JP6270237B2 - 酸化還元酵素の活性測定方法 - Google Patents
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Description
本発明は、テトラゾリウム塩の存在下でヒドロキシルアミン酸化還元酵素（ＨＡＯ）をヒドロキシルアミンと接触させることを含む、ＨＡＯの活性測定方法に関する。本発明は、ＨＡＯの製造方法にも関する。本発明は、テトラゾリウム塩の存在下でＨＡＯをヒドロキシルアミン及び候補化合物と接触させることを含む、ＨＡＯインヒビターのスクリーニング方法にも関する。本発明は、液体培地格納容器内に隔離して設置された微生物を含む試料格納容器内で、微生物を培養することを含み、微生物を含む試料格納容器は、細孔を有する、微生物の培養方法も提供する。
化学肥料として特に重要な窒素肥料は、アンモニア態窒素（ＮＨ４ +）として農地に過剰投与されている。しかし、その大部分は硝化され、農地からの窒素肥料の流出と温室効果ガス（Ｎ２Ｏ）の生成を招いてしまう。既存の硝化抑制剤には、揮発性のため２０℃以上で使えない、効果が弱い、発がん性や残留毒性があるといった問題があり、これらを解消する新規な硝化抑制剤が期待されている。既存の硝化抑制剤は、アンモニアモノオキシゲナーゼ（ＡＭＯ）をターゲットとしていると考えられる。一方、硝化反応の中心的酵素であるヒドロキシルアミン酸化還元酵素（Hydroxylamine oxidoreductase：ＨＡＯ）をターゲットとする硝化抑制剤はこれまでに知られていない。また、ＨＡＯの活性測定方法は種々知られるが、いずれも感度やコスト面で満足のいくものではなかった。さらに、これまでハイスループットスクリーニングに適用可能なＨＡＯ活性の測定方法は開発されていない。
微生物の培養には、時として困難が伴い、培養時の菌体濃度が最大でもＯＤ６００＝０．１（１０Ｌあたり１ｇ未満）程度となり、大量の培地が必要であるだけでなく、集菌に多大な労力がかかることがあった。これは、土壌、堆肥又は活性汚泥由来の微生物の場合には、特に深刻な問題であった。
H. Maeda, S. Matsu-ura, Y. Yamauchi, H. Ohmori, Resazurin as an electron acceptor in glucose oxidase-catalyzed oxidation of glucose., Chem. Pharm. Bull. 49 (2001) 622-625.
W.J. Maalcke, A. Dietl, S.J. Marritt, J.N. Butt, M.S.M. Jetten, J.T. Keltjens, T.R.M. Barends, B. Kartal, Structural basis of biological NO generation by octaheme oxidoreductases., J. Biol. Chem. 289 (2014) 1228-42.
J. Schalk, S. de Vries, J.G. Kuenen, M.S. Jetten, Involvement of a novel hydroxylamine oxidoreductase in anaerobic ammonium oxidation., Biochemistry. 39 (2000) 5405-12.
本発明の目的は、感度やコスト面で実用的となり、かつ測定が簡便な、ヒドロキシルアミン酸化還元酵素の活性測定方法を提供することにある。また、本発明の目的は、微生物の培養において、培地の準備や集菌にかかる労力を効率的にしつつも、十分に満足できる菌体濃度が得られるような、微生物の培養方法を提供することにもある。さらに、本発明の目的は、多数の酵素を含む試料から、ＨＡＯの活性を簡便、短時間かつ高感度に解析できる新たな手法を提供することにある。
本発明者は鋭意研究の末、テトラゾリウム塩、特にはテトラゾリウム塩のレサズリン塩に対してヒドロキシルアミンを多く存在させた反応系で測定するヒドロキシルアミン酸化還元酵素の活性測定方法を見出し、本発明を完成させるに至った。また、本発明者らは非変性のＨＡＯを含む試料をゲル電気泳動後、ゲル内にて酵素反応させ、その反応生成物を蛍光測定によって可視化させることで、当該酵素の有無や活性の強さを効果的に解析できることを見出し、本願発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明の要旨は以下である。
[１] テトラゾリウム塩の存在下でヒドロキシルアミン酸化還元酵素（ＨＡＯ）をヒドロキシルアミンと接触させることを含む、ＨＡＯの活性測定方法。
[２] テトラゾリウム塩が、レサズリン塩である、[１]記載の測定方法。
[３] テトラゾリウム塩に対するヒドロキシルアミンが、少なくとも３倍量のモル比で接触させる、[１]または[２]記載の測定方法。
[４] テトラゾリウム塩に対するヒドロキシルアミンが、少なくとも５倍量のモル比で接触させる、[１]〜[３]のいずれか一項記載の測定方法。
[５] テトラゾリウム塩に対するヒドロキシルアミンが、少なくとも１０倍量のモル比で接触させる、[１]〜[４]のいずれか一項記載の測定方法。
[６] ｐＨ４．０から８．０で測定する、[１]〜[５]のいずれか一項記載の測定方法。
[７] ｐＨ４．６から７．６で測定する、[１]〜[６]のいずれか一項記載の測定方法。
[８] 測定対象が、土壌、堆肥、活性汚泥又はそれらを非変性状態で電気泳動したポリアクリルアミドゲルである、[１]〜[７]のいずれか一項記載の測定方法。
[９] ＨＡＯを含む試料からＨＡＯを精製することを含み、精製においてＨＡＯが含まれる画分を判別するために[１]〜[８]のいずれか一項記載の測定方法によりＨＡＯの活性を測定する、ＨＡＯの製造方法。
[１０] 精製されたＨＡＯを乾燥することを含む、[９]記載の製造方法。
[１１] テトラゾリウム塩の存在下でＨＡＯをヒドロキシルアミン及び候補化合物と接触させることを含む、ＨＡＯインヒビターのスクリーニング方法。
[１２] 液体培地格納容器内に隔離して設置された微生物を含む試料格納容器内で、微生物を培養することを含み、微生物を含む試料格納容器は、細孔を有する、微生物の培養方法。
[１３] 液体培地と微生物を含む試料の体積比が、１０：１〜１０００：１である、[１２]記載の培養方法。
[１４] 細孔の分画分子量が、５０Ｋ〜１０００ＫＤａである、[１２]または[１３]記載の培養方法。
[１５] 微生物を含む試料格納容器が、透析チューブである、[１２]〜[１４]のいずれか一項記載の培養方法。
[１６] 微生物を含む試料格納容器の封入口が、殺菌されている、[１２]〜[１５]のいずれか一項記載の培養方法。
[１７] 微生物が、難培養性微生物である、[１２]〜[１６]のいずれか一項記載の培養方法。
[１８] 微生物が、ＯＤ６００が０．２以下の濁度で静止期に達する微生物である、[１]〜[１７]のいずれか一項記載の培養方法。
[１] テトラゾリウム塩の存在下でヒドロキシルアミン酸化還元酵素（ＨＡＯ）をヒドロキシルアミンと接触させることを含む、ＨＡＯの活性測定方法。
[２] テトラゾリウム塩が、レサズリン塩である、[１]記載の測定方法。
[３] テトラゾリウム塩に対するヒドロキシルアミンが、少なくとも３倍量のモル比で接触させる、[１]または[２]記載の測定方法。
[４] テトラゾリウム塩に対するヒドロキシルアミンが、少なくとも５倍量のモル比で接触させる、[１]〜[３]のいずれか一項記載の測定方法。
[５] テトラゾリウム塩に対するヒドロキシルアミンが、少なくとも１０倍量のモル比で接触させる、[１]〜[４]のいずれか一項記載の測定方法。
[６] ｐＨ４．０から８．０で測定する、[１]〜[５]のいずれか一項記載の測定方法。
[７] ｐＨ４．６から７．６で測定する、[１]〜[６]のいずれか一項記載の測定方法。
[８] 測定対象が、土壌、堆肥、活性汚泥又はそれらを非変性状態で電気泳動したポリアクリルアミドゲルである、[１]〜[７]のいずれか一項記載の測定方法。
[９] ＨＡＯを含む試料からＨＡＯを精製することを含み、精製においてＨＡＯが含まれる画分を判別するために[１]〜[８]のいずれか一項記載の測定方法によりＨＡＯの活性を測定する、ＨＡＯの製造方法。
[１０] 精製されたＨＡＯを乾燥することを含む、[９]記載の製造方法。
[１１] テトラゾリウム塩の存在下でＨＡＯをヒドロキシルアミン及び候補化合物と接触させることを含む、ＨＡＯインヒビターのスクリーニング方法。
[１２] 液体培地格納容器内に隔離して設置された微生物を含む試料格納容器内で、微生物を培養することを含み、微生物を含む試料格納容器は、細孔を有する、微生物の培養方法。
[１３] 液体培地と微生物を含む試料の体積比が、１０：１〜１０００：１である、[１２]記載の培養方法。
[１４] 細孔の分画分子量が、５０Ｋ〜１０００ＫＤａである、[１２]または[１３]記載の培養方法。
[１５] 微生物を含む試料格納容器が、透析チューブである、[１２]〜[１４]のいずれか一項記載の培養方法。
[１６] 微生物を含む試料格納容器の封入口が、殺菌されている、[１２]〜[１５]のいずれか一項記載の培養方法。
[１７] 微生物が、難培養性微生物である、[１２]〜[１６]のいずれか一項記載の培養方法。
[１８] 微生物が、ＯＤ６００が０．２以下の濁度で静止期に達する微生物である、[１]〜[１７]のいずれか一項記載の培養方法。
本発明により、従来には知られていなかった微量高感度、低価格かつホモジニアスアッセイが可能なＨＡＯの活性測定方法が提供される。本発明によるＨＡＯの活性測定方法は、ハイスループットスクリーニングに適し、生菌から直接検出することも、土壌等の試料から直接検出することも、非変性ポリアクリルアミド電気泳動ゲルから直接検出することも可能である。本発明によるＨＡＯの活性測定は、通常の酸素の存在下でも可能であり、リアルタイム測定も可能である上に、蛍光測定をすればより高い感度が得られる。本発明によるＨＡＯの活性測定方法では、ＰＭＳのような電子キャリアーが不要である。本発明によれば、難培養性微生物、特には土壌、堆肥又は活性汚泥中の微生物を効果的に培養することもできる。本発明によるＨＡＯの製造方法は、硫安分画を行わないため、精製時間が大幅に短縮され、スケールアップが容易となる。そして、本発明により得られるＨＡＯは、長期保存が可能である。ＨＡＯを有するアンモニア酸化細菌を含む培養液などを解析すれば、サンプル中のＨＡＯの活性を定量することができる。さらに、これらのサンプルに対してＨＡＯ阻害剤としての候補化合物をあらかじめ処理すれば、候補化合物のＨＡＯ阻害効果を簡便に解析することができる。
本発明は、テトラゾリウム塩の存在下でヒドロキシルアミン酸化還元酵素（ＨＡＯ）をヒドロキシルアミンと接触させることを含む、ＨＡＯの活性測定方法を提供する。
本発明のＨＡＯの活性測定方法は、テトラゾリウム塩、好ましくはテトラゾリウム塩のレサズリン塩の吸光度の変化または蛍光物質への変化を検出する。
本発明のＨＡＯの活性測定方法では、テトラゾリウム塩、好ましくはレサズリン塩に対して、ヒドロキシルアミンを少なくとも３倍量、好ましくは５倍量、さらに好ましくは１０倍量（モル比）存在させた反応系で測定する。
本発明のＨＡＯの活性測定方法では、ｐＨ４．０から８．０で測定するとよい。好ましくは、シグナルバックグラウンド比が２以上となるため、ｐＨ４．６から７．６で測定するとよい。緩衝液は、クエン酸−リン酸緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液などから選択することができる。バッファーとｐＨを変えるとＨＡＯ活性（初速）が変わるため、実験目的によってそれら条件を選択することができる。例えば、１５分程度で最大蛍光強度に達するＨＡＯ活性が最も高い条件は、迅速な測定やＨＡＯ濃度が低い場合の測定に適している。そのため、ＨＡＯ精製時のＨＡＯ画分の確認のような、厳密な定量性は不要だが、迅速な測定が必要な工程に適した測定条件となる。この条件として、ｐＨ約５．６におけるリン酸カリウム緩衝液及びクエン酸−リン酸緩衝液、またはｐＨ約６．８におけるＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液及びＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液などが利用できる。一方、２〜３時間程度で最大感度に達するようなＨＡＯ活性が比較的低い条件では、数分程度のインキュベーション時間の誤差が無視できる。そのため、薬剤スクリーニングなどのように、大量のアッセイを並列で行い、なおかつアッセイ間のブレを抑える事が必要な工程に適した測定条件となる。この条件として、ｐＨ７．０付近のリン酸カリウム緩衝液などが利用できる。
本発明のＨＡＯの活性測定方法では、試料は細菌群集を含む固形物や液体、好ましくは土壌、堆肥又は活性汚泥であってもよく、それらに含まれるＨＡＯの活性を直接測定することもできる。活性汚泥とは、微生物が豊富に存在する浮遊性汚泥を含む浄化処理中の汚水の事であり、汚泥と汚水の両方を意味する。本発明の活性測定方法は、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離された、多数のタンパク質のバンドから、ＨＡＯ特異的に蛍光染色することが可能である。非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動では、ゲル中で活性を保持したままＨＡＯが分離される。このゲル中のＨＡＯをテトラゾリウム塩の存在下でヒドロキシルアミンと接触させることで、テトラゾリウム塩を蛍光物質へ変化させる。さらにゲルイメージャー光源と蛍光観察用フィルターを用いることにより、ゲル中の蛍光物質を高感度で検出できる。これにより、励起光源として青色光（４４０−５００nm）が使用可能であり、より好ましくはシアン色光（波長４８０−５３０ｎｍ)であり、さらに好ましくは緑色光（４９０−５８０nm）が使用可能である。蛍光観察用フィルターとしてオレンジフィルターが使用可能である。電気泳動の手法としては、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法である、ネイティブ−ＰＡＧＥやブルーネイティブ−ＰＡＧＥなどが利用できる。電気泳動に供するサンプルとしては、精製されたＨＡＯ、 菌体の破砕上清、土壌サンプル、活性汚泥など、およびそれらにＨＡＯ阻害剤を添加したサンプルでよい。あらかじめ濃度または活性が知られている精製ＨＡＯをマーカーとして用いれば、ＨＡＯ活性の簡易定量もできる。
本発明のＨＡＯの活性測定方法は、ハイスループットスクリーニングに適用可能であり、硝化反応の中心的酵素であるＨＡＯのインヒビターをスクリーニングすることができる。
本発明はまた、液体培地格納容器内に隔離して設置された微生物を含む試料格納容器内で、微生物を培養することを含み、微生物を含む試料格納容器は、細孔を有する、微生物の培養方法を提供する。
本発明による微生物の培養方法では、液体培地と微生物を含む試料との体積比が、１０：１〜１０００：１、好ましくは１００：１〜８００：１、より好ましくは２００：１〜６００：１、最も好ましくは４００：１であればよい。
本発明による微生物の培養方法では、液体培地格納容器は、１〜５０Ｌ、好ましくは３〜３０Ｌ、より好ましくは２０Ｌのボトルであればよいが、これらに制限されず、液体培地格納容器のスケールアップ及び微生物を含む試料格納容器のスケールアップが容易であることを特徴とする。微生物を含む試料格納容器は、いかなる形状であってもよいが、例えば筒、チューブ、皿状などであり、好ましくはチューブである。微生物を含む試料格納容器は、細孔を有し、細孔は、培地成分の交換不足による増殖抑制を起こしにくくするためには５０ＫＤａ以上、微生物を通過させないためには１０００ＫＤａ以下の分画分子量（ＭＷＣＯ）である。微生物を含む試料格納容器は、好ましくはそのような分画分子量を有する透析チューブである。微生物を含む試料格納容器の封入口は、殺菌されていることが好ましい。
本発明による微生物の培養方法では、Journal of Environmental Biotechnology（環境バイオテクノロジー学会誌）Vol.7, No.2, 69-73, 2007に記載されているような難培養微生物、さらに詳しくは非常に低い濁度（ＯＤ６００が０．２以下）の細胞数レベルで静止期に達する難培養微生物を培養することができる。そのような微生物は例えばアンモニア酸化細菌、アンモニア酸化古細菌又は亜硝酸酸化細菌、鉄還元細菌、硫黄還元菌、アナモックス菌であり、アンモニア酸化細菌の例としてはNitrosomonas属、Nitrosococcus属、Nitrosospira属などが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明による微生物の培養方法を用いれば、難培養微生物であっても微生物を効果的に培養することができ、菌体回収の際に培地の遠心分離の手間が格段に簡素化できる。特には、本発明による微生物の培養方法を用いれば、ヒドロキシルアミン酸化還元酵素（ＨＡＯ）を効果的に製造することができる。
本発明のＨＡＯの製造方法は、ＨＡＯを含む試料からＨＡＯを精製することを含み、精製においてＨＡＯが含まれる画分を判別するためにＨＡＯの活性を測定する工程を含んでよい。ＨＡＯの活性を測定する工程は、好ましくは本発明のＨＡＯの活性測定方法を適用してもよいが、これに限定されない。
本発明のＨＡＯの製造方法は、例えば、本発明の微生物の培養方法により微生物を培養し、ＨＡＯを含む微生物の菌体を破砕した後、上清画分をカラムにかけ、ＨＡＯの活性を測定する方法を用いてＨＡＯを含む画分を検出し、必要に応じてさらに低酸素濃度条件下でカラムにかける工程を含む。本発明のＨＡＯの製造方法で用いられるカラムとしては、陰イオン交換カラム、ゲルろ過カラム、ハイドロキシアパタイトカラム、強陰イオン交換カラム、強陽イオン交換カラムなどが挙げられるが、これらに限定されない。ＨＡＯの製造は、好ましくは低酸素濃度条件下、より好ましくは０．５％以下の酸素濃度条件下で行われる。
本発明のＨＡＯの製造方法は、保存のために精製されたＨＡＯを乾燥する工程を含んでもよい。
次に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例に限定されるものではない。
１． ＨＡＯの製造
ヒドロキシルアミン酸化還元酵素を製造した。ＨＡＯはアンモニア酸化細菌から精製し、溶液状態または乾燥後に低酸素濃度条件下で保存した。
ヒドロキシルアミン酸化還元酵素を製造した。ＨＡＯはアンモニア酸化細菌から精製し、溶液状態または乾燥後に低酸素濃度条件下で保存した。
１．１ 微生物の培養
１．１．１ 菌株
以下５種のアンモニア酸化細菌を利用した。
菌株１：Nitrosomonas europaea NBRC14298 (NBRC*1より購入)
菌株２：Nitrosococcus oceani ATCC19707 (米国ATCC*2より購入)
菌株３：Nitrosomonas sp. NBRC108559 (NBRCより購入)
菌株４：Nitrosomonas cryotolerans ATCC49181 (ATCCより購入)
菌株５：Nitrosospira multiformis ATCC25196 (ATCCより購入)
*1NBRC:独立行政法人製品評価基盤研究機構バイオテクノロジーセンター
*2ATCC: American type culture collection
１．１．１ 菌株
以下５種のアンモニア酸化細菌を利用した。
菌株１：Nitrosomonas europaea NBRC14298 (NBRC*1より購入)
菌株２：Nitrosococcus oceani ATCC19707 (米国ATCC*2より購入)
菌株３：Nitrosomonas sp. NBRC108559 (NBRCより購入)
菌株４：Nitrosomonas cryotolerans ATCC49181 (ATCCより購入)
菌株５：Nitrosospira multiformis ATCC25196 (ATCCより購入)
*1NBRC:独立行政法人製品評価基盤研究機構バイオテクノロジーセンター
*2ATCC: American type culture collection
１．１．２ 培地
使用した培地の組成は、以下の通りであった。
１．１．２．１ 培地１
菌株１：Nitrosomonas europaea NBRC14298
菌株５：Nitrosospira multiformis ATCC25196
の培養に使用する培地
使用した培地の組成は、以下の通りであった。
１．１．２．１ 培地１
菌株１：Nitrosomonas europaea NBRC14298
菌株５：Nitrosospira multiformis ATCC25196
の培養に使用する培地
水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨ７．８に調製後、オートクレーブした。
１．１．２．２ 培地２（人工海水培地）
菌株２：Nitrosococcus oceani ATCC19707
菌株４：Nitrosomonas cryotolerans ATCC49181
の培養に使用する培地
菌株２：Nitrosococcus oceani ATCC19707
菌株４：Nitrosomonas cryotolerans ATCC49181
の培養に使用する培地
水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨ７．８に調製後、オートクレーブした。
１．１．２．３ 培地３（NBRC medium 1201）
菌株３：Nitrosomonas sp. NBRC108559
の培養に使用する培地
菌株３：Nitrosomonas sp. NBRC108559
の培養に使用する培地
水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨ７．８に調製後、オートクレーブした。
１．１．２．４ トレースエレメント混合用液（微量元素溶液）
以下成分を純水１Ｌに溶解させた。
以下成分を純水１Ｌに溶解させた。
１．１．３ 培養方法
微生物は、通常の培養方法と、本発明による透析チューブを利用した培養方法の２通りで培養した。透析チューブ法では、１００ｍＬの培地に菌体を懸濁し、そこから５０ｍＬをとって、５０ｍＬ透析チューブに封入し、チューブを２０Ｌの培地に沈めて培養した。この方法によれば、培養時間は長くなるが、大量の培地の遠心分離による菌体回収が不要になった。
微生物は、通常の培養方法と、本発明による透析チューブを利用した培養方法の２通りで培養した。透析チューブ法では、１００ｍＬの培地に菌体を懸濁し、そこから５０ｍＬをとって、５０ｍＬ透析チューブに封入し、チューブを２０Ｌの培地に沈めて培養した。この方法によれば、培養時間は長くなるが、大量の培地の遠心分離による菌体回収が不要になった。
１．１．３．１ 前培養
各菌株を、菌株に適した３０ｍＬの培地を入れた、換気フィルター付５０ｍＬプラスチック試験管（バイオリアクターチューブ、TPP社）にて培養した。アンモニア酸化細菌は亜硝酸を分泌するため、増殖に伴いｐＨが低下し、ｐＨ６程度になると定常状態となり増殖が停止する。そのため、培地中に含まれるｐＨ指示薬のフェノールレッドが黄色（ｐＨ６．０付近）になるまで１週間程度培養した。
各菌株を、菌株に適した３０ｍＬの培地を入れた、換気フィルター付５０ｍＬプラスチック試験管（バイオリアクターチューブ、TPP社）にて培養した。アンモニア酸化細菌は亜硝酸を分泌するため、増殖に伴いｐＨが低下し、ｐＨ６程度になると定常状態となり増殖が停止する。そのため、培地中に含まれるｐＨ指示薬のフェノールレッドが黄色（ｐＨ６．０付近）になるまで１週間程度培養した。
１．１．３．２ 透析チューブを用いない通常の培養方法
透析チューブを用いない通常の培養では、前培養された３０ｍＬの培養液を２０Ｌ培地入りの２０Ｌプラスチックボトル（Nalgene クリアボーイ：サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に入れ、培養を行った。培養は、オートクレーブ済みベントフィルター（Millex-FG:ミリポア社）を通した空気をエアーポンプで毎分２．５Ｌ送り込み、室温２６℃の部屋にて行った。１週間後、培地中のｐＨ指示薬が黄色（ｐＨ６．０）になったため、培養を終了した。培養液は５００ｍＬのプラスチック遠沈管に移し、７, ０００ｇの遠心分離を複数回行ない集菌した。集菌した菌体は、培地を完全に除去後に５０ｍＬプラスチック試験管に入れ、窒素ガスを封入し低酸素濃度条件にした後、酵素精製作業を行うまで−８０℃のフリーザーで保存した。各菌の菌体量は、２０Ｌの培地あたり１〜２ｇ程度であった。
透析チューブを用いない通常の培養では、前培養された３０ｍＬの培養液を２０Ｌ培地入りの２０Ｌプラスチックボトル（Nalgene クリアボーイ：サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に入れ、培養を行った。培養は、オートクレーブ済みベントフィルター（Millex-FG:ミリポア社）を通した空気をエアーポンプで毎分２．５Ｌ送り込み、室温２６℃の部屋にて行った。１週間後、培地中のｐＨ指示薬が黄色（ｐＨ６．０）になったため、培養を終了した。培養液は５００ｍＬのプラスチック遠沈管に移し、７, ０００ｇの遠心分離を複数回行ない集菌した。集菌した菌体は、培地を完全に除去後に５０ｍＬプラスチック試験管に入れ、窒素ガスを封入し低酸素濃度条件にした後、酵素精製作業を行うまで−８０℃のフリーザーで保存した。各菌の菌体量は、２０Ｌの培地あたり１〜２ｇ程度であった。
１．１．３．３ 透析チューブを用いた培養方法
前培養された少量の菌体を透析チューブに封入した後、大量の培地が入った大型ボトルにて継続的に培養した。具体的には、以下の通りに行った。
前培養された少量の菌体を透析チューブに封入した後、大量の培地が入った大型ボトルにて継続的に培養した。具体的には、以下の通りに行った。
前培養した３０ｍＬ程度の培地中の菌体を、７,０００ｇの遠心分離によって回収し、５０ｍＬの新しい培地に再懸濁した。再懸濁した菌体は、オートクレーブ滅菌済みの透析チューブ（Spectra/Pore(R)6 Dialysis Membrane MWCO:50 kD: SPECTRUM社）に入れ、オートクレーブ滅菌済みの透析チューブ用クリップ（SPECTRUM社）で封入した。また、封入口付近に付着した菌が外部の培地中で増殖するのを防止するために、封入口を殺菌用エタノール（和光純薬工業社）及びイソジンスクラブ（Meiji Seika ファルマ社）にて殺菌した。
菌体が封入された透析チューブを２０Ｌ培地入りの２０Ｌプラスチックボトル（Nalgene クリアボーイ：サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に入れ、培養を行った。培養は、オートクレーブ済みベントフィルター（Millex-FG:ミリポア社）を通した空気をエアーポンプで毎分２．５Ｌ送り込み、室温２６℃の部屋にて行った。３週間後、培地中のｐＨ指示薬が黄色（ｐＨ６．０）になったため、培養を終了し、透析チューブの中から菌体を含む培養液を回収した。培養液を５０ｍＬのプラスチック遠沈管に移し、１５分間の７, ０００ｇの遠心分離にて集菌した。菌体ペレットが入った遠沈管に窒素ガスを封入し、低酸素濃度条件にした後、酵素精製作業を行うまで−８０℃のフリーザーで冷凍保存した。各菌の菌体量は、２０Ｌの培地あたり１〜２ｇ程度であった。
前記透析チューブを用いた培養により、６時間以上かかっていた２０Ｌの培地から集菌する手間をなくし、雑菌のコンタミリスクを低減することが可能となった。透析チューブ内の約５０ｍＬの培地からの集菌は、５０ｍＬのプラスチック遠沈管を使用して、２０分間７，０００ｇで遠心分離することにより行った。透析チューブを利用した培養の場合は、集菌せずに新しい培地に移すことにより、培養をつづけることも可能であった。また、透析チューブを用いた培養により、増殖が遅いため雑菌がコンタミしやすく、また浮遊しやすく集菌が難しいアンモニア酸化細菌を、格段に効率よく培養でき、回収することができた。
１．２ ＨＡＯの精製
１．２．１ 破砕と上清画分の回収
凍結保存されていた約１ｇの菌体を流水で溶解後、５０ｍＬのバッファーＡ（ｐＨ７．５、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液)に懸濁した。懸濁液を、超音波破砕器（UD-201, トミー社）にてＯＵＴＰＵＴ ５．５、ＤＵＴＹ ５０にて １５分間破砕した。破砕液を、４０，０００ｇで３０分間の遠心分離を行った。ＨＡＯが含まれる上清画分を３５ｍＬ回収した。
１．２．１ 破砕と上清画分の回収
凍結保存されていた約１ｇの菌体を流水で溶解後、５０ｍＬのバッファーＡ（ｐＨ７．５、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液)に懸濁した。懸濁液を、超音波破砕器（UD-201, トミー社）にてＯＵＴＰＵＴ ５．５、ＤＵＴＹ ５０にて １５分間破砕した。破砕液を、４０，０００ｇで３０分間の遠心分離を行った。ＨＡＯが含まれる上清画分を３５ｍＬ回収した。
１．２．２ 陰イオン交換カラム精製
バッファーＡで平衡化された５ｍＬのＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ (GE healthcare社)を直列に３本つなげたカラムに上清画分を添加した。次に、バッファーＡとバッファーＢ（ｐＨ７．５、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液、１Ｍ塩化ナトリウム）を用いて、０〜５００ｍＭの塩化ナトリウム濃度のリニアグラジェントにより溶出を行った。溶出液の分画は３ｍＬずつ行った。ＨＡＯを含む画分を検出し、約１０ｍＬの溶液を回収した。ＨＡＯを含む画分の検出は、後述の１．２．７に記載の方法で行った。
バッファーＡで平衡化された５ｍＬのＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ (GE healthcare社)を直列に３本つなげたカラムに上清画分を添加した。次に、バッファーＡとバッファーＢ（ｐＨ７．５、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液、１Ｍ塩化ナトリウム）を用いて、０〜５００ｍＭの塩化ナトリウム濃度のリニアグラジェントにより溶出を行った。溶出液の分画は３ｍＬずつ行った。ＨＡＯを含む画分を検出し、約１０ｍＬの溶液を回収した。ＨＡＯを含む画分の検出は、後述の１．２．７に記載の方法で行った。
１．２．３ ゲルろ過カラム精製
回収した陰イオンカラム溶出画分を、バッファーＢ (ｐＨ７．０、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液、１５０ｍＭ塩化ナトリウム)で平衡化されたゲルろ過カラムＨｉＬｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ (GE healthcare社）に添加した。次にバッファーＢを１．５ｍＬ／分で送液し、溶出させた。溶出液の分画は３ｍＬずつ行った。ＨＡＯを含む溶出画分を１２ｍＬ回収した。
回収した陰イオンカラム溶出画分を、バッファーＢ (ｐＨ７．０、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液、１５０ｍＭ塩化ナトリウム)で平衡化されたゲルろ過カラムＨｉＬｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ (GE healthcare社）に添加した。次にバッファーＢを１．５ｍＬ／分で送液し、溶出させた。溶出液の分画は３ｍＬずつ行った。ＨＡＯを含む溶出画分を１２ｍＬ回収した。
１．２．４ ハイドロキシアパタイトカラム
回収したゲルろ過カラム溶出画分を、５ｍＬのＣＨＴ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ担体（Ｔｙｐｅ Ｉ、粒子径２０μｍ、BioRad社)が充填され、バッファーＣ（ｐＨ７．５、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液）で平衡化された内径１ｃｍのカラムに添加した。次に、バッファーＣとバッファーＤ (ｐＨ７．５、５００ｍＭリン酸カリウム緩衝液)を用いて、２０〜５００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液のリニアグラジェントにより溶出を行った。溶出液の分画は２ｍＬずつ行った。ＨＡＯを含む画分を１２ｍＬ回収した。
回収したゲルろ過カラム溶出画分を、５ｍＬのＣＨＴ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ担体（Ｔｙｐｅ Ｉ、粒子径２０μｍ、BioRad社)が充填され、バッファーＣ（ｐＨ７．５、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液）で平衡化された内径１ｃｍのカラムに添加した。次に、バッファーＣとバッファーＤ (ｐＨ７．５、５００ｍＭリン酸カリウム緩衝液)を用いて、２０〜５００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液のリニアグラジェントにより溶出を行った。溶出液の分画は２ｍＬずつ行った。ＨＡＯを含む画分を１２ｍＬ回収した。
１．２．５ 強陰イオン交換カラム、または強陽イオン交換カラム
ハイドロキシアパタイトカラムの溶出画分を、バッファーＡで平衡化された強陰イオン交換カラムのＭｏｎｏＱ １０／１０ ＧＬ（GE healthcare社）に添加した。溶出は、バッファーＡとバッファーＢを用い、０〜５００ｍＭの塩化ナトリウム濃度のリニアグラジェントにて行った。溶出液の分画は２ｍＬずつ行った。最終的に、ＨＡＯを含む画分を１２ｍＬ回収した。なお、Nitrosospira multiformis由来ＨＡＯのみＭｏｎｏＱには吸着されなかったため、強陽イオン交換カラムのＭｏｎｏＳ １０／１００ ＧＬ (GE healthcare社）を利用した。
ハイドロキシアパタイトカラムの溶出画分を、バッファーＡで平衡化された強陰イオン交換カラムのＭｏｎｏＱ １０／１０ ＧＬ（GE healthcare社）に添加した。溶出は、バッファーＡとバッファーＢを用い、０〜５００ｍＭの塩化ナトリウム濃度のリニアグラジェントにて行った。溶出液の分画は２ｍＬずつ行った。最終的に、ＨＡＯを含む画分を１２ｍＬ回収した。なお、Nitrosospira multiformis由来ＨＡＯのみＭｏｎｏＱには吸着されなかったため、強陽イオン交換カラムのＭｏｎｏＳ １０／１００ ＧＬ (GE healthcare社）を利用した。
１．２．６ 酸素に弱いＨＡＯを失活させずに低酸素濃度条件で精製するための工夫
Nitrosomonas europaea及びNitrosococcus oceani以外の菌由来のＨＡＯは、酸素に非常に弱く、２〜３日かかる精製中にその大部分が失活してしまうため、低酸素濃度条件で精製する必要があった。Nitrosomonas europaea及びNitrosococcus oceaniも低酸素濃度条件で精製することで活性の保持が期待できるため、これらも同様に精製を行った。
Nitrosomonas europaea及びNitrosococcus oceani以外の菌由来のＨＡＯは、酸素に非常に弱く、２〜３日かかる精製中にその大部分が失活してしまうため、低酸素濃度条件で精製する必要があった。Nitrosomonas europaea及びNitrosococcus oceaniも低酸素濃度条件で精製することで活性の保持が期待できるため、これらも同様に精製を行った。
すべての緩衝液類は、事前に１時間以上窒素ガスを通気することにより脱気を行い、低酸素濃度条件にした。通気に用いた窒素ガスは、低濃度酸素モニターJKO-O2 Ver.3（ジコー社）で検出限界の０．００％の値を示した（以後、酸素濃度０．０１％以下と表記）。脱気したバッファー類は、溶存酸素計（MultiLine 3410型 光学式DO電極 FDO925型付, WTW社）にて検出限界の０．０１ｍｇ／ｍｌ以下になっていることを確認した。
精製中は、クロマトグラフィーシステムのフラクションコレクターにビニール袋をかぶせ、そこに窒素ガスを常に流すことで低酸素濃度条件を保ったまま精製を行った。ビニール袋内の酸素濃度は０．０１％以下であった。さらに、脱気済み緩衝液が入ったガラス瓶にも窒素ガスを常時送り込むことで、酸素が溶け込むのを防止し、低酸素濃度条件を保った。各クロマトステップが終わったら、フラクションチューブに窒素ガスを吹き付けながら、低酸素濃度条件下でサンプル採取を行い、直ちにフタをした。
１．２．７ 各精製ステップにおいてＨＡＯが含まれる画分を判別する方法
ＨＡＯの精製には、クロマトグラフィーシステムのＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅ (GE healthcare社)を用いた。ＨＡＯを含む画分の判別は、ＡＫＴＡによる３波長の吸光測定｛２８０ｎｍ (タンパク質)、４０９ｎｍ（ヘム）、４６３ ｎｍ (ＨＡＯ特有のヘムＰ４６０）｝、レサズリン法によるＨＡＯ蛍光活性測定(ｐＨ５．６のリン酸クエン酸緩衝液を使用)、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるバンド確認を併用して行った。
ＨＡＯの精製には、クロマトグラフィーシステムのＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅ (GE healthcare社)を用いた。ＨＡＯを含む画分の判別は、ＡＫＴＡによる３波長の吸光測定｛２８０ｎｍ (タンパク質)、４０９ｎｍ（ヘム）、４６３ ｎｍ (ＨＡＯ特有のヘムＰ４６０）｝、レサズリン法によるＨＡＯ蛍光活性測定(ｐＨ５．６のリン酸クエン酸緩衝液を使用)、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるバンド確認を併用して行った。
１．３ ＨＡＯの保存法
１．３．１ 溶液による保存（短期保存）
酸素濃度０．０１％以下のグローブボックス中で、Ｏ−リング付きの１．５ｍＬスクリューキャップチューブ（深江化成社）に保存した。
１．３．１ 溶液による保存（短期保存）
酸素濃度０．０１％以下のグローブボックス中で、Ｏ−リング付きの１．５ｍＬスクリューキャップチューブ（深江化成社）に保存した。
１．３．２ 乾燥による保存（長期保存）
５ｎＭのＨＡＯ溶液（バッファーＢ）を３８４穴マイクロプレート(Greiner bio-one社)の各ウェルに０．１μＬずつスポットし、室温で自然乾燥させた。１日程度常温で放置した後、後述の蛍光法で活性を測定したところ、乾燥前にくらべ８０％程度の活性が残っていた。乾燥後は、プレートにアルミシートを張り、低温で保存すれば長期保存が可能であった。すべての操作は、酸素濃度が０．０１％以下の低酸素濃度条件下のグローブボックス内で行った。
５ｎＭのＨＡＯ溶液（バッファーＢ）を３８４穴マイクロプレート(Greiner bio-one社)の各ウェルに０．１μＬずつスポットし、室温で自然乾燥させた。１日程度常温で放置した後、後述の蛍光法で活性を測定したところ、乾燥前にくらべ８０％程度の活性が残っていた。乾燥後は、プレートにアルミシートを張り、低温で保存すれば長期保存が可能であった。すべての操作は、酸素濃度が０．０１％以下の低酸素濃度条件下のグローブボックス内で行った。
２ ＨＡＯ蛍光活性測定法（レサズリン法）
２．１ 試薬調製法
測定のために長期保存可能な３種のストック溶液を調製した。
２．１ 試薬調製法
測定のために長期保存可能な３種のストック溶液を調製した。
２．１．１ ４倍希釈用の基質（ヒドロキシルアミン）のストック溶液調製
超純水を用い４ｍＭ 塩酸ヒドロキシルアミン溶液（東京化成工業社）を調製し、１０ｍＬずつ１５ｍＬサイズのプラスチックチューブに分注した。このとき、超純水は事前に十分脱気し、作業は低酸素濃度条件下のグローブボックス内（酸素濃度０．０１％以下）で行った。調製済みの溶液は、−８０℃で冷凍保存した。
超純水を用い４ｍＭ 塩酸ヒドロキシルアミン溶液（東京化成工業社）を調製し、１０ｍＬずつ１５ｍＬサイズのプラスチックチューブに分注した。このとき、超純水は事前に十分脱気し、作業は低酸素濃度条件下のグローブボックス内（酸素濃度０．０１％以下）で行った。調製済みの溶液は、−８０℃で冷凍保存した。
２．１．２ ４倍希釈用の電子受容体のテトラゾリウム塩（レサズリン塩）のストック溶液調製
前述のヒドロキシルアミンと同様に、４００μＭレサズリンナトリウム溶液（和光純薬工業社）を調製した。作業は低酸素濃度条件下のグローブボックス内（酸素濃度０．０１％以下）で行った。−８０℃で冷凍保存した。
前述のヒドロキシルアミンと同様に、４００μＭレサズリンナトリウム溶液（和光純薬工業社）を調製した。作業は低酸素濃度条件下のグローブボックス内（酸素濃度０．０１％以下）で行った。−８０℃で冷凍保存した。
２．１．３ ２倍希釈用の緩衝液のストック溶液調製
測定用緩衝液（１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、３００ｍＭ塩化ナトリウム）を調製した。作業は低酸素濃度条件下のグローブボックス内（酸素濃度０．０１％以下）で行った。調製済みの溶液は、４℃で保存した。ＨＡＯインヒビターのスクリーニング用にはｐＨ７．０の緩衝液を、ＨＡＯ精製時のＨＡＯを含む画分の確認用および土壌ダイレクトＨＡＯ活性測定用にはｐＨ５．６の緩衝液を用意した。
測定用緩衝液（１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、３００ｍＭ塩化ナトリウム）を調製した。作業は低酸素濃度条件下のグローブボックス内（酸素濃度０．０１％以下）で行った。調製済みの溶液は、４℃で保存した。ＨＡＯインヒビターのスクリーニング用にはｐＨ７．０の緩衝液を、ＨＡＯ精製時のＨＡＯを含む画分の確認用および土壌ダイレクトＨＡＯ活性測定用にはｐＨ５．６の緩衝液を用意した。
２．２ 活性測定の実施法
３８４穴マイクロプレート（MICROPLATE, 384 WELL, NON-BINDING, F-BOTTOM, BLACK, Greiner Bio-One社）と、分注装置搭載型モノクロメーター式マイクロプレートリーダー（infinite M1000 PRO: テカン社）を利用して測定した。
３８４穴マイクロプレート（MICROPLATE, 384 WELL, NON-BINDING, F-BOTTOM, BLACK, Greiner Bio-One社）と、分注装置搭載型モノクロメーター式マイクロプレートリーダー（infinite M1000 PRO: テカン社）を利用して測定した。
２．２．１ ストック溶液の混合と分注
液量は、１アッセイ１００μＬで３８４穴全面を使用した。プレート１枚分で、３８．４ｍＬ分のアッセイ溶液が必要であった。まず、４倍希釈用のテトラゾリウム塩のストック溶液１０ｍＬ、２倍希釈用の緩衝液のストック溶液２０ｍＬ、５μＭのＨＡＯ溶液４００μＬをゆっくり混和した。この時、ＨＡＯ溶液だけではなく、プレート上で乾燥保存されているＨＡＯも利用可能である。混合液は、１６チャンネル電動ピペット(VIAFLO II 125 μL, INTEGRA社)を使用して、７５μＬずつ３８４穴マイクロプレートの各ウェルに分注した。
液量は、１アッセイ１００μＬで３８４穴全面を使用した。プレート１枚分で、３８．４ｍＬ分のアッセイ溶液が必要であった。まず、４倍希釈用のテトラゾリウム塩のストック溶液１０ｍＬ、２倍希釈用の緩衝液のストック溶液２０ｍＬ、５μＭのＨＡＯ溶液４００μＬをゆっくり混和した。この時、ＨＡＯ溶液だけではなく、プレート上で乾燥保存されているＨＡＯも利用可能である。混合液は、１６チャンネル電動ピペット(VIAFLO II 125 μL, INTEGRA社)を使用して、７５μＬずつ３８４穴マイクロプレートの各ウェルに分注した。
２．２．２ 基質の添加と測定
基質以外の試薬が分注された３８４穴マイクロプレートを、プレートリーダーに挿入した。まず、プレートリーダーに備え付けられたインジェクターによって、基質である４倍希釈用のヒドロキシルアミンストック溶液を全ウェルに２５μＬずつ添加し、反応系において、レサズリンに対するヒドロキルアミンを１０倍量（モル比）とした。その後、ただちに蛍光測定を開始した(励起波長４６２ｎｍ：波長幅２０ｎｍ、測定波長４８２ｎｍ：波長幅 ２０ｎｍ)。測定はカイネティックスモードで行い、全ウェルを１分毎に１回測定し、それを５時間続けた。測定は常温で行った。測定値は、２時間程度で最大蛍光強度に達した。活性の比較には、酵素活性の初速、または２時間未満の時点での活性値が利用可能であった。
基質以外の試薬が分注された３８４穴マイクロプレートを、プレートリーダーに挿入した。まず、プレートリーダーに備え付けられたインジェクターによって、基質である４倍希釈用のヒドロキシルアミンストック溶液を全ウェルに２５μＬずつ添加し、反応系において、レサズリンに対するヒドロキルアミンを１０倍量（モル比）とした。その後、ただちに蛍光測定を開始した(励起波長４６２ｎｍ：波長幅２０ｎｍ、測定波長４８２ｎｍ：波長幅 ２０ｎｍ)。測定はカイネティックスモードで行い、全ウェルを１分毎に１回測定し、それを５時間続けた。測定は常温で行った。測定値は、２時間程度で最大蛍光強度に達した。活性の比較には、酵素活性の初速、または２時間未満の時点での活性値が利用可能であった。
３ 蛍光活性測定法の応用
３．１ ＨＡＯインヒビタースクリーニングへの適用
３．１．１ 試薬条件の検討
レサズリン法によるＨＡＯ蛍光活性測定をＨＡＯインヒビターのスクリーニングに用いることを検討した。具体的には、化合物の溶媒として多用されるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）濃度、化合物の非特異的阻害の原因となるケミカルアグリゲーション防止のための界面活性剤濃度を検討した。前述の活性測定法に沿い、ストック溶液の混合時に同時にこれらの添加物類も混合することにより検討した。その結果、一般的に使われる０．０３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００（界面活性剤）では、特に蛍光測定の妨害効果は見られなかった。しかし、ＤＭＳＯは、その濃度と比例して顕著な蛍光の低下が見られたが、０．５％程度のＤＭＳＯ濃度であれば、十分な測定（ＤＭＳＯなしの場合に比べて半分程度の活性値）が可能である事がわかった。
３．１ ＨＡＯインヒビタースクリーニングへの適用
３．１．１ 試薬条件の検討
レサズリン法によるＨＡＯ蛍光活性測定をＨＡＯインヒビターのスクリーニングに用いることを検討した。具体的には、化合物の溶媒として多用されるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）濃度、化合物の非特異的阻害の原因となるケミカルアグリゲーション防止のための界面活性剤濃度を検討した。前述の活性測定法に沿い、ストック溶液の混合時に同時にこれらの添加物類も混合することにより検討した。その結果、一般的に使われる０．０３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００（界面活性剤）では、特に蛍光測定の妨害効果は見られなかった。しかし、ＤＭＳＯは、その濃度と比例して顕著な蛍光の低下が見られたが、０．５％程度のＤＭＳＯ濃度であれば、十分な測定（ＤＭＳＯなしの場合に比べて半分程度の活性値）が可能である事がわかった。
３．１．２ アッセイ用化合物ライブラリの準備
レサズリン法を用いたスクリーニング実験に供するＨＡＯインヒビター候補化合物を絞り込むため、まずｉｎ ｓｉｌｉｃｏスクリーニングを行った。
レサズリン法を用いたスクリーニング実験に供するＨＡＯインヒビター候補化合物を絞り込むため、まずｉｎ ｓｉｌｉｃｏスクリーニングを行った。
Nitrosomonas europaea由来ＨＡＯ及びNitrosomonas oceani由来ＨＡＯの結晶構造をもとに、創薬支援ソフトウェアＭＯＥ(CCG社)を使ったファーマコフォアサーチを市販化合物５３０万種のライブラリ（ナミキ商事）に対して行い、基質ミミック型の化合物を探索した。その結果、ヒット化合物１０００種を得て、実際に７０種を購入した。それらのうち、１００ｍＭの濃度でＤＭＳＯまたは水に溶解可能であった４０種の化合物をスクリーニング用化合物ライブラリとした。
３．１．３ スクリーニングの実施
スクリーニング用化合物ライブラリに対してレサズリン法によるＨＡＯ蛍光活性測定を行い、それら化合物の阻害効果を検証した。４０種の化合物は、分子生物学用ＤＭＳＯ(和光純薬工業社)または、超純水に １００ｍＭの濃度で溶解させ、さらに２倍希釈系列を16系列(１００ｍＭ、５０ｍＭ、２５ｍＭ、１２．５ｍＭ、６．２５ｍＭ、３．１３ｍＭ、１．５６ｍＭ、０．７８ｍＭ、０．３９ｍＭ、０．１９ｍＭ、９７μＭ、４８．８μＭ、２４．４μＭ、１２．２μＭ、６．１μＭ、３．１μＭ）作成した（終濃度はこれらの1/200の濃度となる）。ポジティブコントロールとして、既知のＨＡＯインヒビターであるフェニルヒドラジンも同様な希釈系列を作成した。各濃度の化合物０．５μＬを１６チャンネル電動ピペット（VIAFLO II 12.5 μＬ, INTEGRA社）にて、３８４穴マイクロプレート（MICROPLATE, 384 WELL, NON-BINDING, F-BOTTOM, BLACK, Greiner Bio-One社）の空ウェルに添加した。緩衝液・レサズリン溶液・ＨＡＯ溶液の各ストック溶液の混合液を４００ウェル分準備し、３８４ウェルに対し１ウェルあたり７５μＬを１６チャンネル電動ピペット(VIAFLO II 125 μL, INTEGRA社)で添加した（１ウェルあたりの組成は、２倍希釈用緩衝液を５０μＬ、４倍希釈用４００μＭレサズリンを２５μＬ、５ｎＭ ＨＡＯを０．５μＬとなる）。プレートは、試薬インジェクター付蛍光プレートリーダー(infinite M1000 PRO, テカン社)に挿入し、４倍希釈用４ｍＭヒドロキシルアミンストック溶液を１ウェルあたり２５μＬ添加し、反応系において、レサズリンに対するヒドロキシルアミンを１０倍量（モル比）とした。２時間のインキュベート後に蛍光測定(励起波長５６２ｎｍ：波長幅２０ｎｍ、測定波長５９２ｎｍ：波長幅 ２０ｎｍ)を行った。蛍光強度が化合物無添加の場合の１０％以下に低下した候補化合物Ａをヒット化合物として見出した。
スクリーニング用化合物ライブラリに対してレサズリン法によるＨＡＯ蛍光活性測定を行い、それら化合物の阻害効果を検証した。４０種の化合物は、分子生物学用ＤＭＳＯ(和光純薬工業社)または、超純水に １００ｍＭの濃度で溶解させ、さらに２倍希釈系列を16系列(１００ｍＭ、５０ｍＭ、２５ｍＭ、１２．５ｍＭ、６．２５ｍＭ、３．１３ｍＭ、１．５６ｍＭ、０．７８ｍＭ、０．３９ｍＭ、０．１９ｍＭ、９７μＭ、４８．８μＭ、２４．４μＭ、１２．２μＭ、６．１μＭ、３．１μＭ）作成した（終濃度はこれらの1/200の濃度となる）。ポジティブコントロールとして、既知のＨＡＯインヒビターであるフェニルヒドラジンも同様な希釈系列を作成した。各濃度の化合物０．５μＬを１６チャンネル電動ピペット（VIAFLO II 12.5 μＬ, INTEGRA社）にて、３８４穴マイクロプレート（MICROPLATE, 384 WELL, NON-BINDING, F-BOTTOM, BLACK, Greiner Bio-One社）の空ウェルに添加した。緩衝液・レサズリン溶液・ＨＡＯ溶液の各ストック溶液の混合液を４００ウェル分準備し、３８４ウェルに対し１ウェルあたり７５μＬを１６チャンネル電動ピペット(VIAFLO II 125 μL, INTEGRA社)で添加した（１ウェルあたりの組成は、２倍希釈用緩衝液を５０μＬ、４倍希釈用４００μＭレサズリンを２５μＬ、５ｎＭ ＨＡＯを０．５μＬとなる）。プレートは、試薬インジェクター付蛍光プレートリーダー(infinite M1000 PRO, テカン社)に挿入し、４倍希釈用４ｍＭヒドロキシルアミンストック溶液を１ウェルあたり２５μＬ添加し、反応系において、レサズリンに対するヒドロキシルアミンを１０倍量（モル比）とした。２時間のインキュベート後に蛍光測定(励起波長５６２ｎｍ：波長幅２０ｎｍ、測定波長５９２ｎｍ：波長幅 ２０ｎｍ)を行った。蛍光強度が化合物無添加の場合の１０％以下に低下した候補化合物Ａをヒット化合物として見出した。
３．１．４ 候補化合物Ａの５０％阻害濃度の決定
スクリーニングによって得られた候補化合物ＡのＨＡＯに対する５０％阻害濃度の決定をレサズリン法によるＨＡＯ蛍光測定によって行った。ポジティブコントロール用のインヒビターとして、Nitrosomonas europaea由来ＨＡＯの非可逆的インヒビターとして公知のフェニルヒドラジン（東京化成工業社）を用いた。
スクリーニングによって得られた候補化合物ＡのＨＡＯに対する５０％阻害濃度の決定をレサズリン法によるＨＡＯ蛍光測定によって行った。ポジティブコントロール用のインヒビターとして、Nitrosomonas europaea由来ＨＡＯの非可逆的インヒビターとして公知のフェニルヒドラジン（東京化成工業社）を用いた。
ＨＡＯは、Nitrosomonas europaea由来のものを用いた。フェニルヒドラジン及び候補化合物Ａは、ＤＭＳＯに ２５ｍＭの濃度で溶解させ、さらに２倍希釈系列を15系列(２５ｍＭ、１２．５ｍＭ、６．２５ｍＭ、３．１３ｍＭ、１．５６ｍＭ、０．７８ｍＭ、 ０．３９ｍＭ、０．１９ｍＭ、９７μＭ、４８．８μＭ、２４．４μＭ、１２．２μＭ、６．１μＭ、３．１μＭ、１．５μＭ）作成した（終濃度はこれらの1/200の濃度となる）。これらを、ピペットを用いて３８４穴マイクロプレートに０．５μＬずつスポットした。各濃度ｎ＝４となるようにした。
次に、前述の３．１．３の条件に従って測定を行った。５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を求めるため、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ （GraphPad社）を用いて非線形フィッティングを行った。その結果、フェニルヒドラジンと候補化合物ＡのNitrosomonas europaea由来ＨＡＯに対するＩＣ５０値は、それぞれ２７６ｎＭ及び４３ｎＭと求まった。
３．１．５ アンモニア酸化細菌の硝化活性に対する候補化合物Ａの阻害効果の測定
候補化合物Ａの硝化抑制効果（アンモニア酸化細菌の硝化活性の阻害作用）の検証をアンモニア酸化細菌(Nitrosomonas europaea)の生菌を利用して行った。アンモニア酸化細菌として、各菌は大量培養後（ｐＨ６．０付近に達したら集菌）に同容量のフレッシュな培地に交換した。菌体を３８４穴Ｄｅｅｐ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ (BIO-BIK 社）に１００μＬずつ分注した。各インヒビターの希釈系列溶液（ＤＭＳＯに溶解）を０．５μＬ添加した（ｎ＝４または３）。２０００ｒｐｍで１分間撹拌した。空気透過型プレートシール（細胞用培養プレートシール：AeraSeal社）を張ったのち、常温で１２時間インキュベートした。インキュベート後、２０００ｒｐｍで１分間撹拌した。各ウェル１μＬの培地を、５０μＬのＧｒｅｉｓｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ａ液入りの３８４穴マイクロプレートに移した。各ウェルに５０μＬのＧｒｅｉｓｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｂ液を追加した。１５分発色させた後、プレートリーダーで吸光（５４５ｎｍ）を測定。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェアでマニュアルに従って５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を計算した。候補化合物ＡのＩＣ５０は１．８μＭであった。この実験は、Greiss Reagentの文献（Giustarini, D., Rossi, R., Milzani, A., & Dalle-Donne, I. (2008). Nitrite and nitrate measurement by Griess reagent in human plasma: evaluation of interferences and standardization. Methods in enzymology, 440, 361-80. doi:10.1016/S0076-6879(07)00823-3）を参照した。
A: 2 × Sulfanilamide ストック溶液
2% (w/w) sulfanilamide （和光純薬工業社）
12%(v/v) phosphoric acid (リン酸) 生化学用（和光純薬工業社）
B: 2 × NED ストック溶液
0.2% (w/w) N-(1-naphthyl)ethylenediamine（NED）（和光純薬工業社）
保存条件：どちらも遮光ビンに入れ4℃保存
候補化合物Ａの硝化抑制効果（アンモニア酸化細菌の硝化活性の阻害作用）の検証をアンモニア酸化細菌(Nitrosomonas europaea)の生菌を利用して行った。アンモニア酸化細菌として、各菌は大量培養後（ｐＨ６．０付近に達したら集菌）に同容量のフレッシュな培地に交換した。菌体を３８４穴Ｄｅｅｐ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ (BIO-BIK 社）に１００μＬずつ分注した。各インヒビターの希釈系列溶液（ＤＭＳＯに溶解）を０．５μＬ添加した（ｎ＝４または３）。２０００ｒｐｍで１分間撹拌した。空気透過型プレートシール（細胞用培養プレートシール：AeraSeal社）を張ったのち、常温で１２時間インキュベートした。インキュベート後、２０００ｒｐｍで１分間撹拌した。各ウェル１μＬの培地を、５０μＬのＧｒｅｉｓｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ａ液入りの３８４穴マイクロプレートに移した。各ウェルに５０μＬのＧｒｅｉｓｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｂ液を追加した。１５分発色させた後、プレートリーダーで吸光（５４５ｎｍ）を測定。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェアでマニュアルに従って５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を計算した。候補化合物ＡのＩＣ５０は１．８μＭであった。この実験は、Greiss Reagentの文献（Giustarini, D., Rossi, R., Milzani, A., & Dalle-Donne, I. (2008). Nitrite and nitrate measurement by Griess reagent in human plasma: evaluation of interferences and standardization. Methods in enzymology, 440, 361-80. doi:10.1016/S0076-6879(07)00823-3）を参照した。
A: 2 × Sulfanilamide ストック溶液
2% (w/w) sulfanilamide （和光純薬工業社）
12%(v/v) phosphoric acid (リン酸) 生化学用（和光純薬工業社）
B: 2 × NED ストック溶液
0.2% (w/w) N-(1-naphthyl)ethylenediamine（NED）（和光純薬工業社）
保存条件：どちらも遮光ビンに入れ4℃保存
３．２ アンモニア酸化細菌を含む微生物群集（土壌など）からの直接のＨＡＯ活性の検出
土壌サンプルなどの微生物群集からダイレクトにＨＡＯ活性を測定する方法を開発した。この方法により、土壌のアンモニア酸化細菌の菌体量や硝化活性を推定することが可能となった。
土壌サンプルなどの微生物群集からダイレクトにＨＡＯ活性を測定する方法を開発した。この方法により、土壌のアンモニア酸化細菌の菌体量や硝化活性を推定することが可能となった。
土壌サンプル０．５ｇを１２ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に入れた。２５０μＬのｐＨ５．６の２倍希釈用リン酸カリウム緩衝液と、１２５μＬの４倍希釈用レサズリンストック溶液を添加した。５分間、３００ｒｐｍで回転振盪させた。１２５μＬの４倍希釈用ヒドロキシルアミンストック溶液を添加し、反応系において、レサズリンに対するヒドロキシルアミンを １０倍量（モル比）とした。
この時、ネガティブコントロールとして、オートクレーブ滅菌した土壌サンプルを用いた。さらに、ＨＡＯ以外の酵素によるレサズリン還元活性を除くために、スクリーニングによって得られたＨＡＯインヒビターの候補化合物Ａを添加したウェルを用意した。阻害剤候補Ａの添加濃度は、Nitrosomonas europaeaに対するＩＣ５０＝１．８μＭに対して十分に高い１００μＭとした。
土壌サンプルは、固形物や浮遊物を含むため、これらが励起光を遮蔽または乱反射することで、測定上のノイズとなる。しかし、プレートウェル内の土壌サンプルにメッシュをかぶせることで、水流を遮らずに浮遊物をウェル底に固定することが可能となった。具体的には、１２穴プレートのウェルに０．５ｇの土壌を入れ、その上から各ウェルにメッシュ付カップのネットウェル（Netwell Insert 74μm Polyester Mesh 15mm Insert, 12 Well Plate: Corning社）をはめ込んだ。なお、ネットウェルは本来メッシュカップの上側に動植物の組織を入れ、移植片培養や免疫染色を行うためのものであり、本法のように蛍光測定の際に固形物を押し込むために使用された例は知られていない。また、ネットウェルはプレート上に５ｍｍほどはみ出すため、そのままではプレートリーダー（infinite M1000 PRO, テカン社）には挿入できなかった。そこで、発泡スチロール用の電熱線カッターでネットウェルの上部をカットしてからプレートにはめ込み、プレートリーダーに挿入した。
測定は、プレートリーダー（infinite M1000 PRO,テカン社）を使用し、カイネティックスモードで１分ごとに蛍光測定(励起波長 ５６２ｎｍ：波長幅２０ｎｍ、測定波長５９２ｎｍ：波長幅 ２０ｎｍ)を行った。測定を行っていない間は、プレートリーダーのシェイク機能を使い、１５０ｒｐｍで回転振盪させ、室温（２６℃）でインキュベーションを行った。
最も蛍光強度の高くなったインキュベーション時間６０分において、無処理ウェルと阻害剤添加ウェルの相対蛍光強度の差から、その土壌サンプル中に存在するＨＡＯ由来の値を求めた。
３．３ ＨＡＯの蛍光活性染色
レサズリンを含むＨＡＯ蛍光活性測定法の溶液を、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動であるネイティブ−ＰＡＧＥを行ったＨＡＯを含む試料に適用することにより、ゲル内のＨＡＯ活性を可視化した。
レサズリンを含むＨＡＯ蛍光活性測定法の溶液を、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動であるネイティブ−ＰＡＧＥを行ったＨＡＯを含む試料に適用することにより、ゲル内のＨＡＯ活性を可視化した。
３．３．１ 電気泳動用サンプルの調製
ネイティブ−ＰＡＧＥのサンプルには、上記項目１．２．１にて調製したN. europaeaの破砕上清を使用した。また、マーカーとして上記項目１．３．１にて保存したN. europaea由来の精製ＨＡＯを使用した。それぞれの溶液は、サンプルバッファー（０．４％ブロモフェノールブルー、５０％グリセロール、ｐＨ７．５、５ｍＭトリス塩酸塩）と１：１で混合して、ネイティブ−ＰＡＧＥに供した。
ネイティブ−ＰＡＧＥのサンプルには、上記項目１．２．１にて調製したN. europaeaの破砕上清を使用した。また、マーカーとして上記項目１．３．１にて保存したN. europaea由来の精製ＨＡＯを使用した。それぞれの溶液は、サンプルバッファー（０．４％ブロモフェノールブルー、５０％グリセロール、ｐＨ７．５、５ｍＭトリス塩酸塩）と１：１で混合して、ネイティブ−ＰＡＧＥに供した。
３．３．２ ネイティブ-ＰＡＧＥ電気泳動
ネイティブ−ＰＡＧＥ電気泳動にはｅ−ＰＡＧＥＬ１５％ポリアクリアルアミド既成ゲル（ATTO社）を用い、取り扱い説明書に従って行った。泳動層にゲルをセットした後、各ウェルに１０μＬのサンプルをそれぞれ２レーンずつアプライした。ゲル電気泳動は、ネイティブ−ＰＡＧＥ用泳動バッファー（２５ｍＭトリス塩酸、１９２ｍＭグリシン）を用い、３００Ｖ、２０ｍＡで８０分間、室温（約２５℃）で通電した。
ネイティブ−ＰＡＧＥ電気泳動にはｅ−ＰＡＧＥＬ１５％ポリアクリアルアミド既成ゲル（ATTO社）を用い、取り扱い説明書に従って行った。泳動層にゲルをセットした後、各ウェルに１０μＬのサンプルをそれぞれ２レーンずつアプライした。ゲル電気泳動は、ネイティブ−ＰＡＧＥ用泳動バッファー（２５ｍＭトリス塩酸、１９２ｍＭグリシン）を用い、３００Ｖ、２０ｍＡで８０分間、室温（約２５℃）で通電した。
３．３．３ ゲルのレサズリン入り緩衝液処理
電気泳動の後、ゲルをレサズリン含有緩衝液 ３０ｍＬ（上記項目２．１．２に記載の４倍希釈用レサズリン溶液１０ｍＬと上記項目２．１．３に記載の２倍希釈用測定用緩衝液(ｐＨ５．６) ２０ｍＬを混合した溶液）中で５分以上振盪反応させ、ゲル中にレサズリン含有緩衝液を浸透させた。
電気泳動の後、ゲルをレサズリン含有緩衝液 ３０ｍＬ（上記項目２．１．２に記載の４倍希釈用レサズリン溶液１０ｍＬと上記項目２．１．３に記載の２倍希釈用測定用緩衝液(ｐＨ５．６) ２０ｍＬを混合した溶液）中で５分以上振盪反応させ、ゲル中にレサズリン含有緩衝液を浸透させた。
３．３．４ ゲルの可視化
ゲルをレサズリン含有緩衝液からアクリルトレイ上に移し、余分な溶液をキムワイプで除去した。ゲルに上記項目２．１．１で調製した基質のヒドロキシルアミン溶液１ｍＬをまんべんなくかけ、数秒後に余分な溶液をキムワイプで除去した。３０秒ほど反応させた後、シアン色（波長４８０−５３０ｎｍ）のゲルイメージング光源Cyanoview（ATTO社）、およびオレンジフィルター（ATTO社）により、バンドの蛍光染色を確認し、デジタルカメラにて撮影した（図５）。その結果、N. europaeaの破砕上清のレーンで蛍光を発しているバンドが１つあることが確認された。このバンドの位置は、マーカーとして使用したN. europaea由来の精製ＨＡＯのバンドと同等な位置に存在しており、ＨＡＯのバンドであることが確認された。バンドの蛍光強度から、サンプル中のＨＡＯ活性を簡易的に定量することが可能であった。
ゲルをレサズリン含有緩衝液からアクリルトレイ上に移し、余分な溶液をキムワイプで除去した。ゲルに上記項目２．１．１で調製した基質のヒドロキシルアミン溶液１ｍＬをまんべんなくかけ、数秒後に余分な溶液をキムワイプで除去した。３０秒ほど反応させた後、シアン色（波長４８０−５３０ｎｍ）のゲルイメージング光源Cyanoview（ATTO社）、およびオレンジフィルター（ATTO社）により、バンドの蛍光染色を確認し、デジタルカメラにて撮影した（図５）。その結果、N. europaeaの破砕上清のレーンで蛍光を発しているバンドが１つあることが確認された。このバンドの位置は、マーカーとして使用したN. europaea由来の精製ＨＡＯのバンドと同等な位置に存在しており、ＨＡＯのバンドであることが確認された。バンドの蛍光強度から、サンプル中のＨＡＯ活性を簡易的に定量することが可能であった。
Claims (8)
- レサズリン塩の存在下でアンモニア酸化細菌由来のヒドロキシルアミン酸化還元酵素（ＨＡＯ）をヒドロキシルアミンと接触させることを含む、ＨＡＯ活性の蛍光活性測定方法
であって、ｐＨ４．６〜７．６で測定する、方法。 - レサズリン塩に対するヒドロキシルアミンが、少なくとも３倍量のモル比で接触させる、請求項１記載の測定方法。
- レサズリン塩に対するヒドロキシルアミンが、少なくとも５倍量のモル比で接触させる、請求項１または２記載の測定方法。
- レサズリン塩に対するヒドロキシルアミンが、少なくとも１０倍量のモル比で接触させる、請求項１〜３のいずれか一項記載の測定方法。
- 測定対象が、土壌、堆肥、活性汚泥又はそれらを非変性状態で電気泳動したポリアクリルアミドゲルである、請求項１〜４のいずれか一項記載の測定方法。
- ＨＡＯを含む試料からＨＡＯを精製することを含み、精製においてＨＡＯが含まれる画分を判別するために請求項１〜５のいずれか一項記載の測定方法によりＨＡＯの活性を測定する、ＨＡＯの製造方法。
- 低酸素条件下でＨＡＯを精製することを含む、請求項６記載の製造方法。
- レサズリン塩の存在下でｐＨ４．６〜７．６でアンモニア酸化細菌由来のＨＡＯをヒドロキシルアミン及び候補化合物と接触させることを含む、ＨＡＯインヒビターのスクリーニグ方法。
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