KR102009014B1 - 자기확인 기능성 마이크로비드를 이용한 독성 탐지용 딥스틱 바이오센서 - Google Patents

자기확인 기능성 마이크로비드를 이용한 독성 탐지용 딥스틱 바이오센서 Download PDF

Info

Publication number
KR102009014B1
KR102009014B1 KR1020120126223A KR20120126223A KR102009014B1 KR 102009014 B1 KR102009014 B1 KR 102009014B1 KR 1020120126223 A KR1020120126223 A KR 1020120126223A KR 20120126223 A KR20120126223 A KR 20120126223A KR 102009014 B1 KR102009014 B1 KR 102009014B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
toxicity
microbeads
biosensor
stick
functional
Prior art date
Application number
KR1020120126223A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20140059609A (ko
Inventor
구만복
정인섭
서호빈
Original Assignee
고려대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 고려대학교 산학협력단 filed Critical 고려대학교 산학협력단
Priority to KR1020120126223A priority Critical patent/KR102009014B1/ko
Publication of KR20140059609A publication Critical patent/KR20140059609A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102009014B1 publication Critical patent/KR102009014B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/025—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 재조합 발광박테리아와 형광물질이 담지된 기능성 마이크로비드가 고정된 딥-스틱 형태의 바이오센서 및 이를 이용한 독성의 탐지방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 독성탐지용 재조합 발광박테리아와 형광물질이 담지된 기능성 마이크로비드가 고정된 딥-스틱 형태의 바이오센서는 휴대가 간편하고, 사용시에 보조기구가 필요없어, 어느 곳에서든 사용할 수 있기 때문에 미래과학 중 하나인 우주항공 뿐만 아니라 신약개발, 환경, 식품 등에서의 독성 탐지를 확대 적용하여, 궁극적으로 국민보건의 향상에 기여할 것으로 예상된다.

Description

자기확인 기능성 마이크로비드를 이용한 독성 탐지용 딥스틱 바이오센서{A Dip-stick Toxicity Biosensor Using Smart Functional Microbeads}
본 발명은 재조합 발광박테리아와 형광물질이 담지된 기능성 마이크로비드가 고정되어 있는 딥-스틱 형태의 바이오센서 및 이를 이용한 독성의 탐지방법에 관한 것이다.
바이오칩(biochip)이란, 생물에서 유래된 효소, 단백질, 항체, DNA, 생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포 등과 같은 생체 유기물을 유리, 실리콘 및 나일론 등의 재질로 된 기판 위에 집적시켜 만든 혼성 소자(hybrid device)로서, 유전자의 발현 양상, 유전자 결함, 단백질 분포, 반응 양상 등을 분석할 수 있으며 질병 진단 및 신약 개발 등의 역할을 할 수 있다.
이러한 바이오칩의 구성 요소 중 하나인 바이오칩용 기판은 일회용이 대부분이므로 바이오칩이 일반화되는 시점에서 연간 소모량은 천문학적 숫자가 될 것이 틀림없다. 현재 국내외의 바이오 및 의료 관련 기업의 경우, 이러한 잠재적 거대 시장에서의 시장 선점을 위하여 바이오칩용 기판을 이용한 바이오칩 제작에 총력을 기울이고 있다.
발광 박테리아는 기존에 환경 독성을 pre-screening 기반으로 그 탐지능을 여러 가지 독성 분류 즉 유전적 독성, 산화적 손상, 막 손상 그리고 단백질 손상 등을 모니터링 하는데 중요한 역할을 한다. 이러한 다양한 발광 박테리아를 다양한 독성을 한꺼번에 탐지하고자 하는 high throughput 기반 시스템으로 개발하기 위해 세포칩 개발 연구가 진행되고 있다(대한민국 등록특허 제473350호).
기존의 세포칩 연구는 가장 큰 문제점은 많은 세포 중에 어떤 세포가 어느 위치에 고정화 되어있는지 확인하여 배열하고 인식하기 위한 프로그램이 필수적으로 필요하였다. 특히 기존의 연구는 이러한 자기 확인 인식 등에 대한 연구보다는 대부분이 세포의 고정화 방법에 치중하게 되어, 실제로 전기적 회로망 기반 칩과 나일론 멤브레인 어레이 그리고 광학적 탐지 어레이와 한천 (Agar)을 기반으로 한 고정화 방법 어레이 등과 같이 칩에 세포를 고정화하는 방법에 치중하여 연구되어 왔다 (Ahn, J.M. et al, Lab on a Chip, 10:2695, 2010).
이러한 방법은 세포를 배열하는 세포 어레이 칩으로 여전히 각각의 세포에 대한 인식이 필수적으로 제작 뿐만 아니라 분석 시간이 오래 걸리게 되어 실제 독성을 빠르게 탐지하는데 적합하지 않다. 바이오 센서로 기존의 독성 평가 및 진단에 있어 이러한 기술은 비용과 시간면에서 효율적이지 않고, 적용범위가 다양하지 않으며 바이오센서로 응용하는 데에 있어 제한적인 문제점들이 있다.
이에, 본 발명자들은 독성탐지용 재조합 발광박테리아와 형광물질이 담지된 기능성 마이크로비드를 딥-스틱 형태로 고정시킨 바이오센서를 제작하는 경우, 독성물질이 포함된 샘플에 상기 바이오센스를 담그기만 하면, 독성물질의 유무를 간편하게 탐지할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 독성물질이 포함된 샘플에서 간편하게 독성물질을 탐지할 수 있는 바이오센서를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 바이오센서의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 바이오센서를 이용한 독성물질의 탐지방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 독성탐지용 재조합 발광박테리아와 형광물질을 비드기질과 함께 교반한 다음, 전기방사법으로 마이크로비드를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 제조된 마이크로비드를 웰이 형성된 기판에 배열하고, 상기 마이크로비드가 빠져나올 수 없는 메쉬 크기를 가진 망을 기판 위에 고정하는 단계를 포함하는 독성탐지용 재조합 발광박테리아와 형광물질이 담지된 기능성 마이크로비드가 고정된 딥-스틱 형태의 바이오센서의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조되고, 독성탐지용 재조합 발광박테리아와 형광물질이 담지된 기능성 마이크로비드가 고정되어 있는 딥-스틱 형태의 바이오센서를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 바이오센서를 이용하는 것을 특징으로 하는 독성탐지 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 독성탐지용 재조합 발광박테리아와 형광물질이 담지된 기능성 마이크로비드가 고정된 딥-스틱 형태의 바이오센서는 휴대가 간편하고, 사용시에 보조기구가 필요없어, 어느 곳에서든 사용할 수 있기 때문에 미래과학 중 하나인 우주항공 뿐만 아니라 신약개발, 환경, 식품 등에서의 독성 탐지를 확대 적용하여, 궁극적으로 국민보건의 향상에 기여할 것으로 예상된다.
도 1은 전기방사법으로 독성탐지용 재조합 발광박테리아와 형광물질이 담지된 기능성 마이크로비드를 제조하는 방법을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 딥-스틱 형태의 바이오센서의 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 딥-스틱 형태의 바이오센서의 구조 및 제조방법을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 딥-스틱 형태의 바이오센서를 이용하여 독성물질을 탐지한 결과를 cooled CCD 카메라로 찍은 사진을 나타낸 것이다.
본 발명은 일관 점에서, (a) 독성탐지용 재조합 발광박테리아와 형광물질을 비드기질과 함께 교반한 다음, 전기방사법으로 마이크로비드를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 제조된 마이크로비드를 웰이 형성된 기판에 배열하고, 상기 마이크로비드가 빠져나올 수 없는 메쉬 크기를 가진 망을 기판 위에 고정하는 단계를 포함하는 독성탐지용 재조합 발광박테리아와 형광물질이 담지된 기능성 마이크로비드가 고정된 딥-스틱 형태의 바이오센서의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 딥-스틱 형태의 바이오센서는 기존에 사용되었던 바이오칩 기반 자기 확인 코드 기능성 마이크로비드를 이용하여 생물독성을 측정하는 경우, 화합물을 칩에 전달해 줄 파이펫 등의 보조기구들이 필요한 점과, 휴대가 용이하지 않았던 점 등을 극복하기 위하여 제작된 것으로, 본 발명에 따른 딥-스틱(Dip-Stick) 방식의 바이오센서(Biochip)은 측정하려는 화합물이 포함된 샘플에 칩을 담그기만 하면 결과를 확인할 수 있으므로 실험에 필요한 비용과 시간을 절감할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 기능성 마이크로비드를 담지하는 칩의 웰은 빗면으로 깎음으로써, 비드가 칩의 밑으로 빠지지 않으며 발광박테리아가 빛을 내는데 필수적인 산소 공급을 원활히 받을 수 있게 하였으며, 센서의 기재 재질은 유리로 하여 케미컬의 흡착을 최대한 방지하였다.
본 발명의 딥-스틱 형태의 바이오센서는 휴대하기가 쉬워 어느 곳에서든 사용할 수 있기 때문에 미래과학 중 하나인 우주항공 뿐만 아니라 신약개발, 환경, 식품 등에서의 독성 탐지를 확대 적용하여, 궁극적으로 국민보건의 향상에 기여할 것으로 예상된다.
본 발명에 있어서, 상기 독성탐지용 재조합 발광박테리아는 독성에 대해 민감한 프로모터와 발광유전자가 결합된 재조합 플라스미드로 형질전환된 박테리아인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 독성은 유전독성, 산화적 손상, 세포막 독성 및 단백질 손상으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 형광물질은 독성탐지용 재조합 발광박테리아의 종류에 따라 각기 다른 형광물질을 사용하여, 바이오센서의 각 웰에 담지된 재조합 발광박테리아의 종류 및 탐지가능한 독성의 종류를 확인할 수 있으며, 본 발명에서 사용되는 형광물질은 Cy3(그린), Cy5(레드), FITC(그린), 알렉사(Alexa), 보디피(BODIPY), 로다민(Rhodamine) 및 Quantum-도트(dot)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 비드 기질은 천연다당류를 사용하는 것이 바람직하며, 알긴산, 알긴산나트륨, 글루코만난 (Glucomannan), 카파-카라기난(carrageenin) 또는 그의 유도체 및 아가(agar)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 재조합 발광박테리아와 형광물질을 담지하여 마이크로 비드를 형성할 수 있는 물질이라면 제한없이 사용가능하다.
본 발명에 있어서, 상기 바이오센서 기판의 웰은 종단면이 아랫 쪽이 좁고 윗쪽이 넒은 마름모꼴인 것을 특징으로 할 수 있으며, 이러한 형태는 비드가 칩의 밑으로 빠지지 않으며, 화합물과 비드의 접촉면적을 증가시켜주며, 발광박테리아가 빛을 내는데 필수적인 산소 공급을 원활히 받을 수 있게 하는 장점이 있다.
본 발명에 있어서, 상기 독성탐지용 재조합 발광박테리아는 표 1에 기재된 박테리아 중 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 독성에 민감한 유전자의 프로모터와 발광유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 균주라면 제한없이 사용될 수 있다.
No . Strain Plasmid Specific-stress
1 EBHJ1 pSodALux(Vibrio fisheri luxCDABE) 산화적 손상
2 EBHJ2 pSodALux(Vibrio fisheri luxCDABE) 산화적 손상
3 DK1 pKatGLux(Photorhabdus luminescens) 산화적 손상
4 DS1 pSodALux(Photorhabdus luminescens) 산화적 손상
5 EBJM1 pPqi-5Lux(Vibrio fisheri luxCDABE) 산화적 손상
6 DP5 pPqi-5Lux(Photorhabdus luminescens) 산화적 손상
7 DP1 pPqi-5Lux(Photorhabdus luminescens) 산화적 손상
8 DUAL22 pDK1(pKatGLux Photorhabdus luminescens) and ACRG43(recA::GFPuv4) 산화적 손상, 유전자 손상
9 Duo-1 pRGDK1(GFPuv4::recA-katG::lux P. luminescens) 산화적 손상, 유전자 손상
10 Duo-2 pRGDK2(recA::GFPuv4-katG::lux P. luminescens) 산화적 손상, 유전자 손상
11 DNT5 pDNT5(nagR-nagAa::lux P. luminescens) 살리실릭 산 특이적 탐지
12 NAGK-1768 pNAGK1(nagR-nagAa::lux V. fisheri lux) 살리실릭 산 특이적 탐지
13 DC1 pClpB::luxCDABE (P. luminescens) 세포막 손상
14 KAN3 pUCDK (pAac(6 )-Ib ::luxCDABE (V. fisheri lux)) 벤조산 및 페놀 특이 탐지
15 SC122/pUCDK pUCDK (pAac(6 )-Ib ::luxCDABE (V. fisheri lux)) -
16 ID18/pUCDK pUCDK (pAac(6 )-Ib ::luxCDABE (V. fisheri lux)) -
17 WL2 (fadR)/pUCDK pUCDK (pAac(6 )-Ib ::luxCDABE (V. fisheri lux)) -
18 K165/pUCDK pUCDK (pAac(6 )-Ib ::luxCDABE (V. fisheri lux)) -
19 DO2 pOmpT::luxCDABE (P. luminescens) 세포막 손상
20 DRP1 pRpoS::luxCDABE (P. luminescens) 단백질 손상
21 BM401 pLuxRLux (P. luminescens) -
22 EBSoxR pBCSoxR-lux (V. fisheri lux) 산화적 손상
23 EBSoxS pBCSoxS-lux (V. fisheri lux) 산화적 손상
24 EBInaA pBCInaA-lux (V. fisheri lux) 산화적 손상
25 EBFumC pBCFumC-lux (V. fisheri lux) 산화적 손상
26 EBHmp pBCHmp-lux (V. fisheri lux) 산화적 손상
27 EBJM2 pGltA-lux (P. luminescens) 유전자 손상
28 EBMalkA pMalKLux(V. fisheri lux) 산화적 손상
29 ZWF pZwfLux (V. fisheri lux) 산화적 손상
30 FPR pFprLuX (V. fisheri lux) 산화적 손상
31 AGZWF1 pZwfLux (V. fisheri lux) 산화적 손상
32 AGZWF2 pZwfLux (V. fisheri lux) 산화적 손상
33 AGFPR1 pFprLuX (V. fisheri lux) 산화적 손상
34 AGFPR2 pFprLuX (V. fisheri lux) 산화적 손상
35 RAZWF pZwfLux (V. fisheri lux) 산화적 손상
36 RAFPR pFprLuX (V. fisheri lux) 산화적 손상
37 EBalkA pCHalkALux (P. luminescens) 유전자 손상 (alkylation)
38 EBsulA pCHsulALux (P. luminescens) 유전자 손상
39 BBTNrdA pETnrdALux (P. luminescens) 유전자 손상
40 BBTRecN pJMrecNLux (P. luminescens) 유전자 손상
41 BBTSbmC pJMsbmCLux (P. luminescens) 유전자 손상
42 BBTDinI pJMdinILux (P. luminescens) 유전자 손상
43 PGRFM pPGLUX (pPgiLux/V. fisheri lux) 산화적 손상
본 발명에 있어서, 상기 독성탐지용 재조합 발광박테리아는 DPD2794, DPD2511, DPD2540, EBAlkA와 EBSoxS, TV1061, KAN3 및 GC2로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 구현에에서, 독성탐지용 재조합 발광박테리아와 형광물질이 담지된 기능성 마이크로비드가 고정된 딥-스틱 형태의 바이오센서는 다음과 같은 방법으로 제작하였다:
발광 박테리아 배양액을 원심분리하여 농축한 후, 농축된 세포를 2% 알긴산 용액에 재현탁한 후 형광물질을 넣고 함께 혼합하여 멸균된 주사기에 넣었다. 전기방사법으로 비드를 제조하기 위하여 2% 염화칼슘 용액이 담김 비커에 (+) 전극을 넣고, 혼합물이 들어있는 주사기의 바늘을 (-) 전극에 연결시킨후, DC unit을 이용하여 전압을 흐르게 하여 떨어지는 혼합물이 2% 염화칼슘 용액에서 비드화되게 계속 교반하였다 (도 1). 비드를 경화시키기 위해 2% 염화칼슘 용액에서 1시간 동안 교반한 다음, 기능성 마이크로비드를 LB 배지로 3회 세척하여, 염화칼슘을 제거하하고, 기능성 마이크로비드를 제작하였다. 상기 기능성 마이크로비드를 1mm 크기의 10개 구멍이 뚫어져 있는 85 mm x 8 mm 크기의 칩에 2종의 마이크로 비드를 각각 4~5개씩 배열하였다. 그 후 화합물은 통과할 수 있으나 비드는 빠져나갈 수 없는 mesh 사이즈를 가진 망을 칩 위로 고정시켜, 독성탐지용 재조합 발광박테리아와 형광물질이 담지된 기능성 마이크로비드가 고정된 딥-스틱 형태의 바이오센서를 제작하였다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 방법으로 제조되고, 독성탐지용 재조합 발광박테리아와 형광물질이 담지된 기능성 마이크로비드가 고정되어 있는 딥-스틱 형태의 바이오센서에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 독성탐지용 재조합 발광박테리아는 독성에 대해 민감한 프로모터와 발광유전자가 결합된 재조합 플라스미드로 형질전환된 박테리아인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 독성은 유전독성, 산화적 손상, 세포막 독성 및 단백질 손상으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 형광물질은 독성탐지용 재조합 발광박테리아의 종류에 따라 각기 다른 형광물질을 사용하여, 바이오센서의 각 웰에 담지된 재조합 발광박테리아의 종류 및 탐지가능한 독성의 종류를 확인할 수 있으며, 본 발명에서 사용되는 형광물질은 Cy3(그린), Cy5(레드), FITC(그린), 알렉사(Alexa), 보디피(BODIPY), 로다민(Rhodamine) 및 Quantum-도트(dot)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 바이오센서 기판의 웰은 종단면이 아랫 쪽이 좁고 윗쪽이 넒은 마름모꼴인 것을 특징으로 할 수 있으며, 이러한 형태는 비드가 칩의 밑으로 빠지지 않으며, 화합물과 비드의 접촉면적을 증가시켜주며, 발광박테리아가 빛을 내는데 필수적인 산소 공급을 원활히 받을 수 있게 하는 장점이 있다.
본 발명에 있어서, 상기 독성탐지용 재조합 발광박테리아는 상기 표 1에 기재된 박테리아 중 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 독성에 민감한 유전자의 프로모터와 발광유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 균주라면 제한없이 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 독성탐지용 재조합 발광박테리아는 DPD2794, DPD2511, DPD2540, EBAlkA와 EBSoxS, TV1061, KAN3 및 GC2로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 바이오센서를 이용하는 것을 특징으로하는 독성탐지 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 독성탐지는 발광박테리아의 발광유무를 확인하여 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 독성탐지는 독성물질이 포함된 샘플에 상기 바이오센서를 담그어 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 독성탐지용 재조합 발광박테리아의 제작
본 발명에서 사용한 독성탐지용 재조합 발광박테리아는 하기 방법으로 제조하였다.
본 발명의 재조합 발광박테리아의 제조방법은 본 발명의 발명자의 특허인 대한민국 특허 등록 10-0473350 등에 자세하게 기재되어 있으며, 본 발명에 서는 그 방법을 참고하여 제조하였다. 요약하면,
1) 유전자 프로모터는 대장균 RFM443의 게놈(Genomic) DNA로부터 각각의 유전자에 프로모터 부분에 맞는 프라이머를 제작하여 PCR 을 이용하여 증폭한다. 각각의 유전자의 프로모터 증폭에 사용된 프라이머 set는 다음과 같다:
DPD2794
서열번호 1: 5'-ACTTAAGGATCCAGAGAAGCCTGTCGGCAC-3'
서열번호 2: 5'-AGCTTTGAATTCCGCTTTCTGTTTGTTTT-3'
EBAlkA
서열번호 3: 5'-ACTTAAGGATCCGCAAGGCATTGAAGGCAG-3'
서열번호 4: 5'-AGCAGCGAATTCATCCCAACATCCACGACC-3'
EBSoxS
서열번호 5: 5'-AGCAGCGAATTCGCGGCTGGTCAATATGCTC-3'
서열번호 6: 5'-ACTTAAGGATCCGCTGCGTTTCGCCACTT-3'
DPD2511
서열번호 7: 5'-ACTTAGGATCCCGAAATGAGGGCGGGAAA-3'
서열번호 8: 5'-AGCAGCGAATTCGAACGTTGCTGACCACGA-3'
PCR 프라이머 산물은 BamHI와 EcoRI(위 서열에 밑줄로 표시되었다.)의 제한효소로 처리하고 플라스미드 벡터 pUCD615 (프로모터가 없는 luxCDABE operon을 갖고 있는 벡터)를 역시 같은 제한효소로 잘라낸다. 이것을 14 ℃에서 8시간 T4 라이가아제(T4 ligase)를 이용하여 재조합 플라스미드를 pRecALux를 제작하였다. DPD2540, TV1061, KAN3, GC2도 표 2에 기재된 정보를 이용하여, 동일한 방법으로 제조가 가능하다.
이 PCR 산물을 BamHI 과 EcoR1 과 같은 제한효소로 처리하고 플라스미드 벡터 pUCD615 (프로모터가 없는 luxCDABE operon을 갖고 있는 벡터)를 역시 같은 제한효소로 잘라낸다. 이것을 14 ℃에서 8시간 T4 라이가아제(T4 ligase)를 이용하여 표 2에 기재된 재조합 플라스미드를 제작하였다.
No. Strain Plasmid (Lux gene 출처) 유전자
프로모터		 프로모터 출처
1 DPD2794 pRecALux (V. fisheri lux) RecA E.coli RFM443
2 EBAlkA pCHalkALux (P. luminescens) AlkA E.coli RFM443
3 EBSoxS pBCSoxSLux (V. fisheri lux) SoxS E.coli RFM443
4 DPD2511 pKatGLux (V. fisheri lux) KatG E.coli RFM443
5 DPD2540 pFabALux (V. fisheri lux) FabA E.coli RFM443
6 TV1061 pGrpELux (V. fisheri lux) GrpE E.coli RFM443
7 KAN3 pUCDK(pAac(6')-Ib::luxCDABE (V. fisheri lux)) Aac(6')-Ib E.coli RFM443
8 GC2 pLITE2(lac::luxCDABE) (Xenorhabdus luminescens) Lac E.coli RFM443
이를 RFM443 대장균에 형질전환하여 RFM443/pXXX 를 카나마이신이 포함된 아가 플레이트에 키워 선별된 콜로니를 카나마이신이 포함된 LB 배지에서 배양하여, 독성물질 탐지용 재조합 발광박테리아를 제작하였다.
실시예 2: 독성탐지용 재조합 발광박테리아와 형광물질이 담지된 기능성 마이크로비드가 고정된 딥-스틱 형태의 바이오센서의 제작
실시예 1에서 제작한 재조합 발광박테리아를 이용하여, 기능성 마이크로비드를 제작하고, 7가지 다른 독성 물질에 대한을 탐지능을 확인하였다.
우선, 유전 독성을 일으키는 mitomycinC (MMC), 유전독성 중 DNA 아킬레이션을 일으키는 1-methyl-1-nitroso-Nmethylguanidine (MNNG), OH·에 의한 산화적 손상을 일으키는 H2O2, O2·에 의한 산화적 손상을 일으키는 paraquat, 세포막 독성을 일으키는 salicylic acid (SA), 단백질 손상을 일으키는 에탄올, 마지막으로 페놀 계통을 탐지할 수 있는 페놀을 탐지하기 위한 실험을 다음과 같이 수행하였다.
실시예 1에서 제작한 DPD2794, DPD2511, DPD2540, EBAlkA, EBSoxS, TV1061, KAN3, GC2 총 8종의 재조합 발광 박테리아를 배양하고, 다음과 같은 방법으로 기능성 마이크로비드를 제작하였다.
8종의 발광 박테리아 100 ml 를 OD600 = 0.7까지 배양하고, 원심분리기를 이용하여 3,000 rpm에서 10분간 세포를 농축하였다. 2% 알긴산 용액에 농축된 세포를 재현탁한 후 형광물질을 넣고 함께 혼합하여 12 ml 멸균된 주사기에 넣었다(표 3). 전기방사법으로 비드를 제조하기 위하여 2% 염화칼슘 용액이 담김 비커에 (+) 전극을 넣고, 혼합물이 들어있는 주사기의 바늘을 (-) 전극에 연결시켰다. 고전압 DC unit을 이용하여 전압을 흐르게 하여 떨어지는 혼합물이 2% 염화칼슘 용액에서 비드화 되게 계속 교반하였다 (도 1).
비드를 경화시키기 위해 2% 염화칼슘 용액에서 1시간 동안 교반한 다음, 기능성 마이크로비드를 LB 배지로 3회 세척하여, 염화칼슘을 제거하였다.
재조합 발광박테리아의 종류에 따라 사용된 형광물질의 종류
No. Strain 형광물질 종류 색깔 Abs(nm) Em(nm)
1 DPD2794 polystyrene microsphere 1.0um Red 570 598
2 EBAlkA Orange 534 554
3 EBSoxS Green 427 468
4 DPD2511 Red + Orange 534/570 554/598
5 DPD2540 Orange + Green 427/534 468/554
6 TV1061 Red + Green 427/570 468/598
7 KAN3 Red + Orange + Green 427/534/570 468/554/598
8 GC2 No fluorescence
각기 다른 발광 박테리아를 이용한 기능성 마이크로비드의 탐지능을 실험하기 위해 1mm 크기의 10개 구멍이 뚫어져 있는 85 mm x 8 mm 크기의 칩에 2종의 마이크로 비드를 각각 4~5개씩 배열하였다. 그 후 화합물은 통과할 수 있으나 비드는 빠져나갈 수 없는 mesh 사이즈를 가진 망을 칩 위로 고정시키고, 독성탐지용 재조합 발광박테리아와 형광물질이 담지된 기능성 마이크로비드가 고정된 딥-스틱 형태의 바이오센서를 제작하였다. 딥-스틱 형태의 바이오센서의 전체적인 구조는 도 2에 나타내었으며, 칩의 기본 발광정도를 테스트하기 위한 LB 배지만 노출된 칩을 포함하여 상기 명시된 7가지 화학물질을 Dip-Stick 방식으로 노출시킨 후, 10분마다 cooled CCD 카메라를 이용하여 3시간 동안 측정하였다(도 3).
그 결과, MMC는 유전 독성을 탐지하는 DPD2794에서만 특이적으로 반응하였으며, MNNG는 유전독성을 탐지하는 DPD2974와 Alkylation을 탐지하는 EBAlkA에서 반응하는 것을 확인할 수 있었다.
H2O2 노출 결과 간접적으로 유전독성을 일으키며 DPD2794 와 OH·에 의한 산화적 손상에 반응하였다. O2·에 의한 산화적 손상을 일으키는 paraquat은 EBSoxS에 특이적으로 반응하였으며, 산화적 손상에 의한 세포막 손상을 일으키는 salicylic acid는 DPD2511과 DPD2540에서 약하게 반응하는 것을 확인할 수 있었다.
각 비드에 담지된 재조합 발광박테리아의 종류는 함께 담지된 형광물질의 형광으로 확인 가능하도록 하였다 (도 4). paraquat과 H2O2에 반응하는 DPD2511, EBSoxS 그리고 디지털 카메라로 찍은 실제 사진을 도 4에 나타내었으며, 이러한 반응은 눈으로 확인하는 발광의 정도뿐만 아니라 pixel density에 의한 정량분석도 가능 하다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 무작위 배열로 제작된 본 발명의 바이오센서를 이용한 독성물질 탐지
실시예 2의 방법으로 제작된 기능성 마이크로비드를 이용하여, 무작위 배열을 한 Dip-Stick 세포칩을 제작하여 본 발명을 확인하였다. 8가지 기능성 마이크로비드를 파스퇴르 파이펫을 이용하여 하나씩 1mm 크기의 Dip-Stick 세포칩에 채웠다. 이렇게 제작된 무작위 배열된 Dip-Stick 세포칩을 실시예 2에 기재된 독성물질을 이용하여 그 탐지능을 테스트하였다. 우선, 무작위 배열된 기능성 마이크로비드의 자기확인 코드를 확인하기 위해 형광 이미지 맵을 측정한 후 독성물질을 노출하여 실시예 2와 같이 10분마다 cooled CCD 카메라를 이용하여 2시간 동안 발광을 측정하였다. 측정 결과 특정 형광을 띄는 기능성 마이크로비드에서 특이적인 스트레서를 나타내는 화학물질을 탐지하여 발광을 나타내는 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea University Research and Business Foundation <120> A Dip-stick Toxicity Biosensor Using Smart Functional Microbeads <130> P12-B247 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 acttaaggat ccagagaagc ctgtcggcac 30 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 agctttgaat tccgctttct gtttgtttt 29 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 acttaaggat ccgcaaggca ttgaaggcag 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 agcagcgaat tcatcccaac atccacgacc 30 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 agcagcgaat tcgcggctgg tcaatatgct c 31 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 acttaaggat ccgctgcgtt tcgccactt 29 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 acttaggatc ccgaaatgag ggcgggaaa 29 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 agcagcgaat tcgaacgttg ctgaccacga 30

Claims (18)

  1. 다음 단계를 포함하는 독성탐지용 재조합 발광박테리아와 형광물질이 담지된 기능성 마이크로비드가 복수개 고정되어 있는 딥-스틱 형태의 바이오센서의 제조방법:
    (a) DPD2794, DPD2511, DPD2540, EBAlkA, EBSoxS, TV1061, KAN3 및 GC2로 구성된 군에서 선택되는 독성탐지용 재조합 발광박테리아와 형광물질을 비드기질과 함께 교반한 다음, 전기방사법으로 마이크로비드를 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 제조된 마이크로비드를 복수의 웰이 일렬로 형성되어 있고, 상기 웰의 종단면이 아랫 쪽이 좁고 윗쪽이 넒은 사다리꼴인 스틱형 기판에 각 웰마다 배열하고, 상기 마이크로비드가 빠져나올 수 없는 메쉬 크기를 가진 망을 기판 위에 고정하는 단계.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 독성은 유전독성, 산화적 손상, 세포막 독성 및 단백질 손상으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서 형광물질은 Cy3(그린), Cy5(레드), FITC(그린), 알렉사(Alexa), 보디피(BODIPY), 로다민(Rhodamine), 및 Quantum-도트(dot)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 비드기질은 알긴산, 알긴산나트륨, 글루코만난 (Glucomannan), 카파-카라기난(carrageenin) 또는 그의 유도체 및 아가(agar)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제1항의 방법으로 제조되고, DPD2794, DPD2511, DPD2540, EBAlkA, EBSoxS, TV1061, KAN3 및 GC2로 구성된 군에서 선택되는 독성탐지용 재조합 발광박테리아와 형광물질이 담지된 기능성 마이크로비드 복수개가 복수의 웰이 일렬로 형성되어 있고, 상기 웰의 종단면이 아랫 쪽이 좁고 윗쪽이 넒은 사다리꼴인 스틱형 기판에 일렬로 고정되어 있는 딥-스틱 형태의 바이오센서.
  10. 삭제
  11. 제9항에 있어서, 독성은 유전독성, 산화적 손상, 세포막 독성 및 단백질 손상으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  12. 제9항에 있어서, 형광물질은 Cy3(그린), Cy5(레드), FITC(그린), 알렉사(Alexa), 보디피(BODIPY), 로다민(Rhodamine), 및 Quantum-도트(dot)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 제9항, 제11항 및 제12항 중 어느 한 항의 바이오센서를 이용하는 것을 특징으로하는 독성탐지 방법.
  17. 제16항에 있어서, 독성탐지는 발광박테리아의 발광유무를 확인하여 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제16항에 있어서, 독성탐지는 독성물질이 포함된 샘플에 상기 바이오센서를 담그어 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.

KR1020120126223A 2012-11-08 2012-11-08 자기확인 기능성 마이크로비드를 이용한 독성 탐지용 딥스틱 바이오센서 KR102009014B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120126223A KR102009014B1 (ko) 2012-11-08 2012-11-08 자기확인 기능성 마이크로비드를 이용한 독성 탐지용 딥스틱 바이오센서

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120126223A KR102009014B1 (ko) 2012-11-08 2012-11-08 자기확인 기능성 마이크로비드를 이용한 독성 탐지용 딥스틱 바이오센서

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20140059609A KR20140059609A (ko) 2014-05-16
KR102009014B1 true KR102009014B1 (ko) 2019-08-08

Family

ID=50889388

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020120126223A KR102009014B1 (ko) 2012-11-08 2012-11-08 자기확인 기능성 마이크로비드를 이용한 독성 탐지용 딥스틱 바이오센서

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102009014B1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106526172A (zh) * 2016-10-08 2017-03-22 北京国科华仪科技有限公司 基于静电纺丝硝酸纤维素纳米纤维膜的免疫层析试纸条及其制备方法
CN108613957B (zh) * 2018-05-28 2021-05-07 中国人民解放军火箭军特色医学中心 一种用于水产食品中微塑料的检测方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100329121B1 (ko) * 1999-06-21 2002-03-21 김효근 고정된 발광 박테리아를 이용한 유해가스의 독성 탐지방법
KR100355757B1 (ko) * 2000-01-12 2002-10-19 광주과학기술원 토양 오염 독성 탐지장치 및 이를 이용한 토양 오염 독성탐지방법
KR20110137200A (ko) * 2010-06-16 2011-12-22 고려대학교 산학협력단 재조합 발광박테리아의 자기 확인 코드 기반 기능성 마이크로비드 개발과 이를 이용한 바이오센서 응용 및 독성 탐지 방법
KR20120022690A (ko) * 2011-12-28 2012-03-12 고려대학교 산학협력단 재조합 발광박테리아의 자기 확인 코드 기반 기능성 마이크로비드 개발과 이를 이용한 바이오센서 응용 및 독성 탐지 방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ISTC Reports, 2009, RR-114, Yi Lu, University of Illinois at Urbana-Champaign, Illinois Sustainable Technology Center
ISTC Reports, 2009, RR-114, Yi Lu, University of Illinois at Urbana-Champaign, Illinois Sustainable Technology Center (2009.02.28.)*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20140059609A (ko) 2014-05-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3285926B1 (en) Kit and method for high throughput microbiology applications
WO2011068088A1 (ja) ２次元cDNAライブラリを用いた遺伝子発現解析方法
US20090325147A1 (en) Molecularly imprinted polymers for detecting microorganisms
JP2017063716A (ja) 細胞の分析方法、細胞分析用チップ、細胞分析用試薬、細胞分析用キット及び細胞分析用装置
CN101497928B (zh) 鉴定ggⅰ组诺如病毒和ggⅱ组诺如病毒的方法及专用试剂盒
KR102009014B1 (ko) 자기확인 기능성 마이크로비드를 이용한 독성 탐지용 딥스틱 바이오센서
Sosnowski et al. The future of microbiome analysis: Biosensor methods for big data collection and clinical diagnostics
Strovas et al. Direct measurement of oxygen consumption rates from attached and unattached cells in a reversibly sealed, diffusionally isolated sample chamber
Imani et al. Liquid NanoBiosensors Enable One‐Pot Electrochemical Detection of Bacteria in Complex Matrices
Zakaria et al. A review of detection methods for vancomycin-resistant enterococci (VRE) genes: from conventional approaches to potentially electrochemical DNA biosensors
JP2006340684A (ja) 微生物の計測方法
Teles et al. Nucleic-acid testing, new platforms and nanotechnology for point-of-decision diagnosis of animal pathogens
Ahn et al. Randomly distributed arrays of optically coded functional microbeads for toxicity screening and monitoring
CN110049817B (zh) 将材料从第一微加工装置转移到第二微加工装置的方法、和用于其的试剂盒
US10590461B2 (en) High resolution systems, kits, apparatus, and methods using magnetic beads for high throughput microbiology applications
CN102286636A (zh) 检测登革病毒及分型的方法及专用芯片和试剂盒
KR20110137200A (ko) 재조합 발광박테리아의 자기 확인 코드 기반 기능성 마이크로비드 개발과 이를 이용한 바이오센서 응용 및 독성 탐지 방법
EP3532600A1 (en) High resolution systems, kits, apparatus, and methods for screening microorganisms and other high throughput microbiology applications
CN110220951B (zh) 一种利用整合式装置检测食物中的鼠伤寒沙门氏菌的方法
KR20120022690A (ko) 재조합 발광박테리아의 자기 확인 코드 기반 기능성 마이크로비드 개발과 이를 이용한 바이오센서 응용 및 독성 탐지 방법
JP4602318B2 (ja) 微生物細胞壁の透過性を増大させるための組成物および膜上で前記微生物を検出するための方法
Falcone et al. Demonstration of a tailorable and PCR-free detection of Enterococcus DNA isolated from soil samples
CN102925347B (zh) 半导体芯片、半导体酶芯片及筛选目标酶的方法
CN109562377A (zh) 用于高通量微生物学应用的使用联合培养基策略的高分辨率系统、试剂盒、设备和方法
Quintela Development of a Bacteriophage-based Portable Biosensor for the Detection of Shiga-toxin Producing Escherichia coli (STEC) Strains in Food and Environmental Matrices

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)