DE2125126A1 - Verfahren zur Untersuchung des Gehalts von Flüssigkeiten an organischen Stoffen - Google Patents

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Verfahren zur Untersuchung des Gehalts von Flüssigkeiten an organischen Stoffen

Die Erfindung betrifft die Untersuchung des Gehalts an organiscnen Stoffen einer Probenflüssigkeit.

Hauptaufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines einfachen Verfanrens zum Erzielen einer Anzeige der relativen Menge organischer Stoffe, wie Bakterien, die in einem allgemeinen Hintergrund mehr oder weniger ähnlicner Stoffe vorhanden sind.

Die Erscneinung der Chemolumineszenz wurde bisher zum Wachweis und zur quantitativen Messung biologischer Organismen benutzt, wie sie in Proben verschmutzter Luft und verscnmutzten Wassers, Präparaten zur biologischen Kriegfünrung, Lebensmittelverderbern, Sterilisationssystemprodukten usw. anzutreffen sind. Die

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Anwendung der Chemolumineszenztechnik besteht darin, daß Licht durch die Reaktion von Luminöl und wasserstoffperoxyd in Gegenwart solcher Mikroorganismen erzeugt wird.

Durch die Erfindung soll daher ein Verfahren geschaffen werden, mit dem die relativen Mengen von Organismen, ob lebend oder abgestorben, und mit verhältnismässig hoher Empfindlichkeit nachgewiesen und angezeigt werden P können, wobei 'sich durch die Erfindung eine fortlaufende Überwachung des Porpnyringehalts verschiedener Flüssigkeiten erzielen läßt.

Die Durchführung der Erfindung geschieht in der weise, daß eine Strömung des Reagens (Luminol-Wasserstoffperoxyd) und des ProbenmateriäLs durch eine Reaktionszelle während eines Zeitraums erzeugt wird, der sich von vor der Lumineszenz, welche die Folge des Kontakts des Reagens mit der Probe in der Zelle ist, bis nachfolgend der Lumineszenz erstreckt. Die Gesamtlichtausbeute aus der Zelle über diesen Zeitraum wird integriert und auf einem Anzeiger k als Signal dargestellt, welches die Konzentration von Organismen in der Probe darstellt.

Nachfolgend wird eine Ausführungsform der Erfindung in Verbindung mit den beiliegenden Zeichnungen näher Deschrieben und zwar zeigen:

Fig. 1 ein Blockschaltbild einer bevorzugten Einrichtung

zur Durchfünrung des erfindungsgemässen Verfanrens;

Fig. 2 in graphischer Darstellung die Erzeugung der Lichtausbeute aus einer einzelnen statischen Reaktion;

Fig. 3 in graphischer Darstellung LiLe Erzeugung von Liciit-1 α 9 3 A 9 / 1 8 9 9

ausbeute aus einer kontinuierlichen Reaktion im Fließbetrieb, wie sie durch die Einrichtung nach Fig. 1 erhalten wird, und

Fig. H in graphischer Darstellung die Wirkungen der Integration der in Fig. 3 dargestellten Ausbeute.

Das erfxndungsgemasse Verfahren läßt sich senr wirksam mit dem in Fig. 1 dargestellten System durchführen, welche dieses in Form eines Blockschemas zeigt. Die in der Zeichnung dargestellte Reaktorzelle 10 ist aus einem transparenten Material, wie Glas. Die Flüssigkeit, welche die zu überwachende Probe enthält, wird in einen Probenbehälter 11 gebracht, von dem aus eine Leitung 12 zur Zelle 10 führt. Das zu verwendende Reagens, das gewöhnlich ein Gemisch aus Luminol und Wasserstoffperoxyd ist, wird in einen Behälter 13 gebracht, von dem aus eine Leitung 14 in die Zelle 10 führt. Eine Leitung 15, die aus der Zelle 10 herausführt, führt zu einem Ventil 16, das mittels eines Arms 17 durch eine Magnetspule 18 betätigbar ist. Von der Auslaßseite des Ventils 16 führt eine Leitung 19 zu einem Abscheider 20. Eine Leitung 22 verbindet den Abscheider mit einer Vakuumquelle 2 3, welche, wenn das Ventil 16 geöffnet ist, bewirkt, daß Flüssigkeit aus den Behältern 11, 13 in und durch die Zelle 10, durch das Ventil 16 zum Abscheider 20 gesaugt wird. Die Flüssigkeit kann aus einem Flüssigkeitsgemisch oder aus einem Flüssigkeit-Gasgemisch bestehen, von welch letzterem die Flüssigkeit durch den Abscheider 20 abgeleitet wird, während das Gas seinen Weg zur Vakuumquelle 23 nimmt. Das beschriebene Flüssigkeitssystem ist mit Ausnahme des Reagensbehälters 13, des Proben-

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behälters 11 und der Ableitung 25 wirksam gegen die Aussenluft abgedichtet, so daß die Vakuumquelle 23 einen kontinuierlichen Strom aus Reagens und Probe miteinander vermischt durch die Zelle 10 erzeugen kann. Die Flüssigkeit im Abscheider 20 wird über eine Leitung 24 zur Ableitung freigegeben.

Die Zelle 10 befindet sich in einem lichtdichten Gehäuse 26, das teilweise weggebrochen dargestellt ist,

^ und in der Nähe der Zelle 10 ist innerhalb des Gehäuses 26 eine lichtempfindliche Vorrichtung'27, beispielsweise ein Photoelektronen-Vervielfacher, angeordnet. Da in das Gehäuse 26 kein Licht von aussen eintritt, spricht die Vorrichtung 27 nur auf das Licht aus der Zelle 10 an und liefert natürlich einen Ausgang, welcher der Intensität des Lichtes aus,der Zelle 10 proportional ist. Als Stromversorgung für das System dient eine Stromquelle 28, gewöhnlich eine Wechselstromquelle, die über eine Leitung 28a eine Einrichtung 29 speist, welche die von dem Photoelektronenvervielfacher 27 benötigte Hochspannung erzeugt und an den letzteren über eine Leitung 30 angeschaltet ist. Der Ausgang des Photo-

| ' elektronenvervielfacher 27 wird über eine Leitung dem Eingang einer Integrationsschaltung 32 zugeführt, durch welche er integriert und verstärkt wird. Eine geeignete Integrationsschaltung ist in dem Handbook of Operation Amplifier Applications, First Edition, der Burr Brown Research Corp. 1963, dargestellt und beschrieben. Der Ausgang aus der Integrationsschaltung 32 wird über eine Leitung 33 einem Anzeigegerät 34 zugeführt, das ein Voltmeter, ein Oszilloskop od. dgl. sein kann.

Weder die Magnetspule 18 noch die Integrationsschaltung 3 2 noch das Anzeigegerät 34 treten gleichzeitig mit der Stromversorgung da? Einrichtung 2 9 von der Quelle 28 aus in Tätigkeit, wenn der Schalter 28b geschlossen wird.

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Stattdessen ist die Arbeitsweise so programmiert, daß die Elemente 18, 32 und 34 durch die Erregung über einen Mechanismus 36 in Tätigkeit gebracht werden, der von einem Motor 37 aus angetrieben wird, dessen Welle 38 mit einer Welle 39 gekuppelt ist, die Nocken 40, 41 und 42 trägt, welche Schaltern 43, 44, 45 zugeordnet sind. Die Leitung 46 von der Leitung 28a speist den Motor 37 über eine Leitung 47 sowie die Schalter 43, 44, 45 über eine Leitung 48, wenn ein Schalter 49 geschlossen wird. Über eine Leitung 50, die vom Schalter 4 3 ausgeht, wird die Magnetspule 18 erregt. Über eine Leitung 51, die vom Schalter 44 ausgeht, wird das Anzeigegerät 34 erregt,und über eine Leitung 52, die vom Schalter 45 ausgeht, wird die Integrationsschaltung 32 erregt.

Nachdem die Vakuumquelle 23 in Tätigkeit gesetzt und der Schalter 28b geschlossen worden ist, kann der Arbeitszyklus des Systems dadurch eingeleitet werden, daß der Schalter 4 9 geschlossen wird, wodurch der Motor 37 in Tätigkeit gesetzt wird, der die Welle 39 antreibt. Die Magnetspule, die Integrationsschaltung 32 und das Anzeigegerät 34 werden dann zu Zeitpunkten und während Zeitperioden in Tätigkeit gesetzt, welche durch das Schliessen der Schalter 43, 44, 45 bestimmt werden, was von den Stellungen und Konturen der Nocken 40, 41, 42 abhängt.

Zur Erhöhung der Empfindlichkeit hat es sich als wünschenswert erwiesen, die Integration und Anzeige vor, während und nach der Flüssigkeitsströmung durch die Zelle 10 beispielsweise während etwa 30 Sekunden, durchzuführen, wobei nur während etwa 10 Sekunden von dieser Zeit die Flüssigkeit strömend gehalten wird. Im allgemeinen wird das Anzeigegerät 34 während der ganzen Integration betrieben, was jedoch nicht unbedingt erforderlich ist. Was den vollen Arbeiteablauf von etwa 30 Sekunden betrifft,

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so wird der Schalter 49 geschlossen, um den Motor 37 in Gang zu setzen. Hierauf schließt zu einem Zeitpunkt T_Q der Schalter 45, wodurch die Integrationsschaltung 32 in Tätigkeit gesetzt wird, die dazu dient, an das Anzeigegerät 34 ein Signal zu geben. Etwa 10 Sekunden später schließt der Schalter 43 und wird die Magnetspule 18 erregt, so daß deren Arm das Ventil 16 öffnet, was zur Folge hat, daß die Vakuumquelle 23 Flüssigkeit aus den Behältern 11 und 13 über die Zelle 10 zum Abscheider 20 saugen kann. Flüssigkeit fließt daher durch die Zelle 10 während etwa 10 Sekunden, worauf der Schalter 43 wieder öffnet. Während dieser ganzen Zeit bleibt der Schalter 45 geschlossen und behält diesen Zustand während etwa 10 Sekunden bei, nachdem das Ventil 16 geschlossen worden ist. Wenn der Nocken 41 zusammenfallend mit der Betätigung des Nockens 42 angeordnet ist, tritt das Anzeigegerät 34 während der gleichen 30 Sekunden in Tätigkeit, so daß es sich als zweckmässiger erweisen kann, den Nocken 41 wegzulassen und die Leitung 51 einfach mit dem Schalter 45 zu verbinden.

Die vorstehend angegebenen Zeitperioden sind natürlich P nur beispielsweise gegeben und können auch in anderer Weise gewählt werden. Sie hängen gewöhnlich von dem zu untersuchenden Material und dem verwendeten Reagens ab. Geeignete Strömungsperioden liegen gewöhnlich im Bereich von etwa 5 - etwa 30 Sekunden.

Das beschriebene Verfahren eignet sich zur Anzeige der relativen Mengen der Porphyrine, von ATP sowie von freien Radikalen, wie das -OH Radikal, organischen Radikalen oder anderen. Dies umfaßt den Nachweis und die Oberwachung £ir Bakterien oder Gewebezellen, da Porphyrine mit diesen Materialien verbunden sind.

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Die Probe und das Reagens beginnen durch die Zelle 10 beim Öffnen des Ventils zum Zeitpunkt T zu fassen.

Wie in Fig. 2 ersichtlich, findet die Beleuchtung aus einer Einzelreaktion,, d.h. im Satz Betrieb, nicht momentan statt, sondern erfordert eine endliche Zeitperiode T · Die Gesamt-Augenblicksemission aus der Zelle 10 heraus steigt jedoch, wenn die Probe und das Reagens kontinuierlich eingeführt werden (Fig. 3) anfänglich von Null an, bis zum Zeitpunkt T^ diese Emission einen stetigen Zustand erreicht.

In ähnlicher Weise klingt die Emission von dem stetigen Zustand auf Nu!
Ventils 16 ab.

Zustand auf Null zum Zeitpunkt T beim Schliessen des

Der Photoelektronen-Vervielfacher 27 nimmt einen Bruchteil der Gesamt-Augenblicksphotoenergie auf, die von innerhalb der Zelle 10 emittiert wird, und wandelt diese Energie in ein proportionales elektrisches Augenblicksausgangssignal um. Nach der Verstärkung tritt dieses Signal als Spannung am Eingang der Integrationsschaltung 32 auf, die während der ganzen Probenperiode T wirksam ist, wobei die Ausgangs spannung nach dem Ablauf dieser Probenperiode ausgedrückt werden kann durch

e = K \ Edt

wobei K = eine Systemkonstante (welche dem Quantenwirkungsgrad, dem Verstärkungsfaktor und der Kraftgenienverteilung Rechnung trägt) und

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E = Lumineszenzintensität der Reaktion.

Dieser integrierte Spannungswert ist proportional der gesamten akkumulierten Photonenenergie, die von innerhalb der Zelle 10 über die Probenperiode T emittiert wird.

Hierbei ist zu erwähnen, daß bei der erfindungsgemässen kontinuierlichen Reaktionsführung das Probenvolumen nicht auf eine obere Grenze beschränkt ist. Bei einem Satzbetrieb besteht eine solche Beschränkung und kann das Volumen der Reaktionszelle 10 und damit die Probe nicht ohne Begrenzung wegen der optischen Kopplungserfordernisse erhöht werden. Ausserdem eignet sich eine kontinuierliche Reaktionsführung zu einem viel gleichmässigeren und reproduzierbaren Mischen der Probe und des Reagens, was natürlich eine kontinuierliche Echtzeit-Untersuchüng einer Probe ermöglicht.

Patentansprüche:

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Claims (4)

Patentansprüche

1. Verfahren zur Anzeige einer Untersuchung des bakteriologischen Inhalts einer Probenflüssigkeit, bei welchem in einer Zelle die Probe und ein Reagens, das mit der Probe reagieren kann, gemischt wird, um Licht entsprechend dem bakteriologischen Inhalt der Probe zu emittieren, das von der Zelle emittierte Licht aufgenommen und das Ergebnis dieser Aufnahme angezeigt wird, dadurch gekennzeichnet, daß kontinuierliche Ströme der Probe und des Reagens in der Zelle zur Bildung eines aus der Zelle austretenden kontinuierlicnen Stroms gemischt werden und über einen Zeitraum die Aufnahme des aus der Zelle emittierten Lichtes integriert wird.

2, Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Strombildung dadurch erhalten wird, daß der aus der Zelle austretende Strom durch ein Ventil gesteuert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die zeitliche Steuerung des Verfahrens durch motorgetriebene nockenbet&tigte Schalter geschieht .

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch ge-

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kennzeichnet, daß das Integrieren während eines Zeitraums vorgenommen wird, der sich von einem* Zeitpunkt vor dem Mischen zu einem Zeitpunkt nach dem Mischen erstreckt·

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