SE462166B - Toxicitetstest med luminescenta bakterier - Google Patents

Description

462 166 2 Det har föreslagits att mikroorganismer kan användas för analys av prover för detektering av olika substanser. Således beskriver den amerikanska patentskriften 3.370.175 använd- ningen av luminescenta mikroorganismer för detektion av toxiska substanser i luft. Metabolismen hos de luminiscenta mikroorganismerna påverkas negativt av låga nivåer av toxi- kanter och intensiteten av avgiven ljusmängd påverkas. Genom registrering av ändringar i avgiven ljusmängd kan närvaron och den relativa koncentrationen av en toxikant bestämmas. Lik- nande system beskrives i de amerikanska patentskrifterna 3.849.653 och 3.958.938.

De i US-3.370.175 och i andra patent beskrivna systemen är specifikt anpassade för påvisning av toxiska substanser i ånga, aerosol eller gas och erfordrar att mikroorganismkul- turerna föreligger i ett tillväxtstadium på fasta substrat för att maximal kontakt mellan den för testning avsedda luften och kulturen skall åstadkommas. Som en följd därav är dessa system icke anpassade till användning i vätskemiljö och kan icke med lätthet användas för testning av vatten och andra vätskor. Vid användning av dessa system föredrar man att omgivningens be- tingelser ifråga om fuktighet och temperatur upprätthålles vid optimal nivå för att understödja den fortsatta tillväxten av mikroorganismkulturen. Detta är nödvändigt, eftersom samma kultur åter användes ett flertal gånger.

Nämnda system är bristfälliga antingen genom att de är tids- ödande, besvärliga och dyrbara att köra eller att de icke är lämpliga att användas vid testning av toxiska substanser i vätskemiljö.

Uppfinningen avser en metod för testning av vätskor med av- seende på närvaron av toxiska substanser däri. Enligt metoden användes en biologisk organism som indikator och är särskilt lämplig för påvisning av toxiska föroreningar i vatten. Test- resultat kan korreleras med "fisktester", beskrivna ovan, vi ka för närvarande utgör den lämpligaste biologiska metoden för påvisning av toxiska substanser i vatten. 3 462 166 Enligt uppfinningen blandas ett material misstänkt för att innehålla en toxisk substans med en vattensuspension av luminescenta mikroorganismer valda bland Photobacterium, Vibrio, Achromobacter, Lucibacterium och blandningar därav, såsom P. splendidum, P. mandapamensis, P. phosphoreum, V. fischeri, A. fischeri, L. harveyi och blandningar därav med känd angiven ljusmängd. Efter blandning av materialet och vattensuspensionen uppmätes den avgivna ljusmängden i bland- ningen. Om en substans toxisk mot mikroorganismerna är när- varande kommer den avgivna ljusmängden i blandningen att avvika från den av suspensionen före sammanföringen och stor- leken av avvikelsen är approximativt proportionell mot kon- centrationen av toxisk substans i det för testning avsedda materialet.

Vid praktisk tillämpning av uppfinningen suspenderas mikro- organismerna i ett vattenmedium, såsom en saltvattenlösning under testperioden och eftersom det icke är nödvändigt att kulturen verkligen tillväxer vid tidpunkten för testet, be- redes de luminescenta mikroorganismerna med lätthet för an- vändning genom att man helt enkelt avlägsnar mikroorganismer- na från deras tillväxtkultur och suspenderar dem i vatten- mediet.

Det har vid tillämpning av metoden enligt uppfinningen visat sig att den temperatur vid vilken mikroorganismsuspensionen upprätthålles kan påverka känsligheten och avgiven ljusmängd av mikroorganismen. Ehuru det icke är kritiskt, är det sär- skilt lämpligt att temperaturen i provet och mikroorganism- suspensionen kontrolleras för uppnående av bästa möjliga re- sultat.

Enligt uppfinningen föreligger de som biologisk indikator använda mikroorganismerna i lyofiliserad form före använd- ningen. I en sådan form rekonstitueras mikroorganismerna med lätthet för i huvudsak omedelbar användning genom tillsats av destillerat vatten till den lyofiliserade mikroorganismen.

Mikroorganismen kan således med lätthet upprätthållas i 462 166 stabilt tillstånd för transport och förvaring, tills den erfordras för teständamål.

Andra fördelar och kännetecken för uppfinningen framgår av den följande detaljerade beskrivningen av uppfinningen i kombina- tion med de åtföljande ritningarna.

Fig. l avser ett flödesschema av en avgiven ljusmängd-sensor använd enligt uppfinningen.

Fig. 2 visar sambandet mellan fenolkoncentration och avgiven ljusmängd av en luminescent mikroorganism.

Uppfinningen avser således ett förfarande för påvisning av toxisk substans eller toxiskt tillstånd i vätskor med använd- ning av luminescenta mikroorganismer såsom biologisk indikator.

Uttrycket "vätska" inkluderar och omfattar varje livsupprätthållande vätska, som typiskt omfattar en väsentlig mängd vatten och en mindre proportion av andra komponenter lösta eller suspenderade däri. Metoden enligt uppfinningen användes således för påvisning av toxiska substanser eller toxiska tillstånd i vattenförråd, avrinnande ytvatten och liknande. Metoden kan dessutom användas för påvisning av toxiska substanser eller toxiskt tillstånd i kroppsvätskor och sera och andra vätskor som uppvisar en vatten- bas och som upprätthåller livsformer; Uttrycket "tillstånd" avser häri den miljö för mikroorganismerna som tillhandahållas av en vätska.

En substans eller ett tillstånd anses toxiskt, om det skadligt påverkar de metaboliska processerna av de biologiska indikatorer som användes enligt uppfinningen, vilket påvisas genom en ändring i avgiven ljusmängd. Ehuru ett stort antal olika toxiska substan- ser och tillstånd kan påvisas med metoden enligt uppfinningen, är vissa substanser särskilt välkända för att vara toxiska mot livsformer i relativt små koncentrationer. Dessa substanser kan man finna i strömmar, floder och andra vattenkällor föro- renade av industriellt och agrikulturellt avfall och såsom en följd därav är toxicitetstester för vatten normalt anpassade för påvisning av närvaron av dessa substanser. s 462 166 Således har oorganiska material, såsom kvicksilver-, krom-, bly- och zinkföreningar, ammoniak, nitrater, forforföreningar, sulfater och kopparföreningar, samtliga identifierats från olika källor såsom närvarande i vatten förorenat av industriellt avfall. Dessutom är organiska föreningar, såsom DDT, fenol, lindan, heptaklor, aldrin, toluen, 7-l2-dimetylbensantracen, 3-metylkolantren, benseden, o-aminoazotoluen, 4-dimetyl-amino- azobensen, pentaklorfenol, koltetraklorid, aceton, timersol, natriumlaurinsulfat och klordan, exempel på olika herbicider, pesticider, ytaktiva medel och andra organiska produkter som kan förväntas vara närvarande i vatten förorenat genom industriella och agrikulturella aktiviteter.

Nämnda lista är icke avsedd att vara uttömmande och exemplifierar endast det stora antalet substanser, vilkas närvaro eller från- varo omfattar tillstånd toxiska för biologiska organismer. Fler- talet industriella avfall omfattar blandningar av material vilka anses vara föroreningar, av vilka ett eller flera är närvarande i tillräcklig koncentration för att skadligt påverka de meta- boliska processerna av den biologiska indikatorn och således ger upphov till toxiska tillstånd.

Den toxiska substansen behöver inte vara särskilt löslig i testvätskan. Det bör emellertid beaktas att för att en substans skall vara toxisk eller producera ett toxiskt tillstånd måste den uppvisa tillräckliga fysikaliska eller kemiska egenskaper för att möjliggöra att den antingen absorberas i toxiska mängder eller skadligt påverkar den vätska i vilken den är innesluten, antingen fysikaliskt eller kemiskt för produktion av ett toxiskt tillstånd i vätskan. I huvudsak alla toxiska substanser för vilka ett test önskas uppfyller det ena eller båda av dessa krav.

Det med avseende på toxicitet testade materialet behöver från början icke utgöras av en vattenhaltig vätska. Således kan exempelvis material för testning med avseende på toxicitet föreligga i form av ett finfördelat pulver, som därefter kan solubiliseras eller dispergeras i en vattenbas eller sättas direkt till vattensuspensionen av mikroorganismer. 462 166 6 Luminescenta mikroorganismer är i hög grad känsliga för toxiska substanser eller tillstånd utan hänsyn till stammen eller arten av mikroorganismen. Vissa mikroorganismstammar har emellertid visat sig vara känsligare för en speciell substans eller ett givet tillstånd och uppvisar således en mera uttalad ändring av den avgivna ljusmängden, när de föreligger i kontakt med sådana substanser eller sådana tillstånd, än stammar som är mindre känsliga för samma substans eller tillstånd. Det är där- för särskilt lämpligt att använda en mikroorganismstam som väljes med avseende på sin känslighet vid exponering mot en given sub- stans resp. tillstånd. Det ligger även inom ramen för uppfinningen att använda en blandning av mikroorganismstammar, av vilka de individuella stammarna är särskilt känsliga för givna sub- stanser eller tillstånd. Den totala effekten av blandningen av stammar är att tillhandahålla förbättrad och breddad känslig- het för valda varianter av substanser eller betingelser.

Det är emellertid icke nödvändigt att känna den exakta toxiska substansen resp. tillståndet i testmaterialet. Såsom nämnts ovan är luminescenta mikroorganismer i hög grad känsliga för toxiska substanser och oavsett stam eller art kommer de att ge en ändring av den avgivna ljusmängden i närvaro av en toxisk sub- stans resp. tillstånd i testvätskan. Såsom närmare förklaras i det följande utgör ändringen av avgiven ljusmängd av mikro- organismerna en lämplig indikation på koncentrationen av toxisk substans i testvätskan.

Flera bakteriestammar är kända för att uppvisa kraftig lumine- scens inom förloppet av sin tillväxtcykel. Särskilt välkända och med lätthet tillgängliga arter av luminescenta bakterier omfattar Photobacterium, såsom P. splendidum, P. mandapamensis och P. phosphoreum. Stammar av bakterier från släktet Vibrio uppvisar likaledes luminescens, såsom exempelvis V. fischeri, såväl som mikroorganismer från släktet Lucibacterium, såsom L. harveyi och Achromobacter.

Lmmnesuanz.bædæmieUa, och fungala mikroorganismer är tillgäng- liga från the American Type Culture Collection, 12301 Parkland 'l 7 462 166 Drive, Rockville, Maryland eller Northern Regional Research Laboratories, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, såväl som från många komersiella och universitetslaboratorier.

Typiskt får förrådskulturerna av bakterierna eller fungi till- växa från en tidigare kultur genom att man överför en portion av cellerna från den gamla kulturen till ett näringsmedium, vari de tillåtes tillväxa och mångfaldigas. Valet av medium an- vänt för odling av kulturen är beroende av den typ av kultur som användes och det sätt på vilket mikroorganismerna därefter skall behandlas vid beredning av deras användning enligt upp- finningen.

Ett särskilt lämpligt tillväxtmedium för de mera vanliga luminescenta organismerna omfattar typiskt upp till ungefär 2 % agar, ungefär 0,25 till 0,7 % natrium- eller kaliumpyro- fosfat, ungefär 0,5 % glycerol, mellan 0,5 % och ungefär l % peptoner (animaliska och/eller vegetabiliska), upp till unge- fär l % hydrolyserat kasein och ungefär 0,5 % till 5 % natrium- klorid, varvid resten utgöres av vatten. pH i tillväxtmediet varierar företrädesvis ungefär mellan 6,5 och 7,5, och ligger företrädesvis vid ungefär 7,0. För marina mikroorganismer kan sjövatten användas i stället för vattnet i näringsmediet. Vidare kan alltefter den stam av mikroorganismer som odlas ett extrakt, såsom köttextrakt, bläckfisk- eller fiskextrakt, vara i hög grad fördelaktigt i näringsmediet.

Luminescenta fungi odlas lämpligen i en odlingsvätska på vatten- basis med ungefär lO % brödsmulor och artificiellt näringsmedel eller kokt körsbärsodlingsvätska. De kan även odlas på ett fast agarnäringsmedel, omfattande exempelvis 2 % agar och lO % bröd- smulor och vatten.

Enligt förfarandet enligt uppfinningen tas en viss mängd celler ur en växande kultur av luminescenta mikroorganismer och mikroorganismerna suspenderas i en salt- vattenlösning för bildning av en användbar suspension av cellerna i och för användning i en ljusavkännande apparat. Koncentrationen av celler i suspensionen är icke kritisk och kan variera inom ett 462 166 s brett intervall. En tillräcklig mängd celler bör emellertid vara närvarande i suspensionen så att den totalt avgivna ljus- mängden av den använda suspensionen ligger inom det påvisnings- bara intervallet för ljusavkänningsanordningen använd vid metoden. För bildning av en användbar suspension av celler från en växande kultur är det lämpligt att först bereda en förråds- suspension, som är mycket mer koncentrerad än nödvändigt.

Den användbara suspensionen beredes därefter genom utspädning av portioner från förrådslösningen, tills en önskad nivå av inten- siteten av avgiven ljusmängd (avgiven baslinjeljusmängd) erhålles.

Vid arbete med lyofiler inställes koncentrationen av celler före lyofiliseringen och en arbetssuspension med den önskade baslinjen framställes genom att man helt enkelt sätter destillerat vatten till lyofilen. Den avgivna baslinjeljusmängden registreras för varje suspension före införing av testvätskan. Baslinjen har till uppgift att vara en referens för den avgivna ljusmängden, från vilken sedan avvikelser i avgiven ljusmängd uppmätes, Det är uppenbart att en variation eller fluktuation i baslinjen på grund av orsaker andra än den toxiska substansen resp. till- ståndet som testas med avseende på sådana variationer inte är önskvärd och kan leda till missvisande eller falska avläsningar, såvida man icke kompenserar detta med det ljusavkännande medlet.

Det är icke onormalt att den avgivna baslinjeljusmängden kan variera från arbetssuspensionen under en viss tidrymd. Ändringen av avgiven ljusmängd i frånvaro av en toxisk substans resp. till- stånd betraktas såsom baslinjedrift och bsstämmes typiskt med användning av en kontroll för varje serie av tester med använd- ning av en speciell stam av mikroorganismer. När testprocedurerna tillåter, bestämes baslinjedriften företrädesvis för varje arbets- suspension. Baslinjedriften är icke ovanlig vid många fotometriska analytiska system och kan kompenseras med lämpliga medel, såsom elektronisk eller manuell kontroll eller kompenserande instrumenta- tion, såsom är allmänt känt. Baslinjedriften upprätthålles före- trädesvis vid ett minimum, eftersom en låg baslinjedrift möjlig- gör användningen av enklare och typiskt mindre dyrbar instrumen- tation såsom ljusavkännande medel.

Det har visat sig att det suspenderade mediet kan ha en väsentlig effekt på omfattningen av driften i baslinjen. Goda resultat upp- 'x 9 462 166 nås, när det suspenderade mediet innehåller ungefär 0,5 till 6 viktprocent natriumklorid, varvid ungefär 2-6 % natriumklorid är lämpligt, speciellt 3 % natriumklorid. Dessa saltkoncentra- tioner liknar i huvudsak de saltkoncentrationer som användes i näringsmediet under odlingscykeln av cellerna. Man har även funnit att goda resultat uppnås, när det suspenderade vatten- mediet omfattar mindre mängder av andra salter, såsom natrium- sulfat och natriumpyrofosfat, och näringsmedel, såsom jästex- trakt. Ehuru det icke är fullständigt känt varför tillsatsen av nämnda komponenter i det suspenderade mediet förbättrar stabiliteten av avgiven ljusmängd och reducerar baslinjedrift i suspensionen, förmodar man att då cellerna icke är aktivt tillväxande i antal, bör det suspenderade mediet fortfarande tillhandahålla en miljö för upprätthållande av cellmetabolism vid en acceptabel nivå, så att avgiven ljusmängd förblir relativt stabil. Ett särskilt lämpligt suspenderande medium omfattar förutom natriumklorid, mellan l och ungefär 10 mikro- gram/ml jästextrakt och ungefär mellan 50 och 250 mikrogram/ml natriumpyrofosfat.

När man framställt suspensionen av luminescenta mikroorganismer enligt ovan och avkänt och registrerat den avgivna baslinje- ljusmängden av suspensionen införes ett prov misstänkt för att innehålla en toxisk substans eller uppvisar toxiskt tillstånd i kehållaren tillsammans med arbetssuspensionen. Innehållet omröres för omsorgsfull blandning av suspensionen och det in- förda materialet. En ändring av den avgivande ljusmängden bestämmas antingen genom uppmätning av den totala ändringen av avgiven ljusmängd under en given tidsperiod eller omfatt- ningen av ändringen av avgiven ljusmängd. om ändringen av avgiven ljusmängd uppmätes såsom omfattningen av ändringen eller såsom den totala ändringen under en given tidsperiod beror på faktorer såsom typen och koncentrationen av den toxiska substansen, känsligheten av mikroorganismen, medel för avkänning av den avgivna ljusmängden och liknande, och den metod som användes kan med lätthet fastställas genom på förhand utförda försök med mikroorganismen och testvätskan. 462 166 l° Närvaron av en toxisk substans resp. tillstånd indikeras av en ändring i den avgivna ljusmängden av mikroorganismsuspensionen jämfört med den avgivna baslinjeljusmängden. I allmänhet med- för den toxiska substansen resp. tillståndet en reduktion av avgiven ljusmängd, även om, beroende på stammen av mikroorga- nism, vissa toxiska substanser eller tillstånd kan förorsaka åtminstone en temporär ökning av den avgivna ljusmängden av mikroorganismsuspensionen. Omfattningen av ändringen av den avgivna ljusmängden står i relation till koncentrationen av den toxiska substansen eller omfattningen av det toxiska till- ståndet.

Med användning av standardkurvor kan man således bestämma kon- centrationen av en given toxisk substans under antagande att den toxiska substansen är identifierad. Vidare kan en korrela- tion fastställas mellan resultaten av föreliggande metod och de resultat som man erhåller enligt det s.k. "fisk"-testet, det test som vanligen användes för närvarande vid försök att bestämma närvaron av en toxisk substans i vatten.

Varje lämpligt ljusavkänningsmedel kan användas enligt upp- finningen för avkänning av den avgivna ljusmängden från vat- tensuspensionen av mikroorganismer och den därefter bildade blandningen av mikroorganismer och testmaterialet. Såsom är allmänt känt inom detta område finns det olika typer av foto- metriska och optiska analytiska instrument, vilka samtliga arbetar enligt samma allmänna principer.

I fig. l visas i diagramform ett fotometriskt system lämpligt för påvisning av den avgivna ljusmängden från de luminescenta mikroorganismerna och indikeras allmänt genom hänvisning till siffran 10. I sina bredaste aspekter inkluderar systemet 10 en lämplig cell, kyvett eller behållare 12, vari suspensionen av luminescenta mikroorganismer och testprovet bevaras för mät- ning av den avgivna ljusmängden. En ljusdetektor, såsom en multiplikatorfotocell 14, eller en fotocell, anbringas i ett ljusinverkande samband med behållaren l2 under alstring av en ström av låg spänning, som står i relation till intensiteten ll 462 166 av ljusets inverkan på detektorn. Den från cellen l4 avgivna ljusmängden föres igenom en fotocellförstärkare l6, vari den avgivna ljusmängden förstärkes och därefter föres till ett indikatormedel, såsom en mätare 18. Valet av indikatormedel är icke kritiskt och istället för eller i anslutning till mäta- ren 18 kan man i systemet inkludera ett registreringsdiagram eller en digital avläsningsanordning av konventionell typ.

Det bör även observeras att temperaturen i arbetssuspensionen påverkar känsligheten och den aktuella från mikroorganismerna avgivna ljusmängden i arbetssuspensionen. Det är således sär- skilt fördelaktigt att köra alla tester med en speciell stam av mikroorganismer och en speciell toxikant vid samma tempera- tur för tillförsäkrande av reproducerbarhet av resultaten. Med toxikanter såsom fenol har det således visat sig att för en given koncentration av toxikanten minskar den aktuella procen- tuella minskningen av den avgivna ljusmängden av en arbets- suspension av mikroorganismen med ökande temperatur. Med andra toxikanter, såsom isopropylalkohol, ökar den procentuella av- givna ljusmängden i arbetssuspensionen med ökande temperatur.

Det är således särskilt lämpligt, särskilt när man arbetar med nya testprover, att registrera ändringen av avgiven ljusmängd i arbetssuspensionen inom ett intervall av temperaturer mellan ungefär l0°C och ungefär 30°C. Den lämpligaste testtempera- turen är den temperatur vid vilken den maximala ändringen i avgiven ljusmängd registreras. Detta indikerar den temperatur vid vilken mikroorganismen har maximal känslighet för toxi- kanten eller blandningen av toxikanter i testlösningen.

När reproducerbarheten av resultat eller maximal känslighet icke är av större betydelse, kan metoden utföras med en arbets lösning vid rumstemperatur inom fotometern. I vilket fall som helst bör arbetssuspensionen tillåtas antaga en stabil tempe- ratur före avläsningen av den avgivna ljusmängden på grund av att ändringar i temperaturen även påverkar den avgivna baslin- jeljusmängden och resulterar i en onödigt ökad baslinjedrift.

I följande exempel stabiliserades arbetssuspensionen vid rums- temperatur i fotometern innan man registrerade den avgivna ljusmängden. 462 166 12 Uppfinningen åskådliggöres närmare medelst följande exempel, vari de angivna temperaturerna avser Celsius-grader.

ExemBel'l.

Luminescenta bakterieceller för användning vid toxicitets- testning bereddes genom att man ympade agarmedier för bildning av kulturer av V. fischeri, P. phosphoreum, ATCC 11040; P. mandapamensis, ATCC 27561; L. harveyi, ATCC 14126 och A. fischeri, NRRL B-lll77. Agarmediet innehöll följande komponenter: KHZPO4 0,25 viktprocent NaCl 3,0 " Glycerol 0,5 " Jästextrakt 0,1 " Polypepton 0,5 " Hydrolyserad kasein 1,0 " Bläckfiskextrakt 10,0 volymprocent Agar 1,5 viktprocent Destillerat vatten 90,0 volymprocent Bläckfiskextraktet framställdes genom att man homogeniserade 454 g hel bläckfisk med en tillräcklig mängd destillerat vatten för att inställa den slutliga volymen på 1 liter. Upp- slamningen autoklaverades 15 minuter vid 1210 och den bildade suspensionen klarades genom centrifugering.

Efter 24 timmars tillväxt vid 220 avlägsnades cellerna från var och en av kulturerna och suspenderades i 3 %-ig vattenlös- ning av natriumklorid (pH 7,1) för bildning av en förrâds- suspension av var och en av cellkulturerna. Förrådssuspensionen omrördes kraftigt för att tillförsäkra homogen suspension.

En arbetssuspension framställdes ur var och en av förrâds- lösningarna genom att man utspädde portioner om 10 mikroliter av varje förrâdslösning i 2 ml av ett suspenderande vatten- medium. Det suspenderande mediet bestod av en natriumklorid- vattenlösning (3 viktprocent) som innehöll 135 mikrogram/ml natriumpyrofosfat och 5 mikrogram/ml i handeln tillgängligt jästextrakt (Diffco Laboratories, Detroit, Michigan).

B 462 166 Den avgivna baslinjeljusmängden i arbetslösningarna bestämdes med suspensionerna i huvudsak vid rumstemperatur i en foto- meter försedd med en multiplikatorfotocell och en diagram- registreringsanordning.

Exempel 2.

Luminescenta bakteriecellkulturer odlades i vätskemedier.

Kulturer av P. phosphoreum, ATCC llO4l; P. mandapamensis, ATCC 2756l; L. harveyi, ATCC l4l26 och A. fischeri, NRRL B-lll77 odlades såsom skakkolvskulturer. Odlingsmediet var detsamma som användes i exempel l, med det undantaget att ingen agar användes i odlingsmedierna. Kulturerna odlades i 500 ml tre- dubbelt räfflade kolvar av DeLong-typ, innehållande 100 ml per kolv. Kulturerna odlades l8 timmar vid 220 och under tillväxt- perioden omrördes kulturerna vid 240 varv/minut på en "New Brunswick gyrotary"-skakanordning. Cellerna skördades under den logaritmiska fasen av tillväxt och avskildes från odlings- mediet genom centrifugering. Resulterande pellets av celler från var och en av kulturerna upprätthölls vid 40 före bild- ning av respektive förrâdssuspension på det i exempel l beskriv- na sättet.

Varje förrådssuspension utspäddes för bildning av en arbets- suspension i och för användning i fotometern på samma sätt som i exempel l och baslinjedriften registrerades för var och en av arbetssuspensionerna.

Exempel 3.

Kulturer av P. mandapamensis, ATCC 27561; L. harveyi, ATCC l4l26 och A. fischeri, NRRL B-lll77 framställdes i ett odlings- medium enligt exempel 2. Kulturerna avskildes från odlings- vätskan under den logaritmiska tillväxtfasen genom centrifuge- ring och de bildade cellpellets kyldes till 4O_ Kylda cell- pellets suspenderades i en 3%-ig natriumkloridlösning, upprätt- hållen vid en temperatur av 40. Natriumkloridlösningen sattes till suspensionen, till en homogen cellsuspension med en slutlig optisk densitet av l60 erhölls. 462 166 14 Cellsuspensionen blandades med en mjölkvattenlösning (20 vikt- procent skummjölk, 2 viktprocent NaCl, pH 7,1) i ett volymför- hållande av en del cellsuspension per 19 delar mjölklösning.

Cellmjölksuspensionen fördelades i portioner om l ml i 10 ml- vialer och frystes snabbt vid en temperatur av -50°. Cellerna torkades sedan vid -50 under 18 timmars 55 mikron-vakuum. Vialerna vakuumförseglades sedan.

Arbetssuspensionena av var och en av de lyofiliserade proverna framställdes genom tillsats av l ml destillerat vatten till via- lerna. De bildade suspensionerna uppvisade en god avgiven bas- linjeljusmängd.

Exempel 4.

Arbetssuspensioner av flera arter av luminescenta bakterier odlade och framställda enligt exempel l, 2 och 3 försattes med olika koncentrationer av substanser kända för att vara toxiska mot biologiska organismer för bestämning av inverkan på den avgivna ljusmängden i det åstadkomna systemet.

Följande toxiska substanser användes för att skapa toxiska tillstånd: fenol, natriumlaurinsulfat, en blandning av olika substanser benämnd blandning 401 och ett träkonserverings- medel såsom penta, som bestod av 3,5 % pentaklorfenol, 65 % mineralterpentin och 32,5 % inerta komponenter.

Referensblandningen 401 framställdes genom tillsats av 3,82 g NH4Cl, 0,093 g K2CrO4, O,l28 g Na2S.9H2O, 0,20 g kaolin, 0,1 g fenol och 1,28 ml brännolja nr. 2 till 100 ml destillerat vatten.

Testerna utfördes genom nedföring av mellan 10 och 100 mikro- liter av lösningar av den toxiska substansen i en kyvett, innehållande en arbetssuspension av celler för vilken baslinjen och baslinjedriften registreras. Efter införing av den toxiska substansen vändes kyvetterna flera gånger upp och ned för till- försäkrande av omblandning av suspensíonen och det material som innehöll den toxiska substansen. Kyvetterna insattes i foto- metern och den procentuella sänkningen av ljusmängden bestämdes 15 462 166 efter en period av två minuter från tillsatsen av den toxiska substansen. Kontrollprover bestående av en arbetssuspension av var och en av kulturerna och lO mikroliter av en 3%-ig natrium- kloridlösning kördes parellellt med testproverna.

Resultaten anges i tabellerna A, B och C. I varje enskilt fall uttryckes koncentrationerna av de toxiska substanserna i mg/liter, med undantag för blandning 401, som uttryckes i volymprocent av blandningen i testlösningen.

Tabell A visar resultaten för luminescenta celler odlade enligt exempel l. Tabellerna B och C uppvisar resultaten för celler odlade och beredda enligt exemplen 2 resp. 3. 462 166 16 Tabell A Procentuell sänkning av ljusmängd Koncentrationer av ATCC ATCC ATCC NRRL Vibrio testade toxikanter -~ 27561 14126 11040 B-11177 Fischeri 3 % NaCl (kontroll) 0 0 0 0 O Fenol 50 mg/1 20 26 9 13 10 100 mg/1 55 40 18 23 20 250 mg/1 95 91 33 51 41 Natriumlaurylsulfat 25 mg/1 20 19 17 67 21 50 mg/1 40 36 31 90 81 100 mg/1 94 33 12 89 83 Referensblandning 401 0,5 % 9 2 3 7 1,0 % 14 2,5 % 24 18 23 26 Pentaklorfenol 5 mg/1 11 71 85 71 - 10 mg/1 31 73 95 84 - 25 mg/1 61 89 99 90 - Tabell B Celler Procentuell sänkning av ljusmängd Koncentrationer av ATCC ATCC NRRL Vibrio testade toxikanter 27561 14126 B-11177 Fischeri 3 % NaCl (kontroll) 0 0 0 0 Fenol 50 mg/1 36 10 19 26 100 mg/1 50 29 29 37 250 mg/1 37 57 55 52 Natriumlaurylsulfat 25 mg/1 22 48 83 15 50 mg/1 30 45 89 28 100 mg/1 76 69 78 70 Referensblandning 401 0,5 % 7 0 12 12 1,0 % 7 4 14 14 2,5 % 11 1o 16 15 17 462 166 Tabell C Procentuell sänkning av ljusmängd Koncentrationer av ATCC ATCC NRRL Vibrio testade toxikanter 27561 14126 B-11177 Fischeri 3 % NaCl (kontroll) 0 0 0 0 Fenol (PPM) 50 mg/1 7 12 25 13 100 mg/l 20 21 40 27 250 mg/l 28 35 63 50 Natriumlaurylsulfat 25 mg/l 12 33 33 41 50 mg/l 14 40 40 43 100 mg/1 31 56 40 43 Referensblandning 401 0,5 % 3 6 17 ll 1,0 % 10 19 17 2,5 % 9 13 42 23 Ett frystorkat prov av A. fischeri, NRRL B-11177, som odlats och lyofiliserats enligt exempel 3, användes för åskådlig- görande av sambandet mellan koncentration av toxiska substanser och sänkningen av den avgivna ljusmängden efter tvâ minuters exponering.

I kyvetter innehållande l ml av en arbetssuspension av den rekonstituerade luminescenta mikroorganismen (A. fischeri), på vilken baslinjen bestämts på förhand, nedfördes 10 mikroliter av proverna innehållande fenol i olika koncentrationer och kyvetterna vändes upp och ned för tillförsäkrande av god omblandning. Efter två minuter observeredes reduktionen av den avgivna ljusmängden och registrerades såsom procentuell sänkning av ljusmängden. Resultaten visas i tabell D: 462 166 18 Tabell D Fenolkoncentration (PPM) Procentuell sänkning av ljus- mängden efter 2 minuters expone- ring 5 l l0 3 20 10 30 18 40 21 50 25 60 30 70 31 80 37 90 40 lOO 40 Fig. 2 visar ett diagram avseende data i tabell D med koncentrationen av fenol på den vertikala logskalan och den procentuella sänkningen av den avgivna ljusmängden på den horisontella linjära skalan. Vid behandling på så sätt fast- ställes ett direkt samband mellan koncentration av fenol och sänkning av den avgivna ljusmängden.

I de föregående exemplen sattes materialet innehållande de toxiska substanserna till suspensionen av luminescenta mikro- organismer i det suspenderande vattenmediet. Det har emellertid visat sig att när koncentrationen av toxisk substans i vätska är låg, uppnås goda resultat genom att man suspenderar cellerna direkt i vätskan, innehållande den toxiska substansen för bild- ning av arbetssuspensionen. I detta fall sättes en tillräcklig mängd natriumklorid till materialet misstänkt för att innehålla den toxiska substansen för bildning av en 3%-ig lösning av saltet. Den avgivna ljusmängden uppmätes och jämföres med den avgivna ljusmängden i en arbetssuspension av de luminescenta cellerna i endast det suspenderande mediet.

W 12'

Claims (1)

1. /9 462 166 PATENTKRAV Förfarande för snabb biologisk prövning av ett mediums toxicitet genom registrering av dess inverkan på mikroorga- nismers metaboliska processer där en vattensuspension av luminiscenta bakterier valda bland Photobacterium, Vibrio, Achromobacter, Lucibacterium och blandningar därav såsom P. splendidum, P. mandapamensis, P. phosphoreum, V. fischeri, A. fischeri, L. harveyi och blandningar därav bringas i kontakt med mediet och bakteriernas avgivna ljusmängd mätes före och efter kontakten varvid skillanden i avgiven ljusmängd utgör ett mått på mediets toxicitet, k ä n n e t e c k n a t därav, att vattensuspensionen beretts utifrån hela bakterieceller av en lyofiliserad stam av aktuella bakterier, har en halt av lösligt alkalimetallsalt av 0,5-6 viktprocent samt är i övrigt så sammansatt att den tillhandahåller en miljö för upprätt- hållande av bakteriernas cellmetabolism vid en acceptabel nivå och att mediet är en vattenbaserad vätska som tillsättes bakteriesuspensionen i en mängd som är liten i förhållande till mängden vid prövningen använd suspension.