CN103260743A - β-淀粉样肽的聚合物补体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及β-淀粉样肽（Αβ）聚合物补体的制备和用途，其用于在液体样品中检测可溶或聚合的Αβ，或用于治疗具有神经退行性疾病的主体。
Description
技术领域
本申请涉及β-淀粉样肽(Aβ)的聚合物补体的制备以及用途，其用于检测液体样品中的可溶或者聚合Aβ，或用于治疗具有神经退行性疾病的患者。
背景技术
阿耳茨海默氏病(AD)是最普遍的人类晚年痴呆原因，并在发达国家中导致死亡的排名第四的疾病。据认为淀粉样斑块的脑沉积对疾病起了主要作用。因此，在显微镜下，AD的特征为显著的神经元和他们的突触退化，以及在大脑新皮层和海马体内存在大量的衰老斑和神经肌原纤维缠结。斑是由淀粉样蛋白沉积组成，主要包含39-42残基肽，称为：β-淀粉(Aβ)(图1)的聚合。所述肽从跨膜蛋白淀粉样前体蛋白(APP)的蛋白水解断裂而来，包括两种酶，β-分泌酶(在Aβ的N-端)和g-分泌酶(在Aβ的C-端)。
所得的肽展示了异构终端，在疏水的C-端处不一样(图2)。更大，更疏水的肽类(42-43残基)更有效力聚集，并使得斑块形成和神经元死亡。使用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法，有报道指出健康或非痴呆个体的脑脊髓液的两个Aβ42平均值，该两个平均值相差2.5-3的因子(～1650和～650pg/mL)。所有的研究报道指出AD患者的Aβ42水平为对照组的大约一半，尽管通过检测可溶的Aβ42/Aβ40发现具有更好的相关性(K.Blennow，J.Int.Med.，2004，256，224)。除了中枢神经系统(CNS)，在众多周围组织中发现了淀粉样肽。血浆中的Aβ42浓度要比在CSF中的Aβ42浓度要低约十倍。最近报告指出血浆中的Aβ水平和脑部，以及在斑块中的Aβ水平之间的相关性。
使用明显的治疗方法来防止，减少或逆转这些斑块的形成。因此，大多数的药物研制效果都集中在Aβ上，来抑制造成斑块形成(β-和-γ分泌酶)的酶，来隔绝肽的可溶性部分，或打断存在的聚合物。尽管通过第一和第二方法研制的候选药物处于后期临床试验，目前所采取的所有这些方法碰到预料不到的问题，并出现了单一种药可治疗疾病的疑惑。通过隔绝斑块的可溶部分(ADDL＝淀粉样蛋白衍生的可扩散配体)，从脑部清除形成的Aβ是最有前途的方法之一。同样，从血液循环中去除Aβ可导致患者脑部减少的斑块负荷，以及积极的效果。治疗抗体是一种在这方面有希望的方法。近年来，研制了许多Aβ的单克隆抗体，这些抗体可随着时间减少斑块-沉积转基因小鼠模型的脑部的淀粉样斑块的压力(DeMattos，R.B.，et al.2001.Peripheral anti-A beta antibody alters CNS and plasma A betaclearanceand decreasesbrain A beta burdeninamousemodel of Alzheimer′s disease.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98：8850-8855)。然而，大多数这种抗体将Aβ的N-端作为目标，导致所有Aβ-形式的总体减少。这种方法因此不能特定地清除最致病的形式Aβ1-42。所有Aβ亚型的不加区别的去除会干扰更多Aβ可溶形式具有的二次有益作用。因此，允许对致病的Aβ1-42形式进行选择性隔绝的治疗提供了治疗效果。这意味着可以抑制原纤维的形成(淀粉样蛋白聚集以形成斑块)，并限制疾病的发展。显露了高比表面积的纳米颗粒的使用在这方面证实了希望(C.Cabaleiro-Lago，F. Quinlan-Pluck，I.Lynch，K.A.Dawson，S.LinseACS Chem.Neurosci.(2010)，1，279-287.)。通过使用尺寸范围在57和180nm之间的氨基改性聚苯乙烯纳米颗粒，可观察到原纤维形成在更高的颗粒浓度下得到抑制。可以合理地假设抑制的开始可通过增加纳米颗粒对Aβ42蛋白亲合力和选择性来降低。
足够的治疗需要精确并及早地诊断疾病。因此，非常需要可以帮助临床医生对AD诊断的生物诊断标记物(生物标记物)，而不限于在疾病过程的较早阶段。因为AD病例限于脑部，脑脊髓液(CSF)是AD生物标记物的明显来源。CFS生物标记物的总-tau蛋白(T-τ)，不同的磷酸-tau蛋白(P-τ)表位(tau是一种微管-相关的单位，位于神经元轴突)，和不同形式的蛋白β-淀粉(Aβ)，特别如上所述的Aβ42/Aβ40的比例被发现具有最高的诊断可能性(K.Blennow，J.Int.Med.，2004，256，224)。然而，仍然缺乏精确定量Aβ42的实际和稳定方法。首先，这种蛋白发现在血液中的浓度很低，这需要灵敏的方法。另一个抗体基方法中的困难是通过与血浆蛋白结合或通过Aβ低聚反应来遮蔽Aβ42表位。因此，相应的诊断方法与直接结果相差很远，这一般在于不足的选择性，高成本或生产问题。因此，可以在促进游离形式的条件下辨别表位的稳定的受体将意味着这方面的显著提高。
发明内容
本发明的目的在于可在体液，例如血浆或CFS中去除和/或检测淀粉样蛋白。该目的通过用于选择淀粉样蛋白的分子印迹聚合物来获得。本发明因此公开了一种选择β-淀粉样(Aβ)蛋白亚型Aβ1-38(SEQ ID NO：2)，Aβ1-39(SEQ ID NO：3)，Aβ1-40(SEQ ID NO：4)，Aβ1-41(DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVI，SEQ ID NO：5)，Aβ1-42(SEQ ID NO：6)或Aβ1-43(DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSN-KGAIIGLMVGGVVIAT，SEQ ID NO：7)或其截断亚型中的一种或多种的分子印迹聚合物(MIP)，其中使用选自一种或多种Aβ的C-端表位或N-端表位的模板来制备所述MIP；其中该C-端表位选自一组包括：AβX-38，AβX-39，AβX-40，AβX-41，AβX-42或AβX-43或其修饰形式；且N-端表位选自一组包括：(Aβ1-Y)或(Aβ2-Y)或其修饰的形式，其中X为23和40之间的整数，而Y为3和15之间的整数。
在一个优选的实施例中，该模板选自AβX-40或AβX-42，或其修饰形式。
所述MIP的进一步特点是：使用至少一种单体来制备，所述单体选自：交联单体和/或功能性单体，其在模板和选择性溶剂存在下聚合-从所得到的聚合体中去掉模板，来得到分子印迹聚合物(MIP)。
在一个实施例中，该MIP选择性地与β-淀粉(Aβ)蛋白亚型Aβ1-38(SEQ ID NO：2)，Aβ1-39(SEQ ID NO：3)，Aβ1-40(SEQ ID NO：4)，Aβ1-41(SEQ ID NO：5)，Aβ1-42(SEQ IDNO：6)或Aβ1-43(SEQ ID NO：7)，或亚型片段，或任何截断亚型的可溶部分(ADDL-淀粉蛋白衍生的可扩散配体)结合，其中该亚型存在于体液中，例如：血液(血清或血浆)，或脑脊髓液(CSF)，或在经过处理使蛋白引起变性的体液中。
本发明同样公开了AD的诊断和治疗中MIP的使用。该MIPs优选地识别Aβ或Aβ片段的可溶部分或部分聚合部分的N-端(Aβ1-X)序列，或C-端AβX-38，AβX-39，AβX-40，AβX-41，AβX-42或AβX-43)序列，它们在例如血液(血清或血浆)的体液，或在经过处理来引起蛋白质变性的体液中存在。该MIPs可以不同的形式来制备，例如：多孔颗粒，纳米纤维，纳米管，巨型独石，纳米颗粒和它们的纳米结构配对物，例如：具有选择性的不同功能性质的核壳纳米颗粒，例如为：磁性或发光核，或具有允许灵巧检测(例如：电化学发光探针ECL)的探针的标记。它们可经过调节展示与周围介质的最大兼容性，例如：涂层，使蛋白质吸收最小化。
MIPs可用不同的k MIPs可以不同的方式对AD进行诊断。它们可在蛋白质变性后用作血浆样品固相萃取(SPE)的选择性捕获相。这可接着进行蛋白酶解步骤，并通过质谱进行肽片段的检测。可选择地，MIPs可在例如：夹层式分析中使用，其中优先识别Aβ的C-端表位的MIP，作为捕获相来与Aβ，优选地Aβ42亚型结合，而另一个识别另外Aβ表位的MIP用作检测相，该检测相包括允许高度灵敏检测的探针。可选择地，其中的一种MIPs可被识别相同或相似表位的抗体所替代，因此，例如：识别Aβ1-42C-端表位的MIP可用作捕获相，而识别Aβ42N-端的抗体可用于检测。可选择地在一个相似的方式中，捕获相把Aβ的N-端表位作为目标，而检测相将C-端表位作为目标。该MIPs可同样通过结合与例如：光学，电气或重力信号传导的识别而合并成为化学传感器的识别层。
该MIPs可同样用于AD或以Aβ沉积为特征的其它疾病或失调的治疗处理。这种疾病的例子包括：轻度认知障碍(MCI)，大脑淀粉样血管病或血管病，下-综合症相关的阿耳茨海默氏病和包涵体肌炎。典型的淀粉样疾病非限制性地包括：系统性淀粉样变，阿耳茨海默氏病，成熟的糖尿病，帕金森氏疾病，舞蹈症疾病，额颞叶性痴呆和朊病毒相关传染性海绵状脑病(分别是人类的苦鲁病和库贾氏症，羊和牛的痒病和BSE)。可使用MIP基的纳米颗粒，以便抑制Aβ肽的原纤维作用或通过隔绝可溶的Aβ肽来抑制或压制Aβ或其片段的神经毒性。该隔绝可从CSF或血液中开始，通过直接服用纳米颗粒或以生物可相容柱格式(例如：巨型独石或多孔粒子)的MIPs来利用CSF或血液(体外或植入)的清血法治疗。
附图说明
图1简要地展示了淀粉样前体蛋白(APP)和Aβ蛋白的位置，指出了β-和-γ-分泌酶的断裂位置。
图2展示了β-和γ-分泌酶在APP上的作用导致的Aβ肽类变异体的氨基酸序列。指出了对应于可用作产生MIPs的模板(修饰或未修饰)的氨基酸序列。在这些氨基酸序列中，可选择地挑选更短的序列作为模板或部分模板。
图3展示了表位印迹的原理来产生对于N-或C-端Aβ序列的自由末端的特定结合位置。
图4展示了用于印迹淀粉样肽的功能单体和交联单体。
图5展示了用Aβ42印迹的MIP浸透后GLMVGGVVIA(SEQ ID NO：8)(A)和GLMVGGVV(SEQ ID NO：9)(B)的回收和负载容量。
图6为使用Aβ42(固相)的MIP和相应的NIP(虚线)对来自加标血清样品的Aβ33-40(SEQ ID NO：9)和Aβ33-42(SEQ ID NO：8)SPE之后的洗脱组分的HPLC-UV色谱图。
图7展示了从尿素-SDS-PAGE/免疫印迹分析的点强度估计的Aβ1-40(SEQ ID NO：4)和Aβ1-42(SEQ ID NO：6)的回收率，其中该尿素-SDS-PAGE/免疫印迹分析对标记Aβ1-40和Aβ1-42的血清样品SPE洗脱部分进行。
图8展示了随着增加Aβ42MIP(方形)和Aβ40MIP(圆形)上的Aβ42(实心符号)和Aβ40(空心符号)的浓度吸收的改变。
定义
“体液”是指活人身体内的液体。例如：脑脊髓液(CSF)，血清，血浆和尿液。
Aβ亚型“片段”是指例如Ab肽的蛋白断裂所产生的更短肽。
“变性”是指通过应用某些外应力或化合物使蛋白或核酸失去它们三级结构和二级结构的过程，其中该化合物例如为：强酸或强碱，促溶剂，浓无机盐，浓有机溶剂(例如：乙醇，二甲亚砜(DMSO)或氯仿)，或热量。酸的例子有：醋酸或甲酸，促溶剂的例子有尿素，盐酸胍和高氯酸锂。
“可聚合基团”指形成单体部分的原子基团可自我反应，或与其它单体反应形成聚合物。
MIP的“特定结合”指MIP展示了对Aβ或优选表位的明显亲合力，并优选地，并没有展示出显著的交叉反应活性。“没有展示出显著的交叉反应活性”的MIP不会明显地与不理想的实体(例如：蛋白质实体)结合，例如，特定与Aβ结合的MIP将明显与Aβ结合，但不会与非-Aβ蛋白或肽(例如，非-Aβ蛋白或斑块包括的肽)显著反应。例如，特定对于优选表位的MIP不会与远处的在共同蛋白或肽上的表位发生显著的交叉反应。特定的结合可根据任何确定这种结合的本领域-识别的方法来确定。
术语“表位”指目标Aβ肽的位置，与抗体类似，MIP特定地该位置结合。表位一般包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15氨基酸。
“可溶”或“离解的”Aβ指非-聚合或分解的Aβ聚合肽。“不溶的”Aβ指聚集的Aβ聚合肽，例如，通过非共价键而聚集在一起。Aβ(例如：Aβ42)被认为至少部分地由于肽的C-端疏水残基(APP的跨膜区)的存在而聚集。一种制备可溶Aβ的方法是用超声处理在纯净DMSO中离解肽。所获得的溶液离心去除任何不溶的颗粒。
缩写ADDL指淀粉样蛋白衍生的扩散性配体。
“修饰肽”或肽的“修饰形式”，例如AβX-42的修饰形式指在它们的N-或C-端的肽，共价或非共价修饰，以增加Aβ肽的溶解性或用作模板时的接近性。
“支撑物”在产生MIP形式的背景下，指任何无机支撑物，例如：硅，氧化铝，多孔玻璃，平面支撑，纳米管。
“纳米颗粒”指无机或有机颗粒，其颗粒尺寸小于1μm(颗粒直径)。
具体实施方式
本发明涉及一种通过印迹技术制备的用于淀粉样肽的人造受体(分子印迹聚合物＝MIPs)，以及它们在诊断和治疗AD或其它以Aβ沉积为特征的疾病或失调中的用途。
分子印迹是一种能产生稳定受体(MIPs)的技术，该稳定的受体具有抗体能力来结合，并能在分子或其它结构之间加以区别。这包括在模板存在下的功能单体和交联单体的共聚作用。聚合一般以自由基聚合的形式进行，其中引发的自由基通过自由基引发剂并可选择地在溶剂存在的情况下产生。从形成的聚合物中去除模板产生了特定的空穴或结合位置，该空穴或结合位置与模板结构(例如：尺寸，形状和功能性基团)或与模板结构的形状和/或功能有关的目标互补。
本发明涉及分子印迹聚合物(MIPs)，该分子印迹聚合物对β-淀粉样(Aβ)蛋白亚型Aβ1-38(SEQ ID NO：2)，Aβ1-39(SEQ ID NO：3)，Aβ1-40(SEQ ID NO：4)，Aβ1-41(SEQ IDNO：5)，Aβ1-42(SEQ ID NO：6)或Aβ1-43(SEQ ID NO：7)，或其截断亚型的一种或多种进行选择，其中所述MIP使用模板来制备，该模板选自Aβ的C-端表位或N-端表位；其中的C-端表位选自一组包括：AβX-38，AβX-39，AβX-40，AβX-41，AβX-42或AβX-43或其修饰形式；而N-端表位选自一组包括：(Aβ1-Y)或(Aβ2-Y)或其修饰形式；其中的X为23和40之间的整数，而Y为3和15之间的整数。
在一个实施例中，该模板为AβX-38、AβX-39、AβX-40、AβX-41、AβX-42、AβX-43，或(Aβ1-Y)或(Aβ2-Y)或其修饰形式的铵盐或季铵盐。在一个实施例中，该模板选自AβX-40或AβX-42，或其修饰形式。在一个实施例中，该模板选自Aβ33-42(GLMVGGVVIA，SEQ ID NO：8)，Aβ33-40(GLMVGGVV， SEQ ID NO：9)，Aβ37-42(GGVVIA，SEQ ID NO：10)，Aβ35-40(MVGGVV， SEQ ID NO：11)，和Aβ1-8(DAEFRHDS，SEQ ID NO：12)。
在一个实施例中，该MIP使用至少一种单体来制备，该单体选自交联单体和/或功能性单体，该交联单体和/或功能性单体在模板和选择性的溶剂的存在下聚合，且/或模板从所得到的聚合物中去除，来产生分子印迹聚合物(MIP)。在一个实施例中，该交联单体选自二乙烯基苯。在一个实施例中，功能性单体选自包含一个或多个氨基的单体。在一个实施例中，该功能性单体为2-氨基乙基丙烯酸酯或其盐。在一个实施例中，加入1，3-二取代脲单体作为第二功能性单体。在一个实施例中，该第二功能性单体为N-3，5-二(三氟甲基)-苯基-N’-4-乙烯基苯基脲。在一个实施例中，该模板固定成一个支撑物，例如：多孔硅支撑物，而该支撑物在聚合之后与模板一起去掉。在一个实施例中，该C-端表位模板在N-琥珀酸形式。在一个实施例中，该支撑物为具有平均孔径为50nm的多孔硅。在一个实施例中，该MIP通过将聚合物嫁接到支撑物的表面或纳米颗粒核心珠来制备。在一个实施例中，该MIP以尺寸在10-500nm范围的纳米颗粒形式来制备。
本发明涉及权利要求1-14的MIP的用途，其中所述MIP与β-淀粉样肽(Aβ)亚型Aβ1-38(SEQ ID NO：2)，Aβ1-39(SEQ ID NO：3)，Aβ1-40(SEQ ID NO：4)，Aβ1-41(SEQ ID NO：5)，Aβ1-42(SEQ ID NO：6)或Aβ1-43(SEQ ID NO：7)，或该亚型片段或截断亚型的一种或多种的可溶部分(ADDL＝淀粉衍生可扩散性配体)结合，其中的亚型存在于生物或体液中，例如：血液(血清或血浆)，或脑脊髓液(CSF)，或经过处理以引起蛋白质变性的生物或体液。
在一个实施例中，该MIPs用于分析存在生物液体样品中的β-淀粉样(Aβ)肽亚型Aβ1-38(SEQ ID NO：2)，Aβ1-39(SEQ ID NO：3)，Aβ1-40(SEQ ID NO：4)，Aβ1-41(SEQ ID NO：5)，Aβ1-42(SEQ ID NO：6)或Aβ1-43(SEQ ID NO：7)，或任何截断亚型或这些亚型的比例，这些生物体液例如：血液(血清或血浆)，或脑脊髓液(CSF)，或经过处理引起蛋白质变性的生物液体。在一个实施例中，该MIPs用作从生物样品中固相提取淀粉样肽的吸附剂，该生物样品例如为：血液(血清或血浆)，或脑脊髓液(CSF)样品，或经过处理引起蛋白质变性的生物液体。在一个实施例中，该MIPs用作分析中的捕获或检测相。在一个实施例中，选择β-淀粉样亚型，例如：Aβ42或Aβ40的其中之一C-端的MIP用作捕获，而特定对于β-淀粉样N-端的抗体用于在夹层式分析中的检测。在一个实施例中，该MIPs用于化学传感器。在一个实施例中，该用于淀粉样沉积的“体内”成像。在一个实施例中，该MIPs用于抑制β-淀粉样肽的原纤维化作用。
本发明同样涉及用于诊断以Aβ沉积为特征的疾病或失调的MIP。本发明同样涉及用于治疗被Aβ沉积确认的疾病或失调的MIP。在一个实施例中，该疾病为阿耳茨海默氏病(AD)。
组合物
在一个实施例中，该模板为氨基酸序列对应于Aβ或Aβ表位的肽。在一个实施例中，该模板为AβN-端(Aβ1-Y或Aβ2-Y)序列或C-端(AβX-38，AβX-39，AβX-40，AβX-41，AβX-42或AβX-43)序列(见图2)，其中X为28和40之间的任意数字，而Y优选为3和15之间的整数。该肽可通过传统的溶液相或固相肽合成技术来合成，并可在它们的N-或C-端修饰，来增加Aβ肽的溶解性和可接近性。N-端修饰包括N-保护基团(例如：Fmoc，Cbz，Boc，Ac，Bzl，Bn)，而C-端保护包括传统的O-保护基团(例如：叔丁酯，甲酯，乙酯，苯甲酯，甲硅烷基保护)。
N-和/或/C-端修饰都可同样存在于共轭的肽和低聚物，或者聚合物树突状庞大基团内，包括聚乙二醇(PEG)、右旋糖苷、聚丙三醇、聚胺、聚乙烯亚胺或固化在载体粒子表面的肽，载体粒子如，多孔硅或硅的纳米粒子。也可通过将所述肽模板转化为盐来对其进行修饰。对于C-端肽，可利用反阳离子将自由羧酸转化为羧酸盐，反阳离子为无极阳离子，例如Na+，K+，或者有机阳离子，例如胺类化合物中的铵离子，胺类化合物有三乙胺、三丙胺、三丁胺、1，2，2，6，6-戊甲基哌啶或四元铵离子，例如四乙基-、四丙基-、四丁基-、四戊基-或四己基-铵盐或季铵化的芳香族杂环胺，如吡啶盐或咪唑。
在本发明中，功能性单体选自含有酸性基团的单体(见图4)，例如甲基丙烯酸(MAA)、丙烯酸(AA)，三氟甲基丙烯酸(TFM)，衣康酸(ITA)，对乙烯基苯甲酸(PVB)，丙烯酰胺甲基丙磺酸(AMPSA)；含有碱性基团的单体，如含有单体的胺。非限制性实施例是2-乙烯基吡啶(2-VP)，4-乙烯基吡啶(4-VPY)，氮，氮-二乙基-2-氨乙基甲基丙烯酸酯(DEAEMA)，2-氨乙基甲基丙烯酸酯(AEMA)，氮-(2-氨乙基)甲基丙烯酰胺(AEMAM)，乙烯基咪唑(VIM)，氮，氮-二甲基-2-氨乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA)，丙烯胺(ALAM)，4-乙烯基-1-(N，N’-二乙基脒基)苯(VDEAB)，苯乙烯胺(VBA)；阳离子单体如以上任何含有功能性单体的盐的阳离子或含有单体的季铵盐，单体例如N，N，N-三甲基铵-2-氯化甲基丙烯酸乙酯(TMAEMA)、N，N，N-三甲基-N-4-氯乙烯基苯基铵(TMVBA)、N-乙烯基-N’-氯化苯基咪唑(VBI)、N-乙烯基-氯化吡啶(N-VPY)；中性单体，例如N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)、苯乙烯(S)，2-甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)，丙烯腈(AN)，腈基苯乙烯(CS)，N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)，丙烯酰胺(AAM)，甲基丙烯酰胺(MAAM)，N-异丙基丙烯酰胺，N-叔丁基丙烯酰胺，以及基于1，3-二取代脲的单体，例如N-3，5-双(三氟甲基)-苯基-N’-4-乙烯基苯脲(TFU)或显色单体1。
在本发明中，交联单体包括乙二醇二甲基丙烯酸盐(EGDMA)，二乙烯基苯(DVB)，二异丙基苯(DIB)，三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)，季戊四醇三丙烯酸酯(PETA)，乙烯双丙烯酰胺(EBA)，哌嗪双丙烯酰胺(PBA)和亚甲基双丙烯酰胺(MBA)。
在本发明中，引发剂为N，N′-二取代的偶氮引发剂，例如偶氮-N，N′-二异丁腈(AIBN)，偶氮-N，N′-双二甲基戊腈(ABDV)，2，2′-偶氮双(2，4-二甲基-4-甲氧基戊腈)(V70)或任何其他偶氮基引发剂(可从Wako Pure化学工业有限公司(日本)得到)，或氧化还原引发剂，例如添加或未添加促进剂的过硫酸铵(例如TEMED＝四甲基乙二胺)。
例如溶剂为水、甲醇、乙醇、四氢呋喃(THF)、丙酮，二甲基甲酰胺(DMF)，乙腈(ACN)，1，1，1-三氯乙烷，氯仿(CHCL3)，二氯甲烷(DCM)，甲苯，二甲亚砜(DMSO)，异丙醇或这些或其它溶剂的混合。
形式
MIPs可以不同的方式制备，例如：多孔颗粒，纳米纤维，纳米管，巨型独石，纳米颗粒和它们的纳米结构，例如：具有选择性的不同功能性质的核壳纳米颗粒，例如为：磁性或发光核，或具有允许灵巧检测(例如：电化学发光探针ECL)的探针的标记。它们可经过调节展示与周围介质的最大兼容性，例如：涂层，使蛋白质吸收最小化。在一个实施例中，该MIPs可用任何制造聚合物颗粒的技术来制备，包括：依赖通过悬浮聚合或乳液聚合或它们任意改变的液-液两相系统，或通过分散聚合或沉淀聚合的一种液相中聚合的技术。
在另一个实施例中，聚合通过控制的自由基聚合技术(CRP)来进行，CRP在传播自由基生命时间的方面与传统的自由基聚合相区别。在CRP中，可以延伸到小时，这允许了制备具有预定分子量，低聚合，控制成分和功能的聚合物。其导致了MIPs展示出更高的与肽的结合能力，亲和性和更快的结合和离解。普通的CRP技术为RAFT(可逆加成断裂链转移聚合)，ATRP(原子转移自由基聚合)和引发-转移-终止剂(引发剂，转移剂，终止剂)聚合。
在另一个实施例中，颗粒可通过将MIP薄膜嫁接到预成型支撑物的表面上。该嫁接可根据“嫁接到”或“从...嫁接”方法(如上所述)来进行。后者方法改善了制备过程以及分子识别和材料动力学性质(见：美国专利6,759,488)。
在另一个实施例中，通过分层印记方法来制造颗粒。在此多孔硅用作模型来控制所得印记聚合物的颗粒尺寸，形状和多孔性。该模板可固定到模型的壁，或该模型可简单滴溶解在单体混合物中。孔可填充给定的单体/模板/引发剂混合物，在聚合之后，蚀去硅，获得了展示分子识别特点的印记聚合物珠体。在制造的角度来说，该过程具有简单，并能大量产出具有预定和独特形态的有用颗粒的优点。
在另一个实施例中，该MIPs可以一般尺寸范围10-500nm之间的纳米颗粒的形式来制备。纳米-千分尺-尺寸MIP颗粒的工程可通过聚合沉积或细乳液聚合过程来获得，其中可通过一个步骤的高稀释聚合来制得均匀印记珠体。可使用液体和非-液体印记协议。
可选择地，纳米颗粒合成可通过嫁接进行。这从包含自由基引发剂或链转移基团的无孔纳米核心开始。在核心上，使珠体尺寸，分散性和聚合条件下形态的最小影响来在核心上嫁接薄MIP膜。因此可控制纳米颗粒，该纳米颗粒可在活体内的血液或CSF中捕获它们的目标。可选择地，该MIPs可用于来自血浆或整个血液样品的目标Aβ肽的直接和快速提取。顺磁的，纳米级聚合物颗粒一般用于此目的。这种技术快速，温和，不需要离心或色谱层析。顺磁的可以核心/壳微凝胶的形式来制备，通过“种子-和-饲料”沉积聚合或通过在磁性核心珠上嫁接印迹壳来获得。印迹纳米颗粒可同样合并到检测Aβ肽的分析试剂盒中。这些可基于与已经建立的免疫分析相似的原理，尽管具有捕获抗体或检测抗体或都被MIP取代。除了磁性颗粒，该MIP颗粒为了简单的检测可用探针来标记。这些探针可用于普通的免疫分析，例如：酶，放射性同位素，基于钌的电化学发光探针，或基于铕的荧光探针。
该MIP颗粒可同样为了生物相容性而后功能性化。它们可经过调节展示出与周围介质最大的相容性，例如：通过用亲水涂层来涂层壳或外表面，使蛋白吸收和非特定结合最小化。这可以所谓“隐身涂层”的形式来进行，该“隐身涂层”通过在MIP纳米颗粒表面上嫁接包括聚乙二醇链的壳。
本发明的用途
使用MIPs作为Aβ分析和AD以及相关疾病诊断的工具
MIPs可以不同的方式用于Aβ分析以及AD，和以Aβ沉积为特征的任何其它疾病或失调的诊断。它们可用作蛋白变性后血浆样品固相提取(SPE)的选择性捕获相。这可接着进行蛋白消化步骤和用质谱进行蛋白片段检测。可选择地，该富含MIP的样品可经过已经建立的免疫分析方法作Aβ肽的定量分析。可选择地，该MIPs可用于竞争性和非竞争性的结合分析。已知的竞争性结合分析有多种，例如：固相直接或间接放射性免疫测定(RIA)，夹层式分析，如：固相直接或非直接酶免疫分析(EIA或ELISA)；夹层式竞争性分析；固相直接生物素-亲和素EIA；固相直接标记分析；固相直接标记夹层式分析；使用I-125的固相直接标记RIA；固相直接生物素-亲和素EIA；和直接标记RIA。
在夹层式分析中，一种能优选识别Aβ的C-端表位的MIP用作捕获相来与Aβ，优选为Aβ42或Aβ40亚型结合，另一种能识别Aβ表位，例如：N-端1-X片段的MIP用作检测相，该检测相包括允许高灵敏性检测的探针。可选择地，其中一种MIPs可被识别相同或类似表位的抗体所取代，因此，例如，在一个实施例中的识别Aβ1-42C-端表位的MIP用作捕获相，而识别Aβ42N-端序列的抗体用作检测。可选择地，以相似的方式，该捕获相可将的N-端表位作为目标，而检测相可将C-端表位作为目标。
该MIPs可同样通过结合例如：光学，电学或重力信号传导，在化学传感器中合并成识别层。
MIPs用于治疗AD或相关疾病的用途
MIPs可同样用于AD或以Aβ沉积为特征的其它疾病或失调的治疗处理。这种疾病的例子包括：轻度认知障碍(MCI)，大脑淀粉样血管病或血管病，下-综合症相关的阿耳茨海默氏病和包涵体肌炎。典型的淀粉样疾病非限制性地包括：系统性淀粉样变，阿耳茨海默氏病，成熟的糖尿病，帕金森氏疾病，舞蹈症疾病，额颞叶性痴呆和朊病毒相关传染性海绵状脑病(分别是人类的苦鲁病和库贾氏症，羊和牛的痒病和BSE)。可使用MIP基的纳米颗粒，以便抑制Aβ肽的原纤维作用或通过隔绝可溶的Aβ肽来抑制或压制Aβ或其片段的神经毒性。该隔绝可从CSF或血液中开始，通过直接服用纳米颗粒或以生物可相容的列格式(例如：巨型独石或多孔粒子)使用MIPs来利用CSF或血液(体外或植入)的清血法治疗。
阿尔茨海默病和其它淀粉样疾病的治疗可包括在患者产生治疗反应的条件下给患者服用对Aβ特定表位有亲和性的MIPs。在此所使用的术语“治疗”，定义为给患者服用治疗试剂，去除致病Aβ肽的CSF或血液清血法，或在患者的隔绝组织，或细胞系进行应用或服用，其目的在于治疗，治愈，减轻，减缓，改变，补救，改善，改进或影响疾病，疾病的症状或患病的倾向。本发明的治疗试剂包括特定结合Aβ的MIPs，或淀粉样斑块的其它组分。在一个实施例中，该MIP特定结合Aβ的聚合形式，而没有结合可溶形式。在一个实施例中，MIP特定结合可溶形式，而没有结合聚合形式。在一个实施例中，MIP与聚合和可溶形式结合。在一个实施例中，MIP结合Aβ的自然发生短形式(即：Aβ39，40或41)，而没有结合Aβ的自然发生长形式(即：Aβ42和Aβ43)。在一个实施例中，MIP结合Aβ的长形式，而没有结合短形式。
活体成像
本发明同样提供了患者淀粉样沉积的活体成像方法。这种方法有用于阿耳滋海默氏病的诊断或确认诊断。例如，该方法可在具有痴呆症状的患者身上使用。如果患者具有不正常的淀粉样沉积，该患者很有可能患上阿耳滋海默氏病。该方法可同样在无症状的患者身上使用。淀粉样不正常沉积的存在暗示了会遭受未来的症状性疾病。该方法同样用于监控疾病进程和/或具有在先诊断的阿耳滋海默氏病的患者的治疗的反应。该方法通过朝着标记的Aβ服用MIP。标记物的选择取决于检测的方式。例如，荧光标记物适用于光学检测。顺磁标记物的使用适用于不用外科手术的层析检测。放射性标记物可同样使用PET或SPECT来检测。
本发明通过以下非限制实施例来详细说明。
实施例1：目标为Aβ42或Aβ40C-端的MIP
Aβ42的补体MIP用以下方式来制备：将Ac-GGVVIA(SEQ ID NO：10)(8mg)，N-3，5-双(三氟甲基)-苯基-N’-4-乙烯基苯基脲(TFU)(5mg)，溶于甲醇(2μL)的四丁铵(TBA)氯化物(2M)，和2-氨基乙基丙烯酸酯(AEMA)的盐酸盐(235mg)溶于DMSO(600μL)和ACN(900μL)。随后加入二乙烯基苯(DVB)(930μL)和自由基引发剂ABDV(12.0mg，1％(w/w)总的单体)。溶解后，将溶液转到玻璃试管中，冷却到0℃，并通氮气10分钟。随后密封该玻璃试管，通过将该试管放在设为50℃的水浴中来热引发聚合。聚合在该温度下进行48小时。该试管随后破碎，MIP巨型独石粉碎成更小的碎块。通过以下连续的清洗步骤来除去模板分子：MeOH(100mL)，MeOH/水(0.1M HCl)(90/10，v/v)(100mL)以及最后的MeOH(100mL)。该MIP颗粒使用每种洗液后保持平衡约6小时，之后倒出洗液。再之后，研磨所获得的块状聚合物，并过滤使得最后的尺寸在25和50μm之间。在使用之前，用MeOH/水(80/20，v/v)来沉淀它们，以去除细微粒。非-印迹的聚合物也以同样方式制备，但没有模板分子的存在。
类似地制备Aβ40的MIP，但使用N-乙酰化六肽AcMVGGVV(SEQ ID NO：11)作为模板。
实施例2：目标为Aβ42或Aβ40C-端的MIP
Aβ42的补体MIP用以下方法来制备：将Ac-GGVVIA(8mg)，溶于甲醇(2μL)的四丁铵(TBA)氯化物(2M)和2-氨基乙基丙烯酸酯(AEMA)的盐酸盐(235mg)溶于DMSO(600μL)和ACN(900μL)。随后加入二乙烯基苯(DVB)(930μL)和自由基引发剂ABDV(12.0mg，1％(w/w)总的单体)，在溶解后，将溶液转到玻璃试管中，冷却到0℃，并通氮气10分钟。随后密封该玻璃试管，通过将该试管放在设为50℃的水浴中来热引发聚合。聚合在该温度下进行48小时。该试管随后破碎，MIP巨型独石粉碎成更小的碎块。通过以下连续的清洗步骤来除去模板分子：MeOH(100mL)，MeOH/水(0.1M HCl)(90/10，v/v)(100mL)以及最后的MeOH(100mL)。该MIP颗粒使用每种洗液后保持平衡约6小时，之后倒出洗液。再之后，研磨所获得的块状聚合物，并过滤使得最后的尺寸在25和50μm之间。在使用之前，用MeOH/水(80/20，v/v)来沉淀它们，以去除细微粒。非-印迹的聚合物也以同样方式制备，但没有模板分子的存在。
类似地制备Aβ40的MIP，但使用N-乙酰化六肽AcMVGGVV(SEQ ID NO：11)作为模板。
实施例3：目标为Aβ42或Aβ40C-端的MIP
如上述实施例1或2所述的相同方式来制备Aβ40和Aβ42的补体MIPs，但用N-(2-氨乙基)甲基丙烯酰胺(AEMAM)(235mg).来取代2-氨基乙基丙烯酸酯盐酸盐。
实施例4：目标为Aβ42或Aβ40C-端的MIP
如上述实施例1或2所述的相同方式来制备Aβ40和Aβ42的补体MIPs，但用乙烯基苯甲基胺盐酸盐来取代2-氨基乙基丙烯酸酯盐酸盐。
实施例5：目标为Aβ42或Aβ40C-端的MIP
如上述实施例1或2所述的相同方式来制备Aβ40和Aβ42的补体MIPs，但用N，N，N-三甲基-N-4-乙烯基苯甲基氨盐基氯化物来取代2-氨基乙基丙烯酸酯盐酸盐。
实施例6：目标为Aβ42或Aβ40C-端的MIP
如上述实施例1或2所述的相同方式来制备Aβ40和Aβ42的补体MIPs，但用甲基丙烯酸(MAA)来取代2-氨基乙基丙烯酸酯盐酸盐。
实施例7：目标为Aβ42或Aβ40N-端的MIP
Aβ1-8的补体MIP用以下方式来制备：将Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser(SEQ IDNO：12)(12mg)，甲基丙烯酸(2mmol)，甲基丙烯酰胺(20mmol)，乙基双丙烯酰胺(20mmol)和氨盐基过硫酸盐(APS)(1％wt总的单体)溶解到6mL pH7Hepes缓冲液(0.1M)中。该溶液在冰浴中用氮气流除气20分钟。之后将TEMED注入溶液中，随后剧烈混合。随后，在37℃下使聚合反应至少16小时。在聚合完成之后，干燥所述聚合物，并压碎，接着在MeOH，MeOH/水：1/1，MeOH/0.1M HCl(1/1)和MeOH/水中清洗，除去模板。
实施例8：目标为Aβ42或Aβ40C-端的标志MIP
如上述实施例1所述的方式来制备Aβ42的补体MIP，但用3，5-双(三氟甲基)-苯基-N’-4-乙烯基苯基脲(TFU)来取代显色脲单体1(见图4)。
实施例9：在多孔硅支撑物上嫁接MIP薄膜
在将聚合物薄膜嫁接到支撑物表面之前，用RAFT试剂对多孔硅颗粒(平均粒径/d＝50nm)进行修饰。
在修饰步骤之前，根据标准的方法来羟基化硅表面，在第一硅烷化步骤中，最大量的一半的硅醇基与(3-氨丙基)三乙氧基硅烷(APS)反应。后续步骤为加入RAFT试剂。在室温下，往氨基-功能化的硅颗粒的THF浆液(30mL)中逐滴加入巯基噻唑啉活化的4-氰基戊酸二硫代酯CPDB(0.50g，1.3mmol)。在完成加入后，搅拌溶液6小时。通过过滤来回收修饰的硅颗粒。1g的这种RAFT-修饰硅颗粒置于玻璃试管的厚壁上，并根据实施例1-7悬浮在聚合混合物中，调节总单体来获得最大厚度为1，2或3nm的膜，其中假设单体是定量转化的。在密封后，经过三个冻融循环对混合物进行混合和充气，加热试管到50℃持续12小时，以及70℃持续12小时来引发聚合。在聚合之后，通过Soxhlet装置，使用甲醇提取样品。非-印迹的对照聚合物复合材料如上述方法来制备，但不加入模板。
实施例10：分层的印迹Aβ表位
A.固定对应于Aβ40或Aβ42的肽表位
使用氨丙基改性硅(APS-Si)作为普通支撑材料，该氨丙基改性硅(APS-Si)平均孔尺寸为50nm，目标的肽表面覆盖设置为0.2μmol/m2，用以下方式固定对应于Aβ40或Aβ42的N-或C-端序列的肽：
Aβ1-8：往氮气下的溶于干DMF的1.5g APS-Si和Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Phe-Arg(pbf)-His(Trt)-Asp(OtBu)-Ser(Trt)-OH(SEQ ID NO：12)(20μmol)中逐滴加入溶于干DMF的PyBop(20μmol)和HOBt(20μmol)，和DIPEA(40μmol)。该反应在氮气环境下放置过夜。固体产品用DMF，DCM和甲醇清洗，并干燥。非反应的氨基用乙酸酐，通过乙酰化来封端。接着使用哌啶，接下来再用TFA/DCM：1/1连续去除肽保护。
Aβ36-42：往氮气下的溶于干DMF的1.5g APS-Si和N-琥珀酰化模板SucGGVVIAOtBut(SEQ ID NO：10)(20μmol)中逐滴加入溶于干DMF的PyBop(20μmol)和HOBt(20μmol)和DIPEA(40μmol)溶液，反应在氮气环境下放置过夜。用DMF，DCM，和MeOH清洗该产品，并干燥。非反应氨基用乙酸酐，通过乙酰化来封端。接着用TFA/DCM：1/1进行完全的去肽保护。
Aβ34-40：往氮气下的溶于干DMF的1.5g APS-Si和N-琥珀酰化模板SucGGVVIAOtBut(SEQ ID NO：11)(20μmol)中逐滴加入溶于干DMF的PyBop(20μmol)和HOBt(20μmol)和DIPEA(40μmol)溶液，反应在氮气环境下放置过夜。用DMF，DCM，和MeOH清洗该产品，并干燥。非反应氨基用乙酸酐，通过乙酰化来封端。接着用TFA/DCM：1/1进行完全的去肽保护。
B：分层印记
模板合成之后，固定的肽模板的孔填充有与实施例1-9一样的预聚合物混合物，但保留可溶的模板。接着以提高的温度进行聚合。预聚合物混合物的例子用于以下不同的表位：
C-端(Aβ36-42和Aβ34-40)：选择性A：将2-氨基乙基丙烯酸酯的盐酸盐(235mg)和二乙(Aβ1-8)苯(DVB)(930μL)溶于DMSO(600μL)和ACN(900μL)。自由基引发剂为ABDV(12.0mg，1％(w/w)总的单体)，且聚合反应在50℃下进行。
N-端(Aβ1-8)：将甲基丙烯酸(2mmol)，甲基丙烯酰胺(20mmol)，乙基双丙烯酰胺(20mmol)和氨盐基过硫酸盐(APS)(1％wt总的单体)溶于6mLpH7的Hepes缓冲液(0.1M)中。聚合反应在加入TEMED之后，在30℃下进行。
在聚合反应之后，硅模型通过NH4HF2(aq)溶液处理溶解，得到有机聚合物珠，其尺寸和形态反应了原始硅模型的尺寸和形态。此外，固定的胺酸和肽保留在表面印记之后，导致当评估用作SPE或分析的材料时，模板肽的优先保留。
实施例11：核心壳纳米颗粒
从两个30％胶体溶液的商业可得的硅核心尺寸((10-15nm和40-50nm)开始，核心通过氨基硅烷来修饰，以引入反应氨基，用于进一步的包含RAFT试剂羧酸结合。随后在表位模板存在下，通过RAFT控制进行嫁接，用1-9所述的聚合方法来产生表面印记核心壳珠。
实施例12：核心壳纳米颗粒
具有1mL体积的固-相提取柱(Varian，Spain)挤满了20mg Aβ42的补体MIP(实施例1)或对应的非印迹聚合物。该柱与5mL的盐酸胍(GuHCl4M)平衡，包含肽的，溶于缓冲液(GuHCl4M)的样品来自体液(CSF或血液)，在蠕动泵的帮助下以恒定的流速1mL min-1进行过滤。该柱用0.5mL的缓冲液混合物(GuHCl4M)/AcN(95∶5，v/v)清洗，来洗脱非特定保留的化合物。最后，Aβ肽用1mL的甲醇中的0.05M(3％TFA)溶液来洗脱。该柱在新的应用之前与10mL的缓冲液(GuHCl4M)平衡。从MISPE柱的滤出液直接注入到用于分析的HPLC系统。
血清由Sigma-Aldrich公司提供，并用各肽强化。接着，用9倍体积的GuHCl4M对样品进行稀释。在固相萃取之前，将稀释后的样品在室温下培养30分钟。将强化水样预先浓缩，并用肽原液加标，以用于校准目的。
图5-7展示了如实施例1所制备的聚合物的SPE方法的结果。
图5展示了用如实施例1所述的Aβ42印迹的MIP(20mg)浸透之后，溶于4MGuHCl缓冲液的100μg/L GLMVGGVVIA(SEQ ID NO：8)(A)和100μg/L GLMVGGVV(SEQ ID NO：9)(B)的回收与负载容量的对比。
图6展示了使用如实施例1所述的Aβ42的MIP(20mg)，从2.5μg/mL的加标血清样品中的Aβ33-40(GLMVGGVV)(SEQ ID NO：9)和Aβ33-42(GLMVGGVVIA)(SEQ ID NO：8)经过SPE之后的HPLC-UV色谱图，其以实线表示，对应的NIP以短划线表示。Aβ33-40(GLMVGGVV)(SEQ ID NO：9)的洗脱部分在约15分钟时展示了一个峰。虚线代表空白血清样品。SPE如实施例12所述的进行。
图7展示了从尿素-SDS-PAGE/免疫印迹分析的点强度估计的Aβ1-40(SEQ ID NO：4)和Aβ1-42(SEQ ID NO：6)的回收，该尿素-SDS-PAGE/免疫印迹分析为用5ng/mL Aβ1-40(SEQ ID NO：4)和1ng/mL Aβ1-42(SEQ ID NO：6)加标的血清样品的SPE的洗脱部分。该SPE如实施例12所述地进行。
此外，对于根据实施例1嫁接单体4M GuHCl的，如实施例9所制得的Aβ42MIP以及对应的NIP，在从1mg/L Aβ33-40(GLMVGGVV)(SEQ ID NO：9)和1mg/L Aβ33-42(GLMVGGVVIA)(SEQ ID NO：8)加标的4M GuHCl经过SPE，以及用包含15％乙腈.的清洗步骤之后得到以下回收：MIP：Aβ33-42：100％；Aβ33-40：36％；NIP：Aβ33-42：59％；Aβ33-40：34％.
实施例13：使用MIP作为捕获相的夹层式分析，以及检测的酶联抗体。
如实施例10所述制备的，用Aβ37-42(SEQ ID NO：10)或Aβ35-40(SEQ ID NO：11)印迹的MIP，可选择的B和对应的NIP，用于展示夹层分析的MIP/抗体的原理。
将4mg的聚合物置于96孔过滤板的孔中。溶于4M GuHCl的包含30-400pg/mLAβ1-42(SEQ ID NO：6)或Aβ1-40(SEQ ID NO：4)的50μL标准溶液加入每个孔中。该溶液在定轨振动器中与聚合物接触3小时。随后用5x200μL的GuHCl(4M)/AcN95∶5和5x200μL的milliQ水清洗。清洗后，在孔中加入50μL的抗体共轭溶液(特定对于β-淀粉N-端的生物素化抗体)。用板的封口器覆盖该板，孔内物用定轨振荡器混合5分钟。随后板经过在2-8℃下的培养，而没有振动过夜(16-20小时)，两天内去掉封口器，且所有的上层清液过滤去除。加入5x300μL的清洗溶液，接着加入100μL的酶共轭溶液至每个孔中。该板再用板封口器覆盖，并在室温下(20-28℃)定轨振荡器培养30分钟。随后去掉封口器。最后在每个孔中加入100μL的显色溶液。覆盖该板，并振荡30分钟。随着Aβ1-42浓度的增加，所形成的颜色强度增加。30分钟之后，加入100μL的停止液，用手搅动板，来确保所有孔溶液的完全混合。5分钟内，使用酶标仪确保没有气泡时，在450nm和590nm处观察到吸收。
图8展示如实施例1所制备的Aβ42MIP和Aβ40MIP随着Aβ42和Aβ40浓度的增加，吸收发生了改变。同样，CSF样品用肽储备溶液加标，用于校正(30-400pg/mL)，按照标准的方法。
CSF样品分析：用的将CSF稀释30倍。在ELMISA方法之前，稀释的样品在室温下培养了30分钟。同样，按照标准的添加方法，该CSF样品使用用于校准的肽储备溶液来加标。
实施例14：原纤维化的抑制
在37℃下，淀粉样Aβ1-42(SEQ ID NO：6)或Aβ1-40(SEQ ID NO：4)的原纤维化动力学受到硫磺素T(ThT)结合的时间发展所控制，其在根据实施例11制备的，通过嫁接实施例1的单体混合物的Aβ37-42(SEQ ID NO：10)或Aβ35-40(SEQ ID NO：11)印迹聚合物纳米颗粒的不存在和存在的情况下进行。每个样品包含10μM Aβ1-42(SEQ ID NO：6)或Aβ1-40(SEQID NO：4)，200μM ThT，和10mM磷酸钠缓冲液中5μg/mL颗粒，0.02％NaN3，pH7.4。
可观察到用Aβ1-42(SEQ ID NO：6)印迹的颗粒的存在强烈地抑制了Aβ1-42(SEQ IDNO：6)的原纤维化作用。
Claims (20)
1.一种分子印迹聚合物(MIP)，其特征在于，所述分子印迹聚合物选择性识别以下各项中的一项或多项：β-淀粉样(Aβ)肽亚型Αβ1-38(SEQ ID NO:2),Αβ1-39(SEQ ID NO:3),Αβ1-40(SEQ ID NO:4),Αβ1-41(SEQ ID NO:5),Αβ1-42(SEQ ID NO:6)或Αβ1-43(SEQ IDNO:7)或其截断亚型；其中，所述MIP使用模板来制备，该模板选自Αβ的C-端表位或N-端表位中的一个或多个，其中所述C-端表位选自下组：ΑβX-38,ΑβX-39,ΑβX-40,ΑβX-41,ΑβX-42或ΑβX-43或其修饰形式，而所述N-端表位选自(Αβ1-Y)或(Αβ2-Y)或其修饰形式，其中X为23～40之间的整数，Y为3～15之间的整数。
2.根据权利要求1所述的MIP，其特征在于，所述MIP使用至少一种单体来制备，所述单体选自交联单体和/或功能性单体，所述功能性单体在模板和可选的溶剂的存在下聚合而成，从所获得的聚合物中去除所述模板，以得到分子印迹聚合物（MIP）。
3.根据权利要求1所述的MIP，其特征在于，所述模板为ΑβX-38、ΑβX-39、ΑβX-40、ΑβX-41、ΑβX-42、ΑβX-43，或(Αβ1-Y)或(Αβ2-Y)或其修饰形式的铵盐或季铵盐。
4.根据权利要求1所述的MIP，其特征在于，所述模板选自：ΑβX-40或ΑβX-42或其修饰形式。
5.根据权利要求1-4所述的MIP，其特征在于，所述交联单体选自二乙烯基苯。
6.根据权利要求1-5所述的MIP，其特征在于，所述功能性单体选自包含一个或多个氨基的单体。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的MIP，其特征在于，所述功能性单为2-氨基乙基丙烯酸酯或其盐。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的MIP，其特征在于，加入1,3-双取代尿素单体作为第二功能性单体。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的MIP，其特征在于，所述第二功能性单体为N-3,5-二（三氟甲基）-苯基-N’-4-乙烯基苯基脲。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的MIP，其特征在于，所述模板固定到支撑物处。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的MIP，其特征在于，所述MIP通过将聚合物嫁接到支撑物的表面或纳米颗粒核心珠来制备。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的MIP，其特征在于，所述MIP选择性地结合存在于体液，例如：血液（血清或血浆），或脑脊髓液（CSF）或经过处理来引起蛋白质变性的体液，中的β-淀粉样(Aβ)肽亚型Αβ1-38(SEQ ID NO:2),Αβ1-39(SEQ ID NO:3),Αβ1-40(SEQ ID NO:4),Αβ1-41(SEQ ID NO:5),Αβ1-42(SEQ ID NO:6)，或Αβ1-43(SEQ ID NO:7)，或亚型的片段，或截断亚型中的一种或多种可溶部分（ADDL=淀粉衍生的可扩散性配体）。
13.根据权利要求1-11中任一项所述的MIP，其特征在于，用于分析存在于体液，例如：血液（血清或血浆）或脑脊髓液（CSF），或经过处理引起蛋白变性的体液，中的β-淀粉样(Aβ)肽亚型Αβ1-38(SEQ ID NO:2),Αβ1-39(SEQ ID NO:3),Αβ1-40(SEQ ID NO:4),Αβ1-41(SEQ ID NO:5),Αβ1-42(SEQ ID NO:6)或Αβ1-43(SEQ ID NO:7)，或任何截断亚型，或这些亚型的比例。
14.根据权利要求1-11中任一项所述的MIP，其特征在于，用作血液（血浆或血清）或脑脊髓液（CSF）样品中的淀粉样肽的固相提取吸附剂。
15.根据权利要求1-11中任一项所述的MIP，其特征在于，用作分析中的捕获或检测相。
16.根据权利要求1-11中任一项所述的MIP在化学传感器中的用途。
17.根据权利要求1-11中任一项所述的MIP，其特征在于，用于淀粉样沉积的“活体”成像。
18.根据权利要求1-11中任一项所述的MIP，其特征在于，用于诊断以Αβ沉积为特征的疾病或失调。
19.根据权利要求1-11所述的MIP，其特征在于，用于治疗由Αβ沉积识别的疾病或失调。
20.根据权利要求18或19所述的MIP，其特征在于，所述疾病为阿耳滋海默氏病（AD）。
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