CN102105493A - 用于检测微生物的分子印迹聚合物 - Google Patents

Abstract

本文描述的发明提供了能够结合微生物的分子印迹聚合物(MIP)和利用分子印迹聚合物(MIP)检测和/或鉴定微生物的方法。本发明的微生物包括原核生物、真核生物、病毒和朊病毒。本发明的方法包括检测与微生物有关的大分子的全部或部分，包括表位。本发明的大分子包括与所述微生物相关的多糖、蛋白、糖蛋白、肽聚糖、脂蛋白、肽、多肽和多核苷酸。本发明还提供了利用MIP诊断感染微生物的受试者的方法，另外还有诊断试剂盒。

Description

用于检测微生物的分子印迹聚合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2008年6月27日提交的美国临时申请第61/076,353号和2009年4月15日提交的美国临时申请第61/169,450号的优先权，这两篇临时申请的公开内容均通过引用以整体特定地并入本文。

发明领域

本文描述的发明总体上涉及能够结合微生物的分子印迹聚合物(MIP)，包括利用MIP检测、鉴定和/或定量微生物的方法和试剂盒。

发明背景

MIP是对单个化合物或相关化合物家族表现出高亲和力和选择性的工程化交联聚合物。即使当分析物存在于复杂的基质(例如，血浆、尿、肌肉组织、食品基质、环境样品、过程溶液等等)中时，MIP也能够结合分析物。MIP的重要力量是它们能够在存在大量具有相似物理化学特性的其他化合物的情况下结合痕量水平的靶分子。不像大多数只表现非选择性相互作用的分离粒子，MIP具有与特定的一种靶或一类靶在空间上和化学上互补的选择性合成识别位点(或印迹)。MIP的生产是经济且快速的，并且MIP在储存中是稳健且稳定的。它们可以在升高的温度、在有机溶剂中以及在极端pH值下使用。它们还展示了比基于免疫亲和性的吸附剂典型的样品加载能力更高的样品加载能力。这导致分析应用的较高回收率和使用吸附剂用于半制备规模或制备规模分离的适合性。

分子印迹包括围绕模板(例如，伪靶分子、靶分子类似物、实际靶分子的全部或部分等等)排列可聚合的功能单体，接着是聚合作用和模板移除。这种排列通常是通过以下实现的：(i)非共价相互作用(例如，H键、离子对相互作用)或(ii)可逆的共价相互作用。在模板移除后，这些分子印迹聚合物能够识别并结合实际的靶分子。

由于MIP的受控合成和显著的稳定性，它比起抗体用于诊断和样品分析具有若干优点。分子印迹起源于通过模板聚合在聚合物中产生度身定制的识别位点的概念(Mosbach K.等人，Bio/Technology，1996，14，163-170；Ansell R.J.等人，Curr.Opin.Biotechnol.，1996，7，89-94；Wulff G.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，1995，34，1812-32；Vidyasankar S.等人，Curr.Opin.Biotechnol.，1995，6，218-224；和Shea K.J，Trends In Polymer Science，1994，2，166-173)。分子印迹聚合物展现了显著的识别特性，这些特性被应用在多个领域，诸如药物分离(Fischer L.，等人，J.Am.Chem.Soc，1991，113，9358-9360；Kempe M，等人，J.Chromatogr.，1994，664，276-279；Nilsson K.，等人，J.Chromatogr.，1994，680，57-61)、受体模拟物(Ramstrom O.，等人，Tetrahedron：Asymmetry，1994，5，649-656；Ramstrom O.，等人，J.MoI.Recogn.，1996，9，691-696；Andersson L.L，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，1995，92，4788-4792；Andersson L.L，Anal.Chem.，1996，68，111-117)、生物模拟传感器(Kriz D.，等人，Anal.Chem.，1995，67，2142-2144)、抗体模拟物(Vlatakis G.，等人，Nature，1993，361，645-647)、模板辅助合成(Bystrom S.E.，等人，J.Am.Chem.Soc，1993，115，2081-2083)和催化(Muller R.，等人，Makromol.Chem.，1993，14，637-641；Beach J.V.，等人.，J.Am.Chem.Soc，1994，116卷，379-380)。

在MIP上体现的巨大潜力产生了基于分子印迹的分析装置以及检测多种靶的方法的众多发明，综述于Ye和Haupt(Anal.Bioanal.Chem.2004，378，1887-1897)。基于MIP的传感器的一些实例描述于美国专利第5,587,273、6,680,210、6,833,274、6,967,103和6,461,873号中。使用与分析物-标志物的结合物的替换相联合的MIP在几个实验室中显示是切实可行的(Vlatakis G.等人，Nature，1993，361，645-647，Levi等人.，1997，Anal.Chem.69.2017-2021；Nathaniel T.等人，J.Am.Chem.Soc.2005，127，5695-5700；Nicholls C.等人，Biosens.Bioelec，2006，21，1171-1177)。

迄今为止，分子印迹对包括大分子在内的较大分子的结合具有有限的应用。使用靶氨基酸衍生物或肽作为模板创造了选择性结合氨基酸衍生物和肽的合成聚合物(Kemp，1996，Anal.Chem.68：1948-1953)。结合核苷酸衍生物的印迹也已经被创造出来(Spivak和Shea，1998，Macromolecules 31：2160-2165)。通过混合基质材料与受分子图像束缚的完整多肽链创造了多肽的离子分子图像(美国专利第5,756,717号)。细胞色素c、血红蛋白和肌红蛋白的分子印迹也分别通过在存在每种完整蛋白的情况下聚合丙烯酰胺得以制备。马肌红蛋白的印迹从包括鲸肌红蛋白在内的蛋白混合物中选择性结合马肌红蛋白(美国专利第5,814,223号)。

尽管分子印迹的方法已对选择性结合大分子显示有限的成功，但是这些方法还没有被用于检测或鉴定微生物。在该领域中的这些缺点被下述的本发明克服，本发明一方面提供了可用于检测、鉴定和/或定量样品中或靶区域上的微生物的MIP。一般而言，下述本发明的印迹组合物包括限定模板微生物的印迹的基质材料。基于MIP的材料的潜在优点包括：与生物识别元件相当的特异性；在极端化学条件和物理条件下的稳健性和稳定性；以及设计缺乏适合的生物识别元件的靶分子的识别位点的能力。

发明概述

本文描述的发明的一个实施方案提供了能够特异性结合微生物的分子印迹聚合物(MIP)。

本发明的另一个实施方案提供了检测和/或鉴定微生物的方法，包括使一种或多种MIP接触所述微生物。

本发明的另一个实施方案提供了用于诊断感染微生物的受试者的方法，所述方法包括使从所述受试者获得的生物样品接触一种或多种MIP，并且检测和/或鉴定所述生物样品中所述微生物的存在。

在本发明的一个实施方案中，微生物可以选自原核生物、真核生物、病毒和朊病毒组成的组。

在一个实施方案中，MIP能够结合所述微生物独有的大分子的全部或部分。

在本发明的另一个实施方案中，MIP能够结合所述大分子的表位。

在本发明的一个实施方案中，大分子可以选自由以下组成的组：外泌多糖、多糖、蛋白、糖蛋白、肽聚糖、脂蛋白、肽、多肽和多核苷酸。

在本发明的一个实施方案中，MIP能够结合与耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(S.aureus)(MRSA)相关的大分子的全部或部分。

在本发明的一个实施方案中，与MRSA相关的大分子是青霉素结合蛋白2a(PBP2a)。

在本发明的另一个实施方案中，MIP能够结合选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和/或它们的片段。

在本发明的一个实施方案中，MIP与转导元件相偶联，以响应于MIP与所述微生物的结合产生可测量的信号。

在本发明的一个实施方案中，MIP与转导元件相偶联，以响应于MIP与所述大分子的全部或部分的结合产生可测量的信号。

在本发明的一个实施方案中，与转导元件相关联的信号选自由以下组成的组：比色信号、荧光信号、放射性信号和酶信号。

在本发明的一个实施方案中，生物样品选自由以下组成的组：生物流体(biological fluid)、组织提取物和组织。

在本发明的一个实施方案中，生物流体可以选自由以下组成的组：血液、脑脊液、血清、血浆、尿、乳头抽吸物(nipple aspirate)、细针抽吸物、组织灌洗液、唾液、痰、腹水液、精液、淋巴、阴道混合物(vaginal pool)、滑液、脊髓液、羊膜液、母乳(breast milk)、肺痰或肺表面活性物(surfactant)、尿、粪便，从以下任何部位收集的流体：肝、肾、乳房、骨、骨髓、睾丸、脑、卵巢、皮肤、肺、前列腺、甲状腺、胰、宫颈、胃、肠、结肠直肠、脑、膀胱、结肠、鼻孔和子宫(nares and uterine)，头和颈、鼻咽肿瘤和其他生物起源的液体样品。

在本发明的一个实施方案中，组织可以选自由以下组成的组：肝、肾、乳房、睾丸、脑、卵巢、皮肤、头和颈、肺、前列腺、甲状腺、胰、宫颈、胃、肠、结肠直肠、膀胱、结肠和子宫。

在本发明的一个实施方案中，组织提取物可以选自由以下组成的组：肝、肾、乳房、睾丸、脑、卵巢、皮肤、头和颈、肺、前列腺、甲状腺、胰、宫颈、胃、肠、结肠直肠、膀胱、结肠和子宫的提取物。

本发明的一个实施方案提供了用于诊断感染微生物的患者的方法，所述方法包括使从所述患者获得的生物样品接触一种或多种MIP，并且检测和/或鉴定所述生物样品中所述微生物独有的大分子的存在。

本发明的一个实施方案提供了利用能够结合与MRSA相关的大分子的全部或部分的MIP检测或鉴定MRSA的方法。

本发明的另一个实施方案提供了利用能够结合PBP2a的全部或部分的MIP检测或鉴定MRSA的方法。

本发明的另一个实施方案提供了利用能够结合选自由以下组成的组的氨基酸序列的MIP检测或鉴定MRSA的方法：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和/或它们的片段。

在本发明的一个实施方案中，在结合与MRSA相关的大分子的全部或部分后产生了可检测的信号。

在本发明的一个实施方案中，在MRSA与MIP结合后产生了可检测的信号，所述MIP能够结合PBP2a的全部或部分。

在本发明的另一个实施方案中，在MRSA与MIP结合后产生了可检测的信号，所述MIP能够结合选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和/或它们的片段。

本发明的一个实施方案提供了诊断具有MRSA感染的患者的方法。

在本发明的一个实施方案中，诊断具有MRSA感染的患者的方法包括使从所述患者获得的生物样品接触一种或多种能够结合与MRSA相关的大分子的MIP。

在本发明的另一个实施方案中，诊断具有MRSA感染的患者的方法包括测量在从所述患者获得的生物样品中的MRSA与MIP结合后产生的可检测信号，所述MIP能够结合与MRSA相关的大分子。

在本发明的一个实施方案中，诊断具有MRSA感染的患者的方法包括使从所述患者获得的生物样品接触一种或多种能够结合PBP2a的全部或部分的MIP 。

在本发明的另一个实施方案中，诊断具有MRSA感染的患者的方法包括测量在从所述患者获得的生物样品中的MRSA与MIP结合后产生的可检测信号，所述MIP能够结合PBP2a的全部或部分。

本发明的一个实施方案中，诊断具有MRSA感染的患者的方法包括使从所述患者获得的生物样品接触一种或多种MIP，所述MIP能够结合选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和/或它们的片段。

在本发明的另一个实施方案中，诊断具有MRSA感染的患者的方法包括测量在从所述患者获得的生物样品中的MRSA与MIP结合后产生的可检测的信号，所述MIP能够结合选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和/或它们的片段。

本发明的一个实施方案提供了用于确定受试者中与微生物相关的感染的发生、进展或退行的方法，其中通过使从受试者获得的生物样品接触一种或多种MIP筛选所述生物样品的所述微生物。

本发明的一个实施方案提供了包含用于检测或鉴定微生物的一种或多种MIP的试剂盒。

本发明的另一个实施方案提供了检测靶区域上微生物的存在的方法，所述方法包括使所述靶区域接触一种或多种MIP。

在一个实施方案中，靶区域包括环境的表面，诸如在医院、运动设备和医疗装置中。

在本发明的另一个实施方案中，靶区域可以选自由以下组成的组：床栏杆、门把手和计算机键盘。

附图简述

图1展示了产生MIP的方法。

图2A展示了产生针对与微生物有关的大分子的MIP的示意图。

图2B展示了利用本发明的MIP检测微生物的示意图。

图3A显示在PBP2A的晶体结构内的SEQ ID NO：4的链视图。

图3B显示在PBP2A的晶体结构内的SEQ ID NO：4的表面视图。

图4A显示在PBP2A的晶体结构内的SEQ ID NO：5的链视图。

图4B显示在PBP2A的晶体结构内的SEQ ID NO：5的表面视图。

图5A显示在PBP2A的晶体结构内的SEQ ID NO：8的链视图。

图5B显示在PBP2A的晶体结构内的SEQ ID NO：8的表面视图。

图6A显示在PBP2A的晶体结构内的SEQ ID NO：12的链视图。

图6B显示在PBP2A的晶体结构内的SEQ ID NO：12的表面视图。

图7A显示在PBP2A的晶体结构内的SEQ ID NO：13的链视图。

图7B显示在PBP2A的晶体结构内的SEQ ID NO：13的表面视图。

发明详述

本文描述的发明提供了能够结合微生物的分子印迹聚合物(MIP)和利用这些MIP检测微生物的方法。另外，本发明提供了用于检测、鉴定和/或定量生物样品中的微生物的方法和试剂盒，所述生物样品包括但不限于：组织、组织提取物和生物流体。本发明的MIP可用于鉴定和/或定量靶表面上和液体样品中的微生物。期望本发明的MIP可用于任何地点的生物体检测，例如，在家、诊所、医生办公室、医院床边、工厂或现场。这些方法可用于检测各种生物样品、环境样品和工业样品中的微生物而不需要复杂的样品制备程序，并因此也适合甚至现场条件下被未受训练的人员使用。此外，本发明提供了利用MIP诊断与微生物相关的感染的方法。

本发明的MIP可以根据本领域熟练技术人员已知的任何技术使用微生物或其部分作为模板分子来制备。这些方法包括共价印迹(Wulff，1982，Pure & Appl.Chem.，54，2093-2102)，通过共价印迹单体被共价连接至模板并使用交联剂聚合。随后，模板从聚合物上裂解，留下模板特异性结合腔。可选地，可以使用非共价印迹方法，诸如由美国专利第5,110,833号公开的方法，该专利部分通过引用特定地并入本文，从而单体通过非共价力与靶分子相互作用，然后单体通过交联剂相连以便在移除靶分子后形成靶特异性结合位点。可以使用这些方法的组合和变更来构建薄的分子印迹膜(film)和膜(membrane)(Hong等人，1998 Chem.Mater.，10，1029-1033)；在固体支持体表面上的印迹(Blanco-López等人，2004，Anal.Bioanal.Chem.，378，1922-1928；Sulitzky C.等人，2002 Macromolecules，35，79-91)；和微球(Ye等人，2000，Macromolecules，33，8239-8245)。此外，用于制备MIP的方法描述在美国专利第4,406,792、4,415,655、4,532,232、4,935,365、4,960,762、5,015,576、5,208,155、5,310,648、5,321,102、5,372,719、5,786,428、6,063,637和6,593,142号中，所有文献的公开制备MIP的方法的部分均通过引用特定地并入本文。

例如，分子印迹包括制造模板分子的聚合物铸模(polymer cast)，其中模板包括但不限于表位。制造聚合物铸模的方法包括溶解模板分子以印迹在适合的溶剂中。正常情况下，将包含共聚单体、交联单体和聚合引发剂的印迹组合物添加到包含期望的模板的溶剂中。然后将辐射(光化学或离子化)或热能应用到包含印迹组合物和模板的反应混合物，以驱动聚合过程，最终导致固体聚合物的形成。可以使用常规聚合物加工技术加工得到的聚合物，假定这些方法不改变分子印迹位点的结构。使用从聚合物解离模板分子的适当方法提取印迹分子。模板分子从聚合物解离的细节取决于靶分子与聚合物结合位点之间的化学相互作用的性质。从模板分子解离的聚合物拥有对这种模板分子的结构特性和电子特性优化的结合位点。

优选地，模板分子被印迹的条件与大分子被捕获的条件相似或相同。例如，如果大分子在变性条件下被捕获，那么模板分子应该在相同的变性条件下被印迹。类似地，如果大分子在天然条件下被捕获，那么模板分子应该在相同的天然条件下被印迹。天然条件和变性条件是本领域技术人员公知的。可以用来制造根据本发明的印迹组合物的许多热敏性化合物是本领域已知的，并且包括，例如且不限于，水凝胶诸如琼脂糖、明胶、可塑性塑料等等。其他适合的水凝胶的实例描述于美国专利第6,018,033号、美国专利第5,277,915号、美国专利第4,024,073号和美国专利第4,452,892号中，所有文献的涉及印迹的部分均通过引用并入本文。

可以用于制备本发明的聚合物的单体的适合的非限制性实例包括甲基丙烯酸甲酯、其他甲基丙烯酸烷基酯(alkyl methacrylates)、丙烯酸烷基酯(alkylacrylates)、烯丙基(ally)或芳基丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯、氰基丙烯酸酯、苯乙烯、α-甲基苯乙烯、乙烯基酯(包括醋酸乙烯酯)、氯乙烯、甲基乙烯基酮、偏二氯乙烯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、丙烯腈、甲基丙烯腈、乙二醇二丙烯酸酯、季戊四醇二甲基丙烯酸酯、季戊四醇二丙烯酸酯、N，N′-亚甲基双丙烯酰胺、N，N′-亚乙基双丙烯酰胺和N，N′-(1，2-二羟亚乙基)双丙烯酰胺。取决于所用的单体的选择，聚合物颗粒将具有多种物理特性和机械特性，诸如疏水性/亲水性、机械强度以及在存在溶剂时易于溶胀或耐溶胀。

本发明的MIP可以采用多种不同的形式。例如，它们可以处于个体的珠、圆盘、椭圆或其他规则或不规则形状的形式(总称为“珠(bead)”)，或处于片(sheet)的形式。每个珠或片可以包含单个模板分子的印迹腔，或者它们可以包含两个或多个相同或不同模板分子的印迹腔。在一个实施方案中，MIP包含排列成阵列或其他型式的多个不同模板分子的印迹腔，以使得在该阵列或型式内的印迹腔的相对位置与其身份相关，即用于产生印迹腔的模板分子的身份。取决于应用，阵列内的每个位置或地址可以包含单个模板分子的印迹腔或多个不同模板分子的印迹腔。此外，取决于应用，整个阵列或型式可以包括独有的印迹腔或者可以包括多余印迹腔。

在一个实施方案中，本发明提供了制造包括印迹组合物的基质材料的方法。这些基质材料包括但不限于能够经历从流体状态到半固体或固体状态的物理改变的物质。在流体状态中，基质材料的颗粒容易在它们自身之间移动，并且材料保持很少或无定界的形式。处于流体状态的基质材料可以与其他化合物(包括模板分子)混合。在半固态或固态中，基质材料能够形成并保留与模板分子的形状互补的腔。这些基质材料的实例包括热敏水凝胶诸如琼脂糖、聚合物诸如丙烯酰胺、以及交联的聚合物。

在本发明的一个实施方案中，MIP能够通过结合与微生物相关的大分子来结合微生物。一般而言，MIP能够特异性结合大分子的全部或部分，包括但不限于与微生物有关的表位。

在此所述的发明的模板分子可以选自由以下组成的组：微生物的全部或部分、与微生物相关的大分子或其部分、以及其类似物。模板分子对应的部分可以是大分子的内部部分和/或外部部分、和/或大分子的末端部分。可选地，该部分可以是大分子的侧基或修饰，诸如糖蛋白大分子的多糖基团或其部分。

可以使用本文描述的发明的印迹组合物捕获、检测、鉴定和/或定量的微生物包括但不限于任何类型的原核生物、真核生物、病毒和朊病毒。这些微生物的实例包括但不限于细菌、藻类、真菌、酵母、支原体、古细菌(archeabacteria)、分枝杆菌、寄生虫和原生动物。在一个实施方案中，本发明的MIP和方法可用于检测耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)。靶分子可以选自微生物独有的蛋白、肽或糖蛋白。例如，非洲锥虫病是由布氏锥虫(trypanosoma brucei)引起的，布氏锥虫是在非洲引起人昏睡病和动物那加那病的寄生虫原生生物物种。这种专性寄生虫具有两个宿主：昆虫载体和哺乳动物宿主。因为在这些宿主之间的大的差异，锥虫在其生命周期中经历复杂变化以有助于其在昆虫消化道和哺乳动物血流中生存。它的特征也在于独特的且著名的可变表面糖蛋白(VSG)包被以逃避宿主免疫系统。VSG基因在序列水平上具有极大变异性。然而，为了它们满足屏蔽功能，不同的VSG具有高度保守的结构特征。VSG由大约300到350个氨基酸的高度可变的N端结构域和大约100个氨基酸的更为保守的C端结构域组成。C端结构域形成4个α螺旋的结构束，而N端结构域形成这些螺旋周围的‘孔环’。这种孔环的三级结构在不同的VSG之间十分保守(尽管在氨基酸序列上具有广泛变异)，使得不同的VSG形成屏蔽锥虫表面所需的物理屏障。在本发明的一个实施方案中，MIP能够结合保守孔环的表位和/或其他保守的氨基酸序列。

与可以使用本发明的印迹组合物检测、鉴定和/或定量的微生物相关的大分子包括任何类型的大分子，可以根据本文教导的原理从这些大分子设计和构建模板分子。几乎任何类型的大分子都可以使用本发明的方法和组合物检测、鉴定和/或定量。非限制性实例包括多糖、蛋白、糖蛋白、肽聚糖、脂蛋白、肽、多肽和多核苷酸以及其他对本领域技术人员而言明显的大分子靶。

一般来说，模板分子对应的大分子的结构单位在大分子的一级结构内是连续的。如果本领域技术人员能够鉴定大分子一级结构中的一个末端或多个末端，那么优选的模板分子对应于包括大分子的末端的模板。可选地，模板分子对应的大分子的部分大小可以表示为整个大分子的大小的分数。例如，模板分子能够对应于由整个大分子结构的1％到5％、1％到10％、1％到15％、1％到20％、1％到25％、1％到30％、1％到35％、1％到40％、1％到50％、1％到60％、1％到70％、1％到80％、1％到90％、1％到95％或1％到99％组成的大分子的部分。优选地，模板分子具有对应于大分子的一级结构的连续部分的一级结构。

如果大分子是多肽，则模板分子能够对应于由选自该多肽或其类似物的一级序列的氨基酸序列组成的多肽的部分。例如，多肽的部分可以由来自多肽的一级结构的一系列氨基酸组成，所述多肽的一级结构由1到50个氨基酸、2到40个氨基酸、3到30个氨基酸、3到15个氨基酸、3到10个氨基酸、4到10个氨基酸、4到9个氨基酸、4到8个氨基酸、4到7个氨基酸、或5到7个氨基酸组成。优选的大分子的部分是由来自多肽的一级结构的氨基酸的连续序列组成的那些。

如果大分子是多核苷酸，则模板分子可以是具有选自该多核苷酸或其类似物的一级序列的核苷酸序列的寡核苷酸。如果多核苷酸具有n个核苷酸，那么所选的核苷酸序列可以具有1到(n-1)个核苷酸的长度。可选地，所选的序列能够包含1到50个核苷酸、2到40个核苷酸、3到30个核苷酸、3到15个核苷酸、3到10个核苷酸、4到10个核苷酸、4到9个核苷酸、4到8个核苷酸、4到7个核苷酸、或5到7个核苷酸。优选地，所选的序列是来自多核苷酸的一级序列的核苷酸的连续序列。

将理解如本文所用，表述“大分子”并非旨在将对可以用本文描述的方法的MIP鉴定的分子进行具体的大小限制。相反，大分子包括这样的分子：它们包括多个结构部分或其类似物以使得与这些结构部分中的至少一个相对应的模板分子可以用于制备能够结合该大分子的分子印迹。在本发明的一个实施方案中，与结构部分中的至少两个对应的模板分子可以用于制备能够结合大分子的分子印迹。在本发明的一个实施方案中，与结构部分中的至少三个对应的模板分子可以用于制备能够结合大分子的分子印迹。在本发明的一个实施方案中，与结构部分中的至少四个对应的模板分子可以用于制备能够结合大分子的分子印迹。

所谓“类似物”表示不同于参考分子但在结构上、功能上和/或化学上与参考分子相关的分子。类似物可以保留参考分子本质的特性、功能或结构。最优选地，类似物保留参考分子的至少一种生物功能。一般而言，差异是有限的，这样使得参考分子与类似物的结构或序列在总体上相似。例如，肽类似物和它的参考肽的差异可能在于处于任何组合的氨基酸序列的一个或多个置换、添加和/或缺失。类似物的其他实例包括与本文举例的肽相比具有较小氨基酸差异的肽。具体而言，包含保守的氨基酸取代(即那些发生在侧链相近的氨基酸家族内的氨基酸取代)的肽构成类似物。置换或插入的氨基酸残基可能是或者可能不是由遗传密码编码的氨基酸残基。肽或多肽的类似物可以是天然存在的，诸如等位基因变体，或者它可以是还未发现天然存在的变体。通过直接合成、通过修饰或通过诱变技术可以制造肽的非天然存在的类似物。

包括大分子的结构部分的身份取决于大分子的性质并且可能包括大分子的一级结构、二级结构和/或三级结构的区域。例如，对于多肽大分子而言，结构部分可以是构成多肽的个体氨基酸，或者可选地，如果多肽具有几个结构域，则结构部分可以是个体结构域。例如，多肽可以被视为由以上描述的个体氨基酸或结构域和/或糖或寡糖结构部分构成；多核苷酸大分子可以被视为由个体核苷酸结构部分构成。根据本发明的大分子可以源自实际上任何来源。它们可以从天然来源诸如生物样品或合成来源获得。

生物膜(biofilm)是由外泌多糖(EPS)基质结合在一起的细菌聚集物，所述外泌多糖基质是由分泌的蛋白和/或多糖聚合物构成。在感染期间，生物膜基质充当避风港，保护细菌细胞免受抗生素、免疫细胞和抗微生物因子。在一些实施方案中，MIP以与细菌相关的多糖和/或蛋白为靶。这些多糖和/或蛋白可以是生物膜或细菌本身的部分(例如，许多细菌具有多糖包被)。

每个细菌物种的生物膜的组成被认为是独有的。例如，组成EPS的化学物质、多糖、蛋白等等对于个体细菌而言是不同的。因此，以细菌生物膜的独有组分为靶的MIP可能允许细菌的物种特异性检测。由细菌展示的细胞表面多糖和/或蛋白可能对于每个细菌物种而言也是独有的。例如，金黄色葡萄球菌(S.aureus)具有用于结合纤连蛋白的独有的细胞表面纤连蛋白结合蛋白(FnBP)。例如，由M.Huesca等人，Infection & Immunity，卷68:3，第1156-1163页(2000年3月)和Q.Sun等人，Infection & Immunity，卷65:2，第537-543页(1997年2月)公开了金黄色葡萄球菌FnBP的多种表位。以金黄色葡萄球菌FnBP的这些表位为靶的MIP可以用于金黄色葡萄球菌的物种特异性检测。

细菌上的细胞表面蛋白还包括许多细胞表面粘附分子，这些粘附分子介导细菌与生物膜基质的粘附。例如，FnBP是细菌最初附着于宿主所需的MSCRAMM蛋白(识别粘附基质分子的微生物表面组分)家族的一员，提供了建立感染的关键步骤。这一家族的成员的其他实例包括金黄色葡萄球菌的聚集因子A(C1fA)和表皮葡萄球菌(S.epidermidis)的SdrG蛋白。在一些实施方案中，MIP可能以细菌产生的内生孢子上的大分子为靶。例如，艰难梭菌(C.difficile)是已知产生内生孢子的细菌物种。内生孢子是由某些细菌产生的确保细菌存活通过环境应力期的坚固的休眠结构。因此它们对紫外线和γ辐射、干燥、溶菌酶、温度、饥饿和化学消毒剂耐受。内生孢子通常见于土壤和水中，在那里它们可能存活较长时间。

因此，本文描述的发明的MIP可以用于检测和/或鉴定各种环境中的细菌，包括以浮游方式存在的细菌、其生物膜和/或其内生孢子。细菌的浮游形式是当细菌在液体基质中漂浮或游动时的细菌形式。多种类型的细菌可以通过本发明的MIP检测。这些细菌包括金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)、肠球菌(Enterococcus)物种、耐万古霉素的肠球菌(VRE)、艰难梭菌(C.difficile)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和大肠杆菌(E.coli)。

本发明的一个实施方案提供了利用MRSA细菌和/或生物膜的全部或部分作为模板分子制造对MRSA特异的MIP的方法。

在一个实施方案中，本发明的方法包括制造对MRSA细菌和/或生物膜特异的MIP，包括产生对应于与MRSA细菌和/或生物膜相关的大分子的全部或部分的模板并利用这种模板制造MIP。

在一个实施方案中，本发明提供了鉴定MRSA细菌和/或生物膜的方法，所述方法包括利用能够结合PBP2a的全部或部分的MIP。

在另一个实施方案中，本发明提供了鉴定MRSA细菌和/生物膜的方法，所述方法包括利用能够结合选自由以下组成的组的氨基酸序列的MIP：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和/或它们的片段。

类似地，可以利用与各种微生物有关的如以上所述的各种大分子作为产生MIP的模板来鉴定和/或检测所述微生物。大分子的非限制性实例包括用于检测病毒的衣壳蛋白或被膜蛋白以及用于检测寄生虫的表面外壳糖蛋白。

可选地，本发明的MIP与转导元件相偶联，以响应于MIP与所述模板或靶分子的结合产生可测量的信号。

转导元件的适合的实例包括但不限于HABA[2(4’-羟基偶氮苯)-苯甲酸]、染料、荧光剂、荧光染料、放射性标记、磁性颗粒、金属颗粒、有色颗粒、金属溶胶、酶底物、酶、化学发光物、光敏剂和可悬浮颗粒。

在一些实施方案中，可检测信号可能是可见物质，诸如有色乳胶珠，或者它可以参与借以产生有色产物的反应。反应产物在用裸眼观察时可能是可见的，或者例如在暴露于专门的光源诸如紫外光时可能是清楚的。

模板或靶分子的浓度可以由与转导元件相关的可检测信号的量指示。

另外，经由MIP的靶检测可以以多种途径发信号。在一些情况下，检测信号可以被目测(例如，发光或颜色变化)。利用MIP提供颜色改变反应的一种这样的技术在George M.Murray博士的名为“Molecularly Imprinted Polymer Sensor Aerosol(分子印迹聚合物传感器气溶胶)”的文件中被解释，该文献通过引用整体并入本文。使用卟啉与MIP引起电磁辐射的吸收/发射的变化的技术在美国专利第6,872,786号中被解释，该文献描述使用卟啉与MIP的技术的部分通过引用并入本文。在靶检测时使用MIP产生发光的一些技术在以下文献中被解释：美国专利第6,749,811号，该文献描述使用MIP的靶检测的部分通过引用并入本文；A.L.Jenkins等人，Anal.Chem.，卷71:2，第373-378页(1999)；以及B.R.Arnold等人，Johns Hopkins APL Technical Digest，卷20:2，第190-198页(1999)。可以对任何前述技术进行改变以用于本发明的MIP。

例如，根据本发明的一个方面的MIP可以通过以下步骤制备：(A)提供可聚合的卟啉衍生物与模板分子的反应产物；(B)使步骤(A)的反应产物与单体和交联剂共聚来形成聚合物；以及(C)从该聚合物移除模板分子以提供分子印迹聚合物，所述分子印迹聚合物表现出对模板分子的选择性结合亲和力并且在与靶分子结合时经历电磁辐射的吸收和/或发射上的可检测的变化。用于制备MIP的聚合反应混合物因此组成了步骤(A)的反应产物、一种或多种可聚合的单体、对聚合物终产物赋予足够坚硬的结构的有效量的一种或多种交联剂、惰性溶剂以及自由基或其他适当的引发剂。单体和交联剂的混合物可用在聚合方法中。根据所选择的可聚合的卟啉、单体和交联剂的特定性质/反应性以及特定的传感器应用和聚合物/传感器最终被采用的环境，可聚合的卟啉、单体和交联剂的量可以广泛地改变。可以改变每种反应物的相对量以达到在聚合物支持结构中的卟啉的期望浓度。可以改变聚合的溶剂、温度和手段以获得具有最佳物理特征或化学特征例如孔隙率、稳定性和亲水性的聚合物材料。溶剂的选择也可以基于其溶解反应混合物的所有各种组分的能力。

此外，根据本文描述的发明的另一个实施方案，MIP包括含镧系元素的聚合结构，所述结构表现出对被本文描述的发明的传感器装置或试剂盒检测的靶的选择性结合特点。聚合步骤包括使螯合的镧系元素模板络合物与一种或多种交联的单体以及任选的一种或多种另外的基质单体共聚来形成聚合物结构。能够在溶液中离解形成镧系元素离子的广泛范围的镧系元素金属盐中的任何一种及其两种或多种的组合适合于在本文描述的发明中使用。适合的镧系元素盐的实例包括但不限于镧(La)、铈(Ce)、镨(Pr)、钕(Nd)、钷(Pm)、钐(Sm)、铕(Eu)、钆(Gd)、铽(Th)、镝(Dy)、钬(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镱(Yb)和镥(Lu)的卤化物、硝酸盐、高氯酸盐以及类似物。MIP可以用作通过使这些分子与MIP镧系元素结合位点缔合来选择性捕获靶的光学传感器装置的部分。这些MIP充当发光源，可以对发光进行分析来确定溶液中靶的量。可以根据本文描述的发明使用广泛范围的适合检测器的任何一种。适合的检测器的非限制性实例包括分光光度计，分光仪(气体分光仪或质量分光仪)，光电倍增管，配备CCD照相机的单色仪、滤波器、裸眼，以上两种或多种的组合，以及类似检测器。

本文描述的发明另外呈现了形成基于位点选择性标签和模板的分子印迹聚合物(SSTT-MIP)的可靠的化学传感器平台的方法。在本方法中使用的SSTT-MIP策略提供了形成具有对分析物特异的模板位点且报告分子也能够与之相连的MIP。以这种方式，分析物检测能够以与对这种定位没有任何规定的方法相比更高的效率进行。对于本发明，预期改善了诸如信号背景比和信噪比的测量特点。

本发明还提供了分子印迹聚合物平台，其中对于特定靶分子形成了模板位点。在一个实施方案中，可以提供聚合物平台，其中模板位点具有与该位点的反应基团键连的至少一个报告分子。在一个实施方案中，聚合物平台包括干凝胶和气凝胶。由Bright等人在美国公开号2005/0227258中描述了开发用于检测广泛范围的靶的传感器的方法，该文献描述特定靶分子的模板位点的开发的部分通过引用并入本文。

例如，选择模板以使得该模板与聚合物平台形成键，该键的数目超出结合的靶将形成的键的数目。模板可以具有至少一个另外的反应基团以便能够在相对于预定靶的另外位点结合聚合物基质。在一个实施方案中，模板上连接模板与聚合物平台的反应基团的数目比对应靶上的反应基团数目多出至少一个。模板的移除在聚合物平台内产生腔。暴露在每个模板位点的是负责靶识别的反应基团。然而，由于上面提及的另外的反应基团的缘故，当模板从腔裂解时，腔含有超过结合靶所需的基团的一个或多个反应基团。额外的基团用来与报告分子成键。一旦报告分子在模板位点被结合，可以测量来自结合靶的MIP的吸光度/发光，并且报告子的UV、可见的或IR吸光度/发光特性(例如，吸收光谱、激发光谱和发射光谱、激发态的发光寿命和/或发光偏振)的变化指示在模板位点靶的存在。在吸光度/发光上的总变化一般与样品中靶分子的浓度成比例。

本发明的MIP可以被用于诊断感染微生物的受试者，包括使从所述受试者获得的生物样品接触一种或多种MIP，并且检测和/或鉴定所述生物样品中所述微生物的存在。诊断方法包括测量从所述患者获得的生物样品或生物流体中的所述微生物的全部或部分、或与所述微生物相关的大分子的全部或部分的水平。

本发明的MIP也可以被用于确定受试者中与微生物相关的感染的发生、进展或退行，其中通过使从受治疗者获得的生物样品接触一种或多种MIP，对所述生物样品进行所述微生物的全部或部分、或与所述微生物相关的大分子的全部或部分的筛选。

如本文所用，短语“生物样品”包括从受试者获得的并且在本发明的程序中有用的多种样品类型。生物样品可以包括但不限于固体组织样品、液体组织样品、生物流体、抽吸物、细胞和细胞片段。生物样品的具体实例包括但不限于通过手术移除获得的固体组织样品、病理学样本、存档样品、或活检样本、组织培养物或自其获取的细胞及该细胞的子代、以及由这些来源的任何一种制备的切片或涂片。生物样品的非限制性实例包括从乳房组织、淋巴结和乳房肿瘤获得的样品。生物样品还包括从脊椎动物身体获取的任何材料，包括但不限于：血液、脑脊液、血清、血浆、尿、乳头抽吸物、细针抽吸物、组织灌洗液诸如乳管灌洗液(ductal lavage)、唾液、痰、腹水液、肝、肾、乳房、骨、骨髓、睾丸、脑、卵巢、皮肤、肺、前列腺、甲状腺、胰、宫颈、胃、肠、结肠直肠、脑、膀胱、结肠、鼻孔、子宫、精液、淋巴、阴道混合物(vaginal pool)、滑液、脊髓液、头和颈、鼻咽肿瘤、羊膜液、母乳、肺痰或肺表面活性物、尿、粪便和其他生物起源的液体样品。

可以提供如本文描述的发明中的MIP以在多种介质、传感器、装置或产品中使用。例如，本发明的MIP可以被包含在溶液中。像这样，可以将溶液喷洒到物品上检测靶微生物，例如细菌、其生物膜和/或其内生孢子。在一些实施方案中，溶液还可以包含抗微生物剂(例如，抗生素)。可以在各种物品上检测微生物，诸如医院的环境表面、运动设备或医疗装置。基于MIP的传感器的一些实例描述在美国专利第5,587,273、6,680,210、6,833,274、6,967,103、6,749,811和6,461,873号中；该文献描述基于MIP的传感器的部分通过引用特定地并入本文。

在医院，微生物从环境表面转移至患者大部分是通过手同表面接触。尽管手部卫生对于使传递的影响最小化是重要的，适当清洁和消毒环境表面是减少环境表面对健康护理相关感染的发生率的潜在贡献的基本措施。因此，在此描述的发明的MIP产品包括但不限于：用设计为检测微生物的MIP的溶液浸渍的擦手物(hand-wipe)，如果微生物存在于临床工作人员的手上，擦手物可以通过改变颜色帮助确定他们的手没有微生物；可以用在高触摸区域(例如，床栏杆、门把手、计算机键盘等等)中的溶液的喷雾。这些MIP产品可以用来显示清洁工作的效果。这些MIP产品可能在疫情调查中也是有价值的。例如，通过能够区分不同的微生物，例如MRSA、VRE、大肠杆菌等等，有可能追踪微生物传播的途径。同样，这些MIP产品可以用作培训医务人员的教育工具。

本文描述的发明还提供了包含用于特异性检测、鉴定和/或定量微生物的以上所述的MIP的试剂盒。这些试剂盒包括但不限于：具有与移动固相材料或固定固相材料诸如乳胶珠、玻璃纤维、玻璃珠、纤维素条或硝化纤维素膜相连的一种或多种MIP的浸渍片、侧流、流通(flow-through)和迁移装置，如在美国专利第3,802,842、3,915,639、4,059,407、4,373,932、4,689,309、4,703,017号；4,743,560、4,770,853、5,073,484、5,075,078；5,096,837、5,229,073、5,354,692、7,109,042号、WO 88/08534和WO 08/007359中描述的，这些文献描述上述试剂盒和装置的构建和功能的部分通过引用并入本文。

诸如由Hochstrasser(美国专利第4,059,407号)公开的浸渍片装置被设计为浸没在流体生物样品中并给出对该流体中的靶的半定量估计。浸渍片实质上是侧流装置，其应用方法涉及将该装置浸没在液体样品中。在浸渍片装置领域同样感兴趣的是美国专利第3,802,842、3,915,639和4,689,309号。

侧流装置(参见美国专利第5,075,078；5,096,837；5,354,692和5,229,073号)一般包括含有相关的特异性试剂的多孔基质，上述多孔基质在固体条诸如塑料上分层。代替使样品垂直吸上“浸渍片”，侧流形式允许样品通过毛细管作用侧向流过多孔的固相材料，经过一种或多种与靶(如果它在样品中存在的话)相互作用的试剂。可视信号(由有色珠、酶促反应或其他形成颜色的反应产生)指示靶的存在。

在流通类型装置中，应用的测试样品流过多孔材料，使样品中的靶接触包含在该多孔材料中的特异性试剂，最终在该多孔材料上产生可视信号，该可视信号提供了样品中存在靶的指示。

在迁移测定装置中，无需添加外部试剂的测试结果的可视检测是通过加入与有色标记偶联的试剂(即结合物)实现的，从而允许对测定结果的可视检测而无需添加其他物质。这些标记包括但不限于：金溶胶颗粒、染料溶胶颗粒和染色胶乳。在一个实施方案中，在此描述的发明的诊断测试装置包括用于样品和结合的试剂的两种不同途径。

本发明的一个实施方案提供了定量色谱测试条。该装置包括这样的条：通过毛细管作用使样品溶液移动至包含试剂的条中的区域，这些试剂在靶的存在下产生可检测的信号。

本发明的另一个实施方案公开了包含固体支持体的色谱测试条，所述固体支持体具有允许在多种免疫测定中有用的毛细管流的两个部分。第一部分包括可移动的示踪物并且第二部分包括能够结合靶的固定的结合物(binder)。

试剂浸渍的测试条已被用在各种特异性结合测定中。样品被应用到测试条的一个部分上并迁移通过多孔条材料，在某些情况下迁移借助于洗脱溶剂诸如水。样品前进进入或通过检测区，在检测区固定了所检验的靶的特异性结合试剂。样品中存在的靶然后陷入在检测区域中。通常通过使用在测试条中掺入或随后应用的标记试剂来确定结合的靶的量。多种标记，诸如放射性标记、生色团、有色颗粒(金、胶乳)、酶和荧光标记可以用在这些测定中。在大多数情况下，检测结合剂是分析物特异性抗体。

此外，在一个实施方案中，本发明涉及包含能够运送液体样品通过其中的固体支持体的诊断装置，样品是通过毛细管作用沿着或通过固体支持体在液体路径中可移动的。支持体包括：(a)限定的样品应用区，该区用于应用样品到装置并且使样品接触固体支持体；(b)样品应用区下游的限定的MIP-结合物区域，该MIP-结合物区域包含在样品流动路径上固定于固体支持体的靶特异性MIP。MIP具有以干燥状态的可释放的靶类似物：报告子结合物饱和的靶特异性结合位点。靶对靶特异性MIP的结合位点的亲和力比靶类似物：报告子结合物对靶特异性MIP的结合位点的亲和力大。MIP当与包含靶的液体样品接触时能够结合靶并以与特异性靶的浓度直接成比例的量替换靶类似物：报告子结合物，促使被替换的靶类似物：报告子结合物在液体流路径中向下游流动；(c)MIP结合物区下游的限定的结果区，该结果区包含在样品的流动路径上固定于固体支持体的靶类似物：报告子结合物结合元件。当包含靶的液体样品在流动路径区流动时，报告子结合物结合元件能够结合从MIP-结合物区域替换的靶类似物：报告子结合物，以提供指示样品中的靶的存在或浓度的可检测信号。任选地，固体支持体还包括用于在确定测试的样品中靶的存在或半定量中建立参考点的参考区，其中参考区不能通过特异性结合来捕获所述样品中的任何化合物。支持体还可以任选地包括阳性对照区，所述阳性对照区包括用于产生阳性对照的手段，阳性对照证实靶类似物：报告子结合物的正确流动以及与结果区的结合，从而确定测试正在进行。另外，支持体可以任选地包括吸收区，所述吸收区包含当其和固体支持体潮湿时处于与固体支持体的流体连通的吸收材料垫，该垫具有足以吸收过量液体的孔隙率和容量。

在一个实施方案中，本文描述的传感器装置包括分子印迹聚合物，所述分子印迹聚合物包含螯合的镧系元素，能够结合待检测的靶，并且与以下可操作地相关联：用于产生分子印迹聚合物的螯合镧系元素的激发能量的光源，其中激发能量的至少一部分是吸收的分子印迹聚合物；以及用于检测激发时由螯合的镧系元素产生的发光能量的检测器。

应理解，鉴于本文包含的教导内容，本发明的教导内容应用于具体的问题或环境将在本领域普通技术人员的能力之内。通过以下非限制性实例对本发明进行更完全地展示。

实施例

实施例1

如在图1中所展示的那样，本文描述的发明的MIP可以通过产生靶分子的部分的模板并在这种模板的存在下聚合功能单体来制造。功能单体能够结合模板分子上的活性位点，然后在过量交联剂的存在下聚合。虽然聚合可在模板分子的存在下实施，随后模板分子的移除可以留下具有与模板分子的官能团互补的官能团的形状和排列的腔。因此，得到的MIP能够展现紧密地再结合模板分子的能力和选择性。

实施例2

图2A和2B展示了利用本发明的MIP检测细菌的示意图。在鉴定与细菌相关的独有的大分子后，可以产生包含一个或多个表位的大分子的部分的模板。功能单体可以在模板分子的存在下聚合以使得单体结合模板分子上的活性位点，单体可以在过量交联剂的存在下被进一步聚合。随后模板分子的移除(图2A)能够留下具有与微生物独有的大分子的部分的官能团互补的官能团的形状和排列的腔。得到的印迹聚合物可因此表现出紧密结合与微生物相关的大分子的部分的能力和选择性，并鉴定所述微生物(图2B)。

实施例3

利用MIP检测耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)

本发明的一个实施方案包括利用产生的结合PBP2A的MIP检测MRSA。特别地，可以利用与PBP2A内的不同氨基酸序列对应的表位氨基酸序列作为模板分子来产生MIP。例如，模板分子可以被设计成包含氨基酸序列(请参见以下表1)MKKIKIVPLILIVVVVGFGIYFYAS(SEQ ID NO：1)；KKIKIVPL(SEQ ID NO：2)；KIKIVPLI(SEQ ID NO：3)；QNWVQDDTF(SEQ ID NO：4)；KEYKGYKDDAVIGK(SEQ ID NO：5)；EYKGYKDD(SEQ ID NO：6)；YKGYKDDA(SEQ ID NO：7)；DKKEPLLNKFQITTS(SEQ ID NO：8)；KEPLLNKF(SEQ ID NO：9)；EPLLNKFQ(SEQ ID NO：10)；PLLNKFQI(SEQ ID NO：11)；GYNVTRYEVVN(SEQ ID NO：12)；GVGEDIPSDYPFYNAQILD(SEQ ID NO：13)；DYPFYNAQ(SEQ ID NO：14)和/或它们的片段，它们唯一地提供具有对PBP2A的特异性的表面印迹。利用这些氨基酸序列作模板产生的MIP可以用于检测和鉴定MRSA细菌和/或生物膜。

在本说明书中提及的所有的出版物、专利和专利申请都指示本发明所属领域的技术人员的技术水平，并且都通过引用并入本文至如同具体且单独地指明每个个体出版物、专利或专利申请通过引用并入的程度。

可以做出修改而不背离本发明的基本精神。因此，本领域的技术人员将理解在所附权利要求的范围之内，可以不同于本文具体描述来实施本发明。

SEQ ID NO：1	MKKIKIVPLILIVVVVGFGIYFYAS
		SEQ ID NO：2	KKIKIVPL
SEQ ID NO：3	KIKIVPLI
		SEQ ID NO：4	QNWVQDDTF
SEQ ID NO：5	KEYKGYKDDAVIGK
		SEQ ID NO：6	EYKGYKDD
SEQ ID NO：7	YKGYKDDA

SEQ ID NO：8	DKKEPLLNKFQITTS
		SEQ ID NO：9	KEPLLNKF
SEQ ID NO：10	EPLLNKFQ
		SEQ ID NO：11	PLLNKFQI
SEQ ID NO：12	GYNVTRYEVVN
		SEQ ID NO：13	GVGEDIPSDYPFYNAQILD
SEQ ID NO：14	DYPFYNAQ

表1

Claims (44)

1.一种分子印迹聚合物(MIP)，所述分子印迹聚合物能够结合与耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(S.aureus)(MRSA)相关的大分子的全部或部分。

2.如权利要求1所述的MIP，其中所述大分子是青霉素结合蛋白2a(PBP2a)。

3.如权利要求1所述的MIP，其中大分子的所述部分选自由以下组成的组：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14以及它们的片段。

4.如权利要求1所述的MIP，其中所述MIP包含转导元件，以响应于MRSA与所述MIP的结合而产生可测量的信号。

5.如权利要求2所述的MIP，其中PBP2a与所述MIP的结合产生检测信号。

6.如权利要求5所述的MIP，其中选自由以下组成的组的大分子的所述部分的结合产生检测信号：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14以及它们的片段。

7.一种检测生物样品中的MRSA的方法，所述方法包括：

使所述生物样品接触能够结合与耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)相关的大分子的全部或部分的MIP。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述大分子是青霉素结合蛋白2a(PBP2a)。

9.如权利要求7所述的方法，其中大分子的所述部分选自由以下组成的组：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14以及它们的片段。

10.一种检测生物样品中的MRSA生物膜的方法，所述方法包括：

使所述生物样品接触能够结合与耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)或所述生物膜相关的大分子的全部或部分的MIP。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述大分子是青霉素结合蛋白2a(PBP2a)。

12.如权利要求10所述的方法，其中大分子的所述部分选自由以下组成的组：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14以及它们的片段。

13.一种诊断感染MRSA的患者的方法，所述方法包括：

使从所述患者获得的生物样品接触一种或多种MIP并且检测所述生物样品中MRSA的存在，其中所述一种或多种MIP能够结合与MRSA相关的大分子的全部或部分。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述大分子是青霉素结合蛋白2a(PBP2a)。

15.如权利要求13所述的方法，其中大分子的所述部分选自由以下组成的组：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14以及它们的片段。

16.一种分子印迹聚合物(MIP)，所述分子印迹聚合物能够结合微生物。

17.如权利要求16所述的MIP，其中所述微生物选自由以下组成的组：原核生物、真核生物、病毒和朊病毒。

18.如权利要求16所述的MIP，其中所述MIP能够结合所述微生物独有的大分子的全部或部分。

19.如权利要求18所述的MIP，所述MIP能够特异性结合所述大分子的表位。

20.如权利要求18所述的MIP，其中所述大分子选自由以下组成的组：外泌多糖、多糖、蛋白、糖蛋白、肽聚糖、脂蛋白、肽、多肽和多核苷酸。

21.如权利要求16所述的MIP，其中所述MIP包含一种或多种转导元件，以响应于MIP与所述微生物的结合而产生可测量的信号。

22.如权利要求21所述的MIP，其中所述信号选自由以下组成的组：比色信号、荧光信号、放射性信号和酶信号。

23.一种检测或鉴定微生物的方法，所述方法包括：

使一种或多种分子印迹聚合物(MIP)接触所述微生物。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述微生物选自由以下组成的组：原核生物、真核生物、病毒和朊病毒。

25.如权利要求23所述的方法，所述方法包括鉴定所述微生物独有的大分子的全部或部分。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述MIP特异性结合所述大分子的表位。

27.如权利要求25所述的方法，其中所述大分子选自由以下组成的组：外泌多糖、多糖、蛋白、糖蛋白、肽聚糖、脂蛋白、肽、多肽和多核苷酸。

28.如权利要求23所述的方法，其中所述MIP包含一种或多种转导元件，以响应于MIP与所述微生物的结合而产生可测量的信号。

29.如权利要求28所述的方法，其中所述信号选自由以下组成的组：比色信号、荧光信号、放射性信号和酶信号。

30.一种诊断感染微生物的患者的方法，所述方法包括：

使从所述患者获得的生物样品接触一种或多种分子印迹聚合物(MIP)并且检测所述生物样品中所述微生物的存在。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述微生物选自由以下组成的组：原核生物、真核生物、病毒和朊病毒。

32.如权利要求30所述的方法，所述方法包括鉴定所述微生物独有的大分子的全部或部分。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述MIP特异性结合所述大分子的表位。

34.如权利要求32所述的方法，其中所述大分子选自由以下组成的组：外泌多糖、多糖、蛋白、糖蛋白、肽聚糖、脂蛋白、肽、多肽和多核苷酸。

35.如权利要求30所述的方法，其中所述生物样品选自由以下组成的组：生物流体、组织提取物或组织。

36.如权利要求35所述的方法，其中所述生物流体选自由以下组成的组：血液，脑脊液，血清，血浆，尿，乳头抽吸物，细针抽吸物，组织灌洗液，唾液，痰，腹水液，精液，淋巴，阴道混合物，滑液，脊髓液，羊膜液，母乳，肺痰或肺表面活性物，尿，粪便，从以下任何部位收集的流体：肝、肾、乳房、骨、骨髓、睾丸、脑、卵巢、皮肤、肺、前列腺、甲状腺、胰、宫颈、胃、肠、结肠直肠、脑、膀胱、结肠、鼻孔和子宫、头和颈、鼻咽肿瘤，以及其他生物起源的液体样品。

37.如权利要求30所述的方法，其中所述MIP包含一种或多种转导元件，以响应于MIP与所述微生物的结合而产生可测量的信号。

38.如权利要求37所述的方法，其中所述信号选自由以下组成的组：比色信号、荧光信号、放射性信号和酶信号。

39.一种试剂盒，所述试剂盒包含用于检测或鉴定微生物的MIP。

40.如权利要求39所述的试剂盒，其中所述微生物选自由以下组成的组：原核生物、真核生物、病毒和朊病毒。

41.如权利要求39所述的试剂盒，所述MIP能够鉴定所述微生物独有的大分子的全部或部分。

42.如权利要求41所述的试剂盒，其中所述MIP特异性结合所述大分子的表位。

43.如权利要求39所述的试剂盒，其中所述MIP包含一种或多种转导元件，以响应于MIP与所述微生物的结合而产生可测量的信号。

44.如权利要求43所述的方法，其中所述信号选自由以下组成的组：比色信号、荧光信号、放射性信号和酶信号。

Images