CN108474020B - 氧化还原酶的活性测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种HAO的活性测定方法，其包括：在四唑盐的存在下使HAO与羟胺接触。此外，本发明还提供一种微生物的培养方法，其包括：在液体培养基储存容器内分隔设置的含有微生物的试样储存容器内培养微生物，含有微生物的试样储存容器具有细孔。

Description

氧化还原酶的活性测定方法
技术领域
本发明涉及一种HAO的活性测定方法，其包括：在四唑盐的存在下使羟胺氧化还原酶(HAO)与羟胺接触。本发明还涉及HAO的制造方法。本发明还涉及一种HAO抑制剂(inhibitor)的筛选方法，其包括：在四唑盐的存在下使HAO与羟胺及候选化合物接触。本发明提供一种微生物的培养方法，其包括：在液体培养基储存容器内分隔设置的含有微生物的试样储存容器内培养微生物，含有微生物的试样储存容器具有细孔。
背景技术
将作为化肥特别重要的氮肥，以氨态氮(NH4 +)过量投入于农田。然而，其大部分被硝化，从而导致氮肥从农田流出以及温室气体(N2O)的产生。现有的硝化抑制剂存在诸如因挥发性而不能在20℃以上使用、效果差以及具有致癌性和残余毒性的问题，因此期待消除这些问题的新的硝化抑制剂。现有的硝化抑制剂将氨单加氧酶(AMO)作为目标来考虑。另一方面，至今未知有将所谓硝化反应核心酶的羟胺氧化还原酶(Hydroxylamineoxidoreductase，HAO)作为目标的硝化抑制剂。此外，虽然已知各种HAO的活性测定方法，但是在灵敏度和成本方面都不是满意的方法。而且，能够适用于高通量筛选的HAO活性的测定方法至今未被开发。
微生物的培养时时伴随着困难，存在如下问题：培养时的菌体浓度最大也处在OD600＝0.1(低于每10L 1g)程度，因此不仅需要大量的培养基，而且在收集细菌上花费很多的劳力。这对于来自土壤、堆肥或者活性污泥的微生物的情况是特别深刻的问题。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1
H.Maeda,S.Matsu-ura,Y.Yamauchi,H.Ohmori,Resazurin as an electronacceptor in glucose oxidase-catalyzed oxidation of glucose.,Chem.Pharm.Bull.49(2001)622–625.
非专利文献2
W.J.Maalcke,A.Dietl,S.J.Marritt,J.N.Butt,M.S.M.Jetten,J.T.Keltjens,T.R.M.Barends,B.Kartal,Structural basis ofbiological NO generation byoctaheme oxidoreductases.,J.Biol.Chem.289(2014)1228–42.
非专利文献3
J.Schalk,S.de Vries,J.G.Kuenen,M.S.Jetten,Involvement of a novelhydroxylamine oxidoreductase in anaerobic ammonium oxidation.,Biochemistry.39(2000)5405–12.
发明内容
发明所要解决的技术问题
本发明的目的在于提供一种羟胺氧化还原酶的活性测定方法。该方法在灵敏度和成本方面实用，并且测定简单。此外，本发明的目的在于提供一种微生物的培养方法，该方法能够使培养微生物时的培养基的制备及收集细菌所需的劳力高效，同时可获得能够充分满足的菌体浓度。而且，本发明的目的在于提供一种新的方案，该方案能够从含有大量酶的试样中简单、快速且高灵敏地分析HAO的活性。
用于解决技术问题的方案
经过专心研究，本发明人发现了一种羟胺氧化还原酶的活性测定方法并完成了本发明，该方法在相对于四唑盐尤其是作为四唑盐的刃天青盐使羟胺大量存在的反应系统中进行测定。此外，本发明人发现了对含有非变性的HAO的试样进行凝胶电泳之后，使其在凝胶内酶促反应，并通过荧光测定使其反应产物显现，由此能够有效地分析该酶的有无或活性的强度的方案，并完成了本发明。
即，本发明的主旨如下所示。
[1]一种羟胺氧化还原酶的活性测定方法，其包括：在四唑盐的存在下使羟胺氧化还原酶(HAO)与羟胺接触。
[2]在[1]所记载的测定方法中，四唑盐为刃天青盐。
[3]在[1]或[2]所记载的测定方法中，羟胺相对于四唑盐以至少3倍量的摩尔比接触。
[4]在[1]至[3]中任一项所记载的测定方法中，羟胺相对于四唑盐以至少5倍量的摩尔比接触。
[5]在[1]至[4]中任一项所记载的测定方法中，羟胺相对于四唑盐以至少10倍量的摩尔比接触。
[6]在[1]至[5]中任一项所记载的测定方法中，在pH4.0至pH8.0下进行测定。
[7]在[1]至[6]中任一项所记载的测定方法中，在pH4.6至pH7.6下进行测定。
[8]在[1]至[7]中任一项所记载的测定方法中，测定对象为土壤、堆肥、活性污泥或者将土壤、堆肥、活性污泥以非变性状态进行电泳的聚丙烯酰胺凝胶。
[9]一种羟胺氧化还原酶的制造方法，其包括：从含有羟胺氧化还原酶的试样中纯化羟胺氧化还原酶，为了在纯化中判别含有羟胺氧化还原酶的划分，通过[1]至[8]中任一项所记载的测定方法来测定羟胺氧化还原酶的活性。
[10]在[9]所记载的制造方法中，包括对纯化得到的羟胺氧化还原酶进行干燥。。
[11]一种羟胺氧化还原酶抑制剂的筛选方法，其包括：在四唑盐的存在下使羟胺氧化还原酶与羟胺以及候选化合物接触。
[12]一种微生物的培养方法，其包括：在液体培养基储存容器内分隔设置的含有微生物的试样储存容器内培养微生物，含有微生物的试样储存容器具有细孔。
[13]在[12]所记载的培养方法中，液体培养基与含有微生物的试样的体积比为10：1～1000：1。
[14]在[12]或[13]所记载的培养方法中，细孔的切割分子量为50KDa～1000KDa。
[15]在[12]至[14]中任一项所记载的培养方法中，含有微生物的试样储存容器为透析管。
[16]在[12]至[15]中任一项所记载的培养方法中，含有微生物的试样储存容器的封入口被消毒。
[17]在[12]至[16]中任一项所记载的培养方法中，微生物是难培养微生物。
[18]在[12]至[17]中任一项所记载的培养方法中，微生物是在OD600为0.2以下的浊度下达到静止期的微生物。
发明效果
通过本发明提供一种从来未知的微量高灵敏、低价格且能够匀相测定(Homogeneous assay)的HAO的活性测定方法。本发明的HAO的活性测定方法适用于高通量筛选，既可以从活菌直接检测，也可以从土壤等的试样直接监测，还可以从非变性聚丙烯酰胺电泳凝胶直接检测。本发明的HAO的活性测定即使在正常氧的存在下也能够进行，还可以进行实时测定，而且若进行荧光测定则能够获得更高的灵敏度。在本发明的HAO的活性测定方法中不需要如PMS那样的电子载体。根据本发明还能够有效地培养难培养微生物，特别是土壤、堆肥或者活性污泥中的微生物。本发明的HAO的制造方法由于不进行硫酸铵分级，因此能够大幅缩短纯化时间，扩大(Scale-up)变得容易。并且，通过本发明获得的HAO能够长期保存。若分析包含具有HAO的氨氧化细菌的培养液等，则可以定量样品中HAO的活性。而且，若针对这些样品预先处理作为HAO阻化剂的候选化合物，则能够简单地分析候选化合物的HAO阻碍效果。
附图说明
图1示出了根据本发明的HAO活性测定方法中的羟胺相对于刃天青的摩尔比的关系。
图2示出了根据本发明的HAO活性测定方法中的pH依赖性。
图3示出了根据本发明的HAO制造方法的一实施方式。
图4示出了根据本发明的土壤直接(Soil Direct)HAO活性测定的一实施方式。
图5示出了根据本发明在将欧洲亚硝化单胞菌(N.europaea)的纯化HAO及菌体的破碎上清液进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳之后，使用刃天青对HAO进行了荧光活性染色的凝胶图像。图中用箭头表示的带(Band)为HAO。
具体实施方式
本发明提供一种HAO的活性测定方法，其包括在四唑盐的存在下使羟胺氧化还原酶(HAO)与羟胺接触。
本发明的HAO的活性测定方法检测四唑盐的吸光度的变化或向荧光物质的变化，优选地，检测作为四唑盐的刃天青盐的吸光度的变化或向荧光物质的变化。
在本发明的HAO的活性测定方法中，在使羟胺相对于四唑盐、优选为刃天青盐以至少3倍量、优选为5倍量、更优选为10倍量(摩尔比)存在的反应系统中进行测定。
在本发明的HAO的活性测定方法中，在pH4.0～8.0下测定即可。优选为，由于信号背景比为2以上，因此在pH4.6～7.6下测定即可。缓冲液可以从柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液、磷酸钾缓冲液、HEPES-NaOH缓冲液、Tris-HCl缓冲液等中选择。若改变缓冲剂和pH则使HAO活性(初速度)改变，因此可以根据实验目的来选择这些条件。例如，15分钟程度达到最大荧光强度的HAO活性最高的条件适合于迅速的测定和HAO浓度低时的测定。因此，虽然不需要如HAO纯化时确认HAO划分那样的严格的定量性能，但成为适合于迅速的测定所需的工艺的测定条件。作为该条件，可以使用pH约5.6的磷酸钾缓冲液以及柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液或者pH约6.8的HEPES-NaOH缓冲液以及Tris-HCl缓冲液等。另一方面，在如2～3小时程度达到最大灵敏度那样的HAO活性比较低的条件中，可以忽略几分钟程度的孵化时间的误差。因此，它成为如药剂筛选那样，并列进行大量的试验(Assay)，而且适合于需要抑制试验之间的模糊的工序的测定条件。作为该条件，可以使用pH7.0附近的磷酸钾缓冲液等。
在本发明的HAO的活性测定方法中，试样可以是含有细菌群落的固形物或液体，优选为土壤、堆肥或者活性污泥，还可以直接测定其中所包含的HAO的活性。活性污泥是包括含有丰富微生物的悬浮污泥的净化处理中的污水，并且是指污泥和污水的两者。本发明的活性测定方法能够从通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的多个蛋白质带中进行HAO特异性地荧光染色。在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中，HAO在凝胶中以保持活性的方式被分离。使该凝胶中的HAO在四唑盐的存在下与羟胺接触，从而使四唑盐向荧光物质变化。进而，通过利用凝胶成像仪光源和荧光观察用滤光器，从而能够以高灵敏度检测凝胶中的荧光物质。由此，作为激发光源可以使用蓝光(440-500nm)，更优选为青色光(波长480-530nm)，进一步优选为绿色光(490-580nm)。作为荧光观察用滤光器可以使用橙色滤光器。作为电泳的方法可以利用所谓非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法的Native-PAGE或Blue Native-PAGE等。作为供应到电泳的样品可以是纯化得到的HAO、菌体的破碎上清液、土壤样品、活性污泥等、以及其中添加了HAO阻化剂的样品。若将预先已知浓度或者活性的纯化HAO作为标记使用，则还可以简单地量化HAO活性。
本发明的HAO的活性测定方法能够适用于高通量筛选，并且能够筛选所谓硝化反应的核心酶的HAO的抑制剂。
本发明还提供微生物的培养方法，其包括在液体培养基储存容器内分隔设置的含有微生物的试样储存容器内培养微生物，其中，含有微生物的试样储存容器具有细孔。
在根据本发明的微生物的培养方法中，液体培养基和含有微生物的试样的体积比为10：1～1000：1，优选为100：1～800：1，更优选为200：1～600：1，最优选为400：1即可。
根据本发明的微生物的培养方法，其特征在于，液体培养基储存容器为1～50L的瓶子即可，优选为3～30L的瓶子，更优选为20L的瓶子，但不限于此，容易进行液体培养基储存容器的放大以及含有微生物的试样储存容器的放大。含有微生物的试样储存容器可以是任何形状，例如筒状、管状、皿状等，优选为管状。含有微生物的试样储存容器具有细孔，在细孔中，为了使由培养基成分的交换不充分而导致的增殖抑制难以起作用而其为50KDa以上，为了使微生物通过而其为1000KDa以下的切割分子量(MWCO)。含有微生物的试样储存容器优选为具有如其所示的切割分子量的透析管。含有微生物的试样储存容器的封入口优选为对其进行消毒。
在根据本发明的微生物的培养方法中，可以培养如Journal of EnvironmentalBiotechnology(环境生物技术学会杂志)Vol.7,No.2,69-73,2007所记载的难培养微生物，进一步详细而言，可以培养在非常低的浊度(OD600为0.2以下)的细胞数水平下达到静止期的难培养微生物。那样的微生物例如为氨氧化细菌、氨氧化古细菌或者亚硝酸氧化细菌、铁还原细菌、硫还原菌、厌氧氨氧化细菌，氨氧化细菌可以列举出亚硝化单胞菌属、亚硝化球菌属、亚硝化螺菌属等，但不限于此。
若采用根据本发明的微生物培养方法，则即使是难培养微生物也能够有效地培养微生物，在回收菌体时能够特别地简化培养基离心分离的工夫。特别是，若采用根据本发明的微生物的培养方法，则能够有效地制造羟胺氧化还原酶(HAO)。
本发明的HAO的制造方法包括从含有HAO的试样中纯化HAO，为了判别纯化中含有HAO的划分，该方法可包括测定HAO的活性的工艺。测定HAO的活性的工艺优选为可以应用本发明的HAO的活性测定方法，但不限于此。
本发明的HAO的制造方法例如包括如下工艺，即：通过本发明的微生物的培养方法来培养微生物，在破碎含有HAO的微生物的菌体之后，将上清液划分加到柱(column)上，采用测定HAO的活性的方法来检测含有HAO的划分，根据需要进一步在低氧浓度条件下加到柱上。作为采用本发明的HAO的制造方法的柱，可举出阴离子交换柱、凝胶过滤柱、羟基磷灰石柱、强阴离子交换柱、强阳离子交换柱等，但不限于此。HAO的制造在优选为低氧浓度条件下进行，更优选为在0.5％以下的氧浓度条件下进行。
本发明的HAO的制造方法可包括为了保存而对纯化得到的HAO进行干燥的工艺。
实施例
接着，通过实施例对本发明进一步详细说明，但本发明在不脱离其主旨的情况下不限于以下的实施例。
1.HAO的制造
制造了羟胺氧化还原酶。HAO从氨氧化细菌进行纯化，并以溶液状态或者干燥后在低氧浓度条件下进行了保存。
1.1微生物的培养
1.1.1菌株
利用了以下5种的氨氧化细菌。
菌株1：欧洲亚硝化单胞菌(Nitrosomonas europaea)NBRC14298(购自NBRC*1)
菌株2：海洋亚硝化球菌(Nitrosococcus oceani)ATCC19707(购自美国ATCC*2)
菌株3：亚硝化单胞菌(Nitrosomonas sp.)NBRC108559(购自NBRC)
菌株4：耐冷亚硝化单胞菌(Nitrosomonas cryotolerans)ATCC49181(购自ATCC)
菌株5：多型亚硝化螺菌(Nitrosospira multiformis)ATCC25196(购自ATCC)
*1NBRC：独立行政法人产品评価基盘研究机构生物技术中心
*2ATCC：美国菌种保藏中心
1.1.2培养基
已使用的培养基的组成如下所示。
1.1.2.1培养基1
菌株1及菌株5的培养所使用的培养基
菌株1：欧洲亚硝化单胞菌NBRC14298
菌株5：多型亚硝化螺菌ATCC25196
表1
(每1L)
Figure BDA0001717038340000061
用氢氧化钠水溶液调制至pH7.8之后，进行了高压灭菌。
1.1.2.2培养基2(人工海水培养基)
菌株2及菌株4的培养所使用的培养基
菌株2：海洋亚硝化球菌ATCC19707
菌株4：耐冷亚硝化单胞菌ATCC49181
表2
(每1L)
Figure BDA0001717038340000071
用氢氧化钠水溶液调制至pH7.8之后，进行了高压灭菌。
1.1.2.3培养基3(NBRC medium 1201)
菌株3的培养所使用的培养基
菌株3：亚硝化单胞菌NBRC108559
表3
(每1L)
Figure BDA0001717038340000072
用氢氧化钠水溶液调制至pH7.8之后，进行了高压灭菌。
1.1.2.4微量元素(Trace element)混合液(微量元素溶液)
在纯水1L中溶解了以下成分。
表4
硼酸[H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub>] 30mg
氯化锰(II)四水合物[MnCl<sub>2</sub>·4H<sub>2</sub>O] 100mg
氯化钴(II)六水合物[CoC<sub>12</sub>·6H<sub>2</sub>O] 190mg
氯化镍(II)六水合物[NiCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O] 24mg
氯化铜(II)二水合物[CuCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O] 2mg
七水硫酸锌[ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O] 144mg
钼酸钠二水合物[Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O] 36mg
25％盐酸[25％HCl] 12.5ml
1.1.3培养方法
微生物按照普通的培养方法及根据本发明的利用透析管的培养方法这两种方法进行了培养。在透析管法中，将菌体悬浮于100mL的培养基中，从中取出50mL，封入50mL透析管中，将管浸入20L的培养基中进行了培养。根据该方法，培养时间会变长，但不需要进行由大量培养基的离心分离产生的菌体回收。
1.1.3.1预培养
将各菌株在装有适合菌株的30mL的培养基的、带有换气过滤器的50mL塑料试验管(生物反应器管，TPP有限公司)中进行了培养。由于氨氧化细菌分泌亚硝酸，pH随着增殖而降低，并且当其达到pH6程度时，其变为稳定状态而停止增殖。因此，其培养了1周程度直至培养基中所含的pH指示剂的酚红变黄色(pH6.0附近)。
1.1.3.2未使用透析管的普通的培养方法
在未使用透析管的普通的培养方法中，将预培养(preculture)得到的30mL的培养液放入容纳有20L培养基的20L塑料瓶(Nalgene clear boy：赛默飞世尔科技公司)中进行了培养。在进行培养时，在室温26℃的房间利用空气泵每分钟送入2.5L的进行了高压灭菌且通过了排气过滤器(Vent filter)(Millex-FG：密理博公司)的空气来进行。1周后，由于培养基中的pH指示剂变为黄色(pH6.0)，因此终止了培养。将培养液移至500mL的塑料离心管，并多次进行7000g的离心分离而收集了细菌。收集的菌体在完全除去培养基之后放入50mL塑料试验管中，封入氮气而使其达到低氧浓度条件之后，将其在-80℃的冷冻机中保存直至进行酶纯化工作。各菌的菌体量为每20L的培养基1～2g程度。
1.1.3.3使用透析管的培养方法
将预培养得到的少量的菌体封入透析管之后，继续在装有大量的培养基的大瓶中进行了培养。具体而言，如下所示。
将进行了预培养的30mL程度的培养基中的菌体，通过7000g的离心分离而进行回收，并将其再悬浮于50mL的新的培养基中。再悬浮的菌体放入高压灭菌结束的透析管(Spectra/
Figure BDA0001717038340000081
6 Dialysis Membrane MWCO：50kD：SPECTRUM公司)，用高压灭菌结束的透析管用夹子(SPECTRUM公司)封入。此外，为了防止附着于封入口附近的菌在外部的培养基中增殖，封入口使用消毒用酒精(和光纯药工业公司)和聚维酮碘擦洗液(明治制果药业公司)进行了消毒。
将封入菌体的透析管放入容纳20L培养基的20L塑料瓶(Nalgene clear boy：赛默飞世尔科技公司)中，进行了培养。在进行培养时，在室温26℃的房间利用空气泵每分钟送入2.5L的进行了高压灭菌且通过了排气过滤器(Vent filter)(Millex-FG：密理博公司)的空气来进行。3周后，由于培养基中的pH指示剂变为黄色(pH6.0)，因此终止了培养，从透析管之中回收了含有菌体的培养液。将培养液移至500mL的塑料离心管(Plastic centrifugetube)，在15分钟的7000g的离心分离下收集了细菌。将氮气封入装有菌体团的离心管中，使其达到低氧浓度条件之后，将其在-80℃的冷冻机中冷冻保存直至进行酶纯化工作。各菌的菌体量为每20L的培养基1～2g程度。
通过使用了上述透析管的培养，省去花费6小时以上的从20L的培养基中收集细菌的工夫，能够降低杂菌的污染风险。来自透析管内的50mL的培养基的收集细菌，使用50mL的塑料离心管，在7000g下通过离心分离进行了20分钟。利用透析管的培养的情况，通过不收集细菌且移至新的培养基来还可以继续培养。此外，根据利用透析管的培养，由于增殖缓慢而杂菌易于污染，此外易于漂浮而能够将难以收集细菌的氨氧化细菌特别有效地培养、回收。
1.2 HAO的纯化
1.2.1破碎和上清液划分的回收
冻结保存的约1g的菌体在流水中溶解后，将其悬浮于50mL的缓冲剂A(pH7.5、20mMTris盐酸缓冲液)。将悬浮液利用超声波破碎仪(UD-201，Tomy公司)以输出5.5、占空比50破碎了15分钟。将破碎液以40000g进行了30分钟的离心分离。回收了35mL含有HAO的上清液划分。
1.2.2阴离子交换柱纯化
将上清液划分添加至串联连接用缓冲剂A平衡化得到的3根5mL的HiTrap Q HP(GE医疗公司)的柱上。接着，使用缓冲剂A和缓冲剂B(pH7.5、20mMTris盐酸缓冲液、1mM氯化钠)，并通过0～500mM的氯化钠浓度的线性梯度进行了洗脱。按照3mL进行洗脱液的分级。检测含有HAO的划分，并回收了约10mL的溶液。通过后述的1.2.7所记载的方法进行了含有HAO的划分的检测。
1.2.3凝胶过滤柱纯化
将回收的阴离子柱洗脱划分添加至用缓冲剂B(pH7.0、0.20mMTris盐酸缓冲液、150mM氯化钠)平衡化得到的凝胶过滤柱HiLoad 26/600Superdex 200 prep grade(GE医疗公司)上。接着，以1.5mL/分钟输送缓冲剂B并洗脱。按照3mL进行洗脱液的分级。回收了12mL含有HAO的洗脱划分。
1.2.4羟基磷灰石柱
将回收的凝胶过滤柱洗脱划分，由5mL的CHT陶瓷羟基磷灰石载体(I型、粒径20μm、伯乐公司)填充，并添加至用缓冲剂C(pH7.5、20mM磷酸钾缓冲液)平衡化得到的内径1cm的柱上。接着，使用缓冲剂C和缓冲剂D(pH7.5、500mM磷酸钾缓冲液)，并通过20～500mM的磷酸钾缓冲液的线性梯度进行了洗脱。按照2mL进行洗脱液的分级。回收了12mL含有HAO的划分。
1.2.5强阴离子交换柱、或者强阳离子交换柱
将羟基磷灰石柱的洗脱划分添加至用缓冲剂A平衡化得到的强阴离子交换柱的MonoQ 10/10GL(GE医疗公司)。使用缓冲剂A和缓冲剂B，并通过0～500mM的氯化钠浓度的线性梯度进行了洗脱。按照2mL进行洗脱液的分级。最终，回收了12mL含有HAO的划分。需要说明的是，由于仅仅源自多型亚硝化螺菌的HAO未附着于MonoQ，因此使用了强阳离子交换柱的MonoS 10/100GL(GE医疗公司)。
1.2.6用于在低氧浓度条件下纯化而不失活针对氧弱的HAO的处理
源自欧洲亚硝化单胞菌及海洋亚硝化球菌以外的菌的HAO对氧非常弱，在经过2～3天的纯化中其大部分会失活，因此需要在低氧浓度条件下进行纯化。欧洲亚硝化单胞菌及海洋亚硝化球菌也在低氧浓度条件下进行纯化从而能够期待活性的保持，因此它们也以同样的方式进行了纯化。
所有的缓冲液类通过预先通氮气1小时以上之后进行脱气，以达到低氧浓度的条件。通气所使用的氮气利用低浓度氧监测器JKO-O2 Ver.3(JIKCO公司)表示了检测极限的0.00％的值(以后，标记为氧浓度0.01％以下)。使用溶氧计(MultiLine 3410型光学式DO电极FDO925型，WTW公式)确认了脱气后的缓冲剂类在检测极限的0.01mg/ml以下。
在纯化中，通过在色谱系统的馏分收集器上盖住塑料袋，并向该处不断地流入氮气来以保持低氧浓度条件进行了纯化。塑料袋内的氧浓度为0.01％以下。进而，还向脱气结束且装有缓冲液的玻璃瓶常时送入氮气，由此防止氧的溶解，并保持了低氧浓度条件。若完成各色谱步骤，则一边向馏分管吹入氮气，一边在低氧浓度条件下取样品，并立即盖上。
1.2.7在各纯化步骤中判别含有HAO的划分的方法
在HAO的纯化中使用了色谱系统的AKTA Explore(GE医疗公司)。并用通过AKTA的三个波长的吸光测定{280nm(蛋白质)、409nm(血红素)、463nm(HAO特有的血红素P 460)}、基于刃天青法的HAO荧光活性测定(使用pH5.6的磷酸盐柠檬酸盐缓冲液)、通过SDS-PAGE的带进行了含有HAO的划分的判别。
1.3 HAO的保存法
1.3.1溶液保存(短期保存)
在氧浓度0.01％以下的手套箱(Glove box)中，保存于带O形圈的1.5mL螺帽管(深江化成公司)。
1.3.2干燥保存(长期保存)
将5nM的HAO溶液(缓冲剂B)按照0.1μL点滴(Spot)到384孔酶标板(Greiner bio-one公司)的各孔(Well)中，使其在室温下自然干燥。在常温下放置一天程度之后，通过后述的荧光法测定了活性，与干燥前相比保留了80％程度的活性。干燥后，若在平板上贴铝片并以低温保存，则能够长期保存。所有的操作在氧浓度为0.01％以下的低氧浓度条件下的手套箱内进行。
2 HAO荧光活性测定方法(刃天青法)
2.1试剂调制法
为了测定而调制了能够长期保存的三种贮备(Stock)溶液。
2.1.1 4倍稀释用的基质(羟胺)的贮备溶液调制
使用超纯水调制4mM盐酸羟胺溶液(东京化成工业公司)，按照10mL分注到15mL大小的塑料管中。此时，超纯水在事先充分进行脱气，操作在低氧浓度条件下的手套箱内(氧浓度为0.01％以下)进行。调制完成的溶液在-80℃下进行冷冻保存。
2.1.2 4倍稀释用的电子受体的四唑盐(刃天青盐)的贮备溶液调制
与上述羟胺同样地，调制了400μm刃天青钠盐(和光纯药工业公司)。操作在低氧浓度条件下的手套箱内(氧浓度为0.01％以下)进行。在-80℃下进行冷冻保存。
2.1.3 2倍稀释用的缓冲液的贮备溶液调制
调制了测定用缓冲液(100mM磷酸钾缓冲液，300mM氯化钠)。操作在低氧浓度条件下的手套箱内(氧浓度为0.01％以下)进行。调制完成的溶液在4℃下进行保存。在用于HAO抑制剂的筛选上准备了pH7.0的缓冲液，在用于HAO纯化时的含有HAO的划分的确认以及用于土壤直接HAO活性测定上准备了pH5.6的缓冲液。
2.2活性测定的实施法
利用384孔酶标板(酶标板、384孔、无约束力、F-BOTTOM、黑色、Greiner bio-one公司)和分注装置搭载型单色仪式酶标仪(Infinite M1000 PRO：Tecan公司)进行了测定。
2.2.1贮备溶液的混合和分注
液量在一次试验100μL下使用了整个384孔。在一张平板下需要38.4mL的试验溶液。首先，将4倍稀释用的四唑盐的贮备溶液10mL、2倍稀释用的缓冲液贮备溶液20mL、5μM的HAO溶液400μL缓慢进行混合。此时，不仅能够利用HAO溶液，而且还能够利用在平板上干燥保存的HAO。使用16通道电动移液管(VIAFLO II 125μL，INTEGRA公司)，将混合液按照75μL分注到384孔酶标板的各个孔中。
2.2.2基质的添加和测定
将分注基质以外的试剂的384孔酶标板插入酶标仪。首先，通过配置于酶标仪的喷射器，将所谓基质的4倍稀释用的羟胺贮备溶液按照25μL添加至全部孔中，在反应系统中，羟胺相对于刃天青的量为10倍(摩尔比)。此后，立即开始了荧光测定(激发波长462nm：波长宽度20nm，测定波长482nm：波长宽度20nm)。在动力学模式下进行测定，将全部孔每分钟进行一次测定，将其持续了5小时。在常温下进行了测定。测定值以2小时程度达到了最大荧光强度。在活性的比较方面，可以利用酶活性的初速度或者在2小时未满的时间点上的活性值。
3荧光活性测定法的应用
3.1向HAO抑制剂筛选的应用
3.1.1试剂条件的研究
对于将根据刃天青法的HAO荧光活性测定应用于HAO抑制剂的筛选进行了研究。具体而言，对于作为化合物的溶剂大量使用的二甲基亚砜(DMSO)浓度、用于防止成为化合物的非特异性抑制的原因的化学聚集(Chemical aggregation)的表面活性剂浓度进行了研究。根据上述活性测定法，通过在混合贮备溶液时还同时混合这些添加物之类来进行了研究。其结果，在一般所使用的0.03％聚乙二醇辛基苯基醚(表面活性剂)中，没有特别观察到荧光测定的干扰效果。但已知的是，DMSO观察到与其浓度成比例地显著降低荧光，但若其为0.5％程度的DMSO浓度，则可以进行充分的测定(与没有DMSO的情况相比一半程度的活性值)。
3.1.2试验用化合物库的准备
为了缩小向应用刃天青法的筛选实验提供的HAO抑制剂的候选化合物，首先从硅中进行了筛选。
以源自欧洲亚硝化单胞菌的HAO以及源自海洋亚硝化球菌的HAO的晶体结构为基础，针对市售化合物530万种的库(Namiki商事)进行使用新药开发支持软件MOE(CCG公司)的药效团搜索，并探索了基质模仿型的化合物。其结果，获得了1000种命中化合物，实际上购买了70种。其中，将100mM浓度的、可溶于DMSO或水的40种化合物用作筛选用化合物库。
3.1.3筛选的实施
针对筛选用化合物库进行根据刃天青法的HAO荧光活性测定，并验证了这些化合物的阻碍效果。将40种化合物以100mM浓度溶于分子生物学用DMSO(和光纯药工业公司)或超纯水中，进而将2倍稀释系列作成了16系列(100mM、50mM、25mM、12.5mM、6.25mM、3.13mM、1.56mM、0.78mM、0.39mM、0.19mM、97μM、48.8μM、24.4μM、12.2μM、6.1μM、3.1μM)(终浓度是这些浓度的1/200)。作为阳性对照，已知的HAO抑制剂的苯肼也作成了同样的稀释系列。使用16通道电动移液管(VIAFLO II 125μL，INTEGRA公司)，将各浓度的化合物0.5μL添加到384孔酶标板(酶标板、384孔、无约束力、F-BOTTOM、黑色、Greiner bio-one公司)的空孔中。将缓冲液、刃天青溶液、HAO溶液的各贮备溶液的混合液准备400孔份，针对384孔，通过16通道电动移液管(VIAFLO II 125μL，INTEGRA公司)每孔添加75μL(对于每孔的组成而言，两倍稀释用缓冲液为50μL，4倍稀释用400μM刃天青为25μL，5nM HAO为0.5μL)。平板插入带试剂喷射器的荧光酶标仪(Infinite M1000 PRO：Tecan公司)，每孔中添加25μL4倍稀释用4mM羟胺贮备溶液，在反应系统中，羟胺相对于刃天青的量为10倍(摩尔比)。2小时的孵化后进行了荧光测定(激发波长562nm：波长宽度20nm，测定波长592nm：波长宽度20nm)。作为命中化合物发现了荧光强度降至无添加化合物时的10％以下的候选化合物A。
3.1.4候选化合物A的50％抑制浓度的决定
通过根据刃天青法的HAO荧光测定而进行了通过筛选得到的候选化合物A相对于HAO的50％抑制浓度的决定。作为阳性对照用的抑制剂，使用了作为源自欧洲亚硝化单胞菌的HAO的不可逆抑制剂已知的苯肼(东京化成工业公司)。
HAO使用了源自欧洲亚硝化单胞菌的HAO。苯肼及候选化合物A以25mM的浓度溶于DMSO，进而将2倍稀释系列作成了15系列(25mM、12.5mM、6.25mM、3.13mM、1.56mM、0.78mM、0.39mM、0.19mM、97μM、48.8μM、24.4μM、12.2μM、6.1μM、3.1μM、1.5μM)(终浓度是这些浓度的1/200)。作为阳性对照，已知的HAO抑制剂的苯肼也作成了同样的稀释系列。使用移液管，将其按照0.5μL点滴到384孔酶标板。使得各浓度n＝4。
接着，按照上述3.1.3的条件进行了测定。为了求出50％抑制浓度(IC50)，使用GraphPad Prism 6(GraphPad公司)进行了非线性拟合。其结果，苯肼和候选化合物A相对于源自欧洲亚硝化单胞菌的HAO的IC50值分别获得了276nM和43nM。
3.1.5候选化合物A相对于氨氧化细菌的硝化活性的阻碍效果的测定
利用氨氧化细菌(欧洲亚硝化单胞菌)的活菌进行了候选化合物A的硝化抑制效果(氨氧化细菌的硝化活性的阻碍作用)的验证。作为氨氧化细菌，各菌在大量培养后(若达到pH6.0附近则收集细菌)在相同容量的新鲜培养基中进行了交换。将菌体按照100μL分注到384孔深孔板(BIO-BIK公司)。添加了0.5μL各抑制剂的稀释系列溶液(溶于DMSO)(n＝4或3)。以2000rpm搅拌了1分钟。将透气式板密封件(细胞用培养板密封件：AeraSeal公司)贴紧之后，在常温下孵化了12小时。孵化后，以2000rpm搅拌了1分钟。将各孔1μL的培养基移至加入50μL的Greiss试剂A液的384孔酶标板。在各孔中追加了50μL的Greiss试剂B液。显色15分钟后，用酶标仪测定吸光度(545nm)。通过GraphPad Prism 6软件按照指南计算了50％抑制浓度(IC50)。候选化合物A的IC50为1.8μM。该实验参照了Greiss Reagent的文献(Giustarini,D.,Rossi,R.,Milzani,A.,&Dalle-Donne,I.(2008).Nitrite and nitratemeasurement by Griess reagent in human plasma:evaluation of interferences andstandardization.Methods in enzymology,440,361–80.doi:10.1016/S0076-6879(07)00823-3)。
A：2×磺胺贮备溶液
2％(w/w)磺胺(和光纯药工业公司)
12％(v/v)磷酸(磷酸)生物化学用(和光纯药工业公司)
B：2×NED贮备溶液
0.2％(w/w)N-(1-萘基)乙二胺(NED)(和光纯药工业公司)
保存条件：两者均置于遮光仓，并4℃保存
3.2来自含有氨氧化细菌的微生物群落(土壤等)的HAO活性的直接检测
开发了一种从土壤样品等的微生物群落直接测定HAO活性的方法。通过该方法能够推定土壤的氨氧化细菌的菌体量或硝化活性。
将0.5g土壤样品放入12孔板(Corning公司)中。添加了250μL的pH5.6的2倍稀释用磷酸钾缓冲液和125μL的4倍稀释用刃天青贮备溶液。以300rpm旋转振动了5分钟。添加125μL的4倍稀释用羟胺贮备溶液，在反应系统中，羟胺相对于刃天青的量为10倍(摩尔比)。
此时，作为阴性对照，使用了高压灭菌的土壤样品。而且，为了消除由HAO以外的酶产生的刃天青还原活性，准备了添加通过筛选得到的HAO抑制剂候选化合物A的孔。阻化剂候选A的添加浓度设为远高于针对欧洲亚硝化单胞菌的IC50＝1.8μM的100μM。
由于土壤样品含有固形物和悬浮物，因此它会遮挡或漫反射激发光，从而在测定上成为噪声。但是，通过在板孔内的土壤样品上盖住网状物，从而能够将悬浮物固定在孔底而不会阻断水流。具体而言，将0.5g的土壤放入12孔板的孔中，从其上将带网眼杯状的组织筛篮(孔径为74μm且聚酯网直径为15mm的12孔板：康宁公司)嵌入各孔中。需要说明的是，组织筛篮(Net well)是用于在原来网眼杯的上侧放入动植物的组织、并进行移植片培养和免疫染色的构件，如本方法一样，在荧光测定时为了推入固形物而使用的的例子是未知的。此外，由于组织筛篮在板上伸出5mm左右，以那样的状态不能插入到酶标仪(Infinite M1000PRO：Tecan公司)。因此，利用泡沫聚苯乙烯用的电热丝切割机切割组织筛篮的上部之后嵌入至板上，并插入到酶标仪。
在测定中使用酶标仪(Infinite M1000 PRO：Tecan公司)，在动力学模式下每分钟进行了荧光测定(激发波长562nm：波长宽度20nm，测定波长592nm：波长宽度20nm)。在不进行测定的期间，使用酶标仪的摇动(Shake)功能，以150rpm进行旋转震动，在室温(26℃)下进行了孵化。
在荧光强度最强的60分钟孵化时间中，根据未处理的孔和添加阻化剂的孔之间的相对荧光强度之差，求出源自土壤样品中存在的HAO的值。
3.3 HAO的荧光活性染色
通过将含有刃天青的HAO荧光活性测定法的溶液应用于含有进行了非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳即Native-PAGE的HAO的试样，从而显现凝胶内的HAO活性。
3.3.1电泳用样品的调制
在Native-PAGE的样品中，使用了在上述项目1.2.1中调制的欧洲亚硝化单胞菌的破碎上清液。此外，作为标记使用了在上述项目1.3.1中保存的源自欧洲亚硝化单胞菌的纯化HAO。各自的溶液与样品缓冲剂(0.4％溴酚蓝、50％甘油、pH7.5、5mM Tris盐酸盐)1：1进行混合，并向Native-PAGE提供。
3.3.2 Native-PAGE电泳
在Native-PAGE电泳中使用e-PAGEL 15％聚丙烯酰胺现有凝胶(ATTO公司)，并按照说明书进行处理。在电泳层设置凝胶之后，在各孔中分别按照两个泳道(lane)涂抹了(Apply)10μL的样品。凝胶电泳使用Native-PAGE用电泳缓冲剂(25mM Tris盐酸、192mM甘氨酸)，在室温(约25℃)下以300V、20mA通电了80分钟。
3.3.3凝胶的刃天青掺入缓冲液处理
电泳之后，使凝胶在刃天青含有缓冲液30mL(混合了上述项目2.1.2所记载的10mL4倍稀释用刃天青溶液和上述项目2.1.3所记载的20mL 2倍稀释用测定用缓冲液(pH5.6)的溶液)中震动反应5分钟以上，使刃天青含有缓冲液渗入凝胶中。
3.3.4凝胶的可视化
将凝胶从刃天青含有缓冲液移至亚克力托盘上，用KIMWIPE除去了多余的溶液。将上述项目2.1.1中调制的1mL基质的羟胺溶液均匀地涂在凝胶上，几秒后用KIMWIPE除去了多余的溶液。反应约30秒后，通过青色(波长480-530nm)的凝胶成像光源Cyanoview(ATTO公司)和橙色滤光片(ATTO公司)确认带的荧光染色，用数码相机进行了拍摄(图5)。其结果，确认了在欧洲亚硝化单胞菌的破碎上清液的泳道中有一条发出荧光的带。该带的位置存在于与作为标记使用的源自欧洲亚硝化单胞菌的纯化HAO的带同等的位置，并确认了其为HAO的带。根据带的荧光强度可以简单地量化样品中的HAO活性。

Claims (5)

1.一种羟胺氧化还原酶的活性测定方法，其包括：
在刃天青盐的存在下使羟胺氧化还原酶（HAO）与羟胺接触，其中羟胺相对于刃天青盐以至少十倍量的摩尔比接触，并在pH 4.6至7.6下进行测定。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其中，测定的对象为土壤、堆肥、活性污泥或者为将土壤、堆肥、活性污泥以非变性状态进行电泳所获得的聚丙烯酰胺凝胶。
3.一种羟胺氧化还原酶的制造方法，其包括：
从含有羟胺氧化还原酶的试样中纯化羟胺氧化还原酶，
其中通过权利要求1或2所述的测定方法来测定羟胺氧化还原酶的活性。
4.根据权利要求3所述的制造方法，其包括：对纯化得到的羟胺氧化还原酶进行干燥。
5.一种羟胺氧化还原酶抑制剂的筛选方法，其包括：
在刃天青盐的存在下使羟胺氧化还原酶与羟胺以及候选化合物接触，其中羟胺相对于刃天青盐以至少十倍量的摩尔比接触，并在pH 4.6至7.6下进行测定。
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