DE102012100396A1

DE102012100396A1 - Zubereitung und Verfahren zum Nachweis von Mycobacterium avium ssp paratuberculosis (MAP)

Info

Publication number: DE102012100396A1
Application number: DE201210100396
Authority: DE
Inventors: Anmelder Gleich
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-01-18
Filing date: 2012-01-18
Publication date: 2013-07-18

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Zubereitung für den Nachweis von Mycobacterium avium ssp paratuberculosis (MAP). Dabei ist vorgesehen, dass die Zubereitung ein molekular geprägtes Polymer, das von einem Träger gehalten ist, umfasst, wobei das molekular geprägte Polymer zur spezifischen Bindung an Mycobacterium avium ssp paratuberculosis in der Lage ist.

Description

Die Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zubereitung und ein Verfahren zum Nachweis von Mycobacterium avium ssp paratuberculosis (MAP).
Die Paratuberkulose ist eine chronisch verlaufende, tödliche Infektionskrankheit der Wiederkäuer. Sie ist durch eine lange Inkubationszeit, 6 Monate bis 15 Jahre, Leistungsverlust, Abmagerung und unstillbarem Durchfall bei gutem Appetit gekennzeichnet. [1] Die Krankheit wird durch Mycobacterium avium ssp paratuberculosis (MAP) verursacht, das in Makrophagen überlebt und sich dort auch vermehrt. Beim Rind sind die Darmläsionen durch eine lokale diffuse granulomatöse Entzündungsreaktion gekennzeichnet, die zur Verdickung der Darm-Blut-Schranke führt und somit zu Malabsorbtion und Durchfall [3].
Die Übertragungswege sind im Wesentlichen bekannt. Infizierte Tiere scheiden den Erreger mit dem Kot aus, ohne vorerst selbst Symptome zu zeigen. MAP ist sehr resistent gegenüber Umwelteinflüssen und überlebt sowohl hohe als auch niedrige Temperaturen. So kann es auf der Weide im Kot 11 Monate, in der Gülle bei 5°C 8 Monate und in der Tränke 17 Monate überleben [1]. Die Ansteckung erfolgt hauptsächlich über die orale Aufnahme von infiziertem Kot oder Milch. Dabei sind Kälber besonders gefährdet. Transplazentare und transuterine Infektionen sind möglich. Infizierte Bullen scheiden MAP mit dem Sperma aus [1]. Auch jüngste Studien ergaben Hinweise, dass infizierte Kälber einen bedeutenden Beitrag zur Verbreitung von MAP-Infektionen leisten können [24].
Zurückhaltende Schätzungen zur Verbreitung der Paratuberkulose gehen davon aus, dass 25% der weltweiten Milchviehherden von Paratuberkulose betroffen sind [2]. In Europa nimmt man an, dass über 20% der Rinder betroffen sind [24]. Untersuchungen Ende der achtziger Jahre in Dänemark, den USA, Großbritannien und den Niederlanden ergaben, dass 17 bis 55% der Milchviehherden mit MAP infiziert waren [2]. Andere Quellen berichten einen Anteil von 13% in Österreich, 14% in Belgien, 35% in den Niederlanden, 54% in Michigan und sogar von 74% in Missouri [3]. In Dänemark waren 19 von 22 untersuchten Herden serologisch positiv [3]. Es wird geschätzt, dass ca. 10 bis 15% der Rinderbestände Deutschlands mit MAP infiziert sind, wobei es deutliche regionale Unterschiede gibt [8, 15]. In Indien wurde eine Seroprävalenz von 28% bei Rindern und Büffeln festgestellt [24]. In Südjordanien ergaben ELISA-Untersuchungen von Schafen und Ziegen eine Herdenprävalenz um die 48% [24]. Hochrechnungen bis 2020 gehen davon aus, dass weltweit 80% der Milchviehherden diese Krankheit haben werden [2].
Die Infektion mit MAP hat schwerwiegende ökonomische Folgen. Infizierte Tiere zeigen verminderte Fruchtbarkeit, erhöhte Infektanfälligkeit, verkürzte Lebenserwartung und Milchleistungseinbußen bis zu 15% mit ebenfalls bis zu 20% weniger Inhaltsstoffen [5, 9]. In anderen Ländern, besonders in Regionen mit intensiver Milchwirtschaft wird die Prävalenz als noch größer beurteilt. So besagen Schätzungen, dass 60% der Herden in Neuseeland infiziert sind. In mehreren US-amerikanischen Bundesstaaten durchgeführte Untersuchungen ergaben eine Prävalenz von 22% [1, 9]. Es wird geschätzt, dass mit Verlusten von 2000 DM pro Milchkuh zu rechnen ist [3]. Dies beinhaltet bis zu 15% weniger Milch, Fruchtbarkeitsstörungen, tierärztliche Kosten und die Minderung des Schlachterlöses um ca. 30% [3, 5]. In den 90er Jahren des letzten Jahrhunderts betrugen die Verluste durch Paratuberkulose in Dänemark 15 Mio. Dkr; in den USA wurden direkte Verluste von 1,5 Mrd./Jahr USD kalkuliert [5, 17].
Eine Verbindung von MAP zum Morbus Crohn des Menschen (chronische Darmentzündung) wird in der Literatur diskutiert. Als eine mögliche Ursache kommt die Infektion mit MAP über Lebensmittel (z. B. Milch) in Betracht. Der Erreger übersteht teilweise den Pasteurisationsprozess [25].
Es sind direkte und indirekte Nachweismethoden für MAP-Infektionen bekannt. Direkte Nachweismethoden sind die Anzüchtung des Erregers und der mikroskopische Nachweise des Erregers. Indirekte Nachweismethoden sind der Nachweis von Antikörpern im Serum und der Nachweis von zellvermittelter Infektabwehr. Die Nachweisverfahren werden nachstehend unter den Punkten (i) bis (iv) erläutert.
(i) Direkter Erregernachweis unter Anzüchtung des Erregers
Die Anzüchtung von MAP aus dem Kot ist noch immer der Goldstandart des Nachweises einer Infektion mit MAP [4] (im positiven Fall wird die Infektion nachgewiesen). Damit können ab 10 koloniebildende Einheiten (KBE) pro Gramm Kot nachgewiesen werden [3, 4, 12]. Allerdings sind auch Fälle beschrieben, bei denen die Ziehl-Neelsen-Färbung (siehe Pkt. (ii), unten) und die PCR (polymerase-chain-reaction) positiv ausfielen, die Anzüchtung jedoch keinen positiven Befund erbrachte [7]. Für die Anzüchtung werden 8 bis 16 Wochen benötigt, und die Kosten belaufen sich auf ungefähr 25,00 USD [3, 4, 5]. Die Sensitivität (Empfindlichkeit des Tests; Probabilität der Diagnose eines infizierten Tieres als positiv) der Kultivierung von MAP aus dem Kot liegt bei einer einmaligen Herdenuntersuchung zwischen 10% und maximal 50% und wird vom Erregergehalt des Kotes, von der Zwischenlagerung der Kotproben bis zur Aufarbeitung sowie von den verwendeten Kultivierungsmethoden beeinflusst [15]. Mindestkeimgehalte von 50 bis 100 MAP/g Kot wurden für die erfolgreiche Erregeranzucht angegeben [15]. In einer Untersuchung von 2 Milchviehbeständen (A und B) in Thüringen wurden folgende Sensitivitätswerte für die Kotanzüchtung mit folgender molekularbiologischer Diagnostik (PCR) ermittelt: bei einmaliger Untersuchung: 10% (A) bzw. 27% (B), bei zweimaliger Untersuchung: 43% (A) bzw. 43% (B) und bei dreimaliger Untersuchung: 84% (A) bzw. 77% (B). Die Untersuchungen erfolgten im Abstand von 5 bis 7 Monaten. Die Kosten für eine Untersuchung wurden mit EUR 16,00 angegeben (dreimalige Untersuchung – EUR 48,00) [15].
(ii) Direkter mikroskopischer Nachweis des Erregers
Mit dem Direktnachweis im Kotausstrich durch die Ziehl-Neelsen-Färbung lassen sich die Erreger nur nachweisen, wenn sich mehr als 1000000 KBE/Gramm Kot in der Probe befinden [3, 4]. Diese Methode ist sehr ökonomisch und schnell. Mit ihrer sehr geringen Sensitivität eignet sie sich aber nur als Bestätigung für klinisch erkrankte Fälle, dann aber nur mit einem positiven Ergebnis, da die Erregerausscheidung über den Kot intermittierend ist [3, 6]. Dieser Test hat bei klinischen Fällen eine Sensitivität von 49%, im subklinischen Stadium aber nur 19% [7].
(iii) Indirekter Nachweis des Erregers durch Nachweis von Antikörpern im Serum
Für den Nachweis einer MAP-Infektion stehen ELISA's verschiedener Hersteller zur Verfügung. Selbst bei in der Kotkultur positiven Tieren gibt es Schwankungsbreiten bei der Nachweissicherheit von 29,8% bis 100% [4, 7]. Die Sensitivität der serologischen Untersuchung ist abhängig von der Menge der ausgeschiedenen Bakterien im Kot. Sie nimmt mit steigender Anzahl zu [4]. Die Methode des ELISA kann nur fortgeschrittene Stadien der Infektion mit relativ hoher Sicherheit erkennen. 6 Monate bzw. 1 Jahr vor der erfolgreichen Kotanzüchtung betrug die Sensitivität nur 40% bis 55% bzw. 20% bis 35% (zwei verschiedene Testsysteme) [7]. Bei geringer Prävalenz in einer Herde nimmt die serologische Erkennung von infizierten Tieren stark ab [4]. Neuere vergleichende Untersuchungen über den Nachweis mittels Kotkultur/molekular biologischer Diagnostik und zwei ELISA-Testverfahren ergaben Werte von unter 20% für die Sensitivität [15]. Das Nationale Referenzlabor für Paratuberkulose in Deutschlands weist in einer Zusammenstellung diagnostische Sensitivitäten für die in Deutschland zugelassenen ELISA-Testsysteme von um die 55% im Serum und der Milch aus [22].
(iv) Indirekter Nachweis des Erregers durch Nachweis von zellvermittelter Infektabwehr
Für den Nachweis der zellvermittelten Infektabwehr stehen der Intrakutan-Test und ein Bluttest auf Gammainterferon zur Verfügung. Beide Testverfahren ermöglichen die Erkennung einer Infektion vor der Erregerausscheidung. Im späteren Stadium der Erkrankung sind diese Methoden unbrauchbar, da sie negativ ausfallen [4]. Die Blutprobe für den Interferontest muss innerhalb von 8 Stunden angesetzt werden und die Bearbeitung ist kostenintensiv [4]. Durch das Auftreten von Kreuzreaktionen und nicht überprüfbaren positiven Reaktionen (keine Erregeranzüchtung, keine Organveränderungen) führten positive Werte zu Irritationen [4].
Die Bekämpfungsstrategien beinhalten eine Synthese aus serologischen Untersuchungen, Anzüchtung aus dem Kot, Merzung infizierter Tiere, strengem Hygienemanagement und in manchen Staaten Impfungen [3, 5, 11, 16, 24]. Durch den internationalen Tierhandel und die unbefriedigende Diagnostik am Einzeltier wurde der Erfolg mancher Programme jedoch in Frage gestellt. Zurzeit ist es nur möglich, einen Herdenstatus zu ermitteln. Aussagen über die Erregerfreiheit bei Einzeltieren (beispielsweise Zukäufen) sind sehr unsicher bzw. nicht möglich.
Zusammenfassend ist festzustellen, dass ein negatives Ergebnis beim Test eines Einzeltieres sehr unzuverlässig bei der Beantwortung der Frage ist, ob dieses Tier Träger von MAP ist oder nicht. Dies trifft besonders für junge Tiere zu [11, 16, 23, 24]. Es gibt kein Werkzeug zur Erkennung einer Infektion in der frühen Phase der Erkrankung [6]. Eine zuverlässige Erfassung infizierter Tiere ist nicht möglich [8]. Der Goldstandart der Diagnose am lebenden Tier ist derzeit die Anzüchtung von MAP aus dem Kot, mit dem man bei positivem Ergebnis ein infiziertes Tier sicher erkennen kann, was jedoch nur bei ca. 35% der infizierten Tiere gelingt [4, 25]. Es wird angenommen, dass es für jedes klinisch kranke Tier im fortgeschrittenen Stadium 15 bis 25 infizierte Tiere gibt, die keine oder nur sehr wenige Symptome zeigen [3, 24]. Hochrechnungen bis 2020 gehen davon aus, dass weltweit 80% der Milchviehherden mit MAP infiziert sein werden [2]. Beim weltweit regen Tierhandel ist der Test am Einzeltier sehr fraglich bzw. nicht aussagekräftig [4]. Die Feststellung des Infektionsstatus bei MAP ist eine große Herausforderung. Mit den jetzigen Mitteln ist sie zeitaufwendig und teuer. Neue Testmethoden müssen preiswert und mit der normalen landwirtschaftlichen Praxis vereinbar sein [14]. Selbst nach dreimaliger Untersuchung über einen Zeitraum von 12 Monaten betrug die Trefferquote für ein infiziertes Tier nur 84% bis 87% mit Gesamtkosten von 48 EUR [15]. Ein entscheidender und limitierender Faktor bei der Bekämpfung von MAP ist neben der intermittierenden Ausscheidung die ungenügende Erfassung latent infizierter Tiere in frühen Infektionsstadien [16].
Aufgabe der Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Es soll insbesondere eine Zubereitung angegeben werden, die einen zuverlässigen und aufwandsarmen Nachweis von Mycobacterium avium ssp paratuberculosis in kurzer Zeit ermöglicht.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1, 7 und 9 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen der Erfindungen ergeben sich aus den Merkmalen der Unteransprüche.
Nach Maßgabe der Erfindung ist eine Zubereitung für den Nachweis von Mycobacterium avium ssp paratuberculosis (MAP) vorgesehen, umfassend ein molekular geprägtes Polymer, das von einem festen Träger gehalten ist, wobei das molekular geprägte Polymer zur spezifischen Bindung an Mycobacterium avium ssp paratuberculosis in der Lage ist.
Die Zubereitung ist zum sicheren, aufwandsarmen und kostengünstigen Nachweis von MAP bei menschlichen und tierischen Lebewesen, insbesondere bei Wiederkäuern geeignet. Die Zubereitung kann durch jeden geeigneten Weg verabreicht werden, beispielsweise oral in flüssiger, halbfester oder fester Form. Ferner kann die Zubereitung mittels sogenannter therapeutischer Systeme verabreicht werden. Die orale Verabreichung kann in Verbindung mit Arzneimitteln, Mineralstoffen oder anderen Futterergänzungsstoffen erfolgen. Die erfindungsgemäße Zubereitung kann neben dem molekular geprägten Polymer und dem Träger, der das molekular geprägte Polymer hält, weitere Bestandteile enthalten. Insbesondere kann die Zubereitung pharmakologisch akzeptable Bindemittel und/oder Hilfsstoffe umfassen.
Wiederkäuer sind eine taxonomische Unterordnung der Paarhufer. Die Unterordnung „Wiederkäuer” umfasst unter anderem die Familie der Hornträger, zu der Rinder, Schafe und Ziegen gehören. Die erfindungsgemäße Zubereitung ist insbesondere zum Nachweis von MAP bei Rindern, Schafen und Ziegen geeignet. Besonders bevorzugt wird sie zum Nachweis von MAP bei Rindern eingesetzt.
Der Träger und das von ihm gehaltene molekular geprägte Polymer werden im Folgenden gemeinsam auch als „getragenes molekular geprägtes Polymer” bezeichnet.
Formulierung in flüssiger Form zur oralen Verabreichung
Der Erfinder der vorliegenden Erfindung hat überraschenderweise festgestellt, dass eine weitere Verbesserung des Nachweises von Mycobacterium avium ssp paratuberculosisins besonders bei Wiederkäuern erreicht werden kann, wenn die erfindungsgemäße Zubereitung eine hypertone Zubereitung ist. Unter einer hypertonen Zubereitung wird in der vorliegenden Erfindung eine Zubereitung verstanden, bei der das molekular geprägte Polymer und dessen Träger in einer hypertonen Lösung suspendiert sind. Unter einer hypertonen Lösung wird eine Lösung verstanden, deren osmotischer Druck höher als der des Blutplasmas ist. Die hypertone Lösung kann eine gesättigte Lösung sein. Vorzugsweise ist die hypertone Lösung eine wässerige Lösung eines anorganischen Salzes. Die Kationen der Salze sind vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, die aus Kaliumionen, Calciumionen, Natriumionen, Magnesiumionen, Kupferionen und Kombinationen davon besteht. Bevorzugt sind die Kationen Kupferionen oder Natriumionen. Die Anionen der Salze sind vorzugsweise aus der Gruppe gewählt, die Halogenionen wie Chlorid, Bromid und Iodid, Carbonationen, Hydrogencarbonationen, Sulfationen, Hydrogensulfationen und Kombinationen davon umfasst. Ein bevorzugtes anorganisches Salz ist Natriumhydrogencarbonat. Eine bevorzugte hypertonische Lösung ist eine gesättigte wässerige Natriumhydrogencarbonat-Lösung.
Die Formulierung der erfindungsgemäßen Zubereitung als hypertone Zubereitung mit einer Flüssigkeit, in der der Träger, der das molekular geprägte Polymer hält, suspendiert und die anorganische Salze gelöst sind, ermöglicht es bei oraler Verabreichung den Vormagenkomplex der Wiederkäuer zu umgehen und somit eine Zerstörung des Trägers oder des molekular geprägten Polymers weitestgehend zu vermeiden. Der Erfinder hat festgestellt, dass mittels einer solchen Formulierung der erfindungsgemäßen Zubereitung der Haubenrinnenreflex beim Wiederkäuern ausgelöst werden kann, wodurch der feste Träger und mit ihm das molekular geprägte Polymer unter Umgehung des Vormagenkomplexes direkt in den Labmagen der Wiederkäuer gelangt.
Formulierung in fester Form zur oralen Verabreichung
Der feste Träger und mit ihm das molekular geprägte Polymer können aber auch in fester Form mit dem Futter oder durch einen Bolus verabreicht werden. Dabei gelangen das molekular geprägte Polymer und dessen fester Trägers in den Pansen und durchlaufen die normale Verdauung, inklusive Vormägen und Widerkauen. Die erfindungsgemäße Zubereitung kann als Bolus oder als loses Futtermittel erfolgen. Sie kann bekannten Nahrungsergänzungsmitteln zugemischt werden.
Vorteilhafterweise handelt es sich um einen Bolus, der eine Abgabe des molekular geprägten Polymers und dessen festen Träger nach der oralen Gabe über einen längeren Zeitraum bewirkt. Diese Freisetzung wird in der Fachsprache als „kontrollierte Freisetzung” oder „verzögerte Freisetzung” (engl.: sustained relase) bezeichnet. Dazu ist der Bolus vorzugsweise als „osmotische Tablette” formuliert.
Eine osmotische Tablette kann erhalten werden, indem die Zubereitung Substanzen enthält, die das molekular geprägte Polymer und dessen Träger gegen schnelle Beseitigung aus dem Körper schützen, beispielsweise eine Formulierung mit kontrollierter Freisetzung. Verfahren zur Herstellung solcher Formulierungen sind dem Fachmann bekannt. Eine geeignete Form sind therapeutische Systeme wie beispielsweise Orale Osmotische Therapeutische Systeme (OROS).
Die Formulierung der erfindungsgemäßen Zubereitung als Bolus kann eine vorteilhafte Pharmakokinetik bewirken. Nach der oralen Gabe des Bolus an einen Wiederkäuer wie ein Rind gelangt der Bolus in den Pansen des Tieres. Aufgrund des Kontaktes des Bolus mit Flüssigkeit sowie der im Pansen vorherrschenden Temperatur von 40°C beginnt sich die osmotische Tablette auszudehnen. Über einen Zeitraum von mehreren Tagen (je nach Zusammensetzung des Bolus kann der Zeitraum 100 Tage und mehr betragen) wird jeden Tag eine gleichbleibende Menge des Trägers mit dem molekular geprägten Polymer abgegebenen. Am Ende des Zeitraums nimmt die freigesetzte Menge an molekular geprägtem Polymer und seinem Trägers sehr schnell ab. Die Art der Freisetzung verändert weder Metabolismus noch die Kinetik des freigesetzten molekular geprägten Polymers und seines Trägers. Der Wirkstoff und seine Metaboliten werden im Wesentlichen über den Kot ausgeschieden. Selbstverständlich kann auch ein anderer Bolus mit einer anderen Pharmakokinetik gewählt werden.
Formulierung in halbfester Form zur oralen Verabreichung
Soll die erfindungsgemäße Zubereitung in halbfester Form verabreicht werden, so kann sie beispielsweise als Paste formuliert werden.
Träger
Der Träger, der das molekular gepräger Polymer hält, kann aus einem organischen oder anorganischen Material bestehen. Das Material kann ein poröses oder nichtporöses Material sein. Vorzugsweise besteht der Träger aus einem Kunststoff wie Polyethylen, Polypropolyen, Polystryol sowie Derivaten und Copolymeren davon.
Vorzugsweise liegt der Träger in Form vor Partikeln vor. Die Partikel können jede beliebige Form aufweisen, beispielsweise als kugel- oder röhrenförmige Partikel. Sind die Partikel röhrenförmige Partikel, so ist in einer Ausführungsform der Erfindung nur die Innenseite der Röhrchen mit dem molekular geprägten Polymer beschichtet. Die Außenseite der Röhrchen kann jedoch auch mit dem molekular geprägten Polymer beschichtet sein.
Die Partikel sind vorzugsweise monodisperse Partikel.
Soll die erfindungsgemäße Zubereitung als Bolus formuliert werden, so weisen die Partikel vorzugsweise eine Größe von 1 mm oder weniger, besonders bevorzugt im Bereich von 0,01 bis 10 μm, auf. Abgesehen von dieser Anwendung kann eine größere Partikelgröße vorgesehen, beispielsweise 1 mm und größer, vorzugsweise im Bereich von 1 bis 10 mm, stärker bevorzugt 1 bis 5 mm, noch stärker bevorzugt 1 bis 2 mm. Die Wahl von Partikeln mit einer Partikelgröße von 1 mm oder größer ermöglicht es einem Anwender mit bloßem Auge die von einem Tier ausgeschiedenen Partikel zu erkennen. Er kann daher gezielt diese Partikel aus dem Kot auswählen. Nach dem Stand der Technik war es bisher nicht möglich, eine Kotprobe aus dem Kot eines mit MAP infizierten Rindes zu entnehmen, die den Nachweis von MAP sicher ermöglichte. MAP bildet im Kot Aggregate, so dass in ein und demselben Kothaufen nur ein kleiner Teil mit MAP kontaminiert ist, während der größte Teil keine MAP-Kontamination aufweist. Damit war die Wahrscheinlichkeit hoch, dass bei einem MAP-infizierten Rind der MAP-Nachweis nicht gelingt, obwohl das Tier MAP infiziert ist. Im Gegensatz dazu ermöglicht der in der vorliegenden Erfindung vorgeschlagene Träger eine gezielte Entnahme aus dem Kothaufen, so dass eine MAP identifiziert wird, wenn das Tier infiziert ist.
Der Träger weist vorzugsweise eine Eigenschaft auf, die die Abtrennung des Trägers und mit ihm des molekular geprägten Polymers, das von dem Träger gehalten wird, von einer biologischen Probe, beispielsweise einer Kotprobe ermöglicht. Beispielsweise kann der Träger paramagnetisch sein, so dass der Träger unter Einwirkung eines Magnetfeldes von der biologischen Probe abgetrennt werden kann; eine Dichte aufweisen, die geringer als die Dichte von Wasser ist, so dass der Träger schwimmt und mittels Einwirkung von Wasser von der biologischen Probe abgetrennt werden kann; oder eine Farbe aufweisen, die es ermöglicht, die von dem Tier ausgeschiedenen Partikel in dessen Kot optisch zu identifizieren.
Insbesondere für eine optische Identifizierung der ausgeschiedenen Partikel ist es vorteilhaft, wenn die Partikelgröße 1 mm oder größer ist, besonders bevorzugt im Bereich von 1 bis 2 mm liegt.
Molekular geprägtes Polymer
Verfahren zur Herstellung molekular geprägter Polymere auf einem Träger sind aus dem Stand der Technik bekannt. Ein solches Verfahren wird in DE 600 35 603 T2 beschrieben. In der vorliegenden Erfindung wird zur Herstellung des molekular geprägten Polymers zweckmäßigerweise ein Template verwendet, das die spezifische Anbindung des Polymers an MAP selbst oder an Moleküle ermöglicht, die von MAP in dem Lebewesen hervorgerufen werden, beispielsweise indem sie von MAP in dem Lebewesen freigesetzt oder von dem Lebewesen aufgrund der Infektion mit MAP produziert werden. Bei dem Template kann es sich um ein Epitop handeln, das auf dem MAP oder dem hervorgerufenen Molekül zu finden ist. Aufgrund dieser Prägung des Polymers kann das Polymer spezifisch an MAP oder ein Moleküle, das von MAP hervorgerufen wird anbinden. Die molekular geprägten Polymere fungieren als Antikörper, die spezifisch an das Epitop binden können.
Geeignete Epitope zum Nachweise von MAP sind u. a. MAP heat-shock protein 70 kDa (Hsp70), das Lipoarabino-Mannan (LAM), MAP Proteine MAP3865c, MAP2694, MAP3738c, MAP envelope protein MptD (MAP3733c) [15, 26, 27].
Das Polymer wird von dem Träger gehalten. Beispielsweise kann das Polymer über eine kovalente Bindung an den Träger gebunden sein. Das Polymer kann als Beschichtung auf dem Träger vorliegen.
Geeignete Monomere für die Herstellung molekular geprägter Polymere sind beispielsweise Monomere mit einer endständigen Vinylgruppe sowie Säure- oder Basengruppen wie Methacrylsäure, Trifluormethacrylsäure, 4-Vinylpyridin und andere.
Es hat sich herausgestellt, dass die erfindungsgemäß vorgesehenen molekular geprägten und von einem Träger gehaltenen Polymere gegenüber Umwelteinflüssen sehr stabil sind und den Verdauungsprozess ganz oder weitgehend ohne den Verlust ihrer Funktionalität überstehen. Dies ist insbesondere auf die Säure- und Laugenstabilität molekular geprägter Polymere zurückzuführen. Durch die Passagezeit des Futterbreies durch den Rinderdarm von ca. 18 bis 28 Stunden wird ein intensiver Kontakt mit den Darmzotten des gesamten Verdauungskanals gewährleistet. Somit wird das Problem der unregelmäßigen Ausscheidung und der in der subklinischen Phase der Krankheit gering ausgeschiedenen Keimzahlen minimiert.
Nach Maßgabe der Erfindung ist ferner ein Verfahren zum Nachweis von Mycobacterium avium ssp paratuberculosis (MAP) mittels der erfindungsgemäßen Zubereitung vorgesehen, bei dem eine biologische Probe, die von einem menschlichen oder tierischen Lebewesen stammt, der die Zubereitung verabreicht worden ist, bereitgestellt und die Anwesenheit von Mycobacterium avium ssp paratuberculosis nachgewiesen wird.
Die biologische Probe kann aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Fäzes, Urin, Sperma, Muttermilch und Blut besteht. Bevorzugt ist die biologische Probe eine Kotprobe. Die biologische Probe wird zum Nachweis von MAP zweckmäßigerweise labordiagnostisch aufgearbeitet. Anschließend kann ein molekularbiologischer Nachweis von MAP durchgeführt werden, beispielsweise durch den Nachweis des Genomabschnittes IS900 von Mycobacterium avium ssp paratuberculosis [15].
Nach Maßgabe der Erfindung ist außerdem eine Verwendung der erfindungsgemäßen Zubereitung zum Nachweis von Mycobacterium avium ssp paratuberculosis bei menschlichen und tierischen Lebewesen vorgesehen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die erfindungsgemäße Zubereitung zum Nachweis von MAP im Kot von Wiederkäuern, insbesondere Rindern verwendet.
Die Erfindung wird nachstehend anhand eines Ausführungsbeispiels, das die Erfindung nicht einschränken soll, näher erläutert.
Beispiel
Als Träger für das molekular geprägte Polymer wurden Partikel aus Polyethylen verwendet, die eine Partikelgröße von ca. 1,5 mm aufwiesen. Die Partikel waren mit einem molekulargeprägten Polymer (MIP) beschichtet, das zur spezifischen Bindung an Mycobacterium avium ssp paratuberculosis in der Lage ist. Zur Herstellung des MIP wurde ein Template verwendet, dass das heat-shock protein 70 kDa – Epitop von MAP abbildet.
In einer 1,5 Liter Natriumhydrogencarbonat-Lösung (gesättigte Lösung) wurden 300 g Träger, auf denen sich das molekular geprägte Polymere befindet, suspendiert und in das Maul der Kuh eingeschüttet. Das Gemisch wurde von der Kuh selbständig abgeschluckt.
24 Stunden nach der Eingabe erfolgte die rektale Entnahme der Kotprobe. Aus dieser Probe wurden die Träger ausgewaschen und mittels PCR der Nachweis des Genomabschnittes IS900 von Mycobacterium avium ssp paratuberculosis angetreten.
Angegebene Literatur

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23 http://www.fli.bund.de/de/startseite/institute/institut-fuer-molekularepathogenese/referenzlabore/nrl-fuer-paratuberkulose.html
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27 Masala S, Paccagnini D, Cossu D, Brezar V, Pacifico A, et al. (2011) Antibodies Recognizing Mycobacterium avium paratuberculosis Epitopes Cross-React with the Beta-Cell Antigen ZnT8 in Sardinian Type 1 Diabetic Patients. PLoS ONE 6(10): e26931. doi:10.1371/journal.pone.0026931

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

DE 60035603 T2 [0033]

Claims

Zubereitung für den Nachweis von Mycobacterium avium ssp paratuberculosis (MAP), umfassend ein molekular geprägtes Polymer, das von einem festen Träger gehalten ist, wobei das molekular geprägte Polymer zur spezifischen Bindung an Mycobacterium avium ssp paratuberculosis in der Lage ist.
Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zubereitung eine hypertone Zubereitung ist.
Zubereitung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der mit dem molekular geprägtem Polymer beschichtete Träger in einer Flüssigkeit suspendiert sind.
Zubereitung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie anorganische Salze umfasst, wobei die Kationen der Salze aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Kaliumionen, Calciumionen, Natriumionen, Magnesiumionen, Kupferionen und Kombinationen davon besteht.
Zubereitung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger in Form von Partikeln mit einer Größe im Bereich von 1 bis 2 mm vorliegt.
Zubereitung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger in Form von paramagnetischen Partikeln vorliegt.
Verfahren zum Nachweis von Mycobacterium avium ssp paratuberculosis (MAP) mittels einer Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass eine biologische Probe, die von einem menschlichen oder tierischen Lebewesen stammt, der die Zubereitung verabreicht worden ist, bereitgestellt und die Anwesenheit von Mycobacterium avium ssp paratuberculosis nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Kot, Urin, Sperma, Muttermilch und Blut besteht.
Verwendung einer Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zum Nachweis von Mycobacterium avium ssp paratuberculosis bei menschlichen und tierischen Lebewesen.
Verwendung nach Anspruch 9 zum Nachweis von Mycobacterium avium ssp paratuberculosis im Kot von Wiederkäuern.