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Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung von enzymhemmenden Stoffen.
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Bin in einem Reagene getränkter und getrockneter Detektioflsstreifen
ist seit langem bekannt. Beispiele dafür sind das Lackmuspapier und das Kaliumjodid-Stärkepapier.
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Bei diesem letzten Beispiel wird durch ein Oxydationemittel Jod freigemacht,
wodurch die Stärke die bekannte blaue Farbe erhält. Der eigentliche Indikator (die
Stärke) reagiert auf ein durch den nachzuweisenden Stoff verursachtes Reaktionsprodukt,
das durch Reaktion des zu detektierenden Stoffes mit einem auf dem Papier vorhandenen
Reagens entsteht.
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur qualitativen bzw.
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quantitativen Bestimmung von gasförmigen, flüssigen bzw.
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gelösten Stoffen mit enzymhemmender Wirkung, sowie Vorrichtungen zur
Durchführung dieses Verfahrens.
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Die Erfindung Besteht darin dap zumindest ein geeigneter Untergrund
als Reagenzträger verwendet wird, der eine Menge eines Enzyms enthält, dessen Wirkung
durch die zudétektierenden Stoffe gehemmt wird, daß dieser Reagenzträger mit dem
zu untersuchenden Milieu in Kontakt gebracht wird und dann, wenn nötig, doch noch
befeuchtet wird, dap danach mit dem behandelten Trager eine Wartezeit beachtet wird,
daß weiterhin ein anderer geeigneter Reagenz träger verwendet wird, der eine geeignet
Konzentration eines Substrats enthält, das unter dem Einfluß des Enzyme eine Farbreaktion
erfährt, dap danach die beiden erwähnten Reagenzträger nährend 10 bis 300 Sekunden
miteinander in Kontakt gebracht werden, und dap danach das wohl oder nicht Auftreten
einer Farbveranderung beurteilt wird.
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Das Ganze kann als zusammengesetzter Detektionsstreifen bezeichnet
werden.
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Die Erfindung umfaßt gleichzeitig die Anbringung eines geringe Konzentration
eines nicht-iogenen oberflächenaktiven Stoffes im enzymenthaltenden Reagenzträger,
so daß die diesbezüglichen Reagenzträger auch nach einer langeren Lagerzeit noch
reprodusierbar befeuchtet werden können.
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Die ist insbesondere in Nachstehenden fur die Farbreaktion mancher
organischen Ester ausgearbeitet1 deren Hydrolyse durch das Enzym Cholinesterase
katalysiert wird. Die Wirkung dieses Enzyms wird durch die Anwesenheit von Cholineßterase-Hemmern,
wie gewisse organische Phosphorverbindungen und Carbamate, spezifisch gehemmt.
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Geignete Cholinesterase-Enzyme sind zum Beispiel das Pseudocholinesterase
oder Azetylcholinesterase, Ein geeignetes Reagens fur die zu katalysierende Reaktion
ist zum Beispiel 2, 6-Dichorbenzenonindophenylazetat (DIBIA) oder eine Kombination
von a-Naphtylazetat und Diazoniumblau.
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Bei der Hydrolyse dieser Verbindungen wird unter Einfluß des Enzyms
eine tiefblaue Farbung erhalten.
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Cholinesterase-hemmende Verbindungen finden besonders in der Landwirtschaft
und im Gartenbau zur Insektenvertilgung Anwendung. "Nervengase" die bei einer chemischen
Kriegsführung verwendet werden könnten, gehören auch in diese.
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Kategorie.
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In Anbetracht der toxischen Eigenschaften derartiger Verbindungen
sind geeignete qualitative und quantitative Bestimmungsmethoden äußerst wichtig.
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Eine Anzahl chemischer und physikalischer Methoden sind bekannt als
qualitative and quantitative Bestimmungsmethoden für die betreffenden Verbindungen.
In einem polaren Lösungamittel konnen eine Anzahl organische Phosphorverbindungen
mit Hilfe eines Peroxyds und Dianisidins spektralphotometrisch bestimmt werden.
Auch sind polarographische und spektralfluorimetrische Bestimmungsmethoden beschrieben.
1-spezifische Bentimmungsmethoden werden mit gaschromatographischen Detektoren erhalten,
die auf spezifischer Flammionisation, Flammemission oder Elektronenfang basieren,
wobei oft nur die Elemente P, S und Cl gemessen werden.
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Cholinesterase-hemmende Verbindungen lassen sich auch biochemisch
bestimmen, ihrer spezifischen Eigenschaft gemäß, nämlich die Hemmung des Enzyms
Cholineßterase. Das Cholinesterase-Enzym läßt man während einer bestimmten Zeit
mit verschiedenen bekannten Inhibitorkonzentrationen reagieren.
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Die Reaktion wird durch Zufügung einer Natriumlaurylsulfatlösung gestoppt,
wonach ein geeignetes Substrat hinzugefügt wird.
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Das Substrat hydrolysiert unter dem Einfluß des restlichen Enzyms,
wobei Parbbildung auftritt, An B«nd einer spektralphotometrisch bestimmten Bichlinie
können unbekannte Inhibitorkonzentrationen bestimmt werden.
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Derartige, bekannte biochemische Bestimmungsmethoden werden jedoch
immer in lösung ausgeführt.
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Alle umschriebenen chemischen, biochemischen und physikalischen Bestimmungemethoden
erfordern eine große analytische Fertigkeit und ein ausgebreitetes Instrumentarium.
Sie sind deshalb für Kontrollzwecke wenig verlockend, Der erfindungsgemäße Detektionsstreifen
ermöglicht ungelerntem Personal in sehr beschränkter Zeitdauer chne ausgebreitetes
Instrumentarium die Bestimmung der KonzentratAon ton gasförmigen, flüssigen bzw.
aufgelösten Stoffen mit cholinesterses-hemmender Wirkung, ungeachtet deren chemische
Struktur.
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Der Anwendungsbersuich eines derartigen Detektionsstreifens ist deshalb
sehr groß.
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So ist es um Beispiel möglich in Treibhäusern, Fabrikhallen oder auf
Fabrikgeländen, abhängig von der Ausführungsform des Detektion streifens zu bestimmen,
ob eine gestellte Grenzkonzentration an Cholinesterase-hemmenden Stoffen in der
betreffenden Atmoephäre überschritten wird, oder wie oß die diesbezügliche konzentration
ist, 80 lassen sich auf einfache Weise im Abwasser von Insektisiden-produzierenden
oder -Verarbeitenden Fabriken und von landwirtschafts- und Gartenbaubetrieben Gholinosterssehemmende
Stoffe qualitaitv und quantitativ bestimmen.
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Auch kann die Oberfläche der zu konsumierenden Waren auf einfache
Weiee auf die Anwesenheit von Cholineeterasehemmenden Stoffen kontrolliert werden.
Betriebe, die CholinesteraÇe-hemmende Stoffe verarbeiten und nicht über gelerntes
Personal verfügen - eine Situation, die in den Entwicklungsländern vorkommen kann
- sind mit dem erfundenen Detektionsstreifen imstande auf zuverlässige, einfache
und schnelle Weise an Ort und Stelle die Ubersohreitung der Grenzkonzentrationen
nachzuweisen und diese Konzentrationen gleichzeitig quantitativ zu bestimmen.
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Die irreversible Hemmung der Cholinesterase darf durch eine Reaktionsgleiohung
zweiter Ordnung dargestellt werden
Die Abnahme von [Bg wird proportional «u der bimolekularen Geschwindigkeitskonstante
(k) (auch wohl Hemmungskonstante genannt) verlaufen, die Enzymkonzentration [E]
und die Hemmerkonzentration [I] nach
FUr eine bestimmte Verbindung mit ensymhemmender Wirkung wird die Situation vorkommen,
wie in Figur 1 dargestellt ist.
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Bei iner auflaufenden Inkubationszeit t wird pro Enzym konzentration
die Detektionsgrenze niedriger werden.
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Bei abnehmender Enzymkonzentration ([E]4 > [E]3 > [E]2 >
[E]1 wird die, Detektionsgrenze bei gleicher Inkubationszeit niedriger werden. Durch
Variation der Enzynkonzentrationen und der Intubationszeiten(Wertezeiten) läßt sich
die Detektionsgrenze innerhalb eines bestimmten Gebietes variieren, wodurch
die
Möglichkeit besteht, auf diesem Prinzip eine quantitative Bestimmung zu realisieren.
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Die Hemmungskonstante k variiert für die verschiedenen Cholinesterasse-hemmenden
Stoffe von etwa 102 imol -1min-1 bis etwa 108 lmol-1min-1.
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Infolge der Zerlegung des Enzyms weist ein Reagenztrager, der ein
Enzym enthält, allmählich hydrophobe Eigenschaften auf.
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Dies verursacht eine ungenaue, nicht reproduzierbare Befeuchtung
des enzymenthaltenden Reagenzträgers, mit als Folge eine ungenügend genaue Konzentrationsbestimmung.
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Die gebräuchlichen Mittel, einem Reagenzträger hydrophile Eigenschaften
zu verleihen, sind oberflächenaktive Stoffe. Diese Stoffe haben. jedoch den Nachteil,
daß sie sich an den aktiven Stellen im Enzym festsetzen, wodurch die Aktivität stark
abnimmt. Zufügung ines obertlächenaktiven Stoff es ist sogar ein bekanntes Mittel
zur abrupten Abbrechung einer enzymatischen Reaktion.
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Ein großer Vorteil der Erfindung ist es, daß eine Gruppe von oberflächenaktiven
Stoffen gefunden wurde, die das Enzym Cholinesterase nicht an Aktivität verringern
und dem Untergrund gute hydrophile Eigenschaften vermitteln. Dies sind die nicht-iogenen
obertlächenaktiven Stoffe aus der Klasse der Alkoholathoxylate mit der allgemeinen
Struktur wie in -Figur 2 dargestellt ist.
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Gute Ergebnisse wurden uit einen Stoff erzielt, bei dei n + a I 14
und x " 12 in einer Konzentration zwischen 0,005-1,0 Gew. % bezogen auf die Flüssigkeit
mit der der Untergrund imprägnlert wird, Für praktische Anwendungen wird verlangt,
da sich das
papier mindestens ein Jahr halt. Ein Papier, dem ein
Alkohloähtoxylat hinzugefät wurde, ist mindestens zwei Jahre brauchbar.
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Eine der Ausführungsformen besteht darin, daß eine Probe Luft Dampf
oder Flüssigkeit sowohl qualitativ wie quantitativ auf Stoffe mit enzyemmender Wirkung
analysiert wird.
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Zwei andere Ausführungen ermöglichen die Bestimmung in einer Flusig
kettsprobe fur Kontr lzwecke, ob eine Grenkonzentration übersxhritten wird.
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Fur ein gasförmiges Milieu wurde eine Vorrichtung entworfen, bei der
die Luftprobe durch ein Vorsatzstück gesaugt wird, das einen enzymimprägnierten
Reagenztrager enthalt, in dem außerdem ein Ad sorbens (wie Silika, Bentonit und
dergleichen) verarbeitet worden ist. Auch hierait wird die Uberschreitung eines
Grenzwertes bestimmt.
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Dieses Vorsatzstück kann auf einer Gasmaske angeordnet werden oder
in einer mit einer Luftpumpe angetriebenen Vorrichtung zur Probeentnahme und auf
diese Weise während einiger Zeit die Gelegenheit zur Adsorbtion der in geringen
Mengen anwesenden Gase erhalten. Danach ist es notwendig den Trager mit einigen
Tropfen Wasser zu befeuchten, da sonst die Hemmungsrezktion nicht stattfinden kann.
Die "Wartezeit" beginnt im Augenblick des Berfeuchtans.
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Der erfindungsgemaß zu verwendende Reagenzträger kann verschiedener
Art sein. Bei der Wahl des Trägermaterials, du mit Enzym imprägniert werden soll,
sind eine Anzahl Faktoren wichtig. Einerseits müssen die adsorbierenden Eigenschaften
des Trägermaterilas eine homogene Imprägnierung nit Enzym ermöglichen und andererseits
nuß das Tragermaterial derart rein ein, daß die Enzymaktivität nicht gestört wird.
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Auch muß bei der Detektion einer Flüssigkeit der enzymenthaltende
Trager eine reproduzierbare Befeuchtung ermögllehen können.
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Als Reagenztrager lassen sich viele Stoffe verwenden, wie Folien aus
Polyvinylalkohol, gewebte und ungewebte Textilien, Papier und dergleichen. In der
Vorzugsausführung wird Papier verwendet, das aus gereinigter Zellulose besteht.
Diese Papier, das sogenannte "Pellepapier", das zum Beispiel unter dem Handelsnamen
"Ederol 281" erhältlich ist, hat außerdem einen niedrigen Luftwiderstand, was für
die Detektion von gasförmigen Inhibitoren erwünscht ist.
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Der Reagenzträger wird abhängig von dem zu detektierenden Stoff mit
einem Enzym imprägniert. Für Cholinesterase-hemmende Stoffe wird ein Cholinesterase-Enzym
verwendet. Es sind verschiedene Typen Cholinesterase brauchbar. Eine geeignete Cholinesterase
ist Pseudocholinesterase.
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Die Aktivität der Pseudocholinesterase ist vom pH abhangig und ist
bei einem pH von etwa 8 maximal.
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Demzufolge empfielt es sich im Reagenzträger neben dem Enzym einen
Purferstoff vorzunehmen, so dap reproduzierbare Bestimmungen in wasserigem Milieu
mit einem pH, das zwischen etwa 4 und etwa 10 schwankt, durchgeführt werden können.
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Ein geeignetes Puffersyetem ist Tri (hydroxymethyl) methylamin mit
einer Starke zwischen 0,01-1 molar auf die Flüssigkeit bezogen, mit der der Reagenzträger
imprägniert wird.
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Der Reagenztrager wird mit dem zu untersuchenden Milieu in Kontakt
gebracht. Wird die umringende Atmosphare durch einen ein Adsorbens
(und
oberflächenaktiven Stoff) enthaltenden Trager geaogen, eo werden die zu detektierenden
Stoffe an Ort und Stelle adsorbiert werden. Mittels einer derartigen konzentrierenden
Wirkung können sehr niedrige Konzentraionen Cholinesterase-hemmende Stoffe detektiert
werden.
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In einem Flüs keitamilieu, in dem zu detektierende Stoffe gelost sind,
oder in das kleine Tropfen der zu detektierenden Stoffe geraten sind, wird eine
andere Technik der Probeentnahme angewendet.
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Der enzym enthaltende Reagenztrager kan zum Beispiel in die Flüssigkeit
getaucht oder damit bespritzt werden.
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Aus analytischen Erwägungen werden die bekannten Methoden, um eine
abgemessene Probemenge auf dem Papier anzubringen, vorteilhaft benutzt.
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In der Vorzugsausführung wird die Fliissigkeitsprobe durch die Aufsaugfänigkeit
des Pellepapiers dosiert.
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Der Rand des enzymenthaltenden Papiers wird zu diesem Zweck während
einer Zeit, die von 1 bis 60 Sekunden dauern kann, in die Flüssig keit getaucht.
Eine genaue Menge der zu untersuchenden Lösung wird hineingesaugt, wonach das qualitative
oder das quantitative Verfahren durchgeführt wird.
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Zur Bestimmung von Spuren der enzymhemmenden Stoffen auf Leitungen,
Tanks, Füllöffnungen und landwirtschaftlichen Geraten konnen die zu untersuchenden
Oberflachen mit feucht ei Enzympapier mittels Reiben in Kontakt gebracht werden.
Auf derartige Weise kann auch untersucht werden, ob auf den zu konsumierenden Waren
eine unzulzässige Konzentration vorhanden ist.
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Mit dem Papier, das mit dem zu zu untersuchenden Milieu in Kontakt
gebracht
worden ist, werden verschiedene Wartezeiten beachtet.
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Abhängig von der Konzentration des zu detektierenden Stoffes, von
dessen Hemmungskonstante und von der beachteten Wartezeit wird die Aktivität des
Enzyms abnehmen.
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Durch die Anbringung einer geeigneten Enzymkonzentration auf dem Papier
und durch die Beachtung einer geeigneten Einwirkungazeit bzv. Wartezeit ist eine
quantitative Bestimmung der enzymhemmenden Stoffe möglich.
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Die Einwirkungszeiten lassen sich von einigen Sekunden bis auf viele
Minuten variieren. In den meisten Fällen liegt die Ein wirkungszeit zwischen 15
Sekunden und 20 Minuten.
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Nachdem das Enzym mit den zu detektierenden Stoffen reagiert hat,
wird ein anderer geeigneter Reagenzträger, dr eine geeignete Menge eines Substrats
enthalt, das unter dem Einfluß des Enzyms eine Farbreaktion erfährt, mit dem enzymenthaltenden
Reagenztrager in Kontakt gebracht.
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Als Trägermaterial fur" dieses Substrat lassen sich verschiedene adsorbierende
Stoffe verwenden, wie zum Beispiel gewebte und ungewebte Textilien, Filtrierpapier,
Glasfaserpapier und Silikapapier.
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In den Vorzugsausführungen wird Filtrierpapier d.s unter dem Handelsnamen
"thatman Papier Nr. 1" bekannten Typs verwendet.
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Als Substrat können verschiedene chromogene Systeme verwendet werden,
dessen Hydrolyse von mindestens einem Komponenten durch das Enzym katalysiert werden
konnen maß.
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Die Hydrolyse-Produkte bilden selbst oder in Kombination mit anderen
Stoffen des chromogenen Systems eine farbige Verbindung.
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Ein bekanntes System ist a-Naphthylazetat mit Diazoniumblau.
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In den Vorzugosusführungen wird 2,6-Dichlorbenzenonindophenylazetat
(Dibia) verwendet, das bei Hydrolyse unter dem einfluß des Enzyms eine tiefblaue
bildet.
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Im Zusammenhang damit, dap es eine durch Cholinesterase katalyaierte
Hydrolyse von DIBIA betrifft, kann das Substrat in großem übermaß vorhanden sein.
Die einzige Einschränkung, die in bezug auf eine angewandte Konzentration gemacht
wird, ist die minimale Konzentration, die eine Farbwahrnehmung ermoglicht.
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Vorzugsweise wird das verwendete Filtrierpapier mit einer Lösung,
die 0,1-2 mgr/ml DIBIA enthalt, impragniert.
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Danach werden der Substart- und der enzymhaltige Trager wahrend 10
bis 300 Sekunden miteinander in Kontakt gebracht. Diese Zeit ist eine wenig kritische
Göße. Bei einer hohen Aktivität des Enzyms wird die Farbbildung bereits nach einigen
Sekunden auftreten. Falle nur wenig nichtgehemmtes Enzym vorhanden ist, wird die
Farbe langsamer gebildet werden.
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Das Kriteriun bei der Bestimmung ist das wohl oder nicht Erscheinen
einer Farbe. Indem keine Farbe aufkommt, ist das Enzym während der Wargeteit vollig
gehemmt. Indem wöhl eine Farbe gebildet wird, ist das Enzym nicht oder nur teilweise
gehemmt. Damit kleine Farbintensitatsunterschiede in der Zone der Detektiongrenze
auf ihren Wert beurteilt werden konnen, ist eine vergleichende "Blanko"-Bestimmung
durchzuführen. Bei einer "Blank"-Bestimmung wird eine tiefblaue Farbe gebildet.
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Für die qualitative und quantitative Bestimmung von gasförmigen, rlüsßigen
bzw. gelösten Stoffen mit enzymhemmender Wirkung kann bei Stoffen mit einer starken
enzymhemmenden Wirkung von einer ganzen Reabenzträger-Reihe, die unterschiedene
Enzymkonzentrationen enthält, vorteilhaft Gebrauch gemacht werden. Bei Stoffen mit
einer geringen enzymhemmenden Wirkung wird vorteiljaft die Wartezeit variiert.
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Unter Stoffen mit einer starken enzymhemmenden Wirkung versteht man
Stoffe mit einer Hemmungskonstante zwischen 106 bis 108lmol-1min-1 min Ein Stoff
mit einer Hemmungskonstante von 102 bis 10 lmol min wird ein Stoff mit geringer
enzymhemmender Wirkung genannt.
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Bei Stoffen mit einer Hemmungskonstante zwischen 103 und 107 lmol-1min-1
lassen sich sowohl die Enzymkonzentration wie die Wartezeit variieren.
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Die Erfindung wird weiter an Hand der Zeichnung erläutert.
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Darin ist: Fig. 1 die bereits erwahnte graphische Darstellung des
Verlaufs der Detektionegrenze für eine Anzahl verschiedener Enzymkonzentrationen
LE mit der Inkubationszeit t und der Hemmungskonzentration [I] Fig. 2 die allgemeine
Formel des vorzugsweise anzuwendenden nicht iogenen oberflachenaktiven Stoffes;
Fig.3 eine Kombination von zwei einzelnen Streifen; Fig. 4 ein geeignetes Gefge,
bei dem die Streifen nach der Einwirkungs zeit dirch Zusammenfaltung des Gefges
miteinander in Kontakt gebracht werden können; Fig. 9 eine Draufsicht der mittels
eines Drahtes oder einer Kette verbundenen in runde (Plastik) halter gefaßten Streifen,
die nach der Einwirkungszeit aufeinander gedrückt werden kannen;
Fig.
6 ein Durchschnitt durch die Streifenhalter nach Fig. 5 und Fig. 7a und 7b eine
schematisch dargestellte Ausfuhrungsform zur quantitativen Bestimmung der Enzymhemmer.
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Die beiden Streifen 1 und 2 von Fig. 3 sind aus starken Kunstharzstoff
(zum Beispiel Polystyren), während jeweils an einem Ende ein präpariertes Stuck
Papierdetektionsstreifen 3 bzw. 4 befestigt ist (zum Beispiel mit einem doppelseitig
klebenden Klebeband).
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Man kann auch die Enden eines jeden Kunstharzstreifens durch eine
bestimmte Handlung porös machen und die porösen Enden mit einer geeigneten Konzentration
des Enzyms und des Reagens versehen. Es empfiehlt sich die Streifen deutlich mit
einem Zeichem zu versehen, damit kein Zweifel ensteht, welches der Streifen der
mit dem Enzym ist, der in das zu untersuchende Wasser getaucht werden kann.
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Der zusammengesetzte Streifen nach Fig. 4 besteht aus einem mit einer
Faltrille 5 versehenen ueberzug aus wasserdichtem Material, wie zum Beispiel Polyäthylen
oder Teflon. In einem hohlen Teil 7 dieses Uberzuge ist ein mit dem Enzym praparierter
Papierstreifen 8 angeordnet, der einige Millimeter aus der Umhüllung ragt. Bei 9
ist eine Vffnung in die Umhüllung gemacht und symmetrisch zur Faltlinie 5 ist an
der Umhüllung ein Stück 10 des mit dem Substrat behandelten Papiers angebracht.
Man traucht den herauaragenden Teil des Enzym papiers 8 während einiger Sekunden
in das zu untersuchende Wasser und nach einiger Zeit des Wartens faltet man Umhüllung
zusammen, sp daß die Streifenteile 9 und 10 einander bedecken und hält den Streifen
einige Minuten in dieser Lage. Danach kann man ihn auseinanderfalten und die gegebenenfalls
verurzachte Frabenänderung beobachten4
Die ausführung mit dem Detektions
"knopf" nach den Figuren 5 und 6 ist ein wenig robuster. Der mit einigen Durchbohrungen
11 versehene Knopfkörper 12 hat einen enzympräparierten Reagenzträger 13.
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Man saugt wahrend einiger Minuten das zu untersuchende gasförmige
Medium durch den Knopfkörper 12 und befeuchtet das Papier mit einigen Tropfen reinen
IJassers Nach einigen Minuten des Wartens wird der Drucker 15, der an der Unterseite
mit einem mit dem Substrat präparierten adsorbierenden Reagenzträger 16 versehen
ist, auf den Knopf gedrückt und nach wieder einigen Minuten werden beide Teile wieder
auseinandergezogen und die eventuelle Verfärbung beurteilt. Die beiden Teile des
'Knopfes" sind, wenn dies auch nicht von wesentlichem Belang ist, vorteilhaft durch
eine geschmeidige Schnur oder eine Kordel 17 miteinander verbunden.
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Für wässerige Lösungen wurde ein Hilfsgerät für eine quantitative
Bestimmungsmethode für eine Bereich von etwa 100-0,01 ppm entworfen.
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Die allgemeine Form einer Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung
von gaßförmigen, flüssigen bzw gelösten Stoffen mit enzymhemmender Wirkung nach
der Erfindung besteht einerseits aus einem Träger 20 (Fig. ?a) von einem geeigneten
Kunststoff, wie Polystyren, auf dem mehrere Streifen 21 mit variierenden Konzentrationen
enzymenthaltenden Reagenzträger angebracht sind, wie neben der Figur dargestellt
ist.
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Für einen bestimmten zu detektierenden Stoff kann unter jedem Streifenteil
angegeben werden, bei welcher Konzentration an dem Stoff gerade eine sichtbare Verfärbung
auftritt (vorausgesetzt, dap die angegebenen Standardwartezeiten beachtet werden).
In der Figur ist dies angegeben mit [I]1' usw. und tl, usw.
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Andererseits besteht die Vorrichtung aus räumlich davon gestrennten
Streifen 24 mit verschiedenen Reagenzträger, die jeweils eine geeignete Konzentration
Substrat enthälten und auf einem Träger 23 angebracht sind (Fig. 7b), dies alles
in einer Weise, dap der substratenthaltende Untergrund nach verchiedenen Wartezeiten
mit dem enzymenthaltenden Untergrund in Kontakt gebracht werden kann.
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Die Enzympapierstreifen 21 werden vorteilhaft mit Hilfe von doppelseitig
klebendem Klebeband auf dem Träger 20 angebracht.
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Unter jedem Streifen sind eine Anzahl poröse Stellen oder Löcher 22
angebracht, sowohl im Klebeband wie auch im Träger 20. Durch Untertauchen oder Ubergießen
der Probe über die Rückseite desTrägers werden alle Streifen gleichzeitig und reproduzierbar
befeuchtet. Nach Befeuchtung wird eine initielle Wartezeit tl beachtet, wonach der
erste Teil der Streifen wahrend 60 Sekunden mit einem Substratpapier 24 in Kontakt
gebracht wird.
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Diese selbe Handlung wird hintereinander mit sich steigernden Wartezeiten
auf Teilen des Streifensystems durchgefkrt.
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Das Auftragen des Substratpapiers kann auf verschiedene Arten gesehen'
zum Beispiel mittels einer Rolle, die in axialer Richtung mit einer Anzahl Streifen
Substratpapier 24 versehen ist oder mit einem in Harmonika-Art gefaltenen Halter
mit einer Anzahl Streifen Substratpapier, mit dem stets nach einer bestimmten Zeit
ein folgender Streifen auf die bekannten Stellen gedrückt wird.
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Die Brauchbarkeit derartiger Systeme kann durch Klemmvorrichtungen
erhöht werden.