JP6412798B2 - リガンドライブラリーを用いた診断および処置方法 - Google Patents
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（関連出願の相互参照）
出願請求項は、それぞれ２０１１年３月２４日、２０１１年５月３１日、および２０１２年１月６日に出願された米国仮出願特許番号６１／４６７，２５６号、６１／４９１，７１７号、および６１／５８３，８８１号の優先権を主張するものであり、それらの全体を参照により本明細書に援用する。
出願請求項は、それぞれ２０１１年３月２４日、２０１１年５月３１日、および２０１２年１月６日に出願された米国仮出願特許番号６１／４６７，２５６号、６１／４９１，７１７号、および６１／５８３，８８１号の優先権を主張するものであり、それらの全体を参照により本明細書に援用する。
（技術分野）
本発明は、リガンドライブラリーおよびそれから得られた活性化合物を用いた診断および処置方法に関する。特に、本発明は、疾患バイオマーカープロファイルを確認するために、および薬物有害反応、副作用、薬物耐性、および治療効果を含む薬物誘導反応を診断または検出するために使用されるリガンドを見つけ出すためにリガンドライブラリーを用いることに関する。さらに本発明は、薬物誘導反応に関連するバイオマーカーを同定すること、および個人向け医療処置に関する。
本発明は、リガンドライブラリーおよびそれから得られた活性化合物を用いた診断および処置方法に関する。特に、本発明は、疾患バイオマーカープロファイルを確認するために、および薬物有害反応、副作用、薬物耐性、および治療効果を含む薬物誘導反応を診断または検出するために使用されるリガンドを見つけ出すためにリガンドライブラリーを用いることに関する。さらに本発明は、薬物誘導反応に関連するバイオマーカーを同定すること、および個人向け医療処置に関する。
コンビナトリアル・ケミストリーにおいて、小分子マイクロアレイはますます重要なツールになってきている。このアレイの作成は、一般的に、適切なビーズ樹脂上でコンビナトリアル・ライブラリーを最初に合成し、該ビーズをマイクロタイタープレートのウェルに分けた後、ビーズから化合物を解放することで行う。ライブラリー誘導分子が表面に共有結合するように、化学的に修飾されたガラス製顕微鏡スライドに、得られた溶液をロボットで滴下する。また、アレイ表面にそのまま特定の種類の化合物を合成するための方法がいくつか存在する。小分子マイクロアレイの最も一般的な用途は、通常、目的の所定タンパク質に対する小分子リガンドを同定することを目指して、ライブラリースクリーニングのための多目的プラットフォームになってきた。
米国特許公報第２００７／０００３９５４号は、小分子マイクロアレイを用いたタンパク質および抗体プロファイリングを開示する。本出願はリガンドを開示する。当該リガンドは、合成分子のアレイにリガンドが配置されるリガンド結合部位に結合し、バイオマーカーおよび分子指紋に関するスクリーニングに使用される。本明細書で述べられる具体的なアレイとしては、例えば、上記アレイに結合した７６８０種類の化合物を有するペプチドマイクロアレイが挙げられる。その開示では、体液をスクリーニングするために、マイクロアレイ上にアドレス指定可能場所を持つマイクロアレイに後で移されるペプチドを作る初期手段としてビーズベースライブラリーを利用した。スクリーニングすることにより、複合生体混合物中の特定タンパク質に関するアレイ上に特有のパターンまたは分子指紋を生じる。参照により援用される米国特許出願第２０１０／０３０３８０５号は、中枢神経系障害に関連するバイオマーカーに関する体液のスクリーニングで有用な特定のペプチドおよび診断用アレイを開示している。本明細書でアレイを形成するために利用される本明細書で開示される特定モノマーは、ライブラリーがより多くのビーズ／ペプチドまたはビーズ／リガンド、例えば１００，０００〜１５０，０００，０００に拡張されるという条件で、本発明の新規なスクリーニング法で利用される場合もある。
この出願の発明者は、有意に大きなビーズベースライブラリー（抗体バイオマーカーに関するマイクロアレイベーススクリーニングまたは細胞に関するビーズベーススクリーニングと比べて）は、正しい条件の下で、薬物反応関連バイオマーカーのほか前記リガンド結合部位に結合するリガンドの有意に大きなプールを見つけ出すために、複合生体試料の直接的スクリーニングに使用できることを発見した。当該有意に大きなプールとしては、診断ツールのほかに可能性がある治療法としての機能を果たす有意に改善された数の高親和性リガンドが挙げられる。
一実施形態において、本発明は、リガンドライブラリーを提供する。例示的実施形態において、本発明は、ランダムペプトイドライブラリーを含む大型ビーズベースランダムリガンドライブラリーを提供する。
別の実施形態において、本発明では、被験体における薬物誘導反応を診断する方法であって、上記被験体から生体試料を得ること；上記試料に対してリガンドライブラリーをスクリーニングすること；上記試料中の１つ以上のマーカーとライブラリーの１つ以上のリガンドとの結合特性を同定すること；および、上記１つ以上のマーカーが上記薬物誘導反応と関連があるかを確認し、それによって、上記被験体における上記薬物誘導反応を診断すること、を含む方法を提供する。一つの例示的実施形態において、上記薬物誘導反応は有害反応である。別の例示的実施形態において、上記薬物誘導反応は副作用である。別の例示的実施形態において、上記薬物誘導反応は上記薬物に耐性がある。別の例示的実施形態において、上記薬物誘導反応は、投薬効果を含むその治療効果である。
別の実施形態において、本発明は、被験体において疾患を処置する方法であって、上記被験体から生体試料を得ること；上記試料に対してリガンドライブラリーをスクリーニングすること；上記試料中の１つ以上のマーカーとライブラリーの１つ以上のリガンドとの結合特性を同定すること；上記１つ以上のマーカーが上記疾患を処置するための薬物に対する反応と関連があるかを確認すること；上記１つ以上のマーカーと上記反応との関連性の確認に基づいて、上記被験体に上記薬物を投与し、それによって、上記被験体における上記疾患を処置すること、を含む方法を提供する。
別の実施形態において、本発明は、被験体における薬物に対する有害反応の危険性を検出する方法であって、上記被験体から生体試料を得ること；上記試料に対してリガンドライブラリーをスクリーニングすること；上記試料中の１つ以上のマーカーとライブラリーの１つ以上のリガンドとの結合特性を同定すること；上記１つ以上のマーカーが上記危険性と関連があるかを確認し、それによって、上記被験体における上記薬物に対する有害反応の上記危険性を検出すること、を含む方法を提供する。
別の実施形態において、本発明では、疾患を処置するための薬物に対する反応に関して１以上の被験体をプロファイリングする方法であって、上記被験体から生体試料を得ること；上記試料に対してリガンドライブラリーをスクリーニングすること；上記試料中の１つ以上のマーカーとライブラリーの１つ以上のリガンドとの結合特性を同定すること；および、上記１つ以上のマーカーが上記薬物に関する上記反応と関連があるかを確認し、それによって、上記疾患を処置するための上記薬物に対する上記反応に関して上記１以上の被験体をプロファイリングすること、を含む方法を提供する。
別の実施形態において、本発明は、疾患を処置するための薬物誘導反応と関連するマーカーを同定する方法であって、上記被験体から生体試料を得ること；上記生体試料に対してリガンドライブラリーをスクリーニングすること；上記試料中のマーカーとライブラリーのリガンドとの結合特性を確認すること；および、上記マーカーが上記疾患を処置するための上記薬物誘導反応と関連があるかを確認し、それによって、上記疾患を処置するための上記薬物誘導反応に関連する上記マーカーを同定すること、を含む方法を提供する。
別の実施形態において、本発明は、疾患を処置するための薬物と関連するマーカーを同定する方法であって、上記疾患を処置するための上記薬物に対する上記反応を発現している１以上の被験体から第１セットの生体試料を得ること；上記疾患を処置するための上記薬物に対する上記反応を発現していない１以上の被験体から第２セットの生体試料を得ること；上記第１および第２セットの生体試料に対してランダムリガンドライブラリーをスクリーニングすること；上記第１の生体試料と上記第２の生体試料との間で、前記ライブラリーにおける１つ以上のリガンドに対する１つ以上のマーカーの結合に関する差を確認すること；および上記疾患を処置するための上記薬物に対する上記反応に関連するマーカーを同定すること、を含む方法を提供する。例示的実施形態において、上記マーカーは、ペプトイドリガンドに結合する能力がある自己抗体である。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細説明の例および図から明らかになる。しかしながら、本発明の精神および範囲の中でのさまざまな変更および修正は本詳細説明から当業者にとって明らかになるため、本発明の好適な実施形態を示す詳細説明および具体例は図の手段のみで示されることを理解する必要がある。
以下の詳細説明では、発明が十分に理解されるように、多数の具体的詳細が示される。しかし、これらの具体的詳細なしに本発明を実施できる場合があるということは、当業者によって理解される。他の例では、本発明を曖昧にしないように、周知の方法、手順、および構成要素は詳細に説明されていない。
本発明はリガンドライブラリーおよびその使用を含む。特に、本発明は、分子のスクリーニング、ファーマコプロテオミクス、診断、処置、およびランダムライブラリーのその他の使用を含む。
一実施形態において、本発明では個別化医療のためのリガンドライブラリーを提供する。本明細書で使用される場合、用語「個別化医療（ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」は、それから利益を得る可能性が最も高い患者での薬物（または治療法）を対象とする、または該治療による害を受ける危険性がある患者を同定する試験（または診断）の使用のことを言う。米国および他の大部分の国で医薬品または診断製品を市販する前に、その安全性および有効の厳しい規制機関の審査を受ける。個別化医療のための診断製品の場合、治療に対する反応と特定マーカーの存在との間に関連があるかを確かめるために、医薬品を摂取した患者からの組織または体液の試験が必要となる可能性が高い。それ故に、一実施形態において、本明細書で示されるのは、被験体における疾病を処置するための薬物に対する反応を診断する方法であって、上記被験体から生体試料を得ること；上記試料に対してリガンドライブラリーをスクリーニングすること；上記試料中の１つ以上のマーカーとライブラリーの１つ以上のリガンドとの結合特性を同定すること；および、上記１つ以上のマーカーが上記薬物に対する上記反応と関連があるかを確認し、それによって、上記被験体における上記疾患を処置する上記薬物に対する上記反応を診断すること、を含む方法である。反応に例としては、有害反応、副作用、薬物耐性、投薬効果を含む治療効果が挙げられるが、これに限定されるものではない。
薬物有害反応は薬物開発計画の低い成功率の主因である（ヒト臨床試験に入る４つの化合物のうち１つ未満が最終的に米国食品医薬品局（ＦＤＡ）による使用承認を受ける）。薬物誘導性疾患または毒性は、多くの場合、前臨床試験からこれらの反応を予想できず、少数の被験体を参加させる初期臨床試験では検出できないので、薬物開発者に一連の独特な問題を示す。そのような影響が臨床開発の後期に検出されると、薬物開発計画の終了につながることがよくある。いくつかの毒性にかかわらず薬物が承認されると、その臨床使用は、小さな患者群でも有害反応の発生可能性によって頻繁に厳しい制約を受ける。そのような化合物が一次治療になる可能性が少ない（競合製品がない限りは）。本発明を使用する臨床試験では、少数の被験体を参加させる試験での潜在的な中毒反応の予測の改善を可能にする場合がある。本発明の方法は、治療介入の起こり得る将来の有毒作用の素早く導き出した予測を提供する。それ故に、別の実施形態において、本明細書で示されるのは、被験体における薬物に対する有害反応の危険性を検出する方法であって、上記被験体から生体試料を得ること；上記被験体に対してリガンドライブラリーをスクリーニングすること；上記試料中の１つ以上のマーカーとライブラリーの１つ以上のリガンドとの結合特性を同定すること；上記１つ以上のマーカーが上記危険性と関連があるかを確認し、それによって、上記被験体における上記薬物に対する有害反応の前記危険性を検出すること、を含む方法である。
本発明は、一部分において、患者における治療を個別化するのにペプトイド結合バイオマーカーの組み合わせを使用できるという驚きの発見に基づく薬物に対する反応が患者間で大きく変動することから、本発明の分析方法は特に有益である。その理由は、患者の疾患が特定の薬物または薬物の組み合わせによる処置に反応する可能性が高いかどうかを判断するために、複数の分子決定基（例えば、ペプトイド結合バイオマーカー）の結合特性における差を考慮する組み合わせ戦略を利用するからである。患者が応答者と分類されると、中毒性副作用を含まずに治療効果を発揮するために、その患者に合わせられた投薬計画を作成できる。その結果として、応答者と分類された患者は、そのような治療に関連した副作用を経験せずに、薬物誘導性治療の十分な恩恵を受けることができる。同様に、薬物による処置を既に受けている患者は、薬物の二次投与量を調整することによって治療効果を下げずに、中毒性副作用の減少を経験できる。同様に、薬物に対する耐性が生じたか、そして別の治療法を施すべきかを評価するために、薬物による処置を既に受けている患者を監視できる。
結果として、本発明の方法は、被験体の疾患を処置することを可能にする。この方法は、上記被験体から生体試料を得ること；上記被験体に対してリガンドライブラリーをスクリーニングすること；上記試料中の１つ以上のマーカーとライブラリーの１つ以上のリガンドとの結合特性を同定すること；上記１つ以上のマーカーが上記疾患を処置するための薬物に対する反応と関連があるかを確認すること；上記１つ以上のマーカーと上記反応との関連性の確認に基づいて、上記被験体に上記薬物を投与し、それによって、上記被験体における上記疾患を処置すること、を含む。別の実施形態において、本発明は、被験体において薬物による処置を監視することを提供するもので、上記方法は、上記被験体から生体試料を得ること；上記被験体に対してリガンドライブラリーをスクリーニングすること；上記試料中の１つ以上のマーカーとライブラリーの１つ以上のリガンドとの結合特性を同定すること；上記１つ以上のマーカーが上記疾患を処置するための薬物に対する反応と関連があるかを確認すること；上記１つ以上のマーカーと上記反応との関連性の確認に基づいて、上記被験体に上記薬物を投与し、それによって、上記被験体における上記薬物による上記処置を監視すること、を含む。
別の実施形態において、本発明は、ファーマコプロテオミクスのためのリガンドライブラリー、および薬物に対する反応に関連したマーカーを同定すること提供する。それ故に、一実施形態において、本明細書で示されるのは、疾患を処置するための薬物誘導反応と関連するマーカーを同定する方法であり、この方法は、被験体から生体試料を得ること；上記生体試料に対してリガンドライブラリーをスクリーニングすること；上記試料中のマーカーとライブラリーのリガンドとの結合特性を確認すること；および、上記マーカーが上記疾患を処置するための上記薬物誘導反応と関連があるかを確認し、それによって、上記疾患を処置するための上記薬物誘導反応に関連する上記マーカーを同定すること、を含む。例示的実施形態において、薬物に対する反応は、投薬治療、その投与量、または有害反応に対する患者の反応である。
一実施形態において、バイオマーカーの１件以上の推定ヒットまたはリードを同定は、本発明のリガンドライブラリーを用いて行われる。被験体または複数の被験体（例えば、患者集団または亜集団）から生体試料を得てもよい。一部の実施形態では、第１セットの生体試料を、反応（例えば、薬物誘導反応または疾患に対する反応）を示す複数の被験体から得てもよく、そして第２セットの生体試料を、反応を示さない複数の被験体から得てもよい。第１および第２セットの生体試料に対して、リガンドライブラリーを調査してもよい。第１セットの生体試料と第２セットの生体試料との間で、ライブラリーにおける１つ以上のリガンドに対する１つ以上のマーカーの結合特性の違いを確認できる。結合特性の違いに基づいて、バイオマーカーの推定ヒットまたはリードを同定できる。一部の実施形態において、推定ヒットまたはリードは、例えば薬物に対する患者の反応、疾患に対する反応、特定の病期に対するなどの反応に関連する抗原に対する抗体を認識するバイオマーカーである。
一実施形態において、推定ヒットまたはリードを同定するために、約３５０，０００〜約２５０，０００，０００に及ぶペプトイドリガンドを有するビーズベース大型ランダムペプトイドリガンドライブラリーを使用してもよい。その後、本明細書で述べられる診断または併用診断のための次のスクリーニングにおいて試料に対してスクリーニングするために、初期ランダムライブラリースクリーニングで同定されたバイオマーカーの推定ヒットまたはリードを使用してもよい。
一部の実施形態において、その後のスクリーニングにおいて推定ヒットまたはリードを検証する。一実施形態において、初期スクリーニングで使用された同じリガンドライブラリーを、検証二次スクリーニングで使用してもよい。別の実施形態において、（初期スクリーニングで使用されたものと違う）異なるリガンドライブラリーを、検証二次スクリーニングで使用してもよい。
一実施形態において、初期スクリーニングにおいて第１特性（例えば、疾患に対する反応）に関連した推定ヒットまたはリードを同定し、同定した推定ヒットまたはリードを使用して、第２特性（例えば、薬物に対する反応）との関連性を確認するために試料に対してスクリーニングする。一実施形態において、疾患に関連した推定ヒットまたはリードを、初期スクリーニングにおいて同定する。同定した推定ヒットまたはリードを使用することで、上記疾患の特定の病期との関連性について、検証および確認の両方を行う。
一部の実施形態において、大型ランダムリガンドライブラリーを用いて、ビーズベースの装置で推定ヒットを同定する初期スクリーニングを行ってもよい。また、診断または併用診断のための二次スクリーニングを、例えば、非ランダムまたはランダムリガンドライブラリーを用いたマイクロアレイなどのプラットフォームを用いて、行ってもよい。
一実施形態において、診断または併用診断のためのその後のスクリーニングにおいて、第１リガンドライブラリーに対して第１スクリーニングを行い、第２リガンドライブラリーに対してその後のスクリーニングを行ってもよく、前記第１リガンドライブラリーは第１セットのリガンドを含み、および第２リガンドライブラリーは第２セットのリガンドを含む。一例では、疾患に関連するマーカーを同定するために第１リガンドライブラリーをスクリーニングし、その後のスクリーニングで第２リガンドライブラリーをスクリーニングすることで、薬物誘導反応に関連するマーカーを同定する。
一例において、疾患に関連するものを確認するために、薬物処置前に収集された患者試料の第１スクリーニングに推定ヒットまたはリードを使用することで、疾患に関連するものを確認する。薬物処置後に患者から試料を収集してもよく、一実施形態では、事前処置群で使用された同じ推定ヒットを使用して、特定の病期または薬物処置に対する反応の変化を有する患者を同定してもよい。別の実施形態では、薬物投与による薬物関連副作用または処置効果を監視するために、異なる推定ヒットを使用するが、必ずしも事前処置プロファイルと相関関係はなく、あるいは関連しない。一部の実施形態では、薬物処置に関連するかもしれない更なるバイオマーカーを見つけるために、別のランダムライブラリーを使用してもよい。
本明細書で使用される場合、用語「薬物（ｄｒｕｇ）」は、限定されるものではないが、合成無機化合物または有機化合物、タンパク質、ペプチド、多糖類および他の糖類、脂質、ＤＮＡ核酸配列およびＲＮＡ核酸配列、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体、受容体リガンド、酵素、接着ペプチド、抗原、ホルモン、成長因子、リボザイム、並びにレトロウイルスベクターを含む薬物のことを言う。
本発明は、当業者には公知の適切な薬物を包含する。これらの薬物は、次の文献に列挙されている。すなわち、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ； Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ， ＰＤＲ Ｎｅｔｗｏｒｋ， ２０１１ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １， ２０１０）；米国特許第 ７，９３２，２９４号および米国特許公報第２００６００４６９６７号、第２０１１０２７４６９５号、第２０１１０２６９７２２号、第２０１１０２６９７０９号、および第２００６０２０５６７４号。そのすべてが、全体として参照することにより本明細書に援用される。
一実施形態では、前記薬物が以下の分類／群の１つ以上から選択される。すなわち、抗生物質、鎮痛剤、睡眠薬、抗鬱剤、抗精神病薬、抗躁薬、鎮痛剤、解熱剤、抗片頭痛薬、抗痙攣薬、パーキンソン病および運動障害で使用される薬物、認知症の薬物、制吐薬、目まいの薬物、ＣＮＳ興奮剤および活性剤、抗感染性目薬、抗炎症薬、抗アレルギー薬、抗緑内障薬、眼疾患治療薬、点耳薬、点鼻薬、口腔咽頭薬、抗不整脈薬、降圧剤、α／β遮断薬、チャンネル遮断薬、ＡＣＥ阻害薬、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬、利尿薬、抗狭心症薬、硝酸塩、カルシウムチャンネル遮断薬。心不全および心臓ショックの薬物、血管拡張剤、凝固剤、抗凝固剤、血栓溶解剤、抗血小板薬、呼吸刺激薬、鎮咳薬、去痰薬、粘液溶解薬、充血除去剤、抗ヒスタミン薬、抗ぜんそく薬；抗潰瘍薬、抗分泌薬、Ｈ２受容体拮抗薬、タンパク質ポンプ阻害薬、プロスタグランジン類似体、制酸薬、抗痙攣薬、腸運動改善する薬物、下痢止め薬、腸運動抑制薬、抗菌薬、胆嚢に作用する薬物、尿路感染症薬、利尿薬、尿路鎮痛薬、鎮痙攣薬、尿道および膣に作用する抗感染症薬、子宮に作用する薬物、前立腺肥大の薬物、α遮断薬、抗アンドロゲン薬、勃起障害の薬物、殺精子剤、非ホルモン避妊薬、皮膚軟化剤、角質溶解薬、局所性抗感染症薬、局所性抗真菌薬、局所性殺寄生虫薬、局所ステロイド、尋常性座瘡の局所用薬物、乾癬、色素異常症、および抗脂漏性の薬物、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ＣＯＸ−２阻害薬、抗関節炎薬、免疫抑制剤、局所性鎮痛剤、筋弛緩薬、神経筋薬、ペニシリン系抗生物質、セファロスポリン系抗生物質、キノロン、フルオロキノロン系抗生物質、マクロライド系抗生物質、クロラムフェニコール、テトララサイクリン系抗生物質、スルホンアミド、抗嫌気性菌薬、メトロニダゾール、抗結核薬、抗ハンセン病薬、抗真菌剤、抗原虫薬、駆虫薬、抗感染症薬、抗マラリア薬、抗ウイルス薬、同化剤、アンドロゲン性ステロイド、コルチコステロイド、エストロゲン、プロゲストゲンおよびホルモン避妊薬、不妊治療薬、栄養ホルモンおよび関連薬、甲状腺および抗甲状腺薬、抗糖尿病薬および高血糖薬、ビタミン、アミノ酸、抗肥満薬、脂質低下薬、フィブリン酸誘導体、スタチン、ＨＭＧ ＣｏＡ還元酵素阻害薬、ニコチン酸系薬、痛風に使用される薬物、骨代謝に影響を及ぼす薬物、ビスフォスファネート、抗癌剤、アルキル化剤、細胞特性抗生物質、代謝拮抗物質、シタラビン、フルダラビン、５−フルオロウラシル、メルカプトプリン、チオグアニン、ビンカアルカロイド、エトホシド、タキサン、トポイソメラーゼ１阻害薬、細胞毒性免疫抑制剤、免疫刺激剤、細胞保護剤、アミホスチン、エストロゲン、プロゲストゲン、ホルモン拮抗薬、抗新生物薬、抗アレルギー薬、非鎮痛性抗ヒスタミン薬、セチリジン、デスロラタジン、テルフェナジン、フェキソフェナジン、鎮痛性ヒスタミン薬、ヒスタミン受容体遮断薬、局所麻酔薬、静脈麻酔、吸入麻酔、および筋弛緩薬。
一実施形態では、前記薬物が下表１に記載の１つ以上から選択される。
別の実施形態では、前記薬物が以下のうちの１つ以上から選択される。すなわち、アバカビル、アリピプラゾール、三酸化ヒ素、アトモキセチン、アトルバスタチン、アザチオプリン、ボセプレビル、ブレンツキシマブベドチン、ブスルファン、カペシタビン、カルバマゼビン、カリソプロドール、カルベジロール、セレコキシブ、セツキシマブ（１）、セツキシマブ（２）、セビメリン、クロルジアゼポキシドおよびアミトリプチリン、クロロキン、シタロプラム（１）、シタロプラム（２）、クロバザム、クロミフェン、クロミプラミン、クロピドグレル、クロザピン、コデイン、クリゾチニブ、ダプソン、ダサチニブ、デシプラミン、デスロラタジンおよび偽エフェドリン、デクスランソプラゾール（１）、デクスランソプラゾール（２）、デキストロメトルフェンおよびキニジン、ジアゼパム、ドキセピン、ドロスピレノンおよびエチニル、エストラジオール、エルロチニブ、エソメラプラゾール、フルオロウラシル、フルオキセチンおよびオランザピン、フルルビプロフェン、フルボキサミン（１）、フルボキサミン（２）、フルボキサミン（３）、フルベストラント、ガランタミン、ゲフィチニブ（１）、ゲフィチニブ（２）、イロペリドン、イマチニブ（１）、イマチニブ（２）、イマチニブ（３）、イマチニブ（４）、イミプラミン、インダカテロール、イリノテカン、イソソルビドおよびヒドララジン、ラパチニブ、レナリドマイド、マラビロク、メルカプトプリン、メトプロロール、ミバクリウム、モダフィニル（１）、モダフィニル（２）、ネファゾドン、ネルフィナビル、ニロチニブ（１）、ニロチニブ（２）、ノルトリプチリン、オメプラゾール、パニツムマブ（１）、パニツムマブ（２）、パントプラゾール、パロキセチン、ペグインターフェロンα−２ｂ、ペルフエナジン、フェニトイン、ピモジド、プラスグレル、プラバスタチン、プロパフェノン、プロプラノロール、プロトリプチリン、キニジン、ラベプラゾール、ラスブリカーゼ、リファンピン、イソニアジド、ピラジナミド、リスペリドン、フェニル酢酸ナトリウムおよび安息香酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、タモキシフエン、テラプレビル、テルビナフィン、テトラベナジン、チオグアニン、チオリダジン、チカグレロール、チモロール、チオトロピウム、トシツモマブ、トラマドールおよびアセトアミノフェン、トラスツズマブ、トレチノイン、トリミプラミン、バルプロ酸、ベムラフェニブ、ベンラファキシン、ボリミナゾール、ワルファリン（１）、およびワルファリン（２）。
別の実施形態において、本発明では、公知の薬物標的を標的にする薬物に対する併用診断を含む。別の実施形態において、本発明では、臨床試験を受けている薬物標的に対する併用診断を含む。臨床試験を受けている薬物標的の例として、限定されるものではないが、ビピネオズマブ、ソラネズマブ、静注免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）、ラトレピルジン（Ｄｉｍｅｂｏｎ）、シロ−イノシトール／ＥＬＮＤ ００５、塩化メチルチオニニウム（Ｒｅｍｂｅｒ）、ＣＥＲＥ−１１０、ＰＢＴ２、ダブネチド／ＡＬ−１０８、ＢＭＳ−７０８１６３、ＰＦ−０４４９４７００／ＴＴＰ４８８、ジデグルシブ／ＮＰ−１２（Ｎｙｐｔａ）、ベリムマブ、アタシセプト、マパツムマブ、アポマブ、デュラネルミン、オダナカチブ、ＡＭＧ−７８５、ＤＧ−０４１、ＯＣ−０００４５９、ＰＬＸ−４０３２，ＬＸ−１０３１，およびＬＸ−１０３２が挙げられる。
１つ以上の試料成分（例えば、バイオマーカー）の結合プロファイルを用いることで、当業者にとって公知である疾患を予測、診断、評価または処置することができる。用語「疾患（ｄｉｓｅａｓｅ）」または「病状（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」は当該技術分野で一般的に認識され、一般的に異常と認識される個人または患者での兆候および／または症状の存在を規定する。病理学的変化に基づいて、疾患または病状を診断および分類してもよい。兆候は、患者の診察または診断検査の結果によって明らかな変化などの疾患の客観的証拠を含んでもよい。症状は、疾患、または患者の病状の自覚的証拠である。すなわち、症状は、正常な機能、感覚、または外見と違う異常状態の患者の感じ方であり、制限なく、個人が経験する身体障害、病的状態、痛み、および正常状態からの他の変化を含んでもよい。さまざまな疾患または病状としては以下が挙げられるが、これに限定されない。すなわち、栄養、逆症療法、ホメオパシー、および整骨療法の教科書を制限なく含む医療の標準的教科書で分類されるもの。本発明の特定の態様において、疾患または病状は、以下のような標準的教科書に記載の疾患の種類からなる群から選択される。すなわち、Ｈａｒｒｉｓｏｎ´ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， １４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｆａｕｃｉ ｅｔ ａｌ， Ｅｄｓ．， ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ， １９９７）、または Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ， ６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｃｏｔｒａｎ ｅｔ ａｌ， Ｅｄ． Ｗ Ｂ Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．， １９９８）、または ｔｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｎｔａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ： ＤＳＭ−ＩＶ， ４．ｓｕｐ．ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， （Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９９４）、あるいは他の教科書。これらは、その全体が引用により援用される。疾患は、米国特許公報第２００７／０００３９５４号および第２０１１／００９２３８４号にも記載され、その全体が引用により援用される。
疾患または病状の例として、限定されるものではないが、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染性疾患、神経変性疾患、心臓血管疾患、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、プリオン感染症、生理学的状態、汚染状態、または一般的な健康が挙げられる。
本発明のランダムリガンドライブラリースクリーニングは、結合特性を利用して、疾患またはその状態のさまざまな形態を区別することができる。例えば、この方法を用いて、癌の転移状態、または薬物に対する感受性、または病態を確認してもよい。一部の実施形態において、本発明は、癌に存在する、あるいは癌に関連するリガンド結合部位を評価するための方法および組成物を含むもので、該癌の例として、限定されるものではないが、乳癌、肺癌、前立腺癌、子宮頸癌、頭頸部癌、精巣癌、卵巣癌、皮膚癌、脳腫瘍、膵臓癌、肝臓癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、食道癌、リンパ腫、および白血病が挙げられる。
一部の実施形態において、本発明は、自己免疫疾患で存在するリガンド結合部位を評価するための方法および組成物を含む。このような自己免疫疾患の例として、限定されるものではないが、以下の疾患が挙げられる。すなわち、重症筋無力症、慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、拡張型心筋症、心筋炎、多線性自己免疫性症候群１型（ＡＰＳ−１）、自己免疫性肝炎、嚢胞性線維症血管炎、後天性甲状腺機能低下症、グッドパスチャー症候群、クローン病、冠動脈疾患、落葉状天疱瘡、尋常性天疱瘡、ギラン・バレー症候群、１型糖尿病、スティフマン症候群、ラスムッセン脳炎、自己免疫性胃炎、アジソン病、インスリン低血糖症候群（平田病）、Ｂ型インスリン耐性症、表皮肥厚症、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、悪性貧血、治療抵抗性ライム病関節炎、多発ニューロパシー、多発性硬化症、脱髄疾患、リウマチ熱、アトピー性皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、バセドウ病、自己免疫性甲状腺機能低下症、白斑、甲状腺関連眼病、自己免疫性甲状腺炎、橋本自己免疫甲状腺炎、セリアック病、ＡＣＴＨ欠損症、筋炎、皮膚筋炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、全身性硬化症、全身性進行性硬化症、全身性硬化症、強皮症、限局性強皮症、原発性抗リン脂質抗体症候群、水疱性類天疱瘡、妊娠性疱疹、瘢痕性類天疱瘡、慢性特発性じんましん、結合組織症候群、壊死性半月体形成性糸球体腎炎（ＮＣＧＮ）、全身性血管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、チャーグ・ストラウス症候群、多発性筋炎、レイノー症候群、慢性肝疾患、内臓リーシュマニア症、自己免疫性Ｃ１欠損症、増殖性膜糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）、凝固時間延長、自己免疫性血小板減少性紫斑病、免疫不全症、アテローム性動脈硬化症、神経細胞傷害、腫瘍随伴性天疱瘡、腫瘍随伴性スティフマン症候群、腫瘍随伴性脳脊髄炎、亜急性自律性ニューロパシー、癌関連網膜症、腫瘍随伴性オプソクローヌス・ミオクローヌス失調、下位運動ニューロン症候群、ランバート・イートン筋無力症候群、および腫瘍随伴性小脳変性症。
一実施形態において、本発明は、感染症で存在するリガンド結合部位を評価するための方法および組成物を含む。このような感染症の例として、限定されるものではないが、以下の感染症が挙げられる、すなわち、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、炭疽病、ボツリヌス中毒症、ブルセラ症、軟性下疳、クラミジア感染症、コレラ、コクシジオイデス症、クリプトスポリジウム症、シクロスポラ症、ジフテリア、エーリキア症、アルボウイルス脳炎、腸管出血性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ランブル鞭毛虫症、淋病、インフルエンザ菌感染症、ハンセン病（癩）、ハンタウイルス肺症候群、溶血性尿毒症症候群、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症、レジオネラ症、リステリア症、ライム病、マラリア、はしか、髄膜炎菌性疾患、おたふく風邪、百日咳（百日咳）、ペスト、まひ性灰白髄炎（ポリオ）、オウム病（オウム病）、Ｑ熱、狂犬病、ロッキー山発疹熱、風疹、先天性風疹症候群、サルモネラ症、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、細菌性赤痢、天然痘、連鎖球菌感染症（侵襲性群Ａ）、連鎖球菌毒素性ショック症候群（ＳＴＳＳ）、肺炎連鎖球菌感染症、梅毒、破傷風、毒素性ショック症候群、旋毛虫病、結核、野兎病、腸チフス、バンコマイシン中間耐性黄色ブドウ球菌感染症、水痘、黄熱病、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病（ｖＣＪＤ）、デング熱、エボラ出血熱、エキノコックス症（多包虫症）、ヘンドラウイルス感染症、ヒトサル痘、Ａ型インフルエンザＨ５Ｎ１（鳥インフルエンザ）、ラッサ熱、マールブルグ出血熱、ニパウイルス感染症、オニョンニョン熱、リフトバレー熱、ベネズエラウマ脳炎、および西ナイルウイルス感染症。
本発明のリガンドライブラリーを使用して、病期、例えば、疾患の早期または疾患の進行した末期のスクリーニングを行ってもよい。
さらに別の実施形態において、本発明は、神経変性疾患で存在するリガンド結合部位を評価するための方法および組成物を含む。このような神経変性疾患の例として、限定されるものではないが、脳卒中、血液量減少性ショック、外傷性ショック、再かん流傷害、多発性硬化症、ＡＩＤＳ、並びに、神経毒性、アルツハイマー病、頭部外傷、成人呼吸器疾患（ＡＲＤＳ）、急性脊髄損傷、ハンチントン病、およびパーキンソン病に関連する認知症が挙げられる。
本発明は、ペプトイド、ペプチド、オリゴマー、小分子、および天然または合成によって作られたあらゆる分子から選択される化合物の粒子ベースライブラリーを含み、ビーズまたは小粒子などの支持システムに置くことができる組成物を含む。
本発明に従って、薬物に反応する抗体を結合するペプトイドを含む組成物、およびペプチドが固定された支持体に抗体含有試料を接触させることを含む抗体含有試料中の抗体を検出する方法を提供する。リガンドライブラリーには式Ｉの化合物が含まれ、式中、アミン側鎖またはα炭素上のＲ基は、独立して、水素；アルキル；アリル；メチル；エチル；ｎ−プロピル；イソプロピル；ｎ−ブチル；イソブチル；ｎ−ブチルアミン；ｓｅｃ−ブチル；ｔｅｒｔ−ブチル；ペンチル；ヘキシル；イソペンチル；アリール；ヘテロアリール；フラニル；インドリル；チオフェニル；チアソセリル；イミダゾリル；イソオキサゾイル；オキサゾイル；ピペロニル；ピラゾイル；ピロリル；ピラジニル；ビリジル；ピリミジル；ピリミジニル；プリニル；シンノリニル；ベンゾフラニル；ベンゾチエニル；ベンゾトリアゾリル；ベンゾオキサゾリル；キノリン；イソオキサゾリル；イソキノリンシクロアルキル；アルケニル；シクルアルケニル；フェニル；ピリジル；メトキシエチル；（Ｒ）−メチルベンジル；Ｃ０−６アルキルアリール；Ｃ０−６アルキルヘテロアリール；ＯＨ、ＳＨ、ハロゲン、ＯＲ１５、ＣＯＯＲ１５、ＮＲ１５（ここで、Ｒ１５はＨまたはＣ１−６アルキルまたはＣ１−６アルキニルからなる群から選択される）、またはＲ１６（ここで、Ｒ１６はＨまたはＣ１−６アルキニルからなる群から選択される）から選択される群で置換されたＣ１−６アルキル；ＯＣ１−６アルキル；Ｃ２−６アルケニル；Ｃ２−６アルキニル；Ｃ２−６アルケニル；およびＣ２−６アルキニルからなる群から選択され、下記の表１および２に記載の１つ以上の化学基を含む。
一実施形態では、本発明のリガンドライブラリーは、支持体上に式１の化合物を含んでもよい。
式中、
Ｒ１は電子が豊富なアミノ酸側鎖Ｙから選択され；
および、Ｒ３〜Ｒ６は、独立して、Ｈ、−Ｃ１−Ｃ６アルキル、−Ｃ１−Ｃ６アルキルＳＣＨ３、−Ｃ０−Ｃ６アルキルＣ２−Ｃ６アルケニル、−Ｃ０−Ｃ６アルキルＣ２−Ｃ６アルキニル、−Ｃ１−Ｃ６ＣＯＯＨ、−Ｃ１−Ｃ６アルキルＯＨ、−Ｃ１−Ｃ６アルキルＮ（Ｒ）２、−Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、−Ｃ１−Ｃ６アルキルアリール、−Ｃ１−Ｃ６アルキルヘテロアリール、−Ｃ１−Ｃ６アルキルＮＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ６アルキル、−Ｃ１−Ｃ６アルキルシクロアミドからなる群から選択され、ここで、アリールまたはヘテロアリール基のいずれも、独立して、−ＯＨ、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、−ＯＣＨ３、−ＳＯ２ＮＨ２、または−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−で置換されてもよい。
Ｒ１は電子が豊富なアミノ酸側鎖Ｙから選択され；
および、Ｒ３〜Ｒ６は、独立して、Ｈ、−Ｃ１−Ｃ６アルキル、−Ｃ１−Ｃ６アルキルＳＣＨ３、−Ｃ０−Ｃ６アルキルＣ２−Ｃ６アルケニル、−Ｃ０−Ｃ６アルキルＣ２−Ｃ６アルキニル、−Ｃ１−Ｃ６ＣＯＯＨ、−Ｃ１−Ｃ６アルキルＯＨ、−Ｃ１−Ｃ６アルキルＮ（Ｒ）２、−Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、−Ｃ１−Ｃ６アルキルアリール、−Ｃ１−Ｃ６アルキルヘテロアリール、−Ｃ１−Ｃ６アルキルＮＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ６アルキル、−Ｃ１−Ｃ６アルキルシクロアミドからなる群から選択され、ここで、アリールまたはヘテロアリール基のいずれも、独立して、−ＯＨ、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、−ＯＣＨ３、−ＳＯ２ＮＨ２、または−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−で置換されてもよい。
複合体液をスクリーニングするためのランダムリガンドライブラリー（例えば、リガンドライブラリー）の化合物は、米国特許仮出願第６１／４６７，２５６号および第６１／４９１，７１７号で詳しく説明されており、その全体が引用により援用される。
適切な実験条件の下で、本発明の大型リガンドライブラリーを体液で直接利用し、より少ない支持部材（例えば、約１００，０００以下）を使用する必要なしに、あるいは体液をスクリーニングする前に前記ペプトイドまたはリガンドをマイクロアレイに移す必要なしに、バイオマーカーをスクリーニングできる。さらに、特定細胞表面マーカーに特に関連する細胞ベース受容体に関するスクリーニングにも、リガンドライブラリーを使用してもよい。以前の方法と違い、本発明はより多くのビーズ／樹脂を含めることを可能にし、したがって、複合生体試料を直接スクリーニングするために、リガンド結合剤スクリーニングまたは細胞受容体スクリーニングのいずれでも、より大きなライブラリーを含めることができる。
マイクロアレイシステムに対する前述の通り、ランダムビーズまたは樹脂ベースライブラリーを構築するために、ほぼすべての分子または化合物を使用してもよい。これらの「分子」または「化合物」には、天然物または人工化合物または合成的に誘導された分子を含んでもよい。前記分子の源は、生物系からのほか、非生物学的に誘導された源であってもよい。本発明で請求される条件の下で、大型ビーズライブラリーを用いた初期スクリーニング目的に好適なリガンドは、一部分においてサブモノマーから作られ、そのサブモノマーは公知の単量体アミンおよび公知の酢酸ハロゲン化物または置換酢酸ハロゲン化物から選択される。例えば、その全体が引用により援用される米国仮出願特許第６１／４６７，２５６号の表１は、一置換アミン上のさまざまなＲ基を示す。
一部の実施形態において、モノマーおよび／またはサブモノマーは、システイン、グリシン、メチオニン、アリルアミン、エタノールアミン、イソブチルアミン、ジアミノブタン、メチルベンジルアミン（ラセミ化合物または鏡像異性体）、ピペロニルアミン、シクロヘキシルアミン、３，４−ジメトキシフェネチルアミン、ベンジルアミン、Ｎ−（２−アミノエチル）アセトアミド、Ｎ−（３−アミノプロピル）−２−ピロリジノン、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホンアミド、またはフルフリルアミンからなる群から選択される。
酢酸ハロゲン化物および／またはＲ置換酢酸ハロゲン化物（Ｒが任意のアミノ酸側鎖から、または一置換アミン上に基または変数を含む任意の他の群から選択される）も、サブモノマーとして利用される。あるいは、モノマーを形成するために、任意のアミンと任意の酢酸ハロゲン化物の組み合わせを反応させてもよい。その後、上記組み合わせは、本発明のオリゴマーを形成するために、成長するペプトイド鎖上で別の反応性モノマーと反応させられる。
ペプトイドの組み合わせライブラリーは、以下のように作成できる。すなわち、支持体に、あるいは支持体、樹脂、またはビーズ上のリンカーに付着したシステインまたはメチオニン単量体アミノ酸を有するペプトイドを、支持体または支持体上のリンカーに保護アミノ酸をまず添加することで作成できる。上記アミノ酸（あるいは、オリゴマーで機能的目的または他の目的、または上記オリゴマーを有する診断法を果たすことができるように求められる任意のアミノ酸）の添加後、標準ペプチド化学を用いて、あるいはブロモ酢酸（またはα置換ブロモ酢酸または同様の反応物）のサブモノマーとアミンがＲ基で置換される一置換アミンを用いて、残りのモノマーを添加できる。上記Ｒ基は、例えば、その全体が引用により援用される、米国特許公報第２０１０／０３０３８０５号または第２０１０／０３０３８３５号で述べられたもの、および／またはＺｕｃｋｅｒｍａｎｎおよびさまざまなＫｏｄａｄｅｋ出版物で述べられたものを含む任意で公知のペプトイド置換基から選択してもよい。好適なアミンは、１，０００，０００〜２５０，０００，０００のビーズまたは樹脂ライブラリーを構築するために特定の単量体アミンが各ライブラリーに追加される本明細書で列挙されたライブラリーから選択されるものである。好適なライブラリーの大きさは、その上に多様な化合物を有する１，０００，０００〜５０，０００，０００のビーズまたは樹脂に及ぶ。
各ペプトイドを作成するプロセスでは一般的に、（１）支持体（支持体上のオプションのリンカーを含む）上のアミノ酸反応物の調製；（２）ハロゲン化誘導体を形成するための、上記支持体上のアミノ酸部分の反応物とブロモ酢酸またはクロロ酢酸などのハロゲン化アシルとの反応、（３）アミドを形成するためのハロゲン化誘導体と一置換アミンの反応、（４）ペプトイドからステップ（２）および（３）の繰り返しを伴う。メチオニン含有ペプトイドは、一般的に大型ライブラリーで作成される。システイン含有ペプトイドは、大規模な量の高親和性ペプトイドが必要な時に、そして大型ビーズまたは樹脂ライブラリーの初期スクリーニングの後に一般的に作成される。血清などの複合体液を初期スクリーニングするために使用される大型ビーズライブラリーでは、マイクロアレイスクリーニングに一般的に必要な長いＰＥＧリンカーの必要はなく、あるいはその要件はない。ＰＥＧリンカーは、約１０モノマー未満の短いリンカーであることを条件に、ビーズまたは樹脂上にあってもよい。約５０ミクロン未満（例えば、１０ミクロン）のヘッドまたはＴｅｎｔａｇｅｌビーズを含む診断キットでは、短いＰＥＧリンカー（例えば、２〜１０のＰＥＧモノマー）または長いＰＥＧオリゴマーの両方を使用するのに便利であり、利用できる。
オリゴマー構築プロセスの各ステップを行うために使用される条件では、ＤＭＦまたは酢酸ニトリルまたはジクロロメタンなどの溶剤を利用する。開裂目的にはトリフルオロ酢酸が利用され、ピペリジンまたは他の好適なベースは、ブロモ誘導体とアミンの反応でのベースとして使用される。アミノ酸反応物の調製では、さまざまな保護基が利用される。好適な実施形態では、ペプトイドのＣ末端にあるシステイン残基に隣接した鎖での最初のアミンサブモノマーとして、ジアミノブタンが利用される。プロセスの最初のステップで、選択されたビーズまたは樹脂（グラムまたはミリグラムの量で）をＤＭＦなどの適切な溶剤で膨張させ、ビーズが上記ビーズ上の反応性アミンの保護基で「保護」される場合、ヘッドを脱保護するために、ＤＭＦによるその後の洗浄でピペリジンなどの塩基溶液を繰り返し添加する。一旦、ビーズを脱保護すると、あるいはＴｅｎｔａｇｅｌビーズなどのビーズを最初に利用する場合、ＤＭＦなどの適切な溶剤中で、システインまたはメチオニン（窒素上のＦｍｏｃまたは他の適切な保護基で保護され、および硫黄上のＴｒｔ（トリフェニルメチル）で保護され、各ビーズと反応させるために十分なモル量で）などの適切なアミノ酸と反応させてもよい。ビーカー（または試験管またはフラスコ）に入ったビーズ溶液に保護アミノ酸と一緒にＨＢＴＵ（テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）（カップリング試薬）および４−メチルモルフォリン（塩基）を添加し、樹脂に（または樹脂上のリンカーに）Ｆｍｏｃ／Ｔｒｔ保護アミノ酸を形成するために室温で撹拌する。その後、ＤＭＦなどの溶剤中でビーズを数回洗浄する。その後、加熱下（撹拌しながらマイクロ波をかける）、適切な溶剤中で、別の保護アミノ酸などの別の反応物とのアミノ酸上のアミンの反応を可能にする適切な試薬、またはブロモ酢酸などのサブモノマーおよびＤＩＣ（３−イソプロピルカルボジイミド）などの活性化剤を用いてＦｍｏｃ基を脱保護する。その後、結果として得られたビーズを数回洗浄し、次に、過熱下、適切な溶剤柱で望ましい単量体アミン（わずかなモルで過剰な量で）で処理する。結果として得られたビーズを数回洗浄し、その後、オリゴマーおよびオリゴマーを構築するために、ブロモ酢酸および最適なアミンで繰り返し処理する。トリフルオロ酢酸を用いて、ビーズからペプトイドを開裂させてもよい。好適な実施形態を含むペプトイド、例えば１−イル−ｎ−ブチルアミンを有するモノマーに隣接するシステインを有するペプトイドのための別のプロセスまたは他の適切なプロセスは、第二アミノ酸がリシンであるサブモノマー処理で構築されたモノマーのいずれかを添加することをさらに含む処理により、Ｃ末端に２つのアミノ酸を有するペプトイドを構築することを含む。これには、反応物の反応後に、ペプトイド鎖上の炭素またはペプトイド鎖上の窒素のいずれか、または両方にＲ基が見つかるα置換ペプトイドを作成するために、一般的なアミノ酸側鎖から炭素置換基を選択してもよいα置換ブロモ酢酸サブモノマーを作成するために、任意のモノマーまたはサブモノマーの選択を含む。α炭素または窒素上の置換基は、本明細書で列挙されるほぼどの置換基であってもよい。
小分子の組み合わせライブラリーを、当該技術分野で公知の方法を用いて商業的に入手しても、あるいは作成してもよい。例えば、Ｂｉｃｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９５； Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ， １９９９； ＬｅＰｉａｅ ｅｔ ａｌ．， ２００２； Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄ ａｎｄ Ｈｏｌｍ， １９９７； Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ， １９９９）を参照。さらに、米国特許第６，３４４，３３４号、およびＧａｌｌｏｐ等（１９９４年）、Ｇｏｒｄｏｎ等（１９９４年）、ＴｈｏｍｐｓｏｎおよびＥｉｌｍａｎ（１９９６年）による出版物も、上記分子およびライブラリーの情報源である。
ペプチドの組み合わせライブラリーを、当該技術分野で公知の方法を用いて商業的に入手しても、あるいは作成してもよい。例えば、次の参考文献を参照：ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ（１９８４年）；Ｔａｍ等（１９８３年）；ＭｅｒｒｉｆｔｅＭ（１９８６年）；並びにＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９７９年）。これらの各々は、引用により援用される。
ＲＮＡまちはＤＮＡを含む核酸の組み合わせライブラリーを、当該技術分野で公知の方法を用いて商業的に入手しても、あるいは作成してもよい。オリゴ糖の組み合わせライブラリーを、当該技術分野で公知の方法を用いて商業的に入手しても、あるいは作成してもよい。
それぞれの場合において、複合体液中のバイオマーカーに関してスクリーニングするために、本明細書に記載の条件の下で、使用できるスクリーニングライブラリーを形成する樹脂またはビーズを支持するために、「リガンド」またはランダムリガンドを追加してもよい。好適なリガンドはペプトイドリガンドである。
そのようなライブラリーの構築および／または使用に加えて、任意のそのようなリガンドを特徴付ける、精製する、および／または合成または再合成する必要がある、あるいはそうすることを求められる場合がある。そのような方法は当該技術分野で公知であり、クロマトグラフ的手段によるＨＰＬＣなどの精製方法または化学的手段による精製方法；質量分析またはＮＭＲまたはこれら方法のいずれかの組み合わせなどの特徴付け方法のありとあらゆるものを含む。当該方法は、例えば米国特許公報第２００７／０００３９５４号でさらに述べられており、引用により援用される。そのような場合、そのような精製リガンドのいずれも化合物またはほぼ精製された化合物と呼んでもよい。
本発明の初期スクリーニング法において、上記支持体に操作上結合されたオリゴマーを有する支持手段としてビーズおよび／または樹脂が利用される。前記初期スクリーニングによる「ヒット」または「推定ヒット」を有する診断キットまたは他のキットにおいて、マイクロアレイまたは他のいかなる公知の診断プラットフォームを含むほぼすべての支持体に支持システムを拡大することができる。これらの場合、そのようなリガンドに付着したリガンド結合部位を有するリガンドの検出を可能にするために、推定ヒットのあるそのようなキットまたは他の支持システムが検出器または検出手段も有する、あるいは有するように構成されることが必要である。好適な検出方法としては、例えばＥＬＩＳＡ、または標識化二次抗体の使用を伴う他の方法が挙げられる。
支持体は、適切な材料から作ることができる。そのような支持体を作るために利用される材料としては、例えばガラス、プラスチック、セラミック、または高分子樹脂またはビーズが挙げられる。支持体は、ニッケル、真鍮、鉄、または他の金属または金属の混合物などの材料も含んでもよい。また支持体を、リガンドまたはリガンド上の活性基と結合する、接続する、あるいは反応するリンカーおよび／または他の手段を有するように調節してもよい。そのような基は、米国特許公報第２００７／０００３９５４号でも述べられている。本発明では、リガンドまたはリンカーに、そしてその後、上記支持体に結合した個別のリガンドを有する樹脂またはビーズの数は、１００，０００超ないし約１５０，０００，０００の範囲に及ぶ。本発明の初期スクリーニング法で利用される好適な数は、１００万〜２００万のリガンド／樹脂の範囲に及ぶ。
本発明の大型リガンドスクリーニング法には、ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）樹脂が最も好適である。これらの樹脂は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧまたはＦＯＢ）がグラフトされた低架橋ポリスチレンマトリックスからなるグラフト共重合体である。ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂は市販されている（Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ ＧｍｂＨ）。ＰＥＣＳは疎水性と親水性の特性を持つ「カメレオン型」高分子であるため、グラフト共重合体は修正された化学的性質を示す。製造者によれば、原理上は修飾されたポリスチレンマトリックス上にＰＥＧを導入する方法が２つある。最も簡単な固定化手法は、古典的エーテル合成に従って、クロロメチル化ポリスチレンに、その末端の水酸基の１つを通じてＰＥＧを結合させること、または固体支持体上に結合させるために他の二官能性ＰＥＧを使用することである。製造者によると、マトリックス上に段階的にＰＥＧを構築するアニオン性グラフト共重合を用いて、最高２０キロダルトンまで集合する分子のＰＥＧ鎖が、官能化架橋ポリスチレン上に固定されたことが分かった。約２０００〜３０００ダルトンのＰＥＧ鎖があるグラフト共重合体は、運動速度、移動度、膨張、および樹脂容量の点で最適であることが証明された。重合技術で１０エチレンオキサイド単位を超える単分散ＰＥＧを入手する手法がないため、樹脂に１０エチレンオキサイド単位を超える単分散ＰＥＧ鎖を導入する、あるいはポリスチレン骨格への直接重合により単分散ＰＥＧを入手する方法は理論上ない（単分散は、分子量分布のないＰＥＧと定義される）。これらのグラフト共重合体は圧力に安定しており、バッチ処理のほか、連続流条件下でも使用することができる。共重合体は約５０〜７０％のＰＥＧ（ｗ／ｗ）を含む。これらの高分子の特性は、ポリスチレンマトリックスと比べてＰＥＧの特性によって強く支配される。
「ワン・ビーズ・ワン・コンパウンド」手法による化学的ライブラリーまたはペプチドライブラリーを設定する場合、一定量の樹脂のほか単一ビーズの容量の範囲内で利用できるビーズの数を知ることが不可欠である。表１に一部の粒径を要約し、それらを単一ビーズの対応する容量に関連付ける。計算は、０．２５〜０．３ｍｍｏｌ／ｇの範囲内であるＴｅｎｔａＧｅｌビーズの標準的充填に基づく。解析評価のため、ビーズ上で配列決定するために少なくとも５ｐｍｏｌの樹脂結合ペプチドが必要である。経済的に取り扱うことができるライブラリーに対する最適な樹脂量を推定するために、ビーズサイズとビーズ容量を考慮する必要がある。拡散処理および運動速度の均一性に関して、または単一ビーズ分析および単一ビーズ定量のためにも、すべてのビーズが非常に狭い粒度分布を示す。
その用途によって決まる適合特性を示すいくつかの種類のＴｅｎｔａｌＧｅｌ樹脂がある：
ＴｅｎｔａｌＧｅｌ Ｓ樹脂：
ＰＥＧスペーサーが、アルキル結合によってポリスチレン骨格に付着する。この結合は酸または塩基に反応しない。この種類の樹脂は、ペプチド合成、固相有機合成、またはコンビナトリアル・ケミストリーに使用される標準タイプの樹脂である。
ＴｅｎｔａｌＧｅｌ ＰＡＰ樹脂：
ＰＥＧが、ベンジルエーテル結合によってポリスチレン骨格に付着する。このベンジルエーテル結合は、１００％ＴＦＡまたはＴＦＡ／ＦＭＳＢｒの混合物のような厳しい酸条件に反応する。
免疫性付与手法のため、またはＰＥＧ修飾誘導体（ＰＥＧが付着した生成物）の合成に、これらの特別に適合された樹脂が使用される。固相条件を適用することで可溶性ＰＥＧ修飾化合物を得るために（例えば、ＰＥＧ修飾ペプチド）、厳しい酸条件下で、固体支持体から合成化合物と一緒にＰＥＧスペーサーは開裂される。
ＴｅｎｔａｌＧｅｌ Ｎ樹脂：
ＰＥＧスペーサーが、ベンジルエーテル結合によってポリスチレン骨格に付着する。小規模および大規模オリゴヌクレオチド合成のためのオリゴヌクレオチド化学で、これらの適合樹脂が使用される。ＣＰＧガラスとの比べると、容量はＫ）倍増加する。
ＴｅｎｔａｌＧｅｌ樹脂はポリスチレンとポリエチレングリコールから構成される共重合体であるため、両方の基本高分子の化学特性および物理化学特性を考慮する必要がある。
ＰＥＧ自体は吸湿性高分子である。ＰＥＧエステルはあまり安定していなく、簡単に加水分解されることが文献から公知である。保管条件および保管時間に応じて、過酸化物またはエステルを形成するポリエーテル鎖に沿ってＰＥＧ自体が酸化される可能性がある。その結果として、酸処理または塩基による処理によって、少量の「ＰＥＧ結合」を生じる形成したＰＥＧ−エステルを加水分解する。この結合は、ＰＥＧ信号および最終生成物中の不純物としてＭＳまたはＮＭＲによって見つけることができる。この化学的挙動は、すべてのＰＥＧ高分子およびＰＥＧベース高分子に忠実である。
ビーズライブラリーあたり１つのリガンドライブラリーを構築するために、ＴｅｎｔａｌＧｅｌビーズに加えて、他の樹脂および／または粒子を利用してもよい。例えば、軽度に架橋したポリスチレン樹脂またはポリアミド樹脂を利用してもよい。樹脂ビーズに基質を結合させる基が固相合成の不可欠な部分になり得る。リンカーは専用保護基であり、大抵の場合に、合成の最後に再現するためだけに、リンカーは官能基を結び付ける。リンカーは、付着した化合物の修飾または延長に使用される化学的性質の影響を受けてはならない。そして最終的に、開裂ステップが容易に、高い収量で進む必要がある。最良のリンカーによって、定量的収量での結合および開裂が可能でなければならない。
特定の形態では、支持体がビーズ、プレート、ディップスティック、フィルター、膜、ピンまたはその他であってもよい。検出は、ＲＩＡ、ＦＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、フローサイトメトリー、ＦＲＥＴ、または表面プラズモン共鳴を含んでもよい。
カルボン酸リンカー
ペプチド合成に使用される最初の結合基は、固相合成の父の名前を有する。メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）樹脂は、クロロメチル基で官能化された架橋ポリスチレンである。カルボン酸セシウム塩のＤＭＦ溶液を用いた塩化物の求核置換によって、カルボニル基が付着する。通常、カルボン酸を再生する開裂はフッ化水素によって行われる。
カルボン酸に使用される第二分類のリンカーは、Ｗａｎｇリンカーである。一般的にヒットリンカーは、架橋ポリスチレン、ＴｅｎｔａｌＧｅｌおよびポリアクリルアミドに付着してＷａｎｇ樹脂を形成する。これはＦｍｏｃ保護法を用いたカルボン酸ペプチドの合成用に設計され、活性化ベンジルアルコール設計のため、ＴＦＡによってカルボン酸生成物を開裂することができる。Ｗａｎｇ樹脂のさらに酸に不安定な形態が開発されている。ＳＡＳＲＩＮ樹脂はＷａｎｇリンカーと同じ構造を有するが、メトキシ基を添加することで、酸触媒開裂中に形成されるカルボニウムイオンを安定させる。
カルボキサミドリンカー
固相での第１カルボキサミドの作成には、一般的にリンクリンカーが好適である。本発明では、本発明の一次スクリーニングからのヒットまたは推定ヒットを製造または再合成する時に、当該リンカーが利用される。そのような場合、システインがリンクリンカーと反応させられる最初のモノマーであり、その後、プロセスにはオリゴマーを構築するための次のモノマー添加、またはオリゴマーを構築するための次のサブモノマー化学を伴う。リンクリンカーにおける高い酸感度は、２つの追加電子供与メトキシ基の結果である。第１カルボキサミドの作成において、カルボン酸として、ＴＦＡによって樹脂から合成修飾が開裂された後、リンカーに開始材料が付着する。
アルコールリンカー
テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）保護基に基づくヒドロキシルリンカーが、ＴｈｏｍｐｓｏｎおよびＥｌｌｍａｎｎによって開発されている。すべての種類のアルコールがジヒドロピランに容易に加わり、結果として得られるＴＨＰ保護基は強塩基に対して安定しているが、酸で容易に開裂される。当該リンカーは、メリフィールド樹脂に付着する。トリチル基は、多くのヘテロ原子に対して優れた、酸に不安定な保護基である。βメルカプトケトンのライブラリーの合成で、別のアルコールにトリチル基が使用されてきた。
カルバメートおよびアミンリンカー
トリパノソーマ寄生虫感染症の抑制剤の研究で調製される５７６種のポリアミンの組み合わせライブラリーの合成に、カルバメートリンカーが使われてきた。２つのリンカーを調査した。１つは安息香酸ヒドロキシメチルに基づき（１）、他の１つは、電子供与基を追加した（２）。前者が強酸条件で開裂できる一方で、後者はＴＦＡにより開裂が可能であった。
現在では、第３級アミンの作成に非常に有用なリンカーが開発されている。（第３級アミンは一般に薬物分子に使用される。）第１級アミンおよび第２級アミンは、マイケル付加によってリンカーに導入される。樹脂結合第４級アンモニウムイオンを得るために、アミンをアルキル化してもよい。弱塩基条件では、ホフマン脱離によって高純度の第３級アミンが得られる。
トレースレスリンカー
場合によっては、カルボン酸などのある形態で開始物質を取り込み、例えばカルボキサミドなどの別の形態で開裂させる。標的化合物が放出された官能（ｒｅｌｅａｓｅｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を必要とする場合、これは全く問題ない。（ペプチドは、カルボン酸またはカルボキサミドを常に含む。）しかし、低分子量非ペプチドの組み合わせライブラリーにおいて目的とする増加に、新種のリンカーの必要性が生じた。これらのリンカーは、開裂後に非特異的官能（ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を示す。最終化合物が固相に対する結合部位の痕跡を示さないため、トレースレスリンカーと呼ばれる。
試料
上述のように、本発明のプロセスにおける分析のために調製される複合体液としては、細胞（Ｔ細胞または他の免疫エフェクター細胞を含む非接着性細胞）上に発現されたマーカーを含む潜在的バイオマーカーのホスト、微生物、タンパク質、ペプチド、脂質、多糖、小分子、有機分子、無機分子、生体分子、およびそのような複雑な環境で検出可能または反応可能な部分が挙げられる、あるいは挙げられる可能性がある。好適な実施形態では、そのようなマーカーは抗体であり、特に疾患または病状の結果として作成される抗体である。好適な実施形態では、患者または動物または生物から得られた血清、血漿、唾液、または他の液などの体液または試料がそのようなマーカーの入手源である。そのような試料を初期スクリーニングに、または予測ヒットまたはそのようなバイオマーカーに対する親和性を有するリガンドを用いたその後のスクリーニングに曝すために、各試料、組織、あるいは生物由来または環境由来の試料を前処理、処理、希釈、または取り扱う。バックグラウンドレベルまたはノイズと、リガンド結合部位とのリガンドの結合に関連した信号との間の十分な区別を行う、または可能にするために、本明細書で列挙された方法に従って試料を希釈する。
リガンド／支持体を上記試料に曝すために必要な時間および／または条件は、特定の試料および他の要因に左右される。ここでは、請求項に係る発明のプロセスに好適な条件をさらに述べる。ほぼすべての場合、体液の大型リガンドライブラリーおよび／またはそのようなライブラリー由来のリガンドまたはキットに曝した後、洗浄または溶出ステップおよび他の調整手段を利用する。ＨＥＰＥＳバッファー、トリスバッファー、または生理食塩水などの緩衝液を含む水溶液を利用する。支持システムをエネルギー吸収材料で処理して、支持体表面からの「錯体」の脱着またはイオン化を促進してもよい。支持体からリガンド−リガンド結合部錯体を分離または除去するために、化学的手段も利用される。
支持体上のリガンド−リガンド結合部位複合体を検出するための検出方法としては、測光手段および非測光手段が挙げられる。そのような方法は、上記プロセスが吸光度、蛍光、屈折率、偏光、または光散乱を検出および測定する方法を含むようにすることを含む。これらには、そのようなパラメータを測定する直接的および／または間接的手段を含む。蛍光を伴う方法としては、ＥＬＩＳＡまたはサンドイッチ分析などの免疫学的方法での蛍光標識を含む。屈折率を伴う方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、格子結合法（例えば、センサー均一格子カプラー、波長検出光センサー（ＷＩＯＳ）、およびチャープ格子カプラー）、共振ミラー、および干渉法が挙げられる。偏光を伴う方法としては、偏光解析法が挙げられる。光散乱法も使用してもよい。標識化および／または分離および／または検出のための他の手段としては、磁気的手段も含むことができる。磁気共鳴映像法、気相イオン分光分析、ＭＲＩをすべて使用してもよい。
作成されたデータの解析には、対照または基準に対する検出されたバイオマーカーによる信号の定量を一般的に必要とする。適切な手段でデータを解析できる。データを作成および解析するために、コンピュータおよびコンピュータプログラムを利用してもよい。ビーズおよび／または他の支持体を、同定目的のためにコンピュータコード化またはコード化してもよい。データ解析には、分析または検出方法の特定条件下での信号強度の解析を含む。リガンド、リガンド結合部位、または基準部分および／または二次検出部分を、検出可能部分で標識化または放射性標識化してもよい。当業者によって、疾患関連バイオマーカーを有する体液試料と、そのようなマーカーを含まないその対照または健康な患者の試料との違いおよび／または区別を評価できる。当業者によって、本明細書で述べられる方法に従って、構成する対照試料中にある、または発見される可能性がある擬陽性または他のヒットの存在を測定することもでき、および／またはそのような「ヒット」を取り除くことができ、そして当業者によって、本明細書で述べられる方法に従って、疾患または病状を有する患者試料中の疾患関連バイオマーカーを測定または発見するプロセスを続けることができる。いかなる場合でも、そのようなヒットの「検出」は、本明細書で述べられるものなどのリガンドライブラリー中のリガンドに対する疾患関連バイオマーカーまたは他のマーカーなどのリガンド結合部位を検出するための手段によって達成される。
本明細書で列挙された疾患および／または病状に関連したバイオマーカーは、評価される特定の患者または動物または他の生物の疾患および／または病状の特定の段階に応じて変化する。ほとんどの場合、推定ヒットであり、かつ本明細書で列挙される化合物であるリガンドは、まず免疫反応および／または抗体または免疫細胞の形成を開始する天然抗原によく似ることが期待される。本発明と、クレームされ、かつ本明細書に記述されるスクリーニングプロセスとは、抗原に対する反応で生成される特定の抗原または抗体のいずれの知識も必要としない。しかし、リガンドは、本明細書で列記されたスクリーニングおよび診断法で便利であることに加えて、ワクチンまたは医薬品候補として、それ自体で有用な場合がある。したがって、本発明は化合物および医薬品を含む。
ペプトイドスクリーニング：
ワン・ビーズ・ワン・コンパウンド（ＯＢＯＣ）組み合わせペプトイドライブラリーをスクリーニングするために、数万〜数百万のペプトイド支持ビーズを調製し、その後、複合生体試料に混ぜる。最初の複合生体試料は好適には対照試料であり、そしてその後、対照ヒットを「除去」したリガンドライブラリーで処理された次の複合生体試料は、罹患複合生体試料に対して処理および／またはスクリーニングされる。その後、少なくとも１つの疾患関連バイオマーカーと相互作用するリガンド／ビーズを、検出、同定、および単離および／または特徴付けする。好適な実施形態では、（１）ビーズ調製、（２）複合体液のスクリーニング、および（３）ヒットの検出を含むＴｅｎｔａｌｇｅｌスクリーニングプロトコルが使用される。
ペプチドスクリーニング：
ワン・ビーズ・ワン・コンパウンド（ＯＢＯＣ）組み合わせペプチドライブラリーをスクリーニングするために、数万〜数百万のペプチド支持ビーズを調製し、その後、本明細書に記載のプロセス後に複合生体試料に混ぜる。その後、疾患関連バイオマーカーと相互作用するビーズを、化合物構造決定のために同定および単離する。例えば、赤色蛍光染料によって標識化された、プローブタンパク質としてストレプトアビジン（ＳＡ）を用い、および非蛍光ビーズから蛍光を分離するためにＣＯＰＡＳ ＢＩＯ−ＢＥＡＤフローソーターを用いたＯＢＯＣペプチドライブラリースクリーニングを行ってもよい。次の参考文献を参照：Ｍａｎｍｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｏｍｂ． Ｃｈｅｉｎ，， ２００９， １１ （１）， ｐｐ １４６−１５０。使用できる赤色染料はＡＴＴＯ５９０およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄである。ＳＡ−赤色蛍光染料複合体と一緒に上記ライブラリーをインキュベートした後、ペプチド−ＳＡ相互作用によって生じた陽性ビーズが得られる。上記ビーズを、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）で分析する。したがって、ペプチドライブラリーは、ペプトイドに、本明細書に記載のプロセスに類似した方法で使用してもよく、ここで、開始化合物ライブラリーからリガンド／ビーズヒットを除去するために初期対照体液試料を使用し、その後、罹患複合体液試料中のヒットをスクリーニングするためにライブラリーの残りのメンバーを使用する。これらのヒットは、その後、診断キットで進められる推定ヒットである。
同様にして、本明細書に記載のプロセスを用いて、ビーズまたは支持体上でリガンドをスクリーニングしてもよい。これらのリガンドとしては、ペプトイドまたはペプチドに加えて、ライブラリーに組み込むことができ、本明細書に記載の条件下で複合体液のスクリーニングに使用される核酸オリゴマー、多糖、小分子、および／またはその組み合わせが挙げられる。
キットおよび診断ツール
本明細書に記載の化合物または組成物のいずれも、臨床環境または実験室環境のいずれかで診断キットにさらに利用してもよい。これらのキットは、簡単なポイント・オブ・ケア診断分析から複雑で多重化された機器またはプローブまでに及ぶことができる。中核となる支持体／リガンドシステムを取り囲む支持システムおよび「パッケージング」を、推定ヒットおよび／またはそのような適切なプラットフォームに再合成および設置されるヒットを含むように設計される現在市販されているキットから選択できる。あるいは、新たに設計された診断キットでそれらを使用できる。キットには一般的に、キットがそのために設計された特定の疾患または病状をスクリーニングおよび／または診断するキットを使用するためのすべての適切な試薬および取扱説明書が同封されている。そのようなキットまたは方法は、本明細書で列記されたスクリーニング法に従って同定された少なくとも１つの推定ヒットまたはリガンドを含む。当該リガンドまたは複数のリガンドを、本発明の化合物を含む同じリガンドまたはリガンドの混合物から選択してもよい。上記リガンドは、ある特定の病状あるいは疾患または病状の群または組に関して、疾患関連バイオマーカーに対するその親和性に基づいて選択してもよい。好適なリガンドはペプトイドリガンドである。上記キットは、特定の疾患または病状を診断する医師向けの説明書、および特定のキット、および疾患または病状に関するラベルも含む。したがって、本発明は、本明細書に記載され、および／または本明細書に列挙された特定の方法に従うことが公知であるライブラリーのいずれか１つを用いて初期スクリーニングから見つかった推定ペプトイドまたはリガンドなどのキットの必須構成要素のすべてを含むキットの組み合わせ、およびラベル付け説明書を含む。熟練オペレーターの監督下の臨床環境および実験室環境で、本明細書で開示される特定のプロセスおよび方法および材料も利用してもよいことも想定される。キットおよび／または機器または設備は、疾患関連抗体および／または細胞に対して特異的なペプトイドなどのリガンドを含む。「キット」は、一式の診断キットおよび／またはスクリーニングキットを含んでもよく、あるいは「キット」は、診断用ペプトイド、そのようなペプトイドを通じて発見および特徴付けされた抗体、または自己抗体との相互作用および自己抗体からの発見の結果として精製および／または特徴付けされた天然抗原を含む、あるいはそれから構成されるコンポーネントまたはサブコンポーネントを含んでもよい。そのような抗体および精製された抗原は、本発明の一部を成す。
一実施形態において、本明細書で示されるのは、疾病の診断用キットである。別の実施形態において、本明細書で示されるのは、疾病を処置するためのキットである。前記キットは、リガンドライブラリー、生体試料に対してリガンドライブラリーをスクリーニングするための検出試薬、スクリーニング用のアジュバント、および添付文書を含んでもよい。添付文書は、診断ステップの実施に関する指示、薬物投与の決定に関する指示、決定に基づく薬物投与に関する指示を含んでもよい。一部の実施形態において、前記キットは、ＦＤＡまたは他の国の医薬品承認機関の承認を受けたラベルである添付文書を含んでもよい。
本発明のリガンドライブラリーを利用して、疾病関連バイオマーカーに結合するリガンドを発見および測定する。その後、病態または病状を評価、スクリーニング、または診断するために、一般的に上記のキットおよび／または方法でそのようなリガンドを利用する。これらの診断法は一般的に、抗体および／または他の生体マーカーを含む疾病関連バイオマーカーのスクリーニングおよび発見を伴う。上述のように、血液試料からそのような抗体を取り出す、または取り除くために、適切なカラム上の本発明のリガンドを用いて、これら他の抗体をさらに同定し、特徴付けることができる。同様に、そのような抗体に関連した天然抗原を探る、および発見するために、抗体を使用できる。したがって、本発明には、抗体と、そのような抗体に関連し、本発明の方法を用いて発見、単離、および特徴付けられた精製抗原の両方を含む。
まず、病態または病状をスクリーニングおよび／または診断するためのキットおよび／または他の手段を、患者試料に対して評価する必要がある。これらの患者試料は、正常対照試料から、または患者がその疾患または症状を有する、または有することが疑われると確認された患者試料から得てもよい。患者は、疾患関連バイオマーカーの「存在」を越える疾患に関連した他の症状を示してもよい。患者は疾患の早期であってもよく、疾患または症状を全く示していなくてもよく、あるいは特定疾患の末期であってもよい。どのような臨床状況でも、適切な指針および管理下で、患者試料および臨床試料を盲検方式で提供し、その後、本発明の化合物を用いて評価してもよい。その後、特定の患者または患者群についての統計的に有意な結果、または公知または根本的なデータとの相関関係を見つけ出すか、見つけ出さないかにかかわらず、非盲検後にスクリーニングの結果として作成されたデータを評価してもよい。本発明は、（１）本発明の少なくとも１つの化合物で患者からの生体試料をスクリーニングすること、（２）本発明の上記少なくとも１つの化合物を用いて同じ条件下で、対照生体試料をスクリーニングすること、および（３）疾病関連バイオマーカーの有無を測定するために、正常対照データと患者データを比較することを含む疾患または症状の存在をスクリーニングする方法を含む。疾病Ｘを有する、あるいは有すると疑われる患者の群または患者の試料を、本発明の少なくとも１つの化合物を有するキットまたは診断プローブに対してスクリーニングしてもよく、そして、病態または症状またはその欠如を確認または検証するために、各患者に関して作成されたデータを、ケースバイケースで利用してもよい。患者の症状を評価し、治療選択を行う医師に指針を提供するために、その特定の患者について知られている全情報と組み合わせて、本明細書で作成されるそのようなデータを使用してもよい。そのようなスクリーニングの結果として作成された「情報」を、薬物治療を受けている個々の患者を評価するために、臨床試験環境で使用してもよい。したがって、本発明は、本明細書に記載の方法に従って行われるスクリーニングの使用を含む臨床試験の進行を評価する方法を含む。好適な実施形態では、本発明は、疾患関連バイオマーカーを検出するための本明細書の請求項に係るスクリーニングまたは化合物の使用を含む、早期病態をスクリーニングまたは診断する方法に関する。本発明は、疾患の急速な進行前にそのようなバイオマーカーの検出がよく見られる早期疾患治療介入の状況で特に有用である。別の状況では、心臓血管疾患および／または代謝性疾患のほか、神経疾患での早期治療によって、命を救い、早期医療介入または処置を行わない場合のそのような疾患のさらなる進行を防止する、あるいは防止に役立つことが期待される。
本発明は、対照溶液または標準溶液と疾患関連バイオマーカーを含む複合体液との差の分解能または効率を上げる方法も含む。例えば、方法は、バッファーおよび／または大腸菌（Ｅ ｃｏｌｉ）溶解物および／またはリシンの調整剤で、システム／血清を事前調整または前処理または事前ブロックすることを含む。
さらに別の実施形態では、（ａ）被験体からの抗体含有試料を、本明細書で列挙された式のペプトイドを含むペプトイドをそれに付着した１つ以上の支持体に接触させること、（ｂ）上記ペプトイドに結合した抗体を検出すること、および（ｃ）ステップ（ｂ）の結果に基づく処置決定を行うことを含む、疾患を有することが疑われる被験体を処置する方法が提供される。上記方法は、被検者からの上記試料を得ることをさらに含んでもよい。また、上記方法は、上記ペプトイドに結合している抗体が、対照非罹患患者で見られるものよりも多い場合に、上記試料を入手した被験体に関して疾病の診断を行うことをさらに含んでもよい。また、上記方法は、上記被検体に対する処置決定を行うことをさらに含んでもよい。上記試料を、本明細書で列挙された式の、１を超える数のペプトイドに接触させてもよい。複数の病態または症状を診断する目的で、上記試料を多重プラットフォームに接触させてもよい。上記支持体がビーズ、プレート、ディップスティック、フィルター、膜、ピンまたはその他であってもよい。試料は血液、血清、唾液、またはＣＳＦであってもよい。検出は、ＲＩＡ、ＦＬＡ、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、フローサイトメトリー、ＦＲＥＴ、または表面プラズモン共鳴を含んでもよい。
さらに別の実施形態は、失陥を示す体液から単離される抗体組成物に関し、特定の実施形態において、上記抗体を有する試料を、疾患を示すかまたは疾患に関連する抗体に特異的に結合するペプトイド組成物に接触させることで、上記抗体を単離する。上記抗体を、他の非抗体および非Ｄ特異成分から除去、単離、または精製できる。その後、上記抗体を洗浄する、および／またはペプトイド捕捉剤から切り離すことができる。
特定の実施形態では、本明細書に記載の処理で発見されたペプトイドから作られたペプトイド配列が、大腸菌溶解物などの細菌溶解物で補完されている生体試料とハイブリダイズさせる。生体試料としては、対照試料、および中枢神経系障害に関するマーカーを有する試料が上げられる。例えば、マイクロアレイスライドをハイブリダイゼーションチャンバーで覆い、約１５分間、１ＸＴＢＳＴ（５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）で平衡化する。その後、少なくとも、高くとも、あるいはおよそ０．５、１、１．５、２ｍｇ／ｍＬの溶解物濃度の細菌溶解物でスライドをブロックする。溶解物を取り除き、優しく振りながら細菌溶解物中で約１ｍＬの生体試料（すべての範囲および値を含む５、１０、１５、２０、または２５ｇ／ｍＬのおおよそのタンパク質濃度を有する）とともにスライドをインキュベートする。その後、マイクロアレイを１ＸＴＢＳＴで洗浄し、標識抗ＩｇＧ抗体（例えば、１：４００希釈物）とハイブリダイズさせる。その後、適切なバッファーでスライドを洗浄する。遠心分離機を用いてスライドを乾燥させ（例えば、１５００ｒｐｍで５分間回転）、例えば１００％出力で６３５−ｎｍレーザーおよび６００または６５０の光電子増倍管ゲインを用いたマイクロアレイスキャナーでスキャンする。したがって、本発明は、対照血漿試料および大腸菌溶解物を含む罹患試料を処理すること、および前記試料をペプトイドまたはリガンドアレイに接触させることを含む診断分析でのバックグラウンド抗血清ノイズを低減する方法にも関する。このプロセスを使用して、対照試料を罹患試料と比較する状況で血清中の抗体を検出および識別することに使用されるアレイの処理を支援できると考えられる。
本明細書に記載の方法または組成物を、本明細書に記載の他の方法または組成物に対して実施できると考えられる。
請求項および／または明細書で用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と併せて使用される場合の単語「１（ａ、ａｎ）」の使用は「１（ｏｎｅ）」を意味するが、「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ」、「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」、および「１つまたは１つ超（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｏｎｅ）」とも一致する。
本明細書に記載の実施形態を、本発明の方法または組成物に対して実施できる、また逆もまた同様と考えられる。さらに、本発明の組成物およびキットを使用して、本発明の方法を達成できる。
本発明を通して、用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、値が装置、値を測定するために採用されている方法、または治験被験体の間に存在する変動量に対する固有の差異の誤差を含むことを示すため使用される。
当然のことながら、本明細書で列挙された処理を通じて発見された推定ヒットまたはペプトイドは、治療用医薬品またはワクチン候補でもあってよい。したがって、本発明は、本明細書に記載の方法にしたがったスクリーニングの使用を含む医薬品候補またはワクチンを発見するプロセスに関する。
本発明の好適な実施形態をさらに十分に説明するために、以下の実施例を提示する。しかし、これらの実施例が本発明の幅広い範囲を制限するものと解釈してはならない。
実施例
実施例１ ペプトイド調製
ペプトイド合成（システイン−ペプトイドまたはメチオニン−ペプトイド）のプロトコル
以下の例では、本発明のペプトイドライブラリーの調製方法を示す。本実施例で利用される材料としては、反応フラスコまたはビーカー、プラスチックチューブ、針付き３ｍＬシリンジ１０〜１５本、Ｌａｔｅｘ手袋、１５ｍＬポリプロピレン製試験管および溶剤安全チップ付きマイクロピペット（１０００μＬ）１０〜１５本、ガラスピペット、および樹脂ビーズが挙げられる。使用する化学薬品および／または試薬としては、Ｎ，Ｎジメチルホルムアミド、ブロモ酢酸（ＢＭＡ）、無水ジメチルホルムアミド、ピペリジン、アセトニトリル、３−ジイソプロピルホルボジイミド（ＤＩＣ）、トリフルオロ酢酸、５（６）−カルボキシフルオレセイン、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、および４−メチルモルホリン（ＮＭＭ）が挙げられる。各ライブラリーの調製で利用されるさまざまなアミンのほか、ＨＢＴＵ（テトラメチルウロニウムヘキサフルオロフォスフェート）およびトリエチルシランも使用した。
ペプトイド調製
以下の式を用いて、処理に使用される各アミンの濃度を計算する。すなわち、
Ｖ＝ＦＷ／ｄ／１０００ｘ２Ｍｘ５ｍｌ
Ｖ＝ＦＷ／ｄ／１０００ｘ２Ｍｘ５ｍｌ
手順：
ステップ１
樹脂ビーズの膨張
（ａ）樹脂ビーズ２５０ｍｇをきれいな乾燥した反応フラスコに入れ、１時間以内の期間にわたり膨張させたままにしたビーズに、ＤＭＦ水和物５ｍＬを添加した。その後、真空下で複数回（２回または３回）、ＤＭＦでビーズを洗浄した。
（ａ）樹脂ビーズ２５０ｍｇをきれいな乾燥した反応フラスコに入れ、１時間以内の期間にわたり膨張させたままにしたビーズに、ＤＭＦ水和物５ｍＬを添加した。その後、真空下で複数回（２回または３回）、ＤＭＦでビーズを洗浄した。
ステップ２
「脱保護ビーズ」（例えば、Ｔｅｎｔａ−Ｇｅｌ）を使用した場合は、ステップ（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）を省略した。
以下の処理で、溶剤として無水ＤＭＦを用いたピペリジンの２０％溶液（塩基性）を使用した。
「保護ビーズ」を使用する場合、ステップ（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）を含む以下の処理を２回行った
（ｂ）２０％ピペリジン溶液２．５ｍＬを保護ビーズに添加した。
（ｃ）ピペリジンの添加後、２５℃で２００ｒｐｍに設定した振とう器／インキュベーターの上に反応フラスコを２０分間置いた。
（ｄ）その後、ＤＭＦ５ｍＬを用いたＤＭＦ水和物で反応フラスコを８〜１０回洗浄した。
（ｂ）２０％ピペリジン溶液２．５ｍＬを保護ビーズに添加した。
（ｃ）ピペリジンの添加後、２５℃で２００ｒｐｍに設定した振とう器／インキュベーターの上に反応フラスコを２０分間置いた。
（ｄ）その後、ＤＭＦ５ｍＬを用いたＤＭＦ水和物で反応フラスコを８〜１０回洗浄した。
以下の溶液も調製した。
１．４６８ｍｇのＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨの無水ＤＭＦ溶液（量２ｍＬ）（溶液Ａ）。
２．１６１．６ｍｇのＮＭＭのＤＭＦ水和物溶液２ｍＬ。
３．３０３．２ｍｇのＨＢＴＵをＮＭＭバイアルに添加した（溶液Ｂ）。
１．４６８ｍｇのＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨの無水ＤＭＦ溶液（量２ｍＬ）（溶液Ａ）。
２．１６１．６ｍｇのＮＭＭのＤＭＦ水和物溶液２ｍＬ。
３．３０３．２ｍｇのＨＢＴＵをＮＭＭバイアルに添加した（溶液Ｂ）。
ＨＢＴＵ／ＮＭＭおよびＦｍｏｃ−Ｃｙｓの添加
溶液Ａおよび溶液８のそれぞれ１ｍＬをビーズに添加した − （ＨＢＴＵ／ＮＭＭ）およびＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ）に添加した、そして１時間振とうする。
ＤＭＦ中で、ビーズを５〜１０回洗浄した。
１時間振とうしたビーズに溶液Ａおよび溶液Ｂの残りの溶液１ｍＬを添加し、ＤＭＦ中で５〜１０回再び洗浄した。
以下の溶液も調製した。
２０％ピペリジン（無水ＤＭＦ溶液で）
２Ｍブロモ酢酸
５０％ＤＩＣ／Ａ．ＤＭＦ
各アミンの２Ｍ溶液
２０％ピペリジン（無水ＤＭＦ溶液で）
２Ｍブロモ酢酸
５０％ＤＩＣ／Ａ．ＤＭＦ
各アミンの２Ｍ溶液
以下のステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）を２回行った。２０％ピペリジン溶液２．５ｍＬを添加した；（ｂ）２００ｒｐｍ、２５℃で、反応フラスコを振とうした、その後（ｃ）ＤＭＦでビーズを８〜１０回洗浄した。
２Ｍブロモ酢酸溶液１０ｍＬを調製した。
５０％の３．２Ｍ ＤＩＣ／無水ＤＭＦ溶液（ｖ／ｖ）１０ｍＬも調製した。
各ライブラリー用に各アミンの２Ｍアミン溶液を調製した。
ペプトイド合成のため、２Ｍ原液１ｍＬを毎回使用し、ペプトイド鎖にアミンを追加した。
ステップ３
ブロモ酢酸１ｍＬを反応容器に加えた；
（ｂ）その後、５０％ＤＩＣ／ＤＭＦ溶液１ｍＬを添加し、得られた溶液に、（ｃ）１５秒間、１０％の出力でマイクロ波をかけた。
（ｂ）その後、５０％ＤＩＣ／ＤＭＦ溶液１ｍＬを添加し、得られた溶液に、（ｃ）１５秒間、１０％の出力でマイクロ波をかけた。
マイクロ波のセットの間でフラスコを左右に回転さらながら、ステップ（ｃ）を２回行った。
マイクロ波をかけるステップの後、毎回、白色沈殿物が形成された。その後、ＤＭＦで、ビーズを８〜１０回洗浄した。
ステップ４
その順序で最初のアミンを１ｍＬ、前のステップからのブロモ中間体を含む反応フラスコに添加し、反応容器を振とうすることで、ビーズにアミンを均等に分布させた。その後、１５秒間、１０％の出力でマイクロ波を２回使用して、反応を開始させた。その後、ＤＭＦで、反応したビーズを８〜１０回洗浄した。
目標とするペプトイドを作るため、すべてのアミンが追加されるまでステップ３および４を繰り返した。
ステップ５
その後、３回、ジクロロメタン（ＤＣＭ）でヘッドを洗浄し、乾燥させた。
ステップ６
その後、９５％ＴＦＡ溶液（５ｍＬ）を用いて、ビーズからペプトイドを開裂させた。次に、残留ペプトイドを除去するために溶剤（ＣＨ３ＣＮおよび水）で洗浄したビーズからペプトイドを集めた。アルゴンガスを使用して残留ＴＦＡの除去を行った。その後、必要に応じてペプトイドを凍結乾燥、特徴付け、および精製した。
上記反応条件は、特定のビーズ組成物に対して必要な量に応じた必要性を基準として変更される場合がある。
図１〜５は一般的に、例えばＡＤ診断、膵臓癌診断、および狼瘡などの疾患のために本発明のライブラリーを調製する方法を説明する。一般的に、アミン部分を有するビーズは、標準的ペプチド化学を用いた一連のステップを通じてアミノ酸残基に結合し、その後、ハロゲン化物基を有する活性カルボニル部分と反応し、次に、Ｒ基を有する単量体アミンと反応した。１００万〜２００万の異なるリガンドを有する大型ペプトイドライブラリーを作成するために、図に示した通りに、サイクルのステップ２および３を繰り返した。Ｔｅｎｔａｇｅｌ樹脂またはビーズ上に調製された初期スクリーニングライブラリーは、一般的に鎖中の最初のモノマーとしてメチオニンアミノ酸を有した。本発明はそのようなアミノ酸を使用して、開裂可能なリンカーを持たないビーズまたは樹脂からの開裂を促進する。ペプトイドを含むシステインを構築するために使用されるリンク樹脂は、第１のアミノ酸としてメチオニンを必要としない、あるいはその使用が求められないリンカーを有する。一般的に、初期スクリーニングによって推定ヒットを見つけた後、ペプトイドを含むシステインを再合成した。システインの硫黄基によって、例えば、診断プラットフォーム基質上の別の反応部分とのペプトイド鎖の反応を可能にする。再合成されたペプトイドも、アミノ酸アミンの後の鎖上の第１の側鎖として１−イル−ｎ−ブチルアミン部分を含んだ。ペプトイドを表示させ、水溶液にペプトイドを溶解させるために当該基が必要であると考えている。
実施例２ 一般的スクリーニング方法
最適なペプトイドに付着した１６０ミクロンＴｅｎｔａｇｅｌビーズをＤＭＦ中で一晩膨張させた。その後、反応容器内で、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水で、激しく振とうしてビーズを１０回洗浄した。毎回、新しいＭｉｌｌｉｐｏｒｅ水を添加し、１０回目の洗浄で、１５０〜２００ｒｐｍで、ビーズを一晩振とうしたままにした。翌日、１Ｘ ＴＢＳＴを用いて同じ方法でビーズを洗浄し、１５０〜２００ｒｐｍで、少なくとも３時間、振とうしたままにした。
その後、ビーズをチューブ１本あたり約０．５グラム、１Ｘ ＴＢＳＴ溶液で、１５ｍＬコニカルチューブに均等に分けた。ＴＢＳＴを取り除き、希釈正常ヒト血清４ｍＬを各チューブに添加した。１Ｘ ＴＢＳＴ中に作った血清原液を超微量滴下し、希望濃度の２０μｇ／ｍＬを入手した。その後、血清とヘッドを含むチューブを、暗所にて４℃で一晩、タンブラーにかけた。その後、チューブから血清をピペットで取り出し、４ｍＬの１Ｘ ＴＢＳＴと入れ替えた。その後、ビーズを再び浮遊させるためにチューブをゆっくりとひっくり返し、落ち着くまでそのままにした。合計３回のＴＢＳＴ洗浄を行うために、ＴＢＳＴの除去／添加をさらに２回行った。
その後、１Ｘ ＴＢＳＴの１ｍＬあたりヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｑｄｏｔ ６５５を５μＬ調製することで、二次抗体溶液を調製した。ビーズから最後のＴＢＳＴ溶液を取り除くと、Ｑｄｏｔ溶液４ｍＬを添加し、暗所にて、２時間、４℃でビーズをタンブラーにかけた。その後、ビーズが落ち着くまでそのままにし、そしてＱｄｏｔ溶液を取り除いた。その後、４ｍＬの１Ｘ ＴＢＳＴで、ビーズを３回洗浄した。その後、ＤＡＰＩフィルターを含むＵＶ顕微鏡下で確認しながら空のシャーレにビ―ズを注いだ。赤色に染められたすべてのビーズを取り除いた。
初回スクリーニングの完了後、１５ｍＬのコニカルチューブにビーズを注ぎ戻し、次の血清試料添加までの少なくとも４時間、４℃でタンブラーにかけた。その後、１Ｘ ＴＢＳＴとは対照的に、血清をＰＢＳ開始ブロックに希釈した場合を除き、正常血清添加と同じ方法で罹患血清をビーズに添加した。しかし、超微量滴下で正確な濃度を得るために、１Ｘ ＴＢＳＴで元の原液を調製した。血清添加および二次抗体添加は、正常血清と同じである。
罹患「ヒット」を取り除くと、１．５ｍＬエッペンドルフチューブに貯め、９５℃で２５〜３０分間、１％のＳＤＳ中で加熱した。その後、チューブからＳＤＳを取り除き、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水で置き換えた。その後、４℃で１５分間、ビーズをタンブラーにかけた。その後、水を新しい水と交換し、さらに１５分間、ビーズをタンブラーにかけた。その後、水を取り除き、５０／５０のアセトニトリル／水の溶液と置き換え、さらに１５分間、タンブラーにかけたままにした。その後、ビーズを９６ウェルプレートの各ウェルに分け、乾燥させた。
臭化シアン２０〜３０ｍｇ、アセトニトリル５００μＬ、氷酢酸４００μＬ、およびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ水１００μＬの溶液を作成し、ヒットビーズを含む各ウェルに前記溶液２０μＬを添加した。プレートを覆い、１００ｒｐｍで１６時間、振とうしたままにした。その後、カバーを取り除き、ウェルから開裂溶液を蒸発させた。その後、ＭＳＭＳプレートにヒットをスポットで滴下し、４８００ ＭＡＬＤＴ／ＦＯＦ／ＴＯＦ分析装置を用いて配列を決定した。
図６は、本明細書で開示され、本明細書に係るスクリーニング方法の概略的な模式図を示す。
実施例３ 疾患を処置するための薬物に対する反応の診断
１６０ミクロンＴｅｎｔａｇｅｌビーズ（ＪＣ３Ｂライブラリー）５００ｍｇを１５ｍＬコニカルチューブに入れる。ＤＭＦ５ｍＬをチューブに添加し、ビーズを膨張させるために、一晩、静置したままにする。翌日、チューブからＤＭＦをピペットで取り出し、５ｍＬの１Ｘ ＴＢＳＴと入れ替える。チューブを逆さまにして混ぜ合わせ、ビーズが底に落ち着くまでそのままにし、そして１Ｘ ＴＢＳＴを取り除く。５ｍＬの１Ｘ ＴＢＳＴを添加／除去することをさらに５回行う。
ＰＢＳ開始ブロック４ｍＬをチューブに添加し、４つの別個のＡＤ試料それぞれ７μＬを同じチューブに添加することで、正常ＡＤ血清試料を調製する。洗浄したビーズに血清を添加し、暗所にて４℃で一晩、ビーズおよび血清をタンブラーにかけたままにする。翌朝、ビーズをタンブラーから取り出し、チューブから血清をピペットで取り出す前に、そのまま静置する。４ｍＬの１Ｘ ＴＢＳＴをチューブに添加し、チューブを逆さまにして混ぜ合わせる。その後、チューブからＴＢＳＴをピペットで取り出し、４ｍＬの新しい１Ｘ ＴＢＳＴと入れ替え、再び取り除く。
その後、５０μＬのよく混ぜたヤギ抗ヒトＩｇＧ ＤＹＮＡビーズを４ｍＬの１Ｘ ＴＢＳＴに添加することで、ＤＹＮＡ−ビーズ溶液を調製する。その後、洗浄したビーズに混合物を添加する。その後、暗所にて、４℃で２時間、ビーズをタンブラーにかけたままにする。
ビーズを洗浄せずに、ＤＹＮＡビーズスクリーニングを行う。チューブをマグネットホルダーに入れ、１Ｘ ＴＢＳＴを縁まで満たす。２分間、磁石とチューブをゆっくりと掻き混ぜ、マグネットホルダーの中でビーズをそのまま静置する。マグネットによって側面に付いたヒットビーズに触れないように、底に落ち着いたＴＢＳＴおよびフリーのビーズを慎重に取り除き、１Ｘ ＴＢＳＴと置き換える。その後、ヒットビーズを１本のチューブに混ぜ合わせる。
残りの非ヒットビーズを１５ｍＬチューブに分け、逆さまにし、パルス遠心分離処理を素早く行う。上澄みを取り除き、新しい１Ｘ ＴＢＳＴと置き換える。ビーズ／ＴＢＳＴ溶液にＤＹＮＡビーズがこれ以上見えなくなるまで、この処理を６〜８回繰り返す。同じ方法でヒットビーズを洗浄する。
ビーズを混ぜ合わせて１５ｍＬチューブに戻し、上記と同じ方法でビーズに正常血清を添加し、暗所にて４℃で一晩、タンブラーにかけたままにする。さらに、各４つの正常ＡＤ試料を３ｍＬ、ＰＢＳ開始ブロック１ｍＬに添加し、この溶液をＤＹＮＡビーズ「ヒット」ビーズチューブに添加する。翌日、正常血清を添加するとともに、同じ方法でビーズを洗浄する。
２０μＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔ ６５５を４ｍＬの１Ｘ ＴＢＳＴで希釈し（「ヒット」チューブに対しては、１ｍＬの１Ｘ ＴＢＳＴで２０μＬのＱｄｏｔ）、そしてビーズに添加する。暗所にて、４℃で２時間、溶液をタンブラーにかける。ヒットチューブと非ヒットチューブ両方を１Ｘ ＴＢＳＴで４回洗浄し、ＵＶ顕微鏡下で真っ赤なビーズをスクリーニングする。４ｍＬの１Ｘ ＴＢＳＴ中で、１時間、残りのビーズをタンブラーにかけ、そして正常血清と同じ方法で罹患血清試料または薬物処理血清試料を添加した。上記と同じ方法で磁気スクリーニングおよびＱｄｏｔ添加を行う。その後、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析器でヒットの配列を決定する。
実施例４ １回の測定によるマイクロアレイデータ
マイクロアレイを、引用により援用される米国特許公報第２０１０／０３０３８０５号で述べられように調製した。マイクロアレイスライドをハイブリダイゼーションチャンバーで覆い、１５分間、１ＸＴＢＳＴ（５０ｒｏＭ Ｉｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）で平衡化する。その後、１時間、４℃にてブロッキングバッファー１ｍＬでスライドをブロックする。ブロッキングバッファーを取り除き、１６時間、４℃で優しく振とうさせながら血清（２０ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬとともにスライドをインキュベートする。別の方法では、１時間、４℃にて大腸菌溶解物（１．５ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬでスライドをブロックする。大腸菌溶解物を取り除き、１８時間、４℃で優しく振とうさせながら血清（１５ｍｇ／ｍＬ）の大腸菌溶解物（１．５ｍｇ／ｍＬ）溶液１ｍＬとともにスライドをインキュベートする。その後、マイクロアレイを１ＸＴＢＳＴで３回洗浄し、２時間、４℃にてオービタルシェーカーでＡｌｅｘａ−６４７標識抗ＩｇＧ抗体（５ｍｇ／ｍＬ）とハイブリダイズさせる。その後、遠心分離機（１５００ｒｐｍで５分）を用いてスライドを乾燥させ、１００％出力で６３５−ｎｍレーザーおよび６００または６５０の光電子増倍管ゲインを用いたマイクロアレイスキャナー（Ｇｅｎｅ Ｐｉｘ Ａｕｔｏｌｏａｄｅｒ ４２００）でスキャンした。Ｇｅｎｅ Ｆｉｘ Ｐｒｏ ６．０ソフトウェアおよびＧｅｎｅｓｐｒｉｎｇソフトウェアで、すべてのスキャン画像を解析した。
実施例５ ＥＬＩＳＡプロトコル
Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから９６ウェルマレイミド活性化プレートを入手し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒのプレート洗浄機を用いて４００μＬ／ウェルの洗浄バッファー（０．１Ｍ リン酸ナトリウム、０．１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０，ｐＨ７．２）で３回洗浄した。ＰＢＳ結合バッファー（０．１ｍＭ リン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）で、目的のペプトイドを１０ｍＭに希釈し、このペプトイド溶液２００μＬを適当なウェルに加えた。その後、５００ｒｐｍで振とうしながら、室温で暗所にて２時間、プレートをインキュベートしたままにした。その後、プレート洗浄機を用いてウェルからペプトイド溶液を吸い取り、４００μＬ／ウェルの洗浄バッファーで３回再洗浄した。Ｌ−システイン ＨＣＬ：結合バッファーでＨ２０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１０μＬ／ｍＬに希釈し、２００μＬ／ウェルで添加した。その後、５００ｒｐｍで振とうしながら、室温で暗所にて１時間、プレートをインキュベートし、３回洗浄した。ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｅｋ（商標）（ＰＢＳ）ブロッキングバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）２００μＬをウェルに添加し、５００ｒｐｍで振とうしながら、４℃で暗所にて１時間、プレートをインキュベートした。プレート洗浄機を用いてプレートを３回洗浄し、１：２００から希薄になる方向に結合バッファーで連続的に希釈することで血清試料を調製した。試料濃度が同様になるように、ｎａｎｏ−ｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて１：２００濃度の試料原液を用いた。次の希釈物を調製する前に、各希釈試料をボルテックスにかけた。血清（罹患と正常の両方）の適切な希釈物２００μＬのほか、対照として血清を含まない結合バッファーもプレートに添加した。５００ｒｐｍで振とうしながら、室温で暗所にて２時間、血清をインキュベートしたままにした。プレートを再洗浄し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）の１：３０，０００希釈物の結合バッファー溶液２００μＬを適切なウェルに添加し、暗所にて５００ｒｐｍで振とうしながら３０分間、室温でインキュベートした。プレートを３回洗浄し、ＴＭＢ（３，３´，５，５´−テトラメチルベンジジン）溶液Ｌ００μＬを各ウェルに添加し、暗所の作業台上で３０分間、発色させた。反応を停止させるために２Ｍ硫酸停止液１００μＬを添加し、プレートリーダーを用いて４５０の吸光度で読み取った。
したがって、いずれの場合にも、各疾患またはすべての疾患に関して、そのようなマーカーに結合した疾患関連バイオマーカーおよびリガンドを迅速に発見するために、本発明のプロセスを利用してもよい。その後、これらのリガンド（リガンドからなるこの大きなプール）を診断および／または治療目的に使用できる。診断プラットフォームとしては、マイクロアレイ、ビーズベース方法、およびＥＬＩＳＡシステムが挙げられる。上記で利用される条件は、本発明の重要な一面を含む。これらの条件には、血清の希釈範囲のほか、ビーズまたはウェルでの特定ペプトイドの濃度、および検出方法も含む。ビーズ上にペプトイドを有するビーズの数は、特定の試験キットまたはスクリーニングキットに応じて異なる場合がある。これらの数は、ビーズ／リガンドが本明細書で列挙された初期スクリーニングプロトコルおよび方法で使用されるかどうか、および／または高親和性リガンドの発見に基づく試験キットで使用されるかに応じても異なる場合がある。
本発明の広範囲に及ぶ発明概念から逸脱せずに、上述の実施形態に対して変更を行うことができることは、当業者に高く評価されるであろう。そのため、当然のことながら、本発明は開示された特定の実施形態に限定されないが、添付した特許請求の範囲に定められる本発明の精神および範囲内にある修正を対象とすることを意図している。
Claims (17)
- 被験体から予め採取された生体試料における薬物誘導反応を確認するための方法であって、
前記生体試料にペプトイドリガンドライブラリーを接触させるステップ、
前記生体試料中の１つ以上のマーカーと前記ライブラリーの１つ以上のペプトイドリガンドとの結合特性を同定するステップ、および
前記生体試料における薬物誘導反応を確認するために、前記１つ以上のマーカーが薬物誘導反応と関連があるかを確認するステップを含み、
前記薬物誘導反応が薬物の副作用、薬物に対する有害反応、または薬物に対する耐性であり、
前記ライブラリーが下記の式Ｉで表される化合物を含む方法。
Ｒ１は−（Ｃ １ −Ｃ ６ ）ＳＣＨ ３ 又は−ＣＨ ２ ＳＨであり；
Ｒ２はＨであり；
Ｒ３〜Ｒ６は、独立して、Ｈ、−Ｃ１−Ｃ６アルキル、−Ｃ１−Ｃ６アルキルＳＣＨ３、−Ｃ０−Ｃ６アルキルＣ２−Ｃ６アルケニル、−Ｃ０−Ｃ６アルキルＣ２−Ｃ６アルキニル、−Ｃ１−Ｃ６ＣＯＯＨ、−Ｃ１−Ｃ６アルキルＯＨ、−Ｃ１−Ｃ６アルキルＮＨ２、−Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、−Ｃ１−Ｃ６アルキルアリール、−Ｃ１−Ｃ６アルキルヘテロアリール、−Ｃ１−Ｃ６アルキルＮＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ６アルキル、−Ｃ１−Ｃ６アルキルシクロアミドからなる群から選択され；
アリール及びヘテロアリール基は、互いに独立して、−ＯＨ、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、−ＯＣＨ３、−ＳＯ２ＮＨ２、または−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−で置換されてもよく、
ｎは３〜１１である。 - 請求項１の方法であって、
前記薬物がアトルバスタチン、クロピドグレル、エタネルセプト、フルチカゾン・サルメテロール、インフリキシマブ、バルサルタン、リッキシマブ、エソメブラゾール、ベバシズマブ、アリピプラゾール、トラスツズマブ、オランザピン、クエチアピン、アダリムマブ、モンテルカスト、エノキサパリン、ベンラファキシン、ピオグリダゾン、カンデサルタン、エソシタロプラム、若しくはグラチラマー、またはこれらの組み合わせである、方法。 - 請求項１の方法であって、
前記薬物誘導反応が疾患または疾患の病期に関連する、方法。 - 請求項３の方法であって、
前記疾患が癌性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染症、神経変性疾患、または心臓血管疾患である、方法。 - 請求項４の方法であって、
前記癌性疾患が乳癌、肺癌、前立腺癌、子宮頸癌、頭頸部癌、精巣癌、卵巣癌、皮膚癌、脳腫瘍、膵臓癌、肝臓癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、食道癌、リンパ腫、および白血病であって、これらの病態に特有のマーカーを認識するリガンドなどである、方法。 - 請求項４の方法であって、
前記自己免疫疾患が狼瘡、重症筋無力症、多発性硬化症、睡眠発作症、関節リウマチ、腎炎、シャーガス病、強皮症、またはシェーグレン病である、方法。 - 請求項４の方法であって、
前記感染症がウイルス、細菌、または菌類による感染の結果である、方法。 - 請求項４の方法であって、
前記神経変性疾患がアルツハイマー病、認知症、またはクロイツフェルト・ヤコブ病である、方法。 - 請求項１の方法であって、
前記リガンドライブラリーが、早期の初期スクリーニングで同定された、あるいはリガンド結合マーカーに対する公知の反応性に基づいて事前選択された複数のリガンドを含む、方法。 - 請求項１の方法であって、
前記ライブラリーが、下記の（Ａ）〜（Ｅ）の群から選択される反応物の使用を含む処理によって生成された、下記の式Ｉで表される化合物を含む、方法。
（Ａ）フルフリルアミン；３，４−ジメトキシエタノールアミン；ベンジルアミン；Ｎ−（２−アミノエチル）アセトアミド；Ｎ−（３−アミノプロピル）−２−ピロリジノン；エタノールアミン；グリシン；ジアミノブタン；アリルキルアミン；ピペロニルアミン；メチルベンジルアミン；イソブチルアミン；４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホンアミド、またはシクロヘキシルアミン；または
（Ｂ）メトキシエチルアミン；ピペロニルアミン；シクロヘキシルアミン；ジアミノブタン；メチルベンジルアミン；イソブチルアミン；フルフリルアミンまたは４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホンアミド；または
（Ｃ）フルフリルアミン、エタノールアミン；グリシン；ジアミノブタン；アリルアミン；ピペロニルアミン；メチルベンジルアミン；イソブチルアミンまたは４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホンアミド；または
（Ｄ）フルフリルアミン、Ｎ−（２−アミノエチル）アセトアミド；Ｎ−（３−アミノエチル）−２−ピロリジノン；エタノールアミン；グリシン；ジアミノブタン；アリルアミン；ピペロニルアミン；メチルベンジルアミン；イソブチルアミン；４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホンアミド；または
（Ｅ）システイン、グリシン、アリルアミン、エタノールアミン、イソブチルアミン、メチルベンジルアミン、ピペロニルアミン、メチオニン、シクロヘキシルアミン、３，４−ジメトキシフェネチルアミン、ベンジルアミン、Ｎ−（２−アミノエチル）アセトアミド、Ｎ−（３−アミノプロピル）−２−ピロリジノン、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホンアミド、およびフルフリルアミン。
Ｒ１は、−（Ｃ１−Ｃ６）ＳＣＨ３を含む群から選択され；
Ｒ２はＨから選択され；
Ｒ３およびＲ５は、独立して、Ｈ、−Ｃ１−Ｃ６アルキル、−Ｃ１−Ｃ６アルキルＳＣＨ３、−Ｃ０−Ｃ６アルキルＣ２−Ｃ６アルケニル、−Ｃ０−Ｃ６アルキルＣ２−Ｃ６アルキニル、−Ｃ１−Ｃ６ＣＯＯＨ、−Ｃ１−Ｃ６アルキルＯＨ、−Ｃ１−Ｃ６アルキルＮ（Ｒ）２、−Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、−Ｃ１−Ｃ６アルキルアリール、−Ｃ１−Ｃ６アルキルヘテロアリール、−Ｃ１−Ｃ６アルキルＮＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ６アルキル、−Ｃ１−Ｃ６アルキルシクロアミドからなる群から選択され、ここで、アリールまたはヘテロアリール基のいずれも、独立して、−ＯＨ、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、−ＯＣＨ３、−ＳＯ２ＮＨ２、または−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−で置換されてもよく；
Ｒ４は、フルフリルまたは−（Ｃ１−Ｃ６アルキル）ＮＲ７Ｒ８を含む群から選択され、
Ｒ６は、Ｈ、１−イル−アリル、１−イル−２−ヒドロキシエチル、イソブチル、１−イル−ｎ−ブチルアミン、メチルベンジル、ピペロニル、シロヘキシル、１−イル−２−（３，４−ジメトキシフェニル）エチル、ベンジル、１−イル−２−（アセトアミド）エチル、１−イル−３−２−ピロリジノン、１−イル−２−（４−ベンゼンスルホンアミド）エチル、またはフルフリルであり；
ｎは、３〜１１である。 - 請求項１の方法であって、
前記ライブラリーが、下記の式Ｉａで表される化合物、並びにその薬学的に許容される塩を含む、方法。
（ａ）Ｒ９はｎ−ブチルアミン；Ｒ１０は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１１はピペロニル；Ｒ１２はメチルベンジル；Ｒ１３はピペロニル；Ｒ１４はメチルベンジル；Ｒ１５は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチルであり、およびＲ１６は１−イル−２−メトキシエチルである；
（ｂ）Ｒ９は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１０は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１１は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１２はシクロヘキシル；Ｒ１３は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１４は１−イル−２，２−ジメチルエチル（イソブチル）；Ｒ１５は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチルであり、およびＲ１６はメチルベンジルである；
（ｃ）Ｒ９は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１０は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１１はピペロニル；Ｒ１２は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１３は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１４はメチルベンジル；Ｒ１５はメチルベンジルであり、およびＲ１６はシクロヘキシルである；
（ｄ）Ｒ９はピペロニル；Ｒ１０は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１１はイソブチル；Ｒ１２は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１３はメチルベンジル；Ｒ１４はシクロヘキシル；Ｒ１５はイソブチルであり、およびＲ１６は１−イル−ｎ−ブチルアミンである；
（ｅ）Ｒ９は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１０は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１１はメチルベンジル；Ｒ１２は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１３はシクロヘキシル；Ｒ１４はシクロヘキシル；Ｒ１５はメチルベンジルであり、およびＲ１６はピペロニルである；
（ｆ）Ｒ９はピペロニル；Ｒ１０は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１１はイソプロピル；Ｒ１２はイソプロピル；Ｒ１３は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１４はシクロヘキシル；Ｒ１５は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチルであり、およびＲ１６は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチルである；
（ｇ）Ｒ９は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１０は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１１はピペロニル；Ｒ１２はメチルベンジル；Ｒ１３はピペロニル；Ｒ１４はメチルベンジル；Ｒ１５は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチルであり、およびＲ１６はシクロヘキシルである；
（ｈ）Ｒ９は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１０は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１１はメチルベンジル；Ｒ１２は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１３はシクロヘキシル；Ｒ１４はシクロヘキシル；Ｒ１５はメチルベンジルであり、およびＲ１６はピペロニルである；
（ｉ）Ｒ９は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１０はメチルベンジル；Ｒ１１はメチルベンジル；Ｒ１２は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１３は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１４はシクロヘキシル；Ｒ１５は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチルであり、およびＲ１６はシクロヘキシルである；
（ｊ）Ｒ９は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１０はメチルベンジル；Ｒ１１はメチルベンジル；Ｒ１２はシクロヘキシル；Ｒ１３は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１４はメチルベンジル；Ｒ１５はイソブチルであり、およびＲ１６は１−イル−ｎ−ブチルアミンである；
（ｋ）Ｒ９は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１０はイソブチル；Ｒ１１は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１２はピペロニル；Ｒ１３は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１４はシクロヘキシル；Ｒ１５はメチルベンジルであり、およびＲ１６は１−イル−２−メトキシエチルである；
（ｌ）Ｒ９は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１０は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１１は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１２はシクロヘキシル；Ｒ１３は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１４はイソブチル；Ｒ１５は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチルであり、およびＲ１６はメチルベンジルである；
（ｍ）Ｒ９は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１０は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１１は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１２は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１３はメチルベンジル；Ｒ１４は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１５はフルフリルであり、およびＲ１６はフルフリルである；
（ｎ）Ｒ９はシクロヘキシル；Ｒ１０はシクロヘキシル；Ｒ１１は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１２はフルフリル；Ｒ１３は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１４は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１５は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチルであり、およびＲ１６はフルフリルである；
（ｏ）Ｒ９は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１０はピペロニル；Ｒ１１は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１２は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１３はメチルベンジル；Ｒ１４は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１５は１−イル−２−メトキシエチルであり、およびＲ１６はメチルベンジルである；
（ｐ）Ｒ９はシクロヘキシル；Ｒ１０はシクロヘキシル；Ｒ１１はピペロニル；Ｒ１２は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１３は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１４は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１５は１−イル−ｎ−ブチルアミンであり、およびＲ１６はイソブチルである；
（ｑ）Ｒ９はピペロニル；Ｒ１０は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１１は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１２は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１３はピペロニル；Ｒ１４は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１５はメチルベンジルであり、およびＲ１６はメチルベンジルである；
（ｒ）Ｒ９はメチルベンジル；Ｒ１０はメチルベンジル；Ｒ１１はメチルベンジル；Ｒ１２は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１３はピペロニル；Ｒ１４は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１５はピペロニルであり、およびＲ１６は１−イル−ｎ−ブチルアミンである；
（ｓ）Ｒ９は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１０は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１１はメチルベンジル；Ｒ１２は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１３はメチルベンジル；Ｒ１４はメチルベンジル；Ｒ１５は１−イル−２−メトキシエチルであり、およびＲ１６はピペロニルである；
（ｔ）Ｒ９はメチルベンジル；Ｒ１０は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１１は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１２は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１３はイソブチル；Ｒ１４は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１５はメチルベンジルであり、およびＲ１６は１−イル−２−メトキシエチルである；
（ｕ）Ｒ９は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１０は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１１はイソブチル；Ｒ１２はイソブチル；Ｒ１３はシクロヘキシル；Ｒ１４は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１５は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチルであり、およびＲ１６はシクロヘキシルである；
（ｖ）Ｒ９はイソブチル；Ｒ１０は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１１は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１２はメチルベンジル；Ｒ１３は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１４は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１５はピペロニルであり、およびＲ１６はピペロニルである；
（ｗ）Ｒ９は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１０はイソブチル；Ｒ１１はメチルベンジル；Ｒ１２は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１３は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１４はイソブチル；Ｒ１５は１−イル−２−メトキシエチルであり、およびＲ１６はシクロヘキシルである；
（ｘ）Ｒ９はフルフリル；Ｒ１０はフルフリル；Ｒ１１はピペロニル；Ｒ１２はシクロヘキシル；Ｒ１３はピペロニル；Ｒ１４は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１５は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチルであり、およびＲ１６はシクロヘキシルである；
（ｙ）Ｒ９はピペロニル；Ｒ１０はピペロニル；Ｒ１１は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１２は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１３は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１４は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１５は１−イル−ｎ−ブチルアミンであり、およびＲ１６は１−イル−２−メトキシエチルである；
（ｚ）Ｒ９はピペロニル；Ｒ１０は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１１はイソブチル；Ｒ１２は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１３はメチルベンジル；Ｒ１４はシクロヘキシル；Ｒ１５はイソブチルであり、およびＲ１６は１−イル−ｎ−ブチルアミンである；
（ａａ）Ｒ９は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１０は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１１はメチルベンジル；Ｒ１２はメチルベンジル；Ｒ１３は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１４は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１５は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチルであり、およびＲ１６は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチルである；
（ｂｂ）Ｒ９は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１０は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１１は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１２はイソブチル；Ｒ１３はシクロヘキシル；Ｒ１４は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１５は１−イル−ｎ−ブチルアミンであり、およびＲ１６はピペロニルである；
（ｃｃ）Ｒ９はシクロヘキシル；Ｒ１０はメチルベンジル；Ｒ１１はシクロヘキシル；Ｒ１２はピペロニル；Ｒ１３は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１４は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１５は１−イル−ｎ−ブチルアミンであり、およびＲ１６は１−イル−２−メトキシエチルである；
（ｄｄ）Ｒ９は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１０は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１１は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１２は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１３は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１４は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１５はイソブチルであり、およびＲ１６はシクロヘキシルである；
（ｅｅ）Ｒ９は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１０はメチルベンジル；Ｒ１１は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１２は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１３はピペロニル；Ｒ１４はイソブチル；Ｒ１５は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチルであり、およびＲ１６は１−イル−ｎ−ブチルアミンである；
（ｆｆ）Ｒ９は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１０はメチルベンジル；Ｒ１１は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１２はメチルベンジル；Ｒ１３は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１４は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１５は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチルであり、およびＲ１６はシクロヘキシルである；
（ｇｇ）Ｒ９は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１０は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１１は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１２は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１３は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１４は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１５は１−イル−ｎ−ブチルアミンであり、およびＲ１６はメチルベンジルである；
（ｈｈ）Ｒ９はシクロヘキシル；Ｒ１０はシクロヘキシル；Ｒ１１はメチルベンジル；Ｒ１２は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１３はメチルベンジル；Ｒ１４はシクロヘキシル；Ｒ１５はメチルベンジルであり、およびＲ１６は１−イル−ｎ−ブチルアミンである；
（ｉｉ）Ｒ９は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１０はフルフリル；Ｒ１１はメチルベンジル；Ｒ１２は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１３はフルフリル；Ｒ１４はシクロヘキシル；Ｒ１５はメチルベンジルであり、およびＲ１６はシクロヘキシルである；
（ｊｊ）Ｒ９は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１０はメチルベンジル；Ｒ１１は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１２は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１３は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１４はメチルベンジル；Ｒ１５は１−イル−２−メトキシエチルであり、およびＲ１６はイソブチルである；
（ｋｋ）Ｒ９は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１０は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１１は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１２はメチルベンジル；Ｒ１３はメチルベンジル；Ｒ１４はシクロヘキシル；Ｒ１５は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチルであり、およびＲ１６はメチルベンジルである；
（ｌｌ）Ｒ９は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１０は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１１は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１２は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１３はメチルベンジル；Ｒ１４は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１５はメチルベンジルであり、およびＲ１６は１−イル−ｎ−ブチルアミンである；
（ｍｍ）Ｒ９は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１０は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１１は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１２は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１３は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１４はシクロヘキシル；Ｒ１５は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチルであり、およびＲ１６はメチルベンジルである；
（ｎｎ）Ｒ９は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１０は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１１はピペロニル；Ｒ１２は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１３は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１４はメチルベンジル；Ｒ１５はメチルベンジルであり、およびＲ１６はシクロヘキシルである；
（ｏｏ）Ｒ９は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１０はメチルベンジル；Ｒ１１はメチルベンジル；Ｒ１２は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１３はメチルベンジル；Ｒ１４はピペロニル；Ｒ１５は１−イル−ｎ−ブチルアミンであり、およびＲ１６は１−イル−２−メトキシエチルである；
（ｐｐ）Ｒ９はピペロニル；Ｒ１０は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１１は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１２はメチルアミン；Ｒ１３はピペロニル；Ｒ１４は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１５はピペロニルであり、およびＲ１６は１−イル−２−メトキシエチルである；
（ｑｑ）Ｒ９はシクロヘキシル；Ｒ１０はシクロヘキシル；Ｒ１１はフルフリル；Ｒ１２は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１３はイソブチル；Ｒ１４はシクロヘキシル；Ｒ１５はメチルベンジルであり、およびＲ１６はメチルベンジルである；
（ｒｒ）Ｒ９はピペロニル；Ｒ１０は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１１はイソブチル；Ｒ１２はイソブチル；Ｒ１３は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１４はシクロヘキシル；Ｒ１５は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチルであり、およびＲ１６は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチルである；あるいは
（ｓｓ）Ｒ９はシクロヘキシル；Ｒ１０はシクロヘキシル；Ｒ１１は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１２はメチルベンジル；Ｒ１３は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１４はメチルベンジル；Ｒ１５はシクロヘキシルであり、およびＲ１６はピペロニルである。 - 請求項１の方法であって、
前記ライブラリーが、下記の式ＩＩで表される化合物、並びにその薬学的に許容される塩を含む、方法。
（ａ）Ｒ９はｎ−ブチルアミン；Ｒ１０は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１１はピペロニル；Ｒ１２はメチルベンジル；Ｒ１３はピペロニル；Ｒ１４はメチルベンジル；Ｒ１５は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチルであり、およびＲ１６は１−イル−２−メトキシエチルである；
（ｂ）Ｒ９は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１０は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１１は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１２はシクロヘキシル；Ｒ１３は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１４は１−イル−２，２−ジメチルエチル（イソブチル）；Ｒ１５は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチルであり、およびＲ１６はメチルベンジルである；
（ｃ）Ｒ９は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１０は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１１はピペロニル；Ｒ１２は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１３は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１４はメチルベンジル；Ｒ１５はメチルベンジルであり、およびＲ１６はシクロヘキシルである；
（ｄ）Ｒ９はピペロニル；Ｒ１０は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１１はイソブチル；Ｒ１２は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１３はメチルベンジル；Ｒ１４はシクロヘキシル；Ｒ１５はイソブチルであり、およびＲ１６は１−イル−ｎ−ブチルアミンである；
（ｅ）Ｒ９は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１０は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１１はメチルベンジル；Ｒ１２は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１３はシクロヘキシル；Ｒ１４はシクロヘキシル；Ｒ１５はメチルベンジルであり、およびＲ１６はピペロニルである；
（ｆ）Ｒ９はピペロニル；Ｒ１０は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１１はイソプロピル；Ｒ１２はイソプロピル；Ｒ１３は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１４はシクロヘキシル；Ｒ１５は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチルであり、およびＲ１６は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチルである；
（ｇ）Ｒ９は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１０は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１１はピペロニル；Ｒ１２はメチルベンジル；Ｒ１３はピペロニル；Ｒ１４はメチルベンジル；Ｒ１５は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチルであり、およびＲ１６はシクロヘキシルである；
（ｈ）Ｒ９は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１０は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１１はメチルベンジル；Ｒ１２は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１３はシクロヘキシル；Ｒ１４はシクロヘキシル；Ｒ１５はメチルベンジルであり、およびＲ１６はピペロニルである；
（ｉ）Ｒ９は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１０はメチルベンジル；Ｒ１１はメチルベンジル；Ｒ１２は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１３は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１４はシクロヘキシル；Ｒ１５は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチルであり、およびＲ１６はシクロヘキシルである；
（ｊ）Ｒ９は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１０はメチルベンジル；Ｒ１１はメチルベンジル；Ｒ１２はシクロヘキシル；Ｒ１３は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１４はメチルベンジル；Ｒ１５はイソブチルであり、およびＲ１６は１−イル−ｎ−ブチルアミンである；
（ｋ）Ｒ９は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１０はイソブチル；Ｒ１１は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１２はピペロニル；Ｒ１３は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１４はシクロヘキシル；Ｒ１５はメチルベンジルであり、およびＲ１６は１−イル−２−メトキシエチルである；
（ｌ）Ｒ９は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１０は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１１は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１２はシクロヘキシル；Ｒ１３は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１４はイソブチル；Ｒ１５は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチルであり、およびＲ１６はメチルベンジルである；
（ｍ）Ｒ９は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１０は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１１は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１２は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１３はメチルベンジル；Ｒ１４は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１５はフルフリルであり、およびＲ１６はフルフリルである；
（ｎ）Ｒ９はシクロヘキシル；Ｒ１０はシクロヘキシル；Ｒ１１は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１２はフルフリル；Ｒ１３は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１４は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１５は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチルであり、およびＲ１６はフルフリルである；
（ｏ）Ｒ９は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１０はピペロニル；Ｒ１１は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１２は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１３はメチルベンジル；Ｒ１４は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１５は１−イル−２−メトキシエチルであり、およびＲ１６はメチルベンジルである；
（ｐ）Ｒ９はシクロヘキシル；Ｒ１０はシクロヘキシル；Ｒ１１はピペロニル；Ｒ１２は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１３は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１４は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１５は１−イル−ｎ−ブチルアミンであり、およびＲ１６はイソブチルである；
（ｑ）Ｒ９はピペロニル；Ｒ１０は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１１は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１２は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１３はピペロニル；Ｒ１４は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１５はメチルベンジルであり、およびＲ１６はメチルベンジルである；
（ｒ）Ｒ９はメチルベンジル；Ｒ１０はメチルベンジル；Ｒ１１はメチルベンジル；Ｒ１２は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１３はピペロニル；Ｒ１４は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１５はピペロニルであり、およびＲ１６は１−イル−ｎ−ブチルアミンである；
（ｓ）Ｒ９は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１０は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１１はメチルベンジル；Ｒ１２は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１３はメチルベンジル；Ｒ１４はメチルベンジル；Ｒ１５は１−イル−２−メトキシエチルであり、およびＲ１６はピペロニルである；
（ｔ）Ｒ９はメチルベンジル；Ｒ１０は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１１は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１２は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１３はイソブチル；Ｒ１４は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１５はメチルベンジルであり、およびＲ１６は１−イル−２−メトキシエチルである；
（ｕ）Ｒ９は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１０は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１１はイソブチル；Ｒ１２はイソブチル；Ｒ１３はシクロヘキシル；Ｒ１４は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１５は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチルであり、およびＲ１６はシクロヘキシルである；
（ｖ）Ｒ９はイソブチル；Ｒ１０は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１１は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１２はメチルベンジル；Ｒ１３は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１４は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１５はピペロニルであり、およびＲ１６はピペロニルである；
（ｗ）Ｒ９は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１０はイソブチル；Ｒ１１はメチルベンジル；Ｒ１２は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１３は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１４はイソブチル；Ｒ１５は１−イル−２−メトキシエチルであり、およびＲ１６はシクロヘキシルである；
（ｘ）Ｒ９はフルフリル；Ｒ１０はフルフリル；Ｒ１１はピペロニル；Ｒ１２はシクロヘキシル；Ｒ１３はピペロニル；Ｒ１４は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１５は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチルであり、およびＲ１６はシクロヘキシルである；
（ｙ）Ｒ９はピペロニル；Ｒ１０はピペロニル；Ｒ１１は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１２は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１３は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１４は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１５は１−イル−ｎ−ブチルアミンであり、およびＲ１６は１−イル−２−メトキシエチルである；
（ｚ）Ｒ９はピペロニル；Ｒ１０は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１１はイソブチル；Ｒ１２は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１３はメチルベンジル；Ｒ１４はシクロヘキシル；Ｒ１５はイソブチルであり、およびＲ１６は１−イル−ｎ−ブチルアミンである；
（ａａ）Ｒ９は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１０は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１１はメチルベンジル；Ｒ１２はメチルベンジル；Ｒ１３は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１４は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１５は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチルであり、およびＲ１６は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチルである；
（ｂｂ）Ｒ９は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１０は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１１は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１２はイソブチル；Ｒ１３はシクロヘキシル；Ｒ１４は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１５は１−イル−ｎ−ブチルアミンであり、およびＲ１６はピペロニルである；
（ｃｃ）Ｒ９はシクロヘキシル；Ｒ１０はメチルベンジル；Ｒ１１はシクロヘキシル；Ｒ１２はピペロニル；Ｒ１３は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１４は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１５は１−イル−ｎ−ブチルアミンであり、およびＲ１６は１−イル−２−メトキシエチルである；
（ｄｄ）Ｒ９は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１０は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１１は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１２は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１３は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１４は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１５はイソブチルであり、およびＲ１６はシクロヘキシルである；
（ｅｅ）Ｒ９は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１０はメチルベンジル；Ｒ１１は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１２は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１３はピペロニル；Ｒ１４はイソブチル；Ｒ１５は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチルであり、およびＲ１６は１−イル−ｎ−ブチルアミンである；
（ｆｆ）Ｒ９は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１０はメチルベンジル；Ｒ１１は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１２はメチルベンジル；Ｒ１３は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１４は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１５は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチルであり、およびＲ１６はシクロヘキシルである；
（ｇｇ）Ｒ９は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１０は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１１は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１２は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１３は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１４は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１５は１−イル−ｎ−ブチルアミンであり、およびＲ１６はメチルベンジルである；
（ｈｈ）Ｒ９はシクロヘキシル；Ｒ１０はシクロヘキシル；Ｒ１１はメチルベンジル；Ｒ１２は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１３はメチルベンジル；Ｒ１４はシクロヘキシル；Ｒ１５はメチルベンジルであり、およびＲ１６は１−イル−ｎ−ブチルアミンである；
（ｉｉ）Ｒ９は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１０はフルフリル；Ｒ１１はメチルベンジル；Ｒ１２は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１３はフルフリル；Ｒ１４はシクロヘキシル；Ｒ１５はメチルベンジルであり、およびＲ１６はシクロヘキシルである；
（ｊｊ）Ｒ９は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１０はメチルベンジル；Ｒ１１は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１２は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１３は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１４はメチルベンジル；Ｒ１５は１−イル−２−メトキシエチルであり、およびＲ１６はイソブチルである；
（ｋｋ）Ｒ９は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１０は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１１は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１２はメチルベンジル；Ｒ１３はメチルベンジル；Ｒ１４はシクロヘキシル；Ｒ１５は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチルであり、およびＲ１６はメチルベンジルである；
（ｌｌ）Ｒ９は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１０は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１１は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１２は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１３はメチルベンジル；Ｒ１４は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１５はメチルベンジルであり、およびＲ１６は１−イル−ｎ−ブチルアミンである；
（ｍｍ）Ｒ９は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１０は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１１は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１２は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１３は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１４はシクロヘキシル；Ｒ１５は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチルであり、およびＲ１６はメチルベンジルである；
（ｎｎ）Ｒ９は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１０は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１１はピペロニル；Ｒ１２は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１３は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１４はメチルベンジル；Ｒ１５はメチルベンジルであり、およびＲ１６はシクロヘキシルである；
（ｏｏ）Ｒ９は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチル；Ｒ１０はメチルベンジル；Ｒ１１はメチルベンジル；Ｒ１２は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１３はメチルベンジル；Ｒ１４はピペロニル；Ｒ１５は１−イル−ｎ−ブチルアミンであり、およびＲ１６は１−イル−２−メトキシエチルである；
（ｐｐ）Ｒ９はピペロニル；Ｒ１０は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１１は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１２はメチルアミン；Ｒ１３はピペロニル；Ｒ１４は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１５はピペロニルであり、およびＲ１６は１−イル−２−メトキシエチルである；
（ｑｑ）Ｒ９はシクロヘキシル；Ｒ１０はシクロヘキシル；Ｒ１１はフルフリル；Ｒ１２は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１３はイソブチル；Ｒ１４はシクロヘキシル；Ｒ１５はメチルベンジルであり、およびＲ１６はメチルベンジルである；
（ｒｒ）Ｒ９はピペロニル；Ｒ１０は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１１はイソブチル；Ｒ１２はイソブチル；Ｒ１３は１−イル−２−メトキシエチル；Ｒ１４はシクロヘキシル；Ｒ１５は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチルであり、およびＲ１６は１−イル−２−（４（ベンゼンスルホンアミド）エチルである；あるいは
（ｓｓ）Ｒ９はシクロヘキシル；Ｒ１０はシクロヘキシル；Ｒ１１は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１２はメチルベンジル；Ｒ１３は１−イル−ｎ−ブチルアミン；Ｒ１４はメチルベンジル；Ｒ１５はシクロヘキシルであり、およびＲ１６はピペロニルである。 - 請求項１の方法であって、
リガンドライブラリーが、ビーズに結合したリガンドを有する複数のビーズを含むビーズベースリガンドライブラリーである、方法。 - 請求項１の方法であって、
前記接触させるステップがアレイによって行われる、方法。 - 請求項１４の方法であって、
前記アレイがマイクロアレイ、顕微鏡スライド、プレート、チップ、またはビーズの集団である、方法。 - 請求項１４の方法であって、
前記アレイが、表面を有する固体基質、基質に結合した複数のリガンド、基質表面に安定的に結合したアンカー部分、ペプトイド部分、並びにアンカーおよびペプトイド部分を接続および分離するリンカー部分を含むリガンドの各々を含む、方法。 - 請求項１４の方法であって、
前記アレイが約１０００〜１００，０００の異なるリガンドを含む、方法。
Applications Claiming Priority (7)
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