方法包括施用有效量的具有选自式I至V的通式的药剂和其混合物,使得至少一种与神经退行性疾病相关或关联的病况或症状得到治疗或至少部分缓解。优选地,只要怀疑或观察到症状,就应继续治疗。在一个实施方案中,本方法预防和/或治疗PD。还预期枪刀药素氧化物、其一种或多种衍生物、相关天然植物产物或它们的组合也可用于治疗或预防其他神经退行性疾病,诸如但不限于AD、路易体痴呆、亨廷顿病、MS和多系统性萎缩等。
另一实施方案包括降低患者新皮质中的小胶质细胞数目和星形胶质增生水平的方法,其包括向患者施用有效量的本发明化合物。
另一实施方案包括减少患者中促炎细胞因子产生的方法,其包括向患者施用有效量的本发明化合物。
另一实施方案包括减少患者中TH-阳性纹状体纤维损失的方法,其包括向患者施用有效量的本发明化合物。
另一实施方案包括降低患者神经元和神经毡中α-突触核蛋白水平的方法,其包括向患者施用有效量的本发明化合物。
另一实施方案包括降低患者中SDS-不溶性α-突触核蛋白水平的方法,其包括向患者施用有效量的本发明化合物。
另一实施方案包括降低患者中磷酸化NF-κB水平的方法,其包括向患者施用有效量的本发明化合物。
化合物的量、施用途径和给药方案将取决于各种因素,诸如待治疗、待预防或待管理的具体指征、疾病类型、疾病进展、使用的其他疗法,以及患者的年龄、性别和状况。这类因素所起的作用是本领域公知的,并且可通过常规实验来调节。在具体实施方案中,以约0.1、0.5、1.0、3.0、5.0、10.0、15.0至约200mg/kg/天的枪刀药素氧化物、枪刀药素氧化物衍生物、相关化合物,或其组合将本发明的化合物施用于人类患者,约0.1mg至200mg/kg/天的量。
药物制剂
包含一种或多种用于治疗和/或预防PD的本发明化合物的本发明药物组合物可以以适用于口服、粘膜(例如,鼻、舌下、阴道、颊部或直肠)、肠胃外(例如,皮下、静脉内、推注、肌内或动脉内)或经皮施用的任意和所有形式的剂型提供给患者。因此,本发明的药物组合物或药理学组合物可被制备为作为液体溶液或悬浮液的注射剂;或适用于在注射之前溶解或悬浮于液体中的固体形式。
剂型的其他实例包括但不限于片剂、细颗粒剂、晶片、胶囊(包括时间释放胶囊)、扁囊剂、糖锭、锭剂、分散剂、栓剂、软膏、泥敷剂、糊剂、粉剂、敷料剂、乳膏、硬膏剂、溶液、贴剂、气雾剂、凝胶、酏剂、糖浆等。优选的形式是片剂,包括咀嚼片。剂量单位形式通常含有从约0.1、0.5、1.0、3.0、5.0、10.0、15.0至约200mg/kg/天的枪刀药素氧化物、枪刀药素氧化物衍生物、相关化合物,或约0.1mg至200mg/kg/天的其组合。
在这方面,所述制剂应适合施用模式。例如,口服施用需要肠溶衣以保护本发明化合物免于在胃肠道内降解。类似地,制剂可含有促进活性成分向作用部位递送的成分。例如,化合物可在脂质体制剂中施用,以便保护它们免受降解性酶的侵害、促进循环系统中的运输,并跨细胞膜递送至细胞内的部位。
此外,用于治疗和/或预防PD的本发明的药物组合物可使用赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂和/或其他制剂添加剂来制备。该组合物可以以持续释放剂型提供。可通过用含油物质包覆片剂、颗粒剂、细颗粒剂和/或胶囊来制备该剂型。含油物质的非限制性实例包括甘油三酯、聚甘油脂肪酸酯和羟丙基纤维素。
预防性剂量或治疗性剂量的精确量值将随着疾病的类型、疾病的进展、使用的其他疗法和施用途径等因素而变化。例如,在疾病已经进展至晚期并且更具侵袭性的情况下,可能需要更大剂量的化合物。另外,该剂型可随食物或不随食物每天施用一次或两次。如果该剂型施用的频率较低,则可施用较高的剂量。
优选地,剂量在疗法开始时应该较低,并根据患者的反应递增。此外,婴儿、儿童和老年患者以及肾功能或肝功能受损或具有其他损伤的患者最初应接受较低的剂量,并且根据总体反应和血液水平滴定该剂量。在一些情况下可能需要使用这些范围之外的剂量。此外,值得注意的是,临床医生或治疗医师结合个体患者反应将知道如何以及何时中断、调整或终止治疗。例如,当病况或症状得到改善时,可减少治疗剂量。
实施例
本发明的方面可通过以下实施例加以理解,这些实施例并不限制本发明的范围。
动物治疗和行为分析
向五个月龄的雌性非tg小鼠和α-syn-tg小鼠每日腹膜内(IP)注射载体(40%captisol)或5mg/kg的枪刀药素氧化物,持续四周。将右半脑在4℃下于磷酸盐缓冲的4%PFA中后固定以用于神经病理学分析,而将左半脑快速冷冻并储存在-70℃以用于随后的蛋白质和mRNA分析。
治疗之后,使用开放场地和圆束测试来评估小鼠的步态和协调性。总体活动力以十分钟内的总光束中断来计算。通过圆束分析来评估步态和平衡的损伤。在一天中进行各一分钟的三次连续试验。记录脚滑的次数和移动距离。光束上的总错误以脚滑/移动距离来计算。免疫组织化学和免疫荧光以及神经病理学分析
将盲编码的矢状脑切片与第一抗体在4℃下一起温育过夜。第二天,将切片与生物素化的第二抗体或FITC缀合的第二抗体一起温育,并分别用D-HRP HRP(ABC elite,VectorLaboratories,Burlingame,CA)中的亲和素(avid)和直接酪胺信号放大(Tyramide SignalAmplification Direct)系统(PerkinElmer,Waltham,MA)检测。
为了确定神经炎症、神经变性、α-突触核蛋白的积累和NF-κB激活,将脑切片分别用Iba-1、GFAP、TNFα、IL-1β、IL6、人α-突触核蛋白、NF-κB和磷酸化-NF-κB抗体染色。通过Olympus BX41显微镜对切片进行成像。除了Iba-1的免疫反应性以外,所有免疫反应性水平都通过采用Image Quant 1.43程序(NIH)的光密度分析来确定。采用Image Quant 1.43程序(NIH),基于细胞体识别,测定了每个动物每个区域(230μm×184μm)的Iba-1阳性细胞的细胞数。
组织提取物的制备和Western印迹分析
在裂解缓冲液中制备脑匀浆以分离SDS-可溶性级分和SDS-不溶性级分。使用Versadoc XL成像装置和Quantity One(Bio-rad,Hercules,CA)进行化学发光检测和分析。
定量聚合酶链反应(qPCR)
用RNeasy Lipid mini试剂盒(Qiagen,Germantown,MD)从小鼠额皮质提取总mRNA,并分别使用SuperScript VILO cDNA合成试剂盒(Life Technologies)将其逆转录。采用从Life Technologies获得的基因特异性引物,如TNFα(Mm00443258_m1)、IL6(Mm00446190_m1)、IL-1β(Mm00434228_m1)和β-肌动蛋白(Mm00607939_s1),使用Fast Advanced Master Mix(Life Technologies)按照制造商的说明书进行定量实时PCR。通过StepOnePlus实时PCR系统(Applied Biosystems,Carlsbad,CA)测量DNA产物的扩增。根据2-exp(△△Ct)法计算相对mRNA水平。将所有△CT值相对于β-肌动蛋白进行归一化。
测量对小鼠PD模型中神经炎症的影响
图1A-1F示出了脑免疫细胞数目的分析。在α-syn-tg小鼠的新皮质中,Iba-1-阳性小胶质细胞和GFAP阳性星形胶质细胞显著增加。图1A-1B和1D-1E还显示,HE的施用使α-syn-tg小鼠的新皮质中的小胶质细胞数目和星形胶质增生水平显著降低至与非tg小鼠中相似的水平。
除了α-syn-tg小鼠中的免疫细胞总数减少之外,图1A、1C、1D和1F还显示出每个神经胶质细胞的分支数目减少。通过双因素方差分析(two-way ANOVA)确认了HE治疗对Iba-1光密度(F相互作用(1,16)=80.48,p<0.0001)、小胶质细胞分支数目(F相互作用(1,16)=83.25,p<0.0001)、GFAP光密度(F相互作用(1,16)=15.88,p=0.0011)和星形胶质细胞分支数目(F相互作用(1,16)=4.04,p=0.0616)的正交互效应。
使用免疫组织化学分析和基因表达分析来分析促炎细胞因子的水平。与非tg小鼠相比,在α-syn-tg小鼠中,TNFα、IL-1β和IL6的水平升高。相反,HE的治疗显著降低了α-syn-tg小鼠新皮质中这些促炎细胞因子的水平。通过双因素方差分析确认了HE治疗对TNFα(F相互作用(1,16)=12.34,p=0.0029)、IL-1β(F相互作用(1,16)=11.58,p=0.0036)和IL6(F相互作用(1,16)=31.06,p<0.0001)的水平的正交互效应。此外,定量基因表达分析显示,在α-syn-tg小鼠的新皮质中,HE施用明显降低了TNFα、IL-1β和IL6的mRNA水平。通过双因素方差分析确认了HE治疗对TNFα(F相互作用(1,16)=15.78,p=0.0019)、IL-1β(F相互作用(1,16)=11.65,p=0.0051)和IL6(F相互作用(1,16)=6.40,p<0.0264)的mRNA水平的正交互效应。总之,这些结果表明,HE的施用抑制了小胶质细胞和星形胶质细胞的激活,从而减少了小鼠PD模型中促炎细胞因子的产生。
在小鼠PD模型中施用HE对神经变性与行为缺陷的改善
使用经载体或HE治疗的非-tg和α-syn-tg小鼠进行神经变性分析和行为测试。图2A-2C显示,人α-突触核蛋白的神经元过表达导致α-syn-tg小鼠中TH-阳性纹状体纤维的损失,而α-突触核蛋白表达没有改变黑质TH-阳性细胞的数目。然而,图2A-2B显示,HE的施用使α-syn-tg小鼠中TH-阳性纹状体纤维的损失显著减少。通过双因素方差分析确认了HE治疗对TH阳性纹状体纤维水平的正交互效应(F相互作用(1,16)=5.12,p=0.038)。
现在参见图2D-2E,其示出了为研究HE对α-syn-tg小鼠的焦虑样行为和运动行为缺陷的影响而进行的开放场地和圆束测试的结果。与非tg对照小鼠相比,α-syn-tg小鼠显示出光束中断数目和总圆束错误的显著增加。用HE对α-syn-tg小鼠的治疗将这些错误降低至在非tg小鼠中观察到的水平。通过双因素方差分析确认了HE治疗对光束中断数目(F相互作用(1,16)=15.61,p=0.0011)和总圆光束错误(F相互作用(1,16)=8.58,p=0.0098)的正交互效应。总之,这些结果表明,HE的施用可预防小鼠PD模型中的神经变性并改善行为缺陷。
测量对小鼠PD模型中α-突触核蛋白积累的影响
为了确定在α-syn-tg小鼠中观察到的行为改善是否与α-突触核蛋白病理学的变化有关,用来自经载体或HE治疗的非tg和α-syn-tg小鼠的脑切片针对α-突触核蛋白进行免疫组织化学分析。免疫组织化学分析显示出α-syn-tg小鼠的神经元和神经毡中α-突触核蛋白的过表达,如图3A-3E所示。HE的施用使α-syn-tg小鼠神经元和神经毡中的α-突触核蛋白水平显著降低。通过双因素方差分析确认了HE治疗对α-突触核蛋白(额皮质,F相互作用(1,16)=30.74,p<0.0001;海马体,F相互作用(1,16)=13.66,p=0.0020;纹状体,F相互作用(1,16)=7.19,p=0.0164)的光密度的正交互效应。
用人α-突触核蛋白特异性抗体进行了免疫荧光分析以确认该分析。对此,针对人α-突触核蛋白(Syn211抗体)或人α-突触核蛋白的C-末端(Syn105抗体)将小鼠大脑切片进行免疫染色。
对用载体或枪刀药素氧化物治疗的非tg和α-syn-tg小鼠额皮质中的人α-突触核蛋白进行了免疫荧光分析。(每组n=5;非配对t检验;*p<0.05)。误差线代表±SEM。此外,在大脑额皮质中分析了针对人α-突触核蛋白的荧光强度。在非tg小鼠的额皮质中未检测到针对人α-突触核蛋白的免疫反应性,但却在α-syn-tg小鼠的额皮质中检测到很多。与免疫组织化学分析的结果类似,在α-syn-tg小鼠的额皮质中,HE施用使得人α-突触核蛋白免疫反应性的水平显著降低。
最近的证据表明,α-突触核蛋白的C-末端片段特别具有神经毒性。为了确定HE施用是否影响这些C-末端片段的积累,采用特异性识别人α-突触核蛋白C-末端的抗体。对此,对非tg和α-syn-tg小鼠额皮质中的人α-突触核蛋白的C-末端进行了免疫组织化学分析。另外,对额皮质中α-突触核蛋白的C-末端进行了光密度分析。(每组n=5;非配对t检验;**p<0.01)。误差线代表±SEM。比例尺=250μm(低放大倍数)和25μm(高放大倍数)。在α-syn-tg小鼠的额皮质中,HE施用还使针对人α-突触核蛋白C-末端的免疫反应性显著降低。
图4F-4G示出了生化分析的结果。将脑匀浆分离成SDS-可溶性级分和SDS-不溶性级分,并通过免疫印迹分析法进行分析。来自α-syn tg小鼠的SDS可溶性级分中的α-突触核蛋白水平不受HE施用的影响。然而,在来自施用HE的α-syn-tg小鼠的脑匀浆中,SDS-不溶性α-突触核蛋白的水平显著降低。通过双因素方差分析确认了HE治疗对SDS-不溶性α-突触核蛋白水平的正交互效应(F相互作用(1,16)=8.68,p=0.0095)。总之,这些结果表明,HE的施用使小鼠PD模型中α-突触核蛋白的积累减少。
小鼠PD模型中NF-κB活性的抑制
先前的工作表明,HE通过抑制免疫细胞中的IκB激酶来调节NF-κB的活性,该NF-κB是关键的免疫应答信号传导介质。因此,对接受载体或HE的非tg和α-syn-tg小鼠的新皮质中NF-κB活性的改变进行了研究。免疫荧光分析显示,NF-κB总水平并未被非tg和α-syn-tg小鼠新皮质中的HE施用而改变。然而,在α-syn-tg小鼠的新皮质中,针对NF-κB的活化形式——磷酸化NF-κB的免疫反应性水平大幅提高(4倍)。此外,α-syn-tg小鼠新皮质中施用HE使升高的磷酸化NF-κB水平显著降低至在非tg小鼠中观察到的水平。通过双因素方差分析确认了HE治疗对磷酸化NF-κB免疫反应性的正交互效应(F相互作用(1,16)=27.70,p<0.0001)。
使用来自非tg和α-syn-tg小鼠的皮质的脑匀浆进行生物化学分析。通过离心将脑匀浆分离成胞质级分和细胞核级分,并通过Western印迹分析来分析每个级分。在非tg和α-syn-tg小鼠中,NF-κB总水平未被HE施用改变。然而,磷酸化NF-κB的水平仅在来自α-syn-tg小鼠脑匀浆的细胞核级分中显著提高。与通过免疫荧光观察到的结果类似,在α-syn-tg小鼠中施用HE使磷酸化NF-κB的水平显著降低。通过双因素方差分析确认了HE治疗对磷酸化NF-κB水平的正交互效应(F相互作用(1,16)=11.55,p=0.0037)。总之,这些结果表明,在小鼠PD模型中,HE施用通过调节NF-κB活性来减少神经炎症。
HE施用预防小鼠PD模型中的神经变性。在α-syn-tg小鼠中施用HE使TH-阳性神经元的损失显著降低。在α-syn-tg小鼠中施用HE也使行为缺陷得到改善。此外,HE抑制NF-κB的活性,这导致α-syn-tg小鼠中神经炎症减少。
α-突触核蛋白聚集体的神经元内积累是PD的典型病理学特征。研究表明,这些沉积物不仅是病理性的,而且还在PD发病和发展中起关键作用。最近的研究表明,α-突触核蛋白的神经元积累可受到多种神经元内和神经元外因素的影响,包括遗传缺陷、蛋白质质量控制系统的功能障碍、二级结构改变和暴露于环境毒物。此外,已提出神经炎症是神经元中α-突触核蛋白聚集体的促进因子。HE的施用减少了PD模型中α-突触核蛋白的神经元积累。由于α-突触核蛋白mRNA的水平不受HE施用的影响,因此神经元内自噬过程的激活可能受神经炎症调节。
小胶质细胞介导的神经炎症影响α-突触核蛋白聚集体的神经元积累的机制尚不清楚。然而,最近的研究已经显示,一些促炎细胞因子抑制自噬,自噬是α-突触核蛋白消除的有效细胞内过程。例如,IL-10抑制鼠巨噬细胞中饥饿诱导的、雷帕霉素诱导的和脂多糖诱导的自噬。此外,IL-4和IL-13都抑制人和鼠巨噬细胞中饥饿诱导的和IFN-γ诱导的自噬体形成。这些观察结果表明,来自活化的小胶质细胞的细胞因子可抑制大脑中邻近神经元的自噬过程,从而导致神经元α-突触核蛋白积累。将先前的结果与本发明一起考虑,HE的施用通过减少PD模型中的神经炎症来减少α-突触核蛋白的神经元累积,从而导致α-突触核蛋白的自噬降解增加。
因此认为,已在被认为是最实用和最优选的实施方案中示出和描述了本发明。然而,应认识到,在本发明的范围内可以有偏差,并且本领域技术人员将会想到明显的修改。对于以上的描述,应认识到,本发明各个部件的最佳尺寸关系,包括大小、材料、形状、形式、功能以及操作、组装和使用方式的变化,对本领域技术人员而言是显而易见的,并且本发明旨在涵盖图中所示和说明书中所描述的那些的所有等效关系。
因此,应将上文视为仅是对本发明原理的说明。此外,由于本领域技术人员容易想到许多修改和变化,因此并未意在将本发明限于所示出和描述的确切结构和操作,并因此可采用落入本发明范围内的所有合适的修改和等效变换。
Claims (16)
1.一种用于治疗宿主的神经退行性疾病的组合物,其包含有效量的具有选自下组的通式的化合物:
以及
它们的混合物,其中所述有效量足以改善所述神经退行性疾病的至少一种症状。
2.根据权利要求1所述的组合物,其中所述神经退行性疾病为帕金森病。
3.根据权利要求1所述的组合物,其中所述化合物存在于选自片剂、细颗粒剂、胶囊、扁囊剂、糖锭、锭剂、分散剂、栓剂、软膏、泥敷剂、糊剂、粉剂、敷料剂、乳膏、硬膏剂、溶液、贴剂、气雾剂、凝胶、酏剂、糖浆、混悬剂、晶片和注射剂的剂型中。
4.根据权利要求1所述的组合物,其中所述化合物有效减少α-突触核蛋白的神经元积累。
5.一种用于治疗和预防宿主的神经退行性疾病的方法,其包括以步骤:
向所述宿主施用有效量的具有选自下组的通式的化合物:
以及
它们的混合物,其中所述有效量足以改善所述神经退行性疾病的至少一种症状。
6.根据权利要求5所述的方法,其中所述神经退行性疾病为帕金森病。
7.根据权利要求5所述的方法,其中所述化合物存在于选自片剂、细颗粒剂、胶囊、扁囊剂、糖锭、锭剂、分散剂、栓剂、软膏、泥敷剂、糊剂、粉剂、敷料剂、乳膏、硬膏剂、溶液、贴剂、气雾剂、凝胶、酏剂、糖浆、混悬剂、晶片和注射剂的剂型中。
8.根据权利要求5所述的方法,其中所述化合物有效减少α-突触核蛋白的神经元积累。
9.根据权利要求5所述的方法,其进一步包括以下步骤:监测所述宿主的所述神经退行性疾病的所述至少一种症状的减少。
10.根据权利要求5所述的方法,其中所述化合物以约0.1mg/kg/天至约200mg/kg/天的剂量施用。
11.一种调节神经退行性疾病模型中的NF-κB活性的方法,其包括以下步骤:
向所述宿主施用有效量的具有选自下组的通式的化合物:
以及
它们的混合物,其中所述有效量足以改善所述神经退行性疾病的至少一种症状。
12.根据权利要求11所述的方法,其中所述神经退行性疾病为帕金森病。
13.根据权利要求11所述的方法,其中所述化合物存在于选自片剂、细颗粒剂、胶囊、扁囊剂、糖锭、锭剂、分散剂、栓剂、软膏、泥敷剂、糊剂、粉剂、敷料剂、乳膏、硬膏剂、溶液、贴剂、气雾剂、凝胶、酏剂、糖浆、混悬剂、晶片和注射剂的剂型中。
14.根据权利要求11所述的方法,其中所述化合物有效减少α-突触核蛋白的神经元积累。
15.根据权利要求11所述的方法,其进一步包括以步骤:监测所述宿主的所述神经退行性疾病的所述至少一种症状的减少。
16.根据权利要求11所述的方法,其中所述化合物以约0.1mg/kg/天至约200mg/kg/天的剂量施用。
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