DE2841896A1

DE2841896A1 - Verfahren zum nachweis einer toxischen substanz

Info

Publication number: DE2841896A1
Application number: DE19782841896
Authority: DE
Inventors: Anthony A Bulich; Don L Isenberg; Edward H Sie
Original assignee: Beckman Instruments Inc
Current assignee: Azur Environmental Carlsbad Calif Us
Priority date: 1977-09-28
Filing date: 1978-09-26
Publication date: 1979-03-29
Anticipated expiration: 1998-09-27
Also published as: GB2005018B; JPS5458492A; NL7809821A; JPS5728272B2; BE870833A; CA1103050A; FR2404847A1; SE7810154L; SE462166B; DE2841896C3; DE2841896C2; FR2404847B1; SE462166C; GB2005018A

Description

Patentanwälte Dipl.-lng. Curt Wallach

Dipl.-Phys. Dr.Tir^r7jajilgaap£j

^ Dipl.-lng. Rainer Feldkamp

D-8000 München 2 · Kaufingerstraße 8 · Telefon (0 89) 24 02 75 · Telex 5 29 513 wakai d

Datum: 26. Sept. 1978

Unser Zeichen: 1Ö396 H/Bu

Beckman Instruments, Inc., Fullerton, Calif., USA

Verfahren zum Nachweis einer toxischen Substanz

Die Erfindung betrifft allgemein den Nachweis toxischer Substanzen in Flüssigkeiten und insbesondere ein Verfahren zum Nachweis toxischer Substanzen unter Verwendung von Änderungen in den Stoffwechselprozessen biologischer Organismen als Indikator.

Biologische Organismen bilden einen empfindlichen und verhältnismäßig zuverlässigen Indikator für das Vorliegen selbst relativ kleiner Anteile toxischer Substanzen in einem Strömungsmittel. Mit zunehmender Besorgnis wegen der Verunreinigung von Wasser und der schädlichen Auswirkung toxischer Substanzen auf den Menschen wurde die Umweltschutzbehörde ("Environmental Protection Agency" = US-Umweltschutzbehörde) mit der Verantwortlichkeit für die Aufstellung von Vorschriften und Testverfahren für den Nachweis des Vorliegens toxischer Substanzen in Wasser betraut. Das derzeit von den meisten Forschern auf diesem Gebiet bevorzugte Testprogramm bzw. -protokoll sieht vor, daß man biologische Organismen, wie beispielsweise kleine Fische oder Wasserflöhe,

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ORIGINAL !RSPECTED

mit dem zu untersuchenden Wasser in Berührung bringt. Das Vorliegen toxischer Substanzen wird hierbei durch gestörtes zielloses physiologisches Ansprechverhalten oder gar durch den Tod der Fische oder Wasserflöhe angezeigt; die Konzentration des toxischen Materials wird aus der Überlebensrate der Organismen bestimmt. Diese Tests sind zeitaufwendig und kostspielig. So werden beispielsweise bei der Verwendung von Elritzen zur Testuntersuchung von Wasser auf toxische Substanzen die Tests über eine Zeitperiode von 48 bis 96 Stunden durchgeführt; für die Stabilisierung der Elritzenpopulation vor den tatsächlichen Tests ist noch eine viel längere Zeit, in der Größenordnung von 1 bis 4 Wochen, erforderlich. Abgesehen von den langen Testdauern kann auch wegen der Besonderheit jeder jeweiligen für das Testverfahren verwendeten Fischpopulation die Erzielung reproduzierbarer Ergebnisse Schwierigkeiten bereiten.

Man hat auch bereits vorgeschlagen, Mikroorganismen zur Testanalyse von Proben zum Nachweis verschiedener Substanzen zu verwenden. So wird beispielsweise in der US-Patentschrift 3,370,175 die Verwendung lumineszierender Mikroorganismen für den Nachweis toxischer Substanzen in Luft beschrieben. Der Stoffwechsel der Leucht-Mikroorganismen wird durch niedrige Pegelwerte von Schadstoffen beeinflußt, was sich wiederum auf die Intensität der Lichtemission auswirkt. Durch Messung von Änderungen der Lichtausgangsleistung lassen sich das Vorliegen und die relative Konzentration eines toxischen Schadstoffes nachweisen. Ähnliche Systeme sind in den US-Patentschriften 3,849,653 und 3,958,938 beschrieben.

Die in den vorstehend genannten Patentschriften beschriebenen Systeme sind speziell für den Nachweis toxischer Substanzen in Dampf, Aerosol oder Gasform bestimmt und setzen voraus, daß die Mikroorganismen-Kulturen sich in einem Wachsturnszustand auf Festkörpersubstraten befinden, um einen maximalen Kontakt

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zwischen der zu untersuchenden Luft und der Kultur zu gewährleisten. Diese bekannten Systeme eignen sich daher nicht zur Verwendung in einer Plüssigkeitsumgebung und sind daher für die Testuntersuchung von Wasser und anderen Flüssigkeiten nicht gangbar. Für die Anwendung dieser Systeme sollen vorzugsweise die Umgebungsbedingungen hinsichtlich Feuchtigkeit und Temperatur auf bestimmten optimalen Pegelwerten gehalten werden, um ein kontinuierliches Wachstum der Mikroorganismenkultur zu gewährleisten. Dies ist erforderlich, da die gleiche Kultur mehrere Male immer wieder verwendet wird.

Insgesamt besitzen die vorstehend beschriebenen bekannten Systeme nach dem Stand der Technik den Nachteil, daß sie entweder zeitaufwendig, schwierig und kostspielig in der Durchführung sind, oder daß sie sich nicht zur Anwendung für die Testuntersuchung toxischer Substanzen in flüssiger Umgebung eignen.

Der Erfindung liegt daher als Aufgabe die Schaffung eines einfach und schnell und mit geringen Kosten durchführbaren Testverfahrens zum Nachweis toxischer Substanzen in flüssiger Umgebung zugrunde, das auf der Verwendung eines biologischen Organismus als Indikator beruht und sich insbesondere zum Nachweis toxischer Pollutionssubstanzen in Wasser eignet. Die mit dem erfindungsgemäßen Testverfahren erzielten Ergebnisse sollen mit den oben erwähnten "Fisch-Tests" korrelierbar sein, welche die derzeit bevorzugte biologische Testmethode für den Nachweis toxischer Substanzen in Wasser darstellen.

Nach dem Grundgedanken der Erfindung wird zu diesem Zweck ein Material, das verdächtig ist, eine toxische Substanz zu enthalten, mit einer wäßrigen Suspension von Leuchtmikroorganismen bekannter Lichtausgangsleistung vermischt. Nach dem Vermischen des toxizitätsverdächtigen Materials mit der wäßrigen Suspension wird die Lichtausgangsleistung des Gemischs ge messen. Im Fall des Vorliegens einer für die Mikroorganismen

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toxischen Substanz wird die Lichtausgangsleistung des Gemischs vom Wert der Lichtausgangsleistung der Suspension vor der Berührung mit dem Material abweichen und der Betrag der Abweichung ist angenähert proportional der Konzentration der toxischen Substanz in dem zu untersuchenden Material.

Für die praktische Durchführung der Erfindung werden die Mikroorganismen während des TestVerfahrens in einem wäßrigen Medium, wie beispielsweise einer wäßrigen Salzlösung suspendiert; da es nicht erforderlich ist, daß die Kultur sich im Zeitpunkt des Tests tatsächlich im Wachstumszustand befindet, kann die Gewinnung und Vorbereitung der Lumineszenzmikroorganismen zur Verwendung in dem Test in einfacher Weise dadurch erfolgen, daß man die Mikroorganismen aus ihrer Wachstumskultur entnimmt und in dem wäßrigen Medium suspendiert.

Bei der praktischen Erprobung, des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde festgestellt, daß die Temperatur, auf welcher die Mikroorganismen-Suspension gehalten wird, die Empfindlichkeit und die Lichtausgangsleistung der Mikroorganismen beeinflussen kann. Obzwar dies keine kritische Bedingung ist, wird daher zur Erzielung bester Ergebnisse eine Überwachung der Temperatur der Probe und der Mikroorganismensuspension vorgezogen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung liegen die als biologische Indikator verwendeten Mikroorganismen vor der Verwendung in lyophilisierter Form vor. In dieser Form lassen sich die Mikroorganismen in einfacher Weise durch Zugabe von destilliertem Wasser zu den lyophilisierten Mikroorganismen zur praktisch sofortigen Verwendung rekonstituieren. Die Mikroorganismen können daher bis zur tatsächlichen Verwendung für Testzwecke in bequemer Weise zum Versand und zur Aufbewahrung in stabilem Zustand gehalten werden.

Ia folgenden werden Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand

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der Zeichnung beschrieben; in dieser zeigen

Fig. 1 ein Blockdiagramm einer für die Durch

führung der Erfindung verwendeten Anordnung zur Lichtausgangsmessung,

Pig. 2 die Beziehung zwischen der Lichtausgangs

leistung eines Leuchtmikroorganismus in Abhängigkeit von einer Phenolkonzentration.

Die Erfindung gibt, wie dargelegt, ein Verfahren zum Nachweis einer toxischen Substanz oder eines toxischen Zustands in Flüssigkeiten anhand, unter Verwendung von Leucht-Mikroorganismen als biologischer Indikator. Der Begriff "Flüssigkeit" soll dabei jede zur Aufrechterhaltung von Leben geeignete Flüssigkeit umfassen, die somit typischerweise einen größeren Anteil Wasser und einen kleineren Anteil anderweitiger Bestandteile in darin gelöster oder suspendierter Form aufweist. Das erfindungsgemäße Verfahren kann daher zum Nachweis toxischer Substanzen oder toxischer Zustände in Wasserversorgungen, ablaufenden Oberflächengewässern u.dgl. dienen. Darüber hinaus eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren zur Anwendung beim Nachweis toxischer Substanzen oder eines toxischen Zustands in Körperflüssigkeiten und Seren, sowie anderweitigen Strömungsmedien auf wäßriger Grundlage, in welchen Leben bestehen kann.

Unter der Bezeichnung "Zustand" in dem hier verwendeten Sinn soll die von einer Flüssigkeit gebildete Umgebung für Mikroorganismen verstanden werden.

Eine Substanz oder ein Zustand werden dann als toxisch angesehen, falls er die StoffWechselvorgänge der erfindungsgemäß verwendeten biologischen Indikatoren nachteilig beeinflußt, was sich in einer Änderung der Lichtausgangsleistung nieder-

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schlägt. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zum Nachweis einer breiten Vielfalt toxischer Substanzen und Zustände, wobei jedoch bestimmte Substanzen bekanntermaßen in verhältnismäßig kleinen Konzentrationen Toxizität bezüglich Lebensformen besitzen. Diese Stoffe können in durch industrielle und landwirtschaftliche Abfälle verunreinigten Strömen, Flüssen und anderweitigen Gewässern vorliegen, und die Toxizitätstests für Wasserversorgungen sind daher normalerweise speziell auf den Nachweis des Vorliegens dieser Substanzen abgestellt.

So wurde etwa das Vorliegen von Quecksilber-, Chrom-, Blei- und Zinkverbindungen, Ammoniak, Nitraten, Phosphorverbindungen, Sulfaten und Kupferverbindungen aus den verschiedensten Quellen Hn durcn industrielle Abfälle verunreinigten Gewässern festgestellt. Außerdem sind auch verschiedene Herbicide, Pesticide, oberflächenaktive Stoffe und anderweitige organische Substanzen in durch industrielle und landwirtschaftliche Nutzungen verunreinigten Gewässern zu erwarten; Beispiele derartiger organischer Verbindungen sind DDT, Phenol, Lindan, Heptachlor, Aldrin, Toluol, 7-12-Dimethylbenzanthracen, 3-Methylcholanthren, Benzeden, o-Aminoazotoluol, 4-Dimethyl-Amino-Azobenzol, Pentachlorphenol, Tetrachlorkohlenstoff, Aceton, Thimersol, Natriumlaurylsulfat sowie Chlordan.

Die vorstehende Liste ist keineswegs erschöpfend und soll keinerlei einschränkende Bedeutung besitzen, sondern lediglich die breite Vielfalt von Substanzen veranschaulichen, deren Vorliegen oder Fehlen toxische Zustände für biologische Organismen bedeuten kann. Typischerweise enthalten die meisten industriellen Abfälle Gemische von als Pollutionssubstanzen geltenden Stoffen, wobei ein oder mehrere dieser Stoffe in ausreichend hohen Konzentrationen vorliegen können, um die Stoffwechselprozesse des biologischen Indikators nachteilig zu beeinflussen und so toxische Zustände begründen zu können.

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Die toxische Substanz braucht in der untersuchten Flüssigkeit nicht hochlöslich zu sein. Jedoch muß eine Substanz, um toxisch oder einen toxischen Zustand hervorzurufen, ausreichende physikalische oder chemische Eigenschaften besitzen, daß sie entweder in toxischen Mengen absorbiert werden kann oder die Flüssigkeit, in welcher sie enthalten ist, entweder physikalisch oder chemisch so beeinflussen kann, daß, sie einen toxischen Zustand in der Flüssigkeit hervorruft. Praktisch alle toxischen Substanzen, für die ein Test erwünscht ist, erfüllen eine oder beide dieser Bedingungen.

Das auf Toxizität zu untersuchende Material braucht anfänglich nicht als wäßrige Flüssigkeit vorzuliegen. Beispielsweise können die auf Toxizität zu untersuchenden Materialien in Form eines fein verteilten Pulvers vorliegen, das anschließend in einer wäßrigen Trägerflüssigkeit gelöst oder dispergiert oder direkt zu der wäßrigen Suspension der Mikroorganismen zugegeben werden kann.

Allgemein sind Leucht-Mikroorganismen in breitestem Sinn empfindlich für toxische Substanzen oder Zustände, unabhängig von dem jeweiligen Mikroorganismus-Stamm oder -Spezies. Jedoch wurde festgestellt, daß einige Mikroorganismenstämme empfindlicher für eine bestimmte Substanz oder einen bestimmten Zustand sind und daher bei Kontakt mit dieser Substanz oder diesem Zustand eine deutlicher ausgeprägte Änderung der Lichtausgangsleistung zeigen, als für diese gleiche Substanz oder diesen gleichen Zustand weniger empfindliche Stämme. Daher ist jeweils die Verwendung eines speziell nach seiner Empfindlichkeit gegenüber einer bestimmten Substanz oder einem bestimmten Zustand ausgewählten Mikroorganismenstamms vorzuziehen. Die Erfindung erstreckt sich auch auf die Verwendung eines Gemischs von Mikroorganismenstämmen, wobei die einzelnen Stämme jeweils spezielle Empfindlichkeit für bestimmte Substanzen oder Zustände besitzen. Der Gesamteffekt eines derartigen Gemischs von Mikroorganismusstämmen besteht dann in einer erhöhten und verbreiterten Empfindlichkeit für bestimmte verschiedene ausgewählte Arten von Substanzen oder Zuständen. ./.

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Jedoch ist andererseits eine genaue Kenntnis der jeweiligen toxischen Substanz oder des toxischen Zustands in dem untersuchten Material nicht erforderlich. Wie oben erwähnt, sind Leucht-Mikroorganismen im breitesten Sinn empfindlich für toxische Substanzen, unabhängig von dem jeweiligen Stamm oder der jeweiligen Spezies'und zeigen daher eine Veränderung der Lichtausgangsleistung in Gegenwart einer toxischen Substanz oder eines toxischen Zustandes in der Testflüssigkeit. Wie w.u. noch im einzelnen erläutert wird, bildet die Änderung der Lichtausgangsleistung der Mikroorganismen eine bequeme Anzeige der Konzentration der toxischen Substanz in der Testflüssigkeit.

Es ist bekannt, daß bestimmte Bakterienstämme eine starke Lumineszenz im Lauf ihres Wachstumszylklus zeigen. Besonders gut bekannte und leicht verfügbare Spezies von Leuchtbakterien sind u.a. das Photobacterium wie beispielsweise P_. splendidum, P_. mandapamensis, P_. phosphoreum. Auch Bakterienstämme aus der Gattung Vibrio zeigen Lumines-zenz, wie beispielsweise V. fischeri; ebenso Mikroorganismen aus der Gattung Lucibacterium, wie beispielsweise L harveyi und Achromobacter. Neben den verschiedenen Bakterien zeigen auch andere Mikroorganismustypen Luminosität wie beispielsweise bestimmte Meeres-Dinoflagellaten, zu denen insbesondere Noctiluca und Gonyaulax gehören. Auch bestimmte Arten von Pilzen (Basidiomyceten) zeigen Lumineszenz, beispielsweise Armillaria mellea, Panus stipticus, Mycena polygramma und Omphalia flavida. Leucht-Mikroorganismen vom Bakterien- und Pilz-Typus sind von der American Type Culture Collection, 12301 Parkland Drive, Rockville, Maryland oder den Northern Regional Research Laboratories, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois erhältlich, wie auch von vielen anderweitigen kommerziellen und Universitätslaboratorien.

Typischerweise werden die Stock- bzw. Vorratskulturen der Bakterien oder Pilze aus einer Aufbewahrungs- oder Konservierungskultur gezüchtet^ indem man einen Teil der Zellen von der Konservierungskultur auf ein Nährmedium überträgt, wo sie zum Wachstum und zur Vermehrung gebracht werden. Die Wahl des jeweiligen Mediums für die Wachstumsvermehrung der Kultur hängt ·/·

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von der Art der verwendeten Kultur und von der Weise ab, in welcher die Mikroorganismen nachfolgend zur Vorbereitung für die erfindungsgemäße Verwendung weiterbehandelt werden sollen.

Ein bevorzugtes Wachstumsmedium für die gebräuchlicheren Luminiszenzorganismen weist üblicherweise bis etwa 2 % Agar, zwischen etwa 0,25 % und etwa 0,7 % Natrium oder Kaliumpyrophosphat, etwa 0,5 % Glycerol, zwischen 0,5 % und etwa 1 % Peptone (tierischen und/oder pflanzlichen Ursprungs), bis zu etwa 1 % hydrolysiertes Casein sowie zwischen etwa 0,5 bis etwa 5 % Natriumchlorid, Rest Wasser, auf. Der pH-Wert des Wachstumsmediums liegt vorzugsweise im Bereich zwischen etwa 6,5 bis 7,5 und besonders bevorzugt in der Größenordnung von 7,0. Für Meeresmikroorganismen kann in dem Nährmedium anstelle von Wasser Meerwasser verwendet werden. Ebenfalls je nach dem zu vermehrenden Mikroorganismenstamm kann auch ein Extrakt wie beispielsweise Fleisch-, Tintenfisch- oder Fischextrakt, in dem Nährmedium äußerst nützlich sein.

Leuchtpilze werden zweckmäßig in einer wäßrigen Brühe mit etwa 10 % Brotkrümeln, sowie in künstlichen Nährbrühen oder in einer gekochten Kirschenbrühe gezüchtet. Sie lassen sich auch auf einem festen Agar-Nährboden züdvben, der beispielsweise 2 % Agar und 10 % Brotkrumen und Wasser enthält.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens entnimmt man einen Teil der Zellen aus einer Wachstumskultur von Leuchtmikroorganismen und suspendiert diese in einer wäßrigen Salzlösung zu einer in der Lichtmeßapparatur verwendbaren Arbeitssuspension der Zellen. Die Konzentration der Zellen in der Suspension ist nicht kritisch und kann innerhalb eines breiten Bereichs schwanken. Jedoch soll selbstverständlich eine ausreichende Menge Zellen in der Suspension vorliegen, damit die Gesamtlichtausgangsleistung der Arbeitssuspension im Nachweisbereich der für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten Lichtmeßapparatur liegt. Zur Herstellung

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einer Arbeitssuspension von Zellen aus einer Wachstumskultur wird zweckmäßig in der Weise vorgegangen, daß man zunächst eine Vorratssuspension herstellt, die eine höhere Konzentration als benötigt besitzt. Die Herstellung der Arbeitssuspension erfolgt dann durch entsprechende Verdünnung von Teilmengen der Vorratslösung, bis man einen gewünschten Wert der Ausgangslichtintensität (Basis-Lichtausgangsleistung) erhält. Bei lyophilen Präparationen wird die Konzentration der Zellen vor der Lyophilisierung eingestellt und eine Arbeitssuspension mit der gewünschten Basislinie durch einfache Zugabe von destilliertem Wasser zu dem Lyophil hergestellt. Die Basis-Lichtausgangsleistung wird jeweils für jede Suspension vor der Einbringung der Testflüssigkeit aufgezeichnet. Diese Basislinie dient als Bezugswert der Lichtausgangsleistung, gegenüber welcher nachfolgende Änderungen der Lichtausgangsleistungen gemessen werden. Änderungen oder Schwankungen der Basislinie infolge anderer Ursachen als dem Vorliegen einer toxischen Substanz oder eines toxischen Zustande sind unerwünscht und können zu irreführenden oder falschen Ablesungen führen, falls sie durch die Lichtmeßvorrichtung nicht kompensiert werden. Eine Änderung der Basislinien-Lichtausgangsgröße der Arbeitssuspension über eine bestimmte Zeitperiode ist nicht abnormal. Eine derartige Änderung der Lichtausgangsgröße in Abwesenheit einer toxischen Substanz oder eines toxischen Zustands wird als Basislinien-Drift bezeichnet und wird üblicherweise durch eine Kontrollmessung für jede mit einem bestimmten Mikroorganismenstamm durchgeführte Testserie bestimmt; Wo es die Testverfahren zulassen, wird die Basislinien-Drift vorzugsweise für jede Arbeitssuspension bestimmt. Eine Basislinien-Drift ist in vielen photometrischen analytischen Systemen nicht ungewöhnlich und kann durch geeignete Maßnahmen, wie elektronische oder Handregelung oder durch Kompensationsinstrumente in bekannter Weise kompensiert werden. Vorzugsweise wird die Basislinien-Drift auf einem möglichst niedrigen Wert gehalten, da ein niedriger Wert der Basislinien-Drift die An-

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Wendung einfacherer und daher weniger kostspieliger Instrumente als Lichtmeßvorrichtungen ermöglicht.

Es wurde festgestellt, daß das Suspensionsmedium eine wesentliche Auswirkung auf die Größe der Basislinien-Drift haben kann. Gute Ergebnisse wurden erzielt, wenn das Suspensionsmedium zwischen etwa 0,5 % bis etwa 6 Gew.-Ji Natriumchlorid enthielt, mit etwa 2 % bis etwa 6 % Natriumchloridgehalt als bevorzugter Bereich und 3 % Natriumchlorid als besonders bevorzugter Wert. Diese Salzkonzentrationen stimmen im wesentlichen mit den im Nährmedium während des Wachstumszyklus der Zellen verwendeten Salzkonzentrationen überein. Es wurde ferner auch festgestellt, daß gute Ergebnisse erzielt wurden, wenn das wäßrige Suspensionsmedium kleinere Mengen anderweitiger Salze wie beispielsweise Natriumsulfat und Natriumpyrophosphat sowie Nährstoffe wie Hefeextrakt enthält. Die Gründe, warum die Einbeziehung dieser vorstehend genannten Zusatzstoffe in dem Suspensionsmedium die Stabilität der Lichtausgangsgröße verbessert und die Basislinien-Abdrift in der Suspension herabsetzt, sind noch nicht vollständig aufgeklärt; man darf jedoch annehmen, daß die Zellen zwar nicht mehr aktiv zahlenmäßig anwachsen, das Susr pensionsmedium jedoch nach wie vor noch eine Umgebung bildet, welche den Zeil-Stoffwechsel auf einem annehmbaren Pegel hält, derart daß die Lichtausgangsgröße relativ stabil bleibt. Ein bevorzugtes Suspensionsmedium weist zusätzlich zu Natriumchlorid zwischen 1 und etwa 10 Mikrogramm/ml Hefeextrakt und zwischen etwa 50 und 250 Mikrogramm/ml Natriumpyrophosphat auf.

Nachdem in dieser Weise eine Suspension von Leucht-Mikroorganismen hergestellt und die Basislinien-Lichtausgangsgröße der Suspension gemessen und aufgezeichnet wurde, wird eine auf einen Gehalt an einer toxischen Substanz oder einen toxischen Zustand verdächtige Probe in den Behälter mit der Arbeitssuspension eingeführt. Der Behälterinhalt wird umgerührt, um •ine gründliche Durchmisdung der Suspension und des eingebrach ten Materials herbeizuführen. Sodann wird eine eventuelle ./.

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Änderung der Lichtausgangsgröße bestimmt, und zwar entweder indem man die Gesamtänderung der Lichtausgangsgröße über eine gegebene Zeitdauer, oder aber die Xnderungsgeschwiridigkeit der Lichtausgangsgröße mißt. Ob die Änderung der Lichtausgangsgröße als Änderungsgeschwindigkeit oder als Gesamtänderung über eine gegebene Zeitperiode gemessen wird, hängt von Paktoren wie Art und Konzentration der toxischen Substanz, Empfindlichkeit des Mikroorganismus, der jeweiligen Art der Vorrichtung zur Messung der Lichtausgangsgröße usw. ab, und das jeweils anzuwendende Verfahren kann in einfacher Weise durch Voruntersuchung der Mikroorganismen und der zu untersuchenden Flüssigkeit bestimmt werden.

Das Vorliegen einer toxischen Substanz oder eines toxischen Zustande wird als Änderung der Lichtausgangsleistung der Mikroorganismensuspension gegenüber der Basis-Lichtausgangsleistung angezeigt. Typischerweise bewirken eine toxische Substanz oder ein toxischer Zustand eine Verringerung der Lichtausgangsleistung, obwohl je nach dem verwendeten Mikroorganismenstamm bestimmte toxische Substanzen oder Zustände wenigstens zeitweise auch einen Anstieg der Lichtausgangsleistung der Mikroorganismensuspension hervorrufen können» Der Betrag der Lichtänderung steht in Beziehung zur Konzentration der toxischen Substanz bzw. zum Ausmaß des toxischen Zustandes.

Daher kann unter Verwendung von Standardkurven die Konzentration einer gegebenen toxischen Substanz bestimmt werden, unter der Voraussetzung, daß die toxische Substanz identifiziert ist. Des weiteren kann eine Korrelation zwischen den Ergebnissen des erfindungsgemäßen Verfahrens und den Ergebnissen des sogenannten "Fisch-Tests" aufgestellt werden; bei dem erwähnten Fisch-Test handelt es sich um den derzeit geläufigsten Test für den Versuch einer Bestimmung des Vorliegens einer toxischen Substanz in Wasser, wie eingangs erläutert wurde.

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Zur Messung der Lichtausgangsleistung der wäßrigen Lösung von Mikroorganismen und der danach hergestellten Mischung aus Mikroorganismen und untersuchtem Material, nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, kann jede beliebige herkömmliche Lichtmeßvorrichtung verwendet werden. Bekanntlich gibt es verschiedene Arten photometrischer und optischer analytischer Geräte, die sämtlich nach den gleichen allgemeinen bekannten Prinzipien arbeiten.

In Fig. 1 ist ein zum Nachweis des Ausgangslichtes von den Lumineszenz-Mikroorganismen geeignetes photometrisches System schematisch dargestellt. Das als Ganzes mit 10 bezeichnete System weist eine geeignete Zelle bzw. Küvette oder Behälter auf, in welchem die Suspension von Leucht-Mikroorganismen und die Testprobe für die Ausgangslichtmessung untergebracht sind. Ein Lichtdetektor wie beispielsweise eine Photomultiplier-Röhre 14 oder eine Photozelle ist in solcher geometrischer Relativstellung bezüglich dem Behälter 12 angeordnet, daß sie von dem ausgesandten Licht getroffen wird und einen der Intensität des auf den Detektor auffallenden Lichts entsprechenden Strom niedriger Spannung erzeugt. Die Ausgangsgröße der Zelle 14 wird durch einen Photozellenverstärker 17 geleitet, in welchem die Ausgangsgröße verstärkt und sodann an eine Wiedergabevorrichtung wie beispielsweise ein Meßgerät 18 weitergeleitet wird. Die Art der Wiedergabevorrichtung ist nicht kritisch und beispielsweise kann anstelle des oder zusätzlich zu dem Meßgerät 18 in dem System eine Registrierschreibervorrichtung oder eine Digitalanzeige- bzw. -registriervorrichtung herkömmlicher Art vorgesehen sein.

Es sei darauf hingewiesen, daß die Temperatur der Arbeitssuspension sowohl die Empfindlichkeit wie auch die tatsächliche Lichtausgangsleistung der Mikroorganismen in der Arbeitssuspension beftnflußt. Daher sollen vorzugsweise sämtliche mit einem be stimmten Mikroorganismenstamm vorgenommenen und einen bestimmten

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Schadstoff betreffenden Tests bei der gleichen Temperatur ausgeführt werden, um Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten. So wurde beispielsweise für Schadstoffe wie Phenol festgestellt, daß für eine gegebene Schadstoffkonzentration die jeweilige prozentuale Abnahme der Lichtausgangsleistung einer Arbeitssuspension von Mikroorganismen mit zunehmender Temperatur abnimmt. Für andere Schadstoffe, wie beispielsweise Isopropylalkohol nimmt die prozentuale Abnahme der Lichtausgangsgröße der Arbeitslösung mit zunehmender Temperatur zu. Vorzugsweise sollte daher, insbesondere wenn an neuen Testproben gearbeitet wird, zunächst die Änderung der Lichtausgangsgröße der Arbeitssuspension über einen Bereich von Temperaturen zwischen etwa 10⁰C bis etwa 30 C aufgezeichnet werden. Die bevorzugte Testtemperatur ist dann diejenige Temperatur, bei welcher eine maximale Änderung der Lichtausgangsleistung aufgezeichnet wurde. Dies bezeichnet diejenige Temperatur, bei welcher der betreffende Mikroorganismus eine maximale Empfindlichkeit für den Schadstoff oder das Gemisch von Schadstoffen in der Testlösung besitzt.

In Fällen, wo Reproduzierbarkeit der Ergebnisse oder maximale Empfindlichkeit keine besondere Rolle spielen, kann das erfindungsgemäße Verfahren bei auf Umgebungstemperatur in dem Photometer befindlicher Arbeitslösung ausgeführt werden. Auf jeden Fall sollte dafür gesorgt werden, daß die Arbeitssuspension sich zunächst auf eine stabile Temperatur einstellen kann, bevor die Lichtausgangsleistung aufgezeichnet wird, da Änderungen der Temperatur auch die Basis-Lichtausgangsleistung beeinflussen und daher zu einer überhöhten Basislinien-Drift führen. In den nachfolgenden Beispielen wurde die, Arbeitssuspension jeweils zunächst auf die Umgebungstemperatur des Photometers stabilisiert, bevor die Lichtausgangsleistung gemessen bzw. aufgezeichnet wurde.

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Im folgenden werden als Beispiele spezielle Ausführungsformen der Erfindung beschrieben, denen selbstverständlich keinerlei einschränkende Bedeutung zukommen soll.

Beispiel I

Zur Herstellung von Lumineszenzbakterienzellen für Toxizitätstestzwecke wurden Agar-Medien zur Erzeugung von Kulturen von V. fiseheri, P. phosphoreum, ATCC 11040; P. mandapamensis, ATCC 27561; L. harveyi, ATCC 14126 und A. fischeri, NRRL B-III77 geimpft. Das Agar-Medium besaß die folgenden Zusammensetzungsbestandteile :

KH₂PO₁, 0.25 Gew.-?

NaCl 3,0 Gew.-i

Glycerol 0,5 Gew.-ί

Hefeextrakt 0,1 Gew.-Z

Polypepton 0,5 Gew.-%

Hydrolisiertes Casein 1,0 Gew.-J

Tintenfischextrakt 10,0 Vol.-Z

Agar 1,5 Gew. -%

Destilliertes Wasser 90,0 Vol.-!6

Die Herstellung des Tintenfischextrakts erfolgte in der Weise, daß man 454 g ganzen Tintenfisch homogenisierte und mit destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 1 Liter auffüllte. Die Aufschlämmung wurde 15 Min. lang im Autoclaven bei 121°C behandelt und die so erhaltene Suspension durch Zentrifugation geklärt.

Nach 24 Stunden Wachstum bei 22°C wurden die Zellen aus den einzelnen Kulturen entnommen und jeweils in 3 % wäßriger ./

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Natriumchloridlösung (pH 7»1) zu einer Vorratssuspension der einzelnen betreffenden Zellkulturen suspendiert. Die Vorratssuspension wurde jeweils kräftig gerührt, um eine homogene Suspension zu gewährleisten.

Aus jeder der Vorratslösungen wurde eine Arbeitssuspension hergestellt, indem man jeweils Teilmengen von 10 Mikroliter der einzelnen Vorratslösungen in 2 ml wäßrigem Suspensionsmedium verdünnte. Das Suspensionsmedium bestand aus einer wäßrigen Natriumchloridlösung (· 3 Gew.-?), die 135 Mikrogramm/ml Natriumpyrophosphat und 5 Mikrogramm/ml kommerziell verfügbaren Hefeextrakt (Diffco Laboratories, Detroit, Michigan) enthielt.

Sodann wurde die Basis-Lichtausgangsleistung der Arbeitslösungen bestimmt, wobei die Suspensionen sich im wesentlichen auf Umgebungstemperatur in einem mit Photomultiplier-Röhre und einem Registrierstreifenschreiber ausgerüsteten Photometer befanden.

Beispiel II

Auch in flüssigen Medien wurden Lumineszenz-Bakterienzellkulturen ge züchtet, und zwar wurden Kulturen von £. phosphoreum, ATCC 11041; P. mandapamemsis, ATCC 27561; L. harveyi, ATCC 14126 und A. fischeri, NRRL B-11177 als Schüttelkolbenkulturen gezüchtet. Als Wachstumsmedium diente das gleiche Medium wie in Beispiel I, mit der Ausnahme, daß in den Kulturmedien kein Agar verwendet wurde. Die Kulturen wurdenjeweils in 500 ml Kolben mit 3-fach-Böden gezüchtet wobei jeder Kolben 100 ml Kultur enthielt. Die Kulturen wurden 18 Stunden lang bei 22°C gezüchtet, wobei die Kulturen während der Wachstumsperiode auf einer New Brunswick -Kreiselschüttelvorrichtung mit 240 U/Min, geschüttelt wurden. Die Zellen wurden während der logarithmischen Wachstumsperiode geerntet und durch Zentrifugation von dem Wachstumsmedium abgetrennt. Die auf diese Weise aus jeder der' Kulturen erhaltenen

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Zellkuchen wurden bei M⁰C aufbewahrt, bis zur Herstellung der jeweiligen Vorratssuspension nach der in Beispiel I beschriebenen Art.

Die einzelnen Vorratssuspensionen wurden jeweils wie in Beispiel I zu einer Arbeitslösung für die Verwendung in dem Photometer verdünnt und es wurde jeweils für jede Arbeitssuspension die Basislinien-Drift festgestellt.

Beispiel III

Kulturen von P. mandapamensis, ATCC 27561; L. harveyi, ATCC 14126 und A, fischeri, NRRL B-11177 wurden jeweils wie in Beispiel II beschrieben in einer als Nährlösung dienenden Brühe hergestellt. Die Kulturen wurden während der logarithm!- schen Wachstumsphase durch Zentrifugation von der Brühe abgetrennt und die so erhaltenen Zeil-Kuchen auf 4°C abgekühlt. Die gekühlten Zeil-Tabletten wurden in einer 3 55-igen Natriumchloridlösung suspendiert und auf einer Temperatur von 4°C gehalten. Die Natriumchloridlösung wurde zu der Suspension zugegeben, bis eine homogene Zellsuspension mit einer optischen Dichte von l60 erreicht war.

Die Zellsuspension wurde mit einer wäßrigen Milchlösung (20 Gew.-Ϊ Magermilch, 2 Gew.-ί NaCl, pH 7,1) in einem Volumenverhältnis von ein Teil Zellsuspension auf 19 Teile Milchlösung gemischt. Die Zell-Milch-Suspension wurde in Teilmengen von 1 ml auf 10 ml Röhrchen verteilt und im Schnellfrierverfahren auf eine Temperatur von - 50⁰C eingefroren. Die Zellen wurden sodann bei - 5⁰C 18 Stunden lang unter 55 Mikron 'Vakuum ge trocknet. Danach wurden die Röhrchen vakuumversiegelt.

Aus diesen lyophilisierten Proben wurden jeweils durch Zugabe von 1 ml destilliertem Wasser zu den Röhrchen Arbeitssuspen sionen hergestellt. Die so erhaltenen Suspensionen zeigten

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einen guten Wert der Basis-Lichtausgangsleistung.

Beispiel IV

Arbeitssuspensionen der verschiedenen gemäß Beispielen I, II und III gezogenen und hergestellten Lumineszenz-Bakterienarten wurden unterschiedlichen Konzentrationen von bekanntermaßen für biologische Organismen toxischen Substanzen ausgesetzt, um die Auswirkung des so herbeigeführten Zustandes auf die Lichtausgangsleistung der Zellen zu bestimmen.

Die folgenden toxischen Substanzen wurden für die Schaffung toxischer Zustände verwendet: Phenol, Natriumlaurylsulfat; ein nachfolgend als Gemisch ²IOl bezeichnetes Gemisch verschiedener Substanzen, sowie ein unter der Bezeichnung Penta bekanntes Holzkonservierungsmittel, das aus 3,5 ί Pentachlorphenol, 65 % Mineralsprits und 32,5 % inerten Bestandteilen bestand.

Das Bezugsgemisch ¹IOl wurde in der Weise hergestellt, daß man 3,82 g NH₁₁Cl, 0,093 g K₂CrO₁₁, 0,128 g Na₃S, 0,9 g H₃O, 0,20 g Kaolin, 0,1 g Phenol und 1,28 ml Nr. 2 Heizöl auf 100 ml destilliertes Wasser zugab.

Die Durchführung der Tests erfolgte, indem man jeweils zwischen 10 und 100 Mikroliter der betreffenden Lösungen der toxischen Substanz in eine Küvette zusetzte, welche eine Arbeitssuspension der Lösungen enthielt,,, für welche die Basislinie und die Basislinien-Drift zuvor festgestellt worden war. Nach Zugabe der toxischen Substanz wurden die Küvetten mehrere Male umgedreht, um eine Durchmischung der Suspension und des die toxische Substanz enthaltenden Materials zu gewährleisten. Die Küvetten wurden sodann wieder in das Photometer eingesetzt und es wurde die prozentuale Lichtabnahme nach einer Periode von 2 Min. nach der Zugabe der toxischen Substanz bestimmt. Gleichzeitig mit den Testproben wurden auch Kontrollproben untersucht, welche jeweils aus einer Arbeitssuspension der betreffenden ./.

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Kulturen und 10 Mikroliter einer 3-i-igen Natriumchloridlösung bestanden.

Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in den nachfolgenden Tabellen A, B und C zusammengestellt. Dabei sind jeweils die Konzentrationen der toxischen Substanzen in Milligramm/ Liter angegeben, mit Ausnahme für das Gemisch 401, für welches die Konzentration als Volum-Prozent des Gemischs in der Test-Lösung angegeben ist.

In Tabelle A sind die Ergebnisse für gemäß Beispiel I gezogene Lumineszenzzellen angegeben. Die Tabellen B und C geben die Ergebnisse mit gemäß den Beispielen II bzw. III gezogenen und hergestellten Zellen wieder.

Tabelle A	-	Prozentuale	ATCC 11040	Lichtabnahme	Vibrio Fischeri
	ATCC 2756I	ATCC 14126	0	NRRL B-11177	0
Konzentration der untersuchten toxischen Substanzen	) 0	0	9	0	10
3 t NaCI (Kontrollprobe!	20	26	18	13	20
Phenol 50 mg/L	55	40	33	23	41
100 mg/L	95	91		51
250 mg/L			17		21
Natriumlaurylsulfat	20	19	31	67	81
25 mg/L	40	36	12	90	83
50 mg/L	94	33		89
100 mg/L			3		6
Bezugsgemisch 401	9	2	9	7	6
0,5 %	14	4	23	9	8
1,0 %	24	18		26
2,5 %			85-		-
Penta-Chlorphenol	11	71	95	71	-
5 mg/L	31	73	99	84	-
10 mg/L	61	89		90
25 mg/L

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- 2ΐ> -

Tabelle B	Konzentration der untersuchten toxi schen Substanzen	ATCC 27561	Konzentration der untersuchten toxi schen Substanzen	ATCC 27561	ATCC 14126	NRRL B-11177	■	25	Vibrio Fiseheri
3 % NaCl (Kontrollprobe)	0	3 % NaCl (Kontrollprobe)	0	0	0	40	0
Phenol 50 mg/L	• 36	Phenol (PPM)		10	19	63	26
100 mg/L	50	50 mg/L	7	29	29		37
250 mg/L	37	100 mg/L	20	57	55	33	52
Natriumlaurylsulfat		250 mg/L	28			40
25 mg/L	22	Natriumlaury1sulfat		48	83	40	15
50 mg/L	30	25 mg/L	12	45	89		28
100 mg/L	76	50 mg/L	14	69	78	17	70
Bezugsgemisch 401		100 mg/L	31			19
0,5 %	7	Bezugsgemisch 401		0	12	42	12
1,0 %	7	0,5 %	3	4	14		14
2,5 %	11-	1,0 %	3	10	16	15
Tabelle C	2,5 *	9
	ATCC 14126	NRRL B-11177	Vibrio Pischeri
0	0	0

12	13
21	27
35	50

33	41
40	43
56	43

6	11
10	17
13	23

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Eine gemäß Beispiel III gezüchtete und lyophilisierte, gefriergetrocknete Probe von A. fischeri, NRRL B-11177 diente zum Nachweis der Beziehung zwischen der Konzentration der toxischen Substanzen und der Abnahme der Lichtausgangsleistung nach einem Kontakt von 2 Min.

In Küvetten, welche 1 ml einer Arbeitssuspension des rekonstituierten Leucht-Mikroorganismus (A. fischeri) enthielten, für welche die Basislinie zuvor bestimmt worden war, wurden jeweils 10 Mikroliter der Phenol in unterschiedlichen Konzentrationen enthaltenden Proben eingeführt und die Küvetten für eine gute Durchmischung umgedreht. Nach zwei Minuten wurde die Abnahme der Lichtausgangsleistung gemessen und als prozentuale Lichtabnahme aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle D zusammengestellt:

Tabelle D

Phenol-Konzentration (PPM)

Prozentuale Lichtabnahme nach 2-Minuten Kontaktzeit

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

1.

3. 10. 18. 21. 25. 30
31. 37. 40
40

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Fig. 2 zeigt eine graphische Darstellung der Daten aus der Tabelle D, wobei die Phenolkonzentration auf der vertikalen logarithmischen Skala und die prozentuale Lichtabnahme linear auf der horizontalen Skala aufgetragen sind. Für diese Art der Darstellung wurde eine direkte Beziehung zwischen der Phenolkonzentration und der Abnahme der Lichtausgangsleistung festgestellt.

In den vorhergehenden Beispielen wurde das toxische Substanzen enthaltende Material jeweils zu der Suspension der Lumineszenzmikroorganismen in dem wäßrigen Suspensionsmedium zugegeben. Es wurde jedoch festgestellt, daß in Fällen niedriger Konzentrationen der toxischen Substanz in der Flüssigkeit sich gute Ergebnisse erzielen lassen, indem man die Zellen direkt in der die toxische Substanz.enthaltenden Flüssigkeit zu der Arbeitssuspension suspendiert. In diesem Fall wird dem auf einen Gehalt an toxischer Substanz verdächtigen Material Natriumchlorid in ausreichender Menge zur Herstellung einer 3-i-igen Salzlösung zugesetzt. Die Lichtausgangsgröße wird gemessen und mit der Lichtausgangsleistung einer Arbeitssuspension der Lumineszenzzellen in dem Suspensionsmedium allein verglichen.

Die Erfindung wurde vorstehend anhand bevorzugter Ausführungsformen und -beispiele beschrieben, die selbstverständlich in mannigfacher Weise abgewandelt werden können, oder daß dadurch der Rahmen der Erfindung verlassen wird.

Zusammenfassung

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis toxischer Substanzen in Flüssigkeiten. Ein oder mehrere Stämme von Leucht-Mikroorganismen werden als biologische Indikatoren zum Nachweis toxischer Substanzen oder Zustände in Flüssigkeiten verwendet. Die beim Kontakt der Mikroorganismen mit den toxi-

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sehen Substanzen oder Zuständen auftretende Änderung der Lichtausgangsgröße wird mit Lichtmeßvorrichtungen festgestellt. Das Ausmaß der Änderung der Lichtausgangsgröße der Mikroorganismen steht in Beziehung zur Konzentration der toxischen Substanz, welcher die Organismen ausgesetzt waren. Die Zellen wurden nach einer Reihe von Verfahren gezüchtet; lyophilisierte Zellen, welche eine lange Lagerfähigkeit besitzen, können ohne weitere Fortpflanzung rekonstituiert und zum Nachweis toxischer Substanzen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.

Patentansprüche:

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-IS-

Leerseite

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zum Nachweis einer toxischen Substanz oder

eines toxischen Zustandes, gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Suspension eines Lumineszenz- oder Leucht-Mikroorganismus dem Kontakt mit einer Substanz oder einem Zustand, die bzw. der der Toxizität für den betreffenden Mikroorganismus verdächtig sind, aussetzt, daß man die Lichtausgangsleistung des betreffenden Leucht-Mikroorganismus nach dem Kontakt mit der toxizitätsverdächtigen Substanz bestimmt, und daß man diesen Wert der Lichtausgangsgröße des Mikroorganismus nach der KontaktVermischung mit der als Basis dienenden Lichtausgangsgröße des Leucht-Mikroorganismus vor der KontaktVermischung vergleicht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man eine Kultur von Leucht- bzw. Lumineszenz-Mikroorganismen züchtet, daß man einen Teil der Kultur in ein wäßriges Medium zur Erzeugung einer Suspension des Leucht-Mikroorganismus in diesem Medium überträgt, und daß man die Basis-Lichtausgangsleistung der wäßrigen Suspension bestimmt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß die Mikroorganismen in einem wäßrigen Medium suspendiert, das zwischen etwa 0,5 Gew.-Ϊ und etwa 6 Gew.-Jt eines löslichen Alkalimetallsalzes enthält.

4* Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , daß das wäßrige Medium zwischen etwa 0,5 Gew.-Ϊ und etwa 6 Gew.-Ϊ Natriumchlorid, vorzugs weise zwischen etwa 2 Gew.-it und etwa 6 Gew.-? Natriumchlorid, und besonders bevorzugt etwa 3 Gew.-X Natriumchlorid enthält. ^m/<

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ORIGINAL INSPECTED

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , daß das Suspensionsmedium zusätzlich einen kleineren Anteil eines Salzes aus der Gruppe Alkalimetallpyrophosphat und -sulfat enthält.

6. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet , daß das Suspensionsmedium zusätzlich Hefeextrakt enthält.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet , daß das Suspensionsmedium zwischen etwa 50 und etwa 250 Mikrogramm/ml Natriumpyrophosphat und zwischen etwa 1 und etwa 10 Mikrogramm/ml Hefeextrakt enthält.

8. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet , daß das Suspensionsmedium eine wäßrige Lösung ist, welche 3 Gew.-Ϊ Natriumchlorid, 135 Mikrogramm/ml Natriumpyrophosphat und 5 Mikrogramm/ml Hefeextrakt enthält.

9. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß als Leucht-Mikroorganismen Leucht-Bakterien aus der Gruppe der Gattungen Photobacterium, Vibrio, Achromobacter, Lucibacterium sowie Gemische hiervon, verwendet werden.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeich net, daß Leucht-Bakterien aus der Gruppe P. splendidum, P. mandapamensis, P_. phO3phoreum, V. fiseheri, A. fischeri, L. harveyi sowie Gemische hiervon verwendet werden.

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11. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß die Mikroorganismen in einem Nährmedium gezüchtet werden, das, jeweils in Gew.-Ϊ, zwischen etwa 0,5 % und etwa 3 % Natriumchlorid, zwischen etwa 0,25 % und etwa 0,7 % eines Alkalimetallpyro-Phosphats, etwa 0,5 % Glycerol, zwischen etwa 0,5 % und etwa 1 % Polypepton, bis zu etwa 1 % Trypticase und bis zu etwa 2 % Agar enthält.

12. Verfahren nach Anspruch 2 oder nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet , daß das Nährmedium zusätzlich Tintenfischextrakt enthält.

13· Verfahren nach einem der Ansprüche 2, 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet , daß der Wasseranteil des Nährmediums Meerwasser enthält.

14. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß die Mikroorganismen in einem lyophilisierten Zustand vorliegen und die Suspension durch Zugabe von Wasser zu dem lyophilisierten Mikroorganismus hergestellt wird.

15· Verfahren zum Nachweis einer toxischen Substanz oder eines toxischen Zustandes in einer Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet , daß man eine Kultur von Lumineszenz- oder Leuchtmikroorganismen aus der Gruppe P_. splendidum, P_. mandapamensis, P_. phosphoreum, V. fischeri, A. fischeri, L. harveyi züchtet und einen Teil dieser Mikroorganismuskultur lyophilisiert, daß man eine wäßrige Suspension des lyophilisierten Mikroorganismus durch Zugabe von destilliertem Wasser als Ersatz für den Plüssigkeits- Ycrluet während der Lyophilisierung herstellt, daß

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man den Basiswert der Lichtausgangsleistung der Suspension bestimmt und sodann die Suspension mit einer auf einen Gehalt an einer toxischen Substanz oder einem toxischen Zustand verdächtigen Flüssigkeit in Kontakt bringt, und daß man die Lichtausgangsleistung der Suspension nach der Kontaktierung mit der Flüssigkeit bestimmt, derart daß die Änderung der Lichtausgangsleistung eine Anzeige für das Vorliegen einer toxischen Substanz oder eines toxischen Zustandes in der Flüssigkeit ist.

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