KR100355757B1

KR100355757B1 - 토양 오염 독성 탐지장치 및 이를 이용한 토양 오염 독성탐지방법

Info

Publication number: KR100355757B1
Application number: KR1020000001320A
Authority: KR
Inventors: 구만복; 장석태
Original assignee: 광주과학기술원
Priority date: 2000-01-12
Filing date: 2000-01-12
Publication date: 2002-10-19
Also published as: KR20010069072A

Abstract

본 발명은 토양 오염물질내 독성을 간편하고 신속하게 탐지할 수 있는 장치 및 이를 이용한 토양 오염지역내 독성 탐지방법에 관한 것으로, 토양을 생물 계면활성제로 추출한 다음, 발광 미생물이 유리비드로 고정화된 센서를 포함하는 본 발명의 토양 오염물질내 독성 탐지장치를 사용하여 토양 중의 독성을 탐지할 경우 현장에서 신속하게 독성을 측정할 수 있어 종래의 장치와는 달리 실효성이 매우 높을 뿐만 아니라 오염을 미연에 방지하여 막대한 처리비용과 시간을 줄일 수 있는 장점이 있다.

Description

토양 오염 독성 탐지장치 및 이를 이용한 토양 오염 독성 탐지방법{DEVICE FOR MONITORING TOXICITY IN CONTAMINATED SOILS AND METHOD FOR MONITORING TOXICITY IN CONTAMINATED SOILS USING SAME}

본 발명은 토양 오염물질내 독성을 간편하고 신속하게 탐지할 수 있는 장치 및 이를 이용한 토양 오염물질내 독성 탐지방법에 관한 것이다.

석유류 및 유독물의 저장시설, 쓰레기 매립지, 각종 산업시설, 군사시설 지역, 폐광산, 농약 사용이 빈번한 농경지 등에서 독성물질이 유출되고 있어, 이에 적절하게 대처하기 위하여 먼저 이들 독성 물질의 탐지가 매우 중요하다.

토양 오염의 실태조사는 대기나 수질오염과 비교하여 조사비용 또는 방법면에서 상당한 어려움이 따르며, 오염이 발견되면 다른 환경오염 처리에 비하여 처리비용이 막대할 뿐만 아니라 처리효율도 매우 낮다는 어려움이 있다.

따라서, 종래에는 토양 오염의 독성을 탐지하기 위해, 오염지역에서 토양시료를 채취한 후 토양 오염물질을 헥산이나 디메틸 설폭사이드(DMSO) 등의 유기용매를 이용하여 추출한 다음, 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 분석하는 방법을 사용한 바 있으나, 이 방법은 토양시료의 채취와 저장이 어려울 뿐 아니라 유기용매의 휘발에 따른 분석과정이 복잡하고 시간이 오래 걸린다는 단점이 있다. 다르게는, 오염지역의 토양 또는 복원 처리된 토양의 일정량을 채취하여 지렁이를 키워 수일 혹은 수주일 후 지렁이의 생존율이나 성장정도로 토양의 오염 정도 및 복원 효율을 파악하는 방법이 있으나, 이 역시 토양 오염을 측정하는데 시간이 많이 걸리고 정확한 오염정도를 알기 어렵다는 단점이 있다.

이에 본 발명자들은 토양 오염 예상지역에서 간편하고 신속하게 토양내 유해 독성물질을 탐지할 수 있는 방법을 개발하기 위해 계속 연구를 진행한 결과, 특정의 생물 계면활성제를 사용하여 토양 오염물질을 추출하고, 발광 미생물이 유리비드에 의해 고정화된 센서를 포함하는 장치를 이용하여 미생물 발광량의 변화를 측정함으로써 토양 오염물질내 독성을 탐지할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 토양 오염물질내 독성을 간편하고 신속하게 직접 탐지할 수 있는 장치 및 이를 이용한 토양 오염내 독성 탐지방법을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 발광 미생물이 고정화된 센서의 한 예를 나타내는 모식도이고,

도 2는 본 발명에 따른 토양 오염 독성 탐지 시스템의 한 예를 나타내는 모식도이고,

도 3은 오염물질을 첨가하지 않은 경우 유리 비드의 함량에 따른 포토박테리움 포스포리움(photobacterium phosphoreum, KCTC 2852)의 발광량을 나타낸 그래프이고,

도 4는 오염물질을 첨가하지 않은 경우 유리비드의 함량에 따른 박테리아 GC2(lac::luxCDABE)의 발광량을 나타낸 그래프이고,

도 5는 오염물질을 첨가하지 않은 경우 공기주입 속도에 따른 박테리아 GC2(lac::luxCDABE)의 발광량을 나타낸 그래프이고,

도 6은 오염물질(페난트렌)의 농도에 따른 포토박테리움 포스포리움(photobacterium phosphoreum, KCTC 2852)의 발광량을 나타낸 그래프이고,

도 7은 오염물질의 농도에 따른 박테리아 GC2(lac::luxCDABE)의 발광량을 나타낸 그래프이다.

<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>

100 : 센서 101 : 유리비드

102 : 발광 미생물 103 : 튜브

104 : 고형 영양배지 201 : 온수 유입구

202 : 공기 배출구 203 : 토양 오염물질 주입구

204 : 광섬유(fiber optic probe) 205 : 공기 주입구

206 : 온수 배출구 207 : LB 용액

208 : 광검출기 209 : 마그네틱 교반기

210 : 온수 자켓

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명에서는 발광 미생물이 유리비드로 고정화된 센서를 포함하는 반응기 및 광검출기가 구비된 토양 오염물질내 독성 탐지장치를 제공한다.

또한 본 발명에서는,

(1) 생물 계면활성제를 이용하여 토양 오염물질을 추출하고, (2) 토양 오염물질을 원심분리하여 고체입자를 제거하고, (3) 발광 미생물이 유리비드로 고정화된 센서를 각각 포함하는 시험 반응기 및 공시험 반응기에 상기 (2)에서 얻은 상층액 및 생물 계면활성제를 각각 주입하고, (4) 각 반응기를 20 내지 40℃에서 반응시킨 후 반응기에서 발광된 빛을 검출 및 비교하는 단계를 포함하는, 토양 오염물질내 독성 탐지방법을 제공한다.

이하 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명에 따른 독성 탐지 시스템의 한 예를 도 2에 나타내었으며, 본 발명의 독성 탐지 시스템은 토양 오염물질이 주입되는 토양 시험 반응기(test reactor), 토양 오염물질이 주입되지 않는 공시험 반응기(control reactor), 각 반응기에 연결된 광검출기 및 광검출기로부터 받은 데이타를 분석하는 DAQ(데이타 취득(Data Acquisition)) 시스템으로 이루어진다. 도 2를 참조로 설명하면, 본 발명의 독성 탐지 시스템은, 발광 미생물이 고정화된 센서(100)가 발광 미생물에 의해 발광된 빛을 광검출기(208)에 수신하는 광섬유(fiber optic probe)(204) 끝에 부착되어 있고, 반응기 상단에는 토양 오염물질 주입구(203), 미생물에 산소를 공급하기 위한 공기 주입구(205) 및 공기 배출구(202)가 장착되어 있으며, 토양 오염물질 주입구(203) 및 공기 주입구(205)를 이루는 튜브는 반응기의 하부까지 연장되어 배양액에 직접 공기를 제공할 수 있다. 또한, 반응기에는 15 내지 80ml의 25% LB 용액(LB Broth(Difco) + 증류수)(207)이 들어 있고, 반응기의 하단에 놓인 마그네틱 교반기(209)를 사용하여 토양 오염물질과 LB 용액 및 미생물이 접촉될 수 있도록 혼합물을 교반시킬 수 있다.

본 발명의 시험 반응기 및 공시험 반응기에는 반응기의 온도를 20 내지 40℃, 바람직하게는 37℃로 유지하기 위한, 온수 유입구(201)와 유출구(206)를 갖는 온수 자켓(210)이 장착되어 있다. 본 시험 반응기 및 공시험 반응기는 20 내지 100ml 크기의 소형 반응기로 제작될 수 있다.

상기 발광 미생물이 고정화된 센서(100)의 한 예를 도 1에 나타내었다. 본 발명에 따른 센서는, 유리비드(101)가 들어 있는 투명한 튜브(103)에, 발광 미생물(102)과 영양배지(104)의 혼합물을 주입함으로써 유리비드에 발광 미생물을 고정화시켜 제조한다.

상기 튜브(103)는 폴리프로필렌, 폴리스티렌 또는 폴리카보네이트 등의 재질로 이루어지며, 상기 영양배지(104)는 바람직하게는 25% LB 용액에 마이크로아가(DUCHEFA) 0.8 내지 2%를 녹여 만든 것이다. 본 발명의 발광 미생물이 고정화된 센서(100)는 4℃에서 냉장보관한다. 본 발명의 장치에 의해 탐지될 수 있는 독성물질은 물에 용해되지 않고 토양에 잔존하는 오염물질을 총괄하여 지칭하며, 페난트렌(phenanthrene), 벤조피렌 및 안트라센과 같은 폴리사이클릭 방향족 탄화수소류, 폴리염화 비페닐(PCB)류, 각종 농약성분 및 오일성분이 이에 포함된다.

본 발명에서 사용하는 발광 미생물은 독성에 대해 발광 특성의 변화를 갖는 미생물로서 독성물질이 없을 경우에는 다량으로 발광하나 독성 물질과 접촉할 경우에는 발광량이 감소하는 특성을 갖는다. 본 발명에 사용되는 발광 미생물의 예로는 박테리아 GC2(lac::luxCDABE,뉴질랜드 그래스랜드 리써치 센터(Grasslands Research Center)의 Dr. Marinc로부터 받은 플라스미드 pLITE205를 대장균 RFM443(듀퐁사, 미국)에 형질전환시켜 제작됨); 포토박테리움 포스포리움(photobacterium phosphoreum, KCTC 2852); 및 대장균 TV1061(GrpE::luxCDABE, ATCC 69315), 대장균 DPD2794(RecA::luxCDABE, 듀퐁사, 미국), 대장균 DPD2511(KatG::luxCDABE, 듀퐁사, 미국) 및 대장균 DPD2540(FabA::luxCDABE, 듀퐁사, 미국)와 같은 재조합 발광 미생물을 들 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 이러한 미생물을 적절히 조합하여 사용하면, 토양 오염물질 중에 포함된 독성의 수준을 결정할 수 있다.

본 발명의 장치를 이용하여 토양 오염물질 중의 독성을 탐지하는 방법은 다음과 같다.

먼저 토양 오염물질을 생물 계면활성제로 추출한 후 원심분리하여 고체입자를 제거한다. 이어서 여액을 도 2에 도시된 시험 반응기의 토양 오염물질주입구(203)로 주사기를 이용하여 주입한다. 이때, 공시험 반응기에서는 상기 추출에 사용된 생물 계면활성제와 동일한 양의 생물 계면활성제만을 주입하는데, 생물 계면활성제로는 발광 미생물에 독성을 나타내지 않는 임의의 계면활성제를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 람노리피드(Rhamnolipid, 재네일 바이오서펙턴트 캄파니(Jeneil Biosurfactant Co.)사제), 트레할로리피드(Trehalolipid), 소포로리피드(Sophorolipid) 및 서펙틴(Surfactin), 더욱 바람직하게는, 람노리피드를 사용할 수 있다. 각 반응기에는, 주입한 25% LB 용액의 양에 따라 공기 주입구(205)를 통해 20 내지 80㎖/분의 속도로 미생물에 산소를 공급하면서, 마그네틱 교반기(209)를 사용하여 반응기내 혼합물을 200 내지 600rpm의 속도로 교반시킨다. 이때, 각 반응기에서 토양 오염물질 중의 독성에 반응하여 미생물에 의해 발광된 빛은 광섬유(204)를 통해 수신되어 루미노미터 등의 광검출기(208)에 전달된다.

독성에 의한 발광 반응은 공시험 반응기에서 측정된 빛에 대한 시험 반응기에서 측정된 빛의 비율(상대 생물발광, relative bioluminescence, RBL)로 나타낼 수 있으며, 상대 생물발광 값을 토대로 하여 다음 수학식 1과 같이 DAQ 시스템을 이용하여 토양 오염물질 중의 독성의 수준을 결정할 수 있다.

본 발명의 토양 오염 독성 탐지장치를 사용하는 토양 오염 독성 탐지방법에 따르면, 각종 독성의 수준을 신속하게 결정할 수 있다.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실 시 예 1

포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum, KCTC 2852)을 액체 영양배지(25% LB Broth(Difco)용액 + 마이크로 아가(DUCHEFA)) 20㎖에 혼합한 혼합액 100㎕(세포수 1.04 ×10⁸cells/튜브)을 0.05g의 유리비드가 들어 있는 폴리프로필렌 튜브에 넣고 상온으로 냉각하여 고정화함으로써 도 1에 도시한 센서를 제조하고, 대조군으로서 유리비드 없이 미생물과 영양배지만 넣은 센서를 제조하였다. 이들을 37℃로 유지되는 LB 용액이 들어 있는 도 2에 도시된 토양 오염 탐지 시스템의 반응기에 각각 넣은 후 토양 오염물질을 첨가하지 않은 상태에서 30㎖/분의 속도로 공기를 주입하면서 미생물에 의한 발광량을 측정하였다.

그 결과는 도 3에 나타내었으며, 여기에서 보듯이, 유리비드를 사용한 경우에는 약 50분 이내에 일정한 발광량을 유지하는 정상상태에 도달하여 100분 이상 지속되었으나, 유리비드를 넣지 않은 대조군의 경우에는 발광량이 정상상태에 도달하지 못하고 계속 감소하는 것을 알 수 있었다.

실 시 예 2

뉴질랜드 그래스랜드 리써치 센터의 Dr. Marinc로부터 받은 플라스미드 pLITE205를 대장균 RFM443(듀퐁사, 미국)에 일반적인 방법으로 형질전환시켜 박테리아 GC2(lac::luxCDABE)를 제작하였다.

발광 미생물로서 상기 제작된 박테리아 GC2(lac::luxCDABE)을 사용하고, 유리비드의 중량을 0.00g, 0.02g, 0.05g 및 0.15g으로 변화시켜 실시하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 미생물에 의한 발광량을 측정하여 그 결과를 도 4에 나타내었다.

여기에서 보듯이, 유리비드를 사용하지 않은 경우에는 발광량이 계속 감소하는 반면, 각 중량의 유리비드를 사용한 경우에는 각각 일정시간 후 발광량을 유지하는 정상상태에 도달하여 계속적으로 유지되는 것을 알 수 있다.

실 시 예 3

발광 미생물로서 박테리아 GC2(lac::luxCDABE)을 사용하고, 공기를 0, 15 및 30㎖/분의 속도를 주입시키는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 미생물에 의한 발광량을 측정하여 그 결과를 도 5에 나타내었다.

여기에서 보듯이, 공기주입을 하지 않은 경우에는 발광량이 계속 감소하는 반면, 공기주입 속도를 달리하여 실시한 경우에는 각 공기주입 속도에 따라 각각 일정시간 후 발광량을 유지하는 정상상태에 도달하여 계속적으로 유지되는 것을 알 수 있다.

실 시 예 4

페난트렌으로 오염된 토양 5g을 4% 람노리피드(제네일 바이오서펙턴트사제) 용액 30㎖와 혼합하고 교반시켜 오염물질인 페난트렌을 추출한 후, 이 혼합물을 6000rpm으로 원심분리하여 고체입자를 제거하였다. 이렇게 얻은 상등액을 페난트렌의 농도가 10.3 및 22.5ppm이 되도록 조정한 후 주사기를 이용하여 도 2에 도시된 장치의 시험 반응기의 토양 오염물질 주입구(203)에 각각 주입하였다. 공시험 반응기에는 추출에 사용된 것과 같은 양의 람노리피드만을 주입하였다. 각 반응기에 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 제조된 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum, KCTC 2852)이 고정화된 센서를 넣은 후 30㎖/분의 속도로 공기를 주입하면서 페난트렌의 농도에 따른 미생물에 의한 발광량을 측정한 후 시험 반응기와 공시험 반응기의 발광량으로부터 RBL을 구하여 그 결과를 도 6a 및 6b에 나타내었다.

도 6a 및 6b는 오염물질 페난트렌의 농도에 따른 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum, KCTC 2852)의 발광량을 나타낸 그래프로서, 도 6a는 10.3ppm의 페난트렌, 도 6b는 22.5ppm의 페난트렌을 사용한 경우이다. 여기에서 보듯이, 페난트렌의 농도가 높을수록 발광량이 더 급격히 감소함을 알 수 있다.

실 시 예 5

발광 미생물로서 박테리아 GC2(lac::luxCDABE)을 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 센서를 제조하였다.

한편, 실시예 4와 동일한 방법으로 토양으로부터 오염물질을 추출한 후, 오염물질의 농도가 각각 0, 2.06, 10.3, 17.6 및 22.5ppm이 되도록 시험 반응기의 토양 오염물질 주입구(203)에 주입하고, 공시험 반응기에는 추출에 사용한 것과 동일한 양의 생물 계면활성제 람노리피드를 주입하였다. 각 반응기에 상기에서 제조된 센서를 넣고 37℃에서 30㎖/분의 속도로 공기를 주입하면서 발광량을 측정하였다. 그 후, RBL을 계산하여 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7은 오염물질의 농도에 따른 박테리아 GC2(lac::luxCDABE)의 발광량을 나타낸 그래프로서, 여기에서 보듯이, 발광량의 감소는 독성 물질의 농도가 클수록 더 급격함을 확인할 수 있었다.

발광 박테리아가 고정화된 센서를 포함하는 본 발명의 토양 오염물질내 독성 탐지장치는 제작 및 사용이 간편하고, 소형이므로 이를 이용하여 토양 중의 독성을 탐지할 경우 현장에서 신속하게 독성을 측정할 수 있어 종래의 장치와는 달리 실효성이 매우 높을 뿐만 아니라 오염을 미연에 방지하여 막대한 처리비용과 시간을 줄일 수 있다.

Claims

토양오염물질의 유입구, 발광미생물이 유리 비드로 고정화된 센서 및 공기 주입구를 갖는 시험 반응기; 대조 용매의 유입구, 발광미생물이 유리 비드로 고정화된 센서 및 공기 주입구를 갖는 공시험 반응기; 각 센서에 연결되어 발광미생물에 의해 발광된 빛을 광검출기에 송신하는 광섬유; 및 수신된 빛의 양을 측정하는 광검출기를 포함하는 토양오염물질내 독성 탐지장치로서, 상기 센서는 유리비드가 들어있는 튜브에 발광미생물과 영양배지의 혼합물을 주입하여 고정화시켜 제조된 것을 특징으로 하는 장치.
삭제
제 1 항에 있어서,

상기 발광 미생물이 박테리아 GC2(lac::luxCDABE), 포토박테리움 포스포리움 (photobacterium phosphoreum, KCTC 2852) 또는 다른 재조합 발광 미생물인 것을 특징으로 하는 장치.
(1) 생물 계면활성제를 이용하여 토양 오염물질을 추출하고, (2) 토양 오염물질을 원심분리하여 고체입자를 제거하고, (3) 발광 미생물이 유리비드로 고정화된 센서를 각각 포함하는 시험 반응기 및 공시험 반응기에 상기 (2)에서 얻은 상층액 및 생물 계면활성제를 각각 주입하고, (4) 각 반응기를 20 내지 40℃에서 반응시킨 후 반응기에서 발광된 빛을 검출 및 비교하는 단계를 포함하는, 제 1 항 또는 제 3 항의 장치를 이용한 토양 오염물질내 독성 탐지방법.
제 4 항에 있어서,

생물 계면활성제가 람노리피드(Rhamnolipid), 트레할로리피드(Trehalolipid), 소포로리피드(Sophorolipid) 또는 서펙틴(Surfactin)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서,

상기 발광 미생물이 박테리아 GC2(lac::luxCDABE), 포토박테리움 포스포리움(photobacterium phosphoreum, KCTC 2852) 또는 다른 재조합 발광 미생물인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서,

토양 오염물질이 폴리사이클릭 방향족 탄화수소류, 폴리염화 비페닐(PCB)류, 각종 농약성분 또는 오일성분인 것을 특징으로 하는 방법.