DE2733426C3

DE2733426C3 - Diagnostisches Mittel zum Nachweis von Ketonkörpern in Flüssigkeiten und Verfahren zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE2733426C3
Application number: DE2733426A
Authority: DE
Inventors: Klaus Dr. 3015 Wunstorf Habenstein
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1977-07-23
Filing date: 1977-07-23
Publication date: 1981-08-06
Also published as: IT7825976A0; AU3824478A; US4184850A; CA1109773A; DE2733426B2; IT1099009B; FR2398307A1; DE2733426A1; GB2001436A; AU516775B2; FR2398307B1; ES471815A1; JPS5424093A; GB2001436B

Description

Die Erfindung betrifft ein diagnostisches Mittel zum Nachweis von Ketonkörpern in Flüssigkeiten, insbesondere in Körperflüssigkeiten, das aus einem mit Natriumnitroprussid, einer wasserlöslichen Aminosäure und einer alkalischen Puffersubstanz imprägnierten saugfähigen Träger besteht.

Ketonkörper treten im Urin bei einer Ketose, d. h. einer Entgleisung des Kohlenhydrat-Fett-Stoffwechsels auf:

Ein Überschuß an Acetyl-Coenzym A wird zu Acetessigsäure kondensiert, woraus nach weiteren Reaktionen Aceton gebildet wird. Der Nachweis dieser beiden Ketonkörper im Urin ist daher für die Erkennung und Kontrolle von Diabetikern von Bedeutung.

Als empfindliches analytisches Verfahren bietet sich die Legal'sche Probe an, die jedoch wegen der Zersetzlichkeit des Natriumnitroprussids in alkalischen Lösungen nur mit stets frisch angesetzten Lösungen durchgeführt werden kann und daher sehr aufwendig ist. Nachdem zwischenzeitlich zu Tabletten verpreßte

ίο Mischungen der Trockenchemikalien verwendet wurden, gelingt heute der Nachweis mit einfacher zu handhabenden Teststreifen, die in einem saugfähigen Träger alle für die Reaktion benötigten Reagenzien enthalten (DE-PS 12 56 920, DE-PS 21 58 125).

Allerdings macht sich auch bei den Teststreifen die Zersetzungsneigung des Natriumnitroprussids bemerkbar, welches nur bei einem pH-Wert unterhalb von 7 stabil und nur in einem alkalischen Medium bei einem pH-Wert über 8 für den Test brauchbar ist.

Die Erhöhung der Lagerfähigkeit wird nach der Lehre der DE-PS 12 56 920 dadurch erreicht, daß das Natriumnitroprussid durch eine organische, filmbildende Substanz vom basischen Puffer abgeschirmt wird. Nachteilig macht sich hierbei eine Verminderung der Reaktionsgeschwindigkeit bemerkbar.

In der DE-PS 21 58 125 wird dagegen der Zusatz einer filmbildenden Substanz vermieden, indem das mit einem basischen Puffer getränkte Papier nach Trocknung mit einer Lösung von Natriumnilroprussid in Methanol und Dimethylformamid getränkt und getrocknet wird. Auch nach längerem Trocknen bei 80⁰C bleibt von dem relativ hochsiedenden Dimethylformamid ein Teil auf dem Trägermaterial zurück und übt dort vermutlich den stabilisierenden Effekt aus. Die auf dem Testpapier nach der Trocknung zurückbleibende Menge an Dimethylformamid ist sehr stark von den Produktionsbedingungen abhängig und kann bei der Produktion eines Papiers konstanter Reaktionsfähigkeit erhebliche Schwierigkeiten bereiten. Hinzu kommt, daß Dimethylformamid als gesundheitsschädlich anzusehen ist.

Der vorliegenden Erfindung lag infolgedessen die Aufgabe zugrunde, stabile Diagnosemittel zum Nachweis von Ketonkörpern herzustellen, die eine gleichmäßige Anzeige aufweisen.

Diese Aufgabe wird durch das erfindungsgemäße diagnostische Mittel gelöst, das aus einem mit Natriumnitroprussid, einer wasserlöslichen niederen Aminosäure und einer alkalischen Puffersubstanz

■>o imprägnierten saugfähigen Träger besteht und gekennzeichnet ist durch einen Gehalt an organischen Säuren, ausgenommen die für die Nachweisreaktion notwendigen niederen Aminosäuren, als stabilisierendes Umgebungsmilieu für das Natriumnitroprussid.

Die stabilisierende Wirkung der organischen Säuren wird damit erklärt, daß der alkalische Puffer bei Zutritt einer geringen Menge Wasser, z. B. aus der Atmosphäre, zunächst mit den Säuren aus der Umgebung des Natriumnitroprussids reagiert und damit das stabilisie-

i>o rende, neutrale bis saure Milieu um das Natriumnitroprussid herum erhalten bleibt. Bei Zutritt größerer Wassermengen, wie es bei der Ausführung eines Testes der Fall ist, stellt dagegen der im Überschuß vorhandene alkalische Puffer nach einer schnell ablaufenden Ionenreaktion mit den Säuren auch im Bereich des Natriumnitroprussids einen schwach alkalischen pH-Wert ein, der die günstigsten Bedingungen für oen Ketonnachweis liefert. Damit wird der stabilisierende

Vorteil einer Mikroverkapselung erzielt, ohne daß ein Nachteil durch Verminderung der Reaktionsgeschwindigkeit infolge des feuchtigkeitsabschirmenden Filmes von echten Mikrokapseln entsteht

Das erfindungsgemäße diagnostische Mittel läßt sich nach einem Verfahren herstellen, bei dem der ;saugfähige Träger nacheinander mit folgenden Lösungen getränkt und jeweils getrocknet wird:

a) einer wäßrigen Lösung der alkalischen Puffersubstanz und einer wasserlöslichen niederen Aminosäure,

b) einer Lösung einer in einem organischen Lösungsmittel löslichen, organischen Säure, ausgenommen die für die Nachweisreaktion notwendigen niederen Aminosäuren, in einem organischen Lösungsmittel bzw. LöEungsmittelgemisch,

c) einer Lösung von Natriumnitroprussid und einer in Wasser und organischen Lösungsmitteln löslichen organischen Säure, ausgenommen die für die Nachweisreaktion notwendigen niederen Aminosäuren, und gegebenenfalls einem Oxidationsinhibitor in einem organischen Lösungsmittel bzw. Lösungsmittelgemisch.

wobei die alkalische Puffersubstanz in einem äquivalenzmäßigen Überschuß gegenüber der Summe der in Lösung b) und c) enthaltenen organischen Säuren auf den organischen Träger aufgebracht wird.

Nach diesem Verfahren hergestellte Testpapiere sind sehr anzeigeempfindlich, biegsam, gut verarbeitbar und besitzen eine helle Grundfarbe.

Prinzipiell ist es auch möglich, drei verschiedene dünne saugfähige Träger mit je einer der Lösungen a), b) und c) zu tränken und nach Trocknung aufeinanderliegend, ζ. B. durch ein feinmaschiges Netzwerk an einer Halterung, zu befestigen.

Jedoch wi'-H das vorstehend beschriebene Verfahren, den gleichen Träger nacheinander mit den verschiedenen Lösungen zu tränken, bevorzugt.

Bevorzugt werden in Lösungen b) und c) als organische Säuren eine oder mehrere aus den folgenden Gruppen verwendet: höhere aliphatische Monocarbonsäuren, aliphatische Polycarbonsäuren, gegebenenfalls substituierte aromatische Carbon- und Sulfonsäuren.

Als Beispiele für die erfindungsgemäß zu verwendenden organischen Säuren seien genannt:

Capronsäure, Caprylsäure,

Dodecylcarbonsäure, Ölsäure,

Oxalsäure, Citronensäure,

Äpfelsäure, Weinsäure,

Salicylsäure, Acetylsalicylsäure,

4-Brominethylbenzoesäure,

4-Chlorbenzoesäure,

4-Fluorbenzoesäure,

4-Nitrobenzoesäure,

4-Methoxyphenylessigsäure,

Diphenyldicarbonsäure,

Phthalsäure, 4,5-Dichlorphthalsäure,

Isophthalsäure, 5-Nitroisophthalsäure,

Zimtsäure, Sulfosalicylsäure.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird in Lösung b) eine in Wasser schwer lösliche organische Säure aus den angeführten Gruppen und in Lösung c) Citronensäure verwendet.

Die genannten organischen Säuren lieferten besonders lagerstabile Testmittel. Es soll jedoch betont werden, daß das Verfahren sich auch mit anderen organischen Säuren durchführen läßt. So lassen sich auch organische Säuren verwenden, die Polymere bilden können.

Als saugfähige Träger kommen die dem Fachmann bekannten Materialien in Betracht, wie Papiere oder Vliese aus tierischen, pflanzlichen oder Kunststoff-Fasern.

Beispiele für niedere wasserlösliche Aminosäuren sind Glycin und Alanin.

Als alkalische Puffersubstanz kommen Alkali- bzw.

κι Ammoniumcarbonate, -phosphate und -borate, ferner EDTA-Alkali-Salze und Aminosäure-Alkali-Salze in Betracht Gute Ergebnisse werden sogar erhalten, wenn zu der niederen wasserlöslichen Aminosäure ein äquivalenzmäßiger Unterschuß von Alkalihydroxid gegeben wird.

Die Wahl des organischen Lösungsmittels ist nicht kritisch. Es können beispielsweise niedere Alkanole, Äthylglykol, Toluol, Tetramethylharnstoff und Dioxan allein oder in Mischung eingesetzt werden.
_'o Durch ZüSi tz eines Oxidationsinhibitors, wie z. B. 2-tert.-Butyl-4-methoxyphenol, erhält man Testmittel mit einer sehr hellen (Jntergrundfarbe, so daß die Empfindlichkeit gesteigert erscheint.

Die folgenden Beispiele erläutern die vorstehend 2) beschriebene Erfindung, ohne sie zu begrenzen:

Es wurde jeweils Filterpapier Nr. 2316 der Firma

Schleicher und Schüll verwendet, das nach Tränkung mit Lösung a) 1 Stunde und nach Tränkung mit den Lösungen b) und. c) jeweils 30 Minuten lang bei 80⁰C getrocknet wurde.

Beispiel 1

Lösung a: 120 g Glycin,

28 g Natriumhydroxid,

300 mi Wasser
Lösung b: 6 g Oxalsäure,

150 ml Methanol,
150 ml n-Propanol

Lösung c: 3 g Natriumnitroprussid,

6 g Citronensäure,

0,3 g 2-tert.-Butyl-4-methoxyphenol,

150 g Methanol,
■f> 150 ml n-Propanol

Das nach der Endtrocknung erhaltene sehr helle Nachweispapier zeigt einen Gehalt von 5—10 mg Acetessigsäure/100 ml Lösung und einen Gehalt von 30—50 mg Aceton/100 ml Lösung an.

Gleichwertige Papiere werden erhalten, wenn in der Lösung b) Ölsäure, 4,5-Dichlorphthalsäure oder Sulfosalicylsäure, anstelle der Oxalsäure verwendet werden.

Beispiel 2

Lösung a: wie Beispiel I
Lösung b: 6 g ölsäure,

300 ml Toluol
Lösung c: wie Beispiel 1

von

sehr helle 5—10 mg

Das nach der Endtrocknung erhaltene
Nachweispapier zeigt einen Gehalt
Acetessigsäure/100 ml Lösung an.

Gleichwertige Papiere werden erhalten, wenn anstatt Toluol in der Lösung b) Tetramethylharnstoff, Dioxan, Äthylglykol oder Propanol verwendet werden.

Beispiel 3

Lösung a: wie Beispiel 1
Lösung b: 6 g Ölsäure,

300 ml n-Propanol
Lösung c: 3 g Natriumnitroprussid

6 g Citronensäure

0,3 g 2-tert-Butyl-4-meihoxyphenol

150 ml n-Propanol

150 ml Äthylglykol

Das fertige Nachweispapier zeigt einen Gehalt von 5—10 mg Acetessigsäure/100 ml Lösung an.

Gleichwertige Papiere werden erhalten, wenn in der Lösung c) anstelle des Lösungsmittelgemisches reines Propanol oder Gemische von Methanol mit denen unter Beispiel 2 genannten Lösungsmitteln verwendet werden.

Beispiel 4

Lösung a: wie Beispiel 1
Lösung b: 6 g Ölsäure

300mi Toluol
Lösung c: wie Beispiel 1, jedoch ohne

2-tert.-Butyl-4-methoxyphenol

Das fertige Nachweispapier ist in der Anzeige geringfügig unempfindlicher als das in Beispiel 2 erhaltene und zeigt noch 10—15 mg Acetessigsäure/ 100 ml Lösung an.

Beispiel 5

Lösung a: wie Beispiel 1

Lösung b: 9 g 4,5-Dichlorphthalsäure

150 ml Methanol

150 ml n-Propanol
Lösung c: wie Beispiel 1

Das fertige Nachweispapier wurde in verschlossenen Rollranddosen bei 55°C gelagert. Die Dosen wurden nach jedem zweiten Tag geöffnet und jeweils 10,20 oder 30 Minuten bei Zimmertemperatur einer Atmosphäre mit 100% relativer Luftfeuchtigkeit ausgesetzt. Der Gehalt Natriumnitroprussid/cm² des Nachweispapiers wurde jeweils bestimmt und die Abnahme infolge Zersetzung ermittelt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die gelagerten 'Papiere zeigten einen Gehalt von 5—10 mg Acetessigsäure/100 ml Lösung noch schwach sichtbar an. Auch nach 29 Tagen waren die Papiere nur leicht gelblich verfärbt.

Tabelle 1

Abnahme des Natriumnitroprussidgehaltes (erfindungsgemäßes Verfahren)

Öfinungs-	Abnahme	in (%) nach	27 Tagen	29 Tagen
10 dauerder
Dosen	18 Tagen	22 Tagen	14,5	19
(Min.)				21,5
15 10	5	8,5	24,5	36
20		8
30	13,0	15,5

Im Gegensatz dazu ergab ein nach DE-PS 21 58 125, Beispiel 1 hergestelltes Testpapier mit

Lösung a: 25 g Glycin

36,3 g EDTA-Na-SaIz

100 ml Wasser
Lösung b: 1,0 g Natriumnitroprussid

40 ml Dimethylformamid

60 ml Methanol

unter denselben Testbedingungen die in Tabelle ι aufgeführten Ergebnisse. Das nach der Herstellung sehr jo harte und leicht gelbliche Papier war nach 12 Tagen bräunlich verfärbt und zeigte 20 mg Acetessigsäure/ 100 ml Lösung nicht mehr an.

Tabelle 2

J5 Abnahme des Natriumnitroprussidgehaltes (Verfahren der DT-PS 21 58 125, Beispiel 1)

Öflnungsdauer
der Dosen

(Min.)

Abnahme in (%) nach

7 Tagen 12 Tagen

10
20

30

4,3	23,6
7,3	23,6
11,2	45,9

Claims

Patentansprüche:

1. Diagnostisches Mittel zum Nachweis von Ketonkörpern in Flüssigkeiten, insbesondere in Körperflüssigkeiten, das aus einem mit Natriumnitroprussid, einer wasserlöslichen niederen Aminosäure und einer alkalischen Puffersubstanz imprägnierten saugfähigen Träger besteht, gekennzeichnet durch einen Gehalt an organischen Säuren, ausgenommen die für die Nachweisreaktion notwendigen niederen Aminosäuren, als stabilisierendes Umgebungsmilieu für das Natriumnitroprussid.

2. Verfahren zur Herstellung eines diagnostischen Mittels nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der saugfähige Träger nacheinander mit folgenden Lösungen getränkt und jeweils getrocknet wird:

a) einer wäßrigen Lösung der alkalischen Puffersubstanz und einer niederen wasserlöslichen Aminosäure,

b) einer Lösung einer in einem organischen Lösungsmittel löslichen organischen Säure, ausgenommen die für die Nachweisreaktion notwendigen niederen Aminosäuren, in einem organischen Lösungsmittel bzw. Lösungsgemisch,

c) einer Lösung von Nairiumnitroprussid und einer in Wasser und organischen Lösungsmitteln löslichen organischen Säure, ausgenommen die für die Nachweisreaktion notwendigen niederen Aminosäuren, und gegebenenfalls einem Oxidationsinhibitor, in einem organischen Lösungsmittel bzw. Lösungsmittelgemisch,

wobei die alkalische Puffersubstanz in einem äquivalenzniäßigen Überschuß gegenüber der Summe der in Lösungen b) und c) enthaltenen organischen Säuren auf den saugfähigen Träger aufgebracht wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß in Lösungen b) und c) als organische Säuren eine oder mehrere aus den folgenden Gruppen verwendet werden: höhere aliphatische Monocarbonsäuren, aliphatische Polycarbonsäuren, ggf. substituierte aromatische Carbon- und Sulfonsäuren.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß in Lösung b) eine in Wasser schwer lösliche organische Säure und in Lösung c) Zitronensäure verwendet wird.