KR101695265B1 - 발광 미생물을 이용한 고체 시료의 생태 독성 평가방법 - Google Patents

발광 미생물을 이용한 고체 시료의 생태 독성 평가방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 발광미생물을 이용한 고체 시료의 생태 독성 평가방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 발광 미생물을 이용한 고체 시료의 생태 독성 평가방법은, (a)표준용액에 발광미생물을 투입하고 일정 시간 경과 후 발광미생물의 표준발광량을 측정하는 단계, (b)표준용액에 평가 대상이 되는 고체 시료가 혼합된 현탁액을 투입하고 일정 시간 경과 후 고체 시료가 포함된 용액을 원심분리하는 단계 및 (c)원심분리 후 발광미생물의 발광량을 측정하여 표준발광량과 비교함으로써 고체 시료의 독성을 평가하는 것에 특징이 있다. 그리고 표준발광량을 측정하기에 앞서 선택적으로 원심분리를 수행함으로써 평가의 정확성을 더욱 향상시킬 수 있다.

Description

발광 미생물을 이용한 고체 시료의 생태 독성 평가방법{Method of solid phase eco-toxicity evaluation using bioluminescent microbes}
본 발명은 토양, 폐기물, 오폐수 등에 대한 환경 오염 여부를 평가하기 위한 것으로서, 특히 발광 미생물을 이용하여 시료의 독성을 평가하는 방법에 관한 것이다.
생물학적 방법을 이용하여 환경오염 여부를 평가하기 위한 기존의 방법은 주로 물벼룩이나 어류와 같은 수중 생물을 평가 대상 시료 내에서 생육시키면서 생존 여부, 생존 기간 및 생존 정도를 측정하는 방법이 널리 사용되어 왔다. 그러나 이러한 방법은 생물의 생육 과정을 적어도 수 일 이상 관찰해야 하므로 측정 기간이 길다는 문제점을 안고 있었다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여 Aliivibrio fischeri(A.fischeri)와 같은 발광 미생물을 이용하여 환경 오염 여부 또는 생태 독성을 평가하는 방법에 제시되었다. 발광 미생물을 이용한 독성의 평가는 미생물이 독성 시료에 노출된 후 일정 시간이 지난 후 미생물의 50% 치사율을 측정하는 방법으로 독성을 평가한다. 보다 구체적으로 설명하면, 시료와 접촉하지 않은 상태(미생물이 모두 살아 있는 상태)에서 발광 미생물의 발광량을 측정한 후, 이 발광 미생물을 평가 대상되는 시료에 노출시킨 후 다시 발광량을 측정한다. 미생물의 50% 치사율 여부는 발광량의 변화를 통해 측정할 수 있다.
발광미생물을 활용한 환경시료의 독성평가는 실험방법의 편의성 및 신속성과 발광수용체의 감도 등이 뛰어나다는 장점에 기인하여 널리 사용되고 있다. 예를 들어, "Microtox"라는 독성 평가 시스템이 상업화되어 널리 사용되고 있으며, 이 외에도 다양한 키트들이 제품화되어 있다.
상기한 바와 같은 발광미생물을 이용한 방법을 고체 시료에 적용하기 위해서는 우선 고체 시료를 용액에 넣어 현탁액을 만든 후 미생물을 이 현탁액에 투입하는 방법이 사용된다. 그러나 고체 시료가 혼합되어 있는 현탁액은 탁도가 높기 때문에, 미생물의 발광량을 측정하는데 어려움이 있다. 이에 상기한 "Microtox"의 메뉴얼에서는 현탁액의 탁도에 의한 발광교란 효과를 필터를 이용하여 제거한 후에 발광량을 측정하는 방법 또는 현탁액을 일정 시간 동안 자연 침강시켜 탁도를 낮춘 후에 측정하는 방법을 제시하고 있다.
그러나 자연 침강의 경우 탁도 제어가 용이하지 않고, 필터를 이용하는 방법은 미생물과 토양의 분리율이 좋지 않기 때문에 고체 시료의 독성 평가에 있어서 효과적인 해결책으로서 기능하지 못한다는 문제점이 있었다.
본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 미생물과 고체 시료가 반응한 후, 미생물과 고체 시료가 혼합되어 있는 용액을 원심분리하여 현탁액의 탁도를 낮추고 미생물의 활성을 증대시켜 고체 시료에 대한 정확한 생태 독성 평가가 가능한 방법을 제공하는데 목적이 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 발광 미생물을 이용한 고체 시료의 생태 독성 평가방법은, 표준용액에 발광미생물을 투입하고 일정 시간 경과 후 상기 표준용액을 원심분리한 후, 상기 발광미생물의 표준발광량을 측정하는 단계와, 상기 표준용액에 평가 대상이 되는 고체 시료가 혼합된 현탁액을 투입하고 일정 시간 경과 후 상기 고체 시료가 포함된 용액을 원심분리하는 단계와, 상기 고체 시료가 포함된 용액의 원심분리 후 상기 발광미생물의 발광량을 측정하여 상기 표준발광량과 비교함으로써 상기 고체 시료의 생태 독성을 평가하는 것에 특징이 있다.
다만, 표준발광량을 측정할 때에는 반드시 원심분리를 선행하여야 하는 것은 아니며, 원심분리를 하지 않고 표준발광량을 측정하여 이 값을 그대로 사용하거나, 원심분리에 의한 미생물의 발광량 활성 정도를 고려하여 그 값을 보정하여 사용할 수도 있다.
원심분리는 300~1,000rpm의 속도로 수행하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 300~500rpm의 속도로 수행한다.
그리고 표준발광량의 측정하기에 앞서 원심분리를 수행하는 경우에 원심분리 속도와 고체 시료를 포함한 용액을 원심분리할 때의 속도는 서로 일치시키는 것이 바람직하다.
본 발명에서는 고체 시료가 포함된 상태에서 발광량을 측정할 때 원심분리를 통해 현탁액에 포함된 부유물을 침전시켜 용액의 탁도를 개선함으로써, 미생물의 실제 발광량을 정확하게 측정할 수 있다. 이에 미생물을 이용한 생태 독성 평가가 정확하게 이루어질 수 있다는 이점이 있다.
또한, 본 발명에서는 표준발광량 및 고체 시료 노출 후의 발광량 측정을 수행하기에 앞서 원심분리를 수행하여 미생물이 활성화되게 함으로써 발광량을 증대시킨다. 이렇게 발광량이 증대됨으로써 발광량이 낮은 경우에도 발광량 측정이 용이해진다는 이점이 있다.
도 1은 본 발명의 제1실시예에 따른 발광미생물을 이용한 고체 시료 독성 평가방법의 개략적 흐름도이다.
도 2는 원심분리에 의한 미생물의 발광량 증대 실험을 한 결과가 나타난 그래프이다.
도 3 내지 도 5는 원심분리를 수행한 경우와 그렇지 않은 경우에 생태독성을 평가한 실험 결과 표이다.
도 6은 본 발명의 제2실시예에 따른 발광미생물을 이용한 고체 시료 독성 평가방법의 개략적 흐름도이다.
본 발명은 발광미생물을 이용하여 고체 시료의 생태 독성을 평가하기 위한 방법에 관한 것이다. 그러나, 본 발명에서 평가의 대상이 되는 시료는 반드시 고체 시료에 한정되는 것은 아니며, 액체 시료라고 하더라도 부유물이 다량 혼합되어 있어 탁도가 높은 시료에 대해서도 적용가능하다. 따라서 하천, 지하수, 산업폐수 등과 같은 액체 시료라고 하더라도, 부유물이 많아 탁도에 영향을 미치는 경우에는 본 발명에서 사용하는 고체 시료의 범위에 포함된다.
이하, 본 발명에 따른 발광미생물을 이용한 고체 시료 생태 독성 평가방법(이하, '생태 독성 평가방법'이라 한다)에 대하여 첨부된 도면을 참고하여 더욱 상세히 설명하기로 한다.
도 1은 본 발명의 제1실시예에 따른 생태 독성 평가방법의 개략적 흐름도이다.
도 1을 참고하면, 본 발명의 제1실시예에 따른 생태 독성 평가방법은 먼저 발광미생물의 표준발광량을 측정하는 것으로부터 시작한다. 즉, 발광미생물을 표준용액에 투입하고 일정 시간 경과 후 발광미생물의 표준발광량을 측정한다.
발광미생물은 스스로 빛을 내는 세균류로서 Aliivibrio fischeri(A.fischeri), Photobacterium 또는 Xenorhabdus 등 다양한 종류가 있다. 발광미생물이 발광을 하는데 있어서 루시페라아제(Luciferase)라는 효소가 중심적인 역할을 담당하는데, 거의 대부분의 발광생물들이 루시페라아제를 이용해 빛을 낸다. 즉, 발광물질인 루시페린(Luciferin)이 ATP에 의해 활성화되었을 때, 루시페라아제가 이것을 산화시켜 산화루시페린으로 만들고, 이 과정에서 빛이 발생한다.
본 발명에서는 다양한 발광미생물을 사용할 수 있는데, 본 실시예에서는 이들 중 A.fischeri를 사용하였다. A. fischeri는 통성혐기성 세균으로서 주로 해수에서 발견된다.
발광미생물을 수용하는 표준용액은 다양한 조성으로 만들어질 수 있는데, 본 실시예에서 사용하는 A.fischeri는 주로 해수에서 발견되는바, 표준용액으로 2% NaCl 용액을 사용한다.
상기한 바와 같이, 표준용액을 시험관과 같은 투명한 용기에 담고 발광미생물을 투입한 후 대략 15분 정도의 시간이 경과한 후 용기 전체의 발광량을 측정한다.
표준발광량을 측정한 후에는 평가대상이 되는 고체 시료를 표준용액과 동일한 조성으로 이루어진 용액에 투입하여 현탁액을 만든다. 그리고 이 현탁액을 발광미생물이 포함되어 있는 표준용액에 혼합한다. 현탁액은 표준용액과 동일한 부피로 형성할 수 있으며, 이 경우 용기에 담겨 있는 용액은 최초의 표준용액에 비하여 2배의 부피를 가진다.
현탁액을 표준용액에 수용한 후 대략 15분 정도의 시간 동안 방치하면 발광미생물과 고체 시료에 노출된다. 고체 시료의 생태 독성이 심한 경우 발광미생물은 죽거나 활성이 현저하게 낮아지게 된다. 이렇게 일정 시간이 경과한 후에는 용기를 원심분리기에 설치하여 발광미생물과 표준용액 및 현탁액이 섞인 용액에 대하여 원심분리를 수행한다. 원심분리를 수행한 후에는 발광미생물의 발광량을 측정하여, 앞서 측정한 표준발광량과 대비함으로써 고체 시료의 생태 독성을 평가한다.
본 발명에서 가장 중요한 특징은 원심분리에 있다. 본 발명에서 원심분리를 수행하는 이유는 2가지 목적이다. 하나는 발광량을 측정할 때 현탁액의 탁도에 의하여 발광량이 실제보다 낮게 측정되는 것을 방지하기 위한 목적이다. 본 발명에서는 표준발광량과 고체 시료와의 반응 후의 발광량의 차이를 비교하여 생태 독성을 판정하는데, 발광량을 측정할 때 현탁액의 부유물로 인해 미생물의 실제 발광량보다 측정된 양이 더 작아질 수 있기 때문이다. 이에 원심분리를 통해 용액 내의 부유물은 침전시킨 후 맑은 용액 상태로 만든 후 발광량을 측정하는 것이다.
두 번째 목적은 발광미생물의 활성을 증대시키기 위한 것이다. 본 연구진은 원심분리를 수행하면 발광미생물의 활성이 증대되어 발광량이 늘어나는 것을 발견하였다. 원심분리의 본래 목적은 용액 내 부유물을 가라앉힘으로써 탁도를 낮추기 위한 것이었지만, 새로운 효과를 발견하게 됨으로써 본 연구진에서는 이를 적극적으로 활용할 방안을 모색하였다. 본 발명에서는 발광미생물이 보통 상태에 있을 때의 발광량(표준발광량)과 고체 시료에 노출된 후의 발광량의 차이를 비교하는 것이기 때문에 발광미생물이 동일한 상태에 놓여 있어야 한다. 따라서, 앞에서 표준발광량을 측정할 때에도 원심분리를 먼저 수행하여 발광미생물의 활성을 증대시키도록 하였다. 표준발광량 측정시와 고체 시료에 노출 후 발광량 측정시에 발광미생물이 모두 활성화된 상태이므로, 발광미생물이 동일한 조건에서 측정이 이루어지는 것이며, 이에 따라 표준발광량과 고체 시료 접촉 후의 발광량의 차이에 의해 고체 시료의 생태 독성을 평가할 수 있다. 그리고 발광미생물이 활성화됨에 따라 표준발광량과 고체 시료 접촉 후의 발광량이 모두 증대되므로 발광량을 측정하는 것이 보다 용이해지는 이점이 있다. 다만 표준발광량을 측정할 때 원심분리를 수행하는 것은 선택적 사항이며, 표준발광량 측정시 원심분리를 수행하지 않는 경우에는 원심분리에 의한 발광량 증대분이 반영되도록 실측된 표준발광량을 수학적으로 보정할 수도 있을 것이다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 연구진은 탁도를 제어하기 위해 원심분리 방식을 고안하였지만, 원심분리에 의해 미생물의 활성이 증대되는 것을 발견하여 이를 적극적으로 활용하였다.
원심분리를 수행함에 있어서 가장 중요한 점은 원심분리를 통해 발광미생물이 함께 침전되지 않도록 제어할 필요가 있다는 것이다. 원심분리에 의해 발광미생물이 침전하거나 죽는 경우에는 오히려 발광량 측정에 오류가 발생할 수 있기 때문이다. 이는 원심분리 속도의 문제로 귀결된다. 본 연구진에서는 수 많은 실험과, 그 결과에 대한 고찰을 통해 원심분리에 의해 발광미생물이 침전되는 것을 방지할 뿐만 아니라, 활성이 증대되도록 원심분리 속도를 최적화하였다.
본 연구진의 실험 결과에 의하면 원심분리 속도를 300~1,000rpm 수준으로 유지할 때 두 가지 효과를 모두 만족하였으며, 특히 300~500rpm 수준에서 최적화되는 것으로 확인하였다.
도 2의 그래프표에는 본 연구진에 의해서 원심분리 속도에 따른 미생물의 발광량 증가율 실험의 결과가 나타나 있다.
실험은 원심분리 속도를 변경시켜 가면서 1분 동안 원심분리를 수행한 후 미생물의 최초 발광량 대비 원심분리 후의 발광 증대율을 나타낸 것이다. 미생물은 300~1,000rpm에서는 대략 30% 정도로 발광량이 증대하였으나, 1,000rpm 이상에서는 오히려 감소하는 것으로 나타났다. 감소의 원인은 미생물이 원심분리에 의해서 침전했기 때문으로 판단된다.
또한 본 연구진에서는 원심분리를 수행하지 않은 경우와 원심분리를 수행한 경우에 발광량의 차이에 대하여 실험하였다. 표준발광량(I0,IC0)과 고체 시료 노출 후의 미생물의 발광량(It, Ict)을 측정할 때 원심분리를 수행하지 않은 경우(control)와, 원심분리를 수행한 경우(원심분리)에 발광량의 차이에 대하여 실험하였다.
도 3 내지 도 5의 표에는 실험 결과가 나타나 있다. 도 3 내지 도 5를 참고하면, 표준발광량과 고체 시료 노출 후의 발광량이 모두 원심분리를 수행한 경우에 더 높게 나타났다. 즉, 고체 시료 노출 후의 발광량 측정값이 증대하는 것은 현탁액의 부유물이 원심분리에 의해 하부로 침전하면서 탁도가 개선된 측면과 함께 미생물 발광량 자체가 증대되었다는 것을 의미한다. 더욱이, 고체 시료에 노출되기 전의 표준발광량이 증대하였다는 것은 탁도에 의한 영향은 전혀 없으므로 원심분리에 의해 미생물의 발광량 자체가 증대하였다는 것을 명확하게 보여준다.
즉, 본 발명에서는 표준발광량 및 고체 시료 노출 후의 발광량 측정을 수행하기에 앞서 원심분리를 수행하여 미생물이 활성화되게 함으로써 발광량을 증대시킴과 동시에 고체 시료가 포함된 상태에서 발광량을 측정할 때에는 용액의 탁도를 개선하여 미생물의 실제 발광량이 정확하게 반영될 수 있도록 하였다.
이렇게 미생물의 발광량 자체를 증대시킴으로써 발광량이 작은 경우라고 해도 정확한 측정이 가능할 뿐만 아니라, 현탁액을 사용하는 경우에도 탁도의 영향을 배제한 상태에서 미생물의 실제 발광량을 정확하게 측정할 수 있다는 이점이 있다.
이상에서는 고체 시료의 독성을 평가함에 있어서 하나의 용기에 표준용액에 미생물을 수용한 후 미생물의 표준발광량을 측정하고, 이 용기에 고체 시료가 포함된 현탁액을 수용하여 미생물과 고체 시료가 반응하게 한 후 발광량을 측정하였다. 즉, 하나의 용기에서 모든 실험을 수행하였다.
그러나, 본 발명의 제2실시예에서는 용기를 분리하여 실험을 수행할 수도 있다. 도 6은 본 발명의 제2실시예에 따른 방법의 개략적 흐름도이다.
도 6을 참고하면, 제2실시예에서는 제1용기에 표준용액과 발광미생물을 수용하고 원심분리를 수행한 후 표준발광량을 측정한다. 마찬가지로 제2용기에는 미생물이 수용된 표준용액에 고체 시료가 포함되어 있는 현탁액을 섞은 후 원심분리를 수행하여 발광량을 측정한다. 앞의 제1실시예에서는 하나의 용기에서 표준발광량과 고체 시료 접촉 후의 발광량을 모두 측정하기 때문에 미생물에 대해서 2번의 원심분리를 수행해야 한다. 그러나 본 발명에서는 동일한 미생물을 사용하되 2개의 용기를 사용하여 각각 한 번씩만 원심분리를 수행함으로써 앞의 제1실시예에 비하여 원심분리의 횟수를 동일하게 할 수 있다는 이점이 있다.
제2실시예에서 도 6의 흐름도에서 설명하지 않은 부분들은 제1실시예와 동일하므로 제1실시예에 대한 설명으로 갈음하기로 한다.
이상에서 설명한 제1실시예와 제2실시예에 따라 생태 독성을 평가할 때, 표준발광량 측정 및 고체 시료 노출 후의 발광량을 측정하기에 앞서 수행하는 원심분리의 속도 및 시간을 서로 동일하게 하는 것이 바람직하다. 원심분리 속도에 따라 미생물의 활성 정도가 다르기 때문에 측정하는 양 시점에 있어서 미생물의 상태를 동일하게 맞추기 위해서는 원심분리의 속도와 시간이 일치해야 하기 때문이다.
본 발명은 첨부된 도면에 도시된 일 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명의 진정한 보호 범위는 첨부된 청구 범위에 의해서만 정해져야 할 것이다.

Claims (10)

  1. (a)표준용액에 발광미생물을 투입하고 일정 시간 경과 뒤에 원심분리를 수행한 후 상기 발광미생물의 표준발광량을 측정하는 단계;
    (b)상기 발광미생물이 투입된 표준용액에 평가 대상이 되는 고체 시료가 혼합된 현탁액을 투입하고 일정 시간 경과 후 상기 고체 시료가 포함된 용액을 원심분리하는 단계; 및
    (c)원심분리 후 상기 발광미생물의 발광량을 측정하여 상기 표준발광량과 비교함으로써 상기 고체 시료의 독성을 평가하는 것을 특징으로 하는 발광미생물을 이용한 고체 시료의 생태 독성 평가방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (a)단계에서 상기 표준발광량을 측정하기에 앞서 수행하는 원심분리 및 상기 (b)단계에서 발광량을 측정하기에 앞서 수행하는 원심분리는 동일한 속도로 수행되는 것을 특징으로 하는 발광미생물을 이용한 고체 시료의 생태 독성 평가방법.
  4. 제1항 또는 제3항에 있어서,
    원심분리는 300~1,000rpm의 속도로 수행하는 것을 특징으로 하는 발광미생물을 이용한 고체 시료의 생태 독성 평가방법.
  5. 제4항에 있어서,
    원심분리는 300~500rpm의 속도로 수행하는 것을 특징으로 하는 발광미생물을 이용한 고체 시료의 생태 독성 평가방법.
  6. (a)제1용기에 담겨 있는 표준용액에 발광미생물을 투입하고 일정 시간 경과 후 상기 발광미생물의 표준발광량을 측정하는 단계;
    (b)제2용기에 담겨 있는 표준용액에 고체 시료를 투입하여 현탁액을 만들고 이 현탁액에 발광미생물을 투입한 후 원심분리하는 단계;
    (c)원심분리 후 상기 발광미생물의 발광량을 측정하여 상기 표준발광량과 비교함으로써 상기 고체 시료의 독성을 평가하는 것을 특징으로 하는 발광미생물을 이용한 고체 시료의 생태 독성 평가방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 (a)단계에서 표준용액을 먼저 원심분리한 후 상기 표준발광량을 측정하는 것을 특징으로 하는 발광미생물을 이용한 고체 시료의 생태 독성 평가방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 (a)단계에서 상기 표준발광량을 측정하기에 앞서 수행하는 원심분리 및 상기 (b)단계에서 발광량을 측정하기에 앞서 수행하는 원심분리는 동일한 속도로 수행되는 것을 특징으로 하는 발광미생물을 이용한 고체 시료의 생태 독성 평가방법.
  9. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    원심분리는 300~1,000rpm의 속도로 수행하는 것을 특징으로 하는 발광미생물을 이용한 고체 시료의 생태 독성 평가방법.
  10. 제9항에 있어서,
    원심분리는 300~500rpm의 속도로 수행하는 것을 특징으로 하는 발광미생물을 이용한 고체 시료의 생태 독성 평가방법.
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