DE4325482C1

DE4325482C1 - Medium zur Reaktivierung konservierter Mikroorganismen

Info

Publication number: DE4325482C1
Application number: DE19934325482
Authority: DE
Inventors: Elmar Dr Grabert
Original assignee: Dr Bruno Lange GmbH
Current assignee: Hach Lange GmbH
Priority date: 1993-07-29
Filing date: 1993-07-29
Publication date: 1994-12-15
Anticipated expiration: 2013-07-30

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neuartiges Medium zur Reaktivierung konservierter Mikroorganismen, das Verfahren zu dessen Herstellung sowie dessen Verwendung.

Biologische Mikroorganismen bilden einen empfindlichen zuverlässigen Indikator für das Vorliegen toxischer Substanzen. Daher werden diese insbesondere im Bereich der Abwasserüberwachung und -untersuchung eingesetzt.

Aus den US-Patentschriften 3370175, 3849653 und 3958938 sowie dem deutschen Patent 28 41 896 sind Verfahren bekannt, bei denen lumineszierende Mikroorganismen zum Nachweis der toxischen Substanzen eingesetzt werden. Nach dem deutschen Patent werden die Mikroorganismen lyophilisiert und anschließend für die Durchführung des Bestimmungsverfahrens in einer entsprechenden Lösung reaktiviert. Die Änderung der Lumineszenzausgangsgröße der Suspension nach dem Einbringen des zu untersuchenden Stoffgemisches bildet das Maß für die Toxizität.

Verfahren zur Bestimmung der Hemmwirkung von wäßrigen Proben auf Leuchtbakterien sind auch Gegenstand der DIN-Vorschriften (DIN 38412 L 34 und L 341). Diese DIN-Leuchtbakterientests arbeiten nicht kontinuierlich.

Inzwischen sind aber Verfahren entwickelt worden, die im Gegensatz zu den DIN-Leuchtbakterientests kontinuierlich betrieben werden. Diese Verfahren sind in der Fachwelt allgemein als sogenannte Leuchtbakterienmonitore bekannt. Entsprechende Systeme für die kontinuierliche Überwachung von Wasser und Abwasser sind im Rahmen des 6. Internationalen Symposions "Toxicity Assessment" am 13. und 14. 05. 1993 in Berlin vorgestellt worden.

Bei diesen Verfahren werden im wesentlichen lumineszierende Leuchtbakterien im Labor angezüchtet. Das Testsystem besteht in der Regel aus der gekühlten Vorratshaltung für die Leuchtbakterienkultur und einem Meßgerät, z. B. einem Zweikanal- Fluorometer. Die Leuchtbakterien erfordern in der Regel zunächst die Zugabe einer Salzlösung zu der zu untersuchenden Wasserprobe. Nachdem dies geschehen ist, werden die Leuchtbakterien in das Salzwasser/Probengemisch gegeben. Gleichzeitig wird eine Referenzprobe mit unbelastetem Wasser angelegt. Die Lumineszenzintensität wird über mehrere Minuten (in der Regel 15-30 Minuten) beobachtet. Während der Einwirkzeit auf die Leuchtbakterien ist in Intervallen eine Probennahme möglich. Die Auswertung kann entsprechend DIN 38412 Teil 34 erfolgen. Maß für die Schadstoffwirkung ist regelmäßig die Hemmung der Lumineszenz, bezogen auf die Referenz.

Bei den Biomonitoren ist es möglich, über mikroprozessorgesteuerte Testgeräte die Rohdaten an einen Rechner zu übermitteln. Dort erfolgen Auswertung und Bedienung. Alle Rohdaten werden gespeichert, auf Wunsch wird ein fortlaufendes Meßprotokoll auf dem Drucker erstellt. Alarmmeldungen werden über die zweite serielle Schnittstelle des Computers z. B. weitergegeben.

Ein wesentliches Hindernis für die Verbreitung der geschilderten Leuchtbakterienmonitore ist, daß hierfür die handelsüblichen Leuchtbakterienkonserven nicht einsetzbar sind. Der Leuchtbakterienmonitor wird nämlich über einen Zeitraum von etwa einer Woche betrieben. Über den gesamten Zeitraum muß eine gut leuchtende Bakteriensuspension bevorratet werden. Bisher kann dieser Vorrat nicht durch Konserven bereitgestellt werden, da die Leuchtleistung der Konserven im Mittel nur acht Stunden anhält. Demzufolge müssen für die Leuchtbakterienmonitore stets Frischzuchten angesetzt werden, die über eine Woche ausreichende Lumineszenz- Emissionen zu erbringen vermögen. Die Folge hiervon ist ein erheblicher apparativer und personeller Aufwand. Insbesondere ist eine ständige Betreuung und Überwachung durch gut ausgebildetes Fachpersonal erforderlich.

Die vorliegende Erfindung hat sich nunmehr die Aufgabe gestellt, ein Medium zur Verfügung zu stellen, das eine Reaktivierung konservierter lumineszierender Mikroorganismen ohne signifikanten Eigenschaftsverlust, insbesondere der Leuchtkraft, über mehrere Tage erlaubt.

Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß das Medium durch Anzucht der lumineszierenden Mikroorganismen auf einem geeigneten Nährmedium bis zur Entfaltung der Lumineszenz- Emission und anschließender Abtrennung des umgesetzten das Reaktivierungsmedium bildenden Nährmediums erhältlich ist.

Die nach der Anzucht und Abtrennung der Leuchtbakterien erhaltene Reaktivierungslösung besteht aus dem entsprechend umgesetzten sterilen, gepufferten und nährstoffhaltigen Restmedium.

Die entstandene Reaktivierungslösung zeichnet sich durch überraschende, für nicht möglich gehaltene Eigenschaften aus. So können nunmehr handelsübliche Leuchtbakterienkonserven (gefriergetrocknete, flüssiggetrocknete und eingefrorene Frischanzuchten nach DIN 38412 L 341) reaktiviert und als Vorrat über einen Zeitraum von mehr als einer Woche bei Kühlung (-5-+8°C) gehalten werden. Messungen haben ergeben, daß die Leuchtkraft während einer Woche nur um den Faktor 5-10 abnimmt. Bei den Verfahren nach dem bisherigen Stand der Technik nahm die Leuchtkraft der reaktivierten Bakterien um den Faktor 100 ab.

Das abgetrennte Nährmedium läßt sich gut konservieren und so für den Bedarfsfall im Labor bereithalten. Die bevorzugte Konservierungsmethode ist das Einfrieren. Jedoch können auch beliebige andere Bevorratungsverfahren zum Einsatz kommen.

Als Ausgangslösung eignen sich die in Nealson, K. H., Isolation, Identification, and Manipulation of Luminous Bacteria, Meth. Enzymol. 57, 153-166, geschilderten Nährmedien. Im wesentlichen handelt es sich hierbei um künstliche Seewasser, die teilweise mit natürlichem Seewasser gemischt werden. In der Regel bestehen diese aus einem Gemisch von NaCl, NaH₂PO₄, K₂HPO₄, (NH₄) HPO₄, CaCO₃, KCl, MgSO₄·7 H₂O, CaCl₂·2 H₂O, Tris-Puffer, FeSO₄·7 H₂O, K₂HPO₄·3 H₂O, NH₄Cl, Glycerin, Pepton und/oder Hefeextrakt in destilliertem Wasser.

Das bevorzugte Einsatzgebiet des erfindungsgemäßen Mediums ist der Bereich der Abwasserüberwachung mittels Leuchtbakterien.

Bei Einsatz des erfindungsgemäßen Reaktivierungsmediums entfällt somit der Kosten-, Apparate- und Personalaufwand für Stammhaltung, Bakterienanzucht und Qualitätsprüfung. Insbesondere der zur Eigenüberwachung verpflichtete Betreiber von Abwasserreinigungsanlagen ist somit nicht mehr auf aufwendige mikrobiologische Laborausstattungen und entsprechend qualifiziertes Personal angewiesen.

Untersuchungen zur Eignung der neuen Reaktivierungslösung

SSWC-Medium (vgl. Meth. Enzymol. 57, 153-166) wurde mit Leuchtbakterien Vibrio fisheri beimpft. Nach ca. 20 Stunden wurden die Bakterien durch Zentrifugation entfernt und das umgesetzte Medium sterilfiltriert, portioniert und eingefroren.

Dieses durch die Bakterien umgesetzte Medium wurde dann als Reaktivierungslösung (RLneu) zur Herstellung von Testsuspensionen mit handelsüblichen Leuchtbakterienkonserven (flüssiggetrocknet) und mit gefriergetrockneten Leuchtbakterienkonserven für die Durchführung von Leuchtbakterienhemmtests eingesetzt. Es sollte die Eignung dieser neuartigen Reaktivierung für den Einsatz in kontinuierlich arbeitenden Leuchtbakterienmonitoren geprüft werden. Im Vergleich dazu wurden handelsübliche - dem Stand der Technik entsprechende - Leuchtbakterientestkits nach DIN 38412, L34 und L341 (Konserven plus entsprechende Reaktivierungslösung) getestet.

Es wurden

1. die Leuchtleistung über die Zeit,
2. die Empfindlichkeit der Bakteriensuspension gegen den Schadstoff 3,5-Dichlorphenol (5 mg/l im Testansatz) über die Zeit

bestimmt (vgl. Tab. 1 und 2).

Ergebnis

Im Leuchtbakterienhemmtest nach DIN 38412 L34 und L341 mit flüssiggetrockneten Leuchtbakterien wurden durch 3,5- Dichlorphenol in o. g. Konzentration ähnliche Werte gefunden wie bei mit RLneu reaktivierten Leuchtbakterien. Dies galt auch für gefriergetrocknete Leuchtbakterien. Der Hauptunterschied lag in der zeitlichen Länge des Leuchtens der reaktivierten Bakterien. Während die herkömmlich reaktivierten Bakterien im Mittel nach acht Stunden rund 80% an Leuchtkraft verloren hatten, blieb bei Verwendung der neuen Reaktivierungslösung die Leuchtkraft der Bakterien über Tage erhalten. Die Lagerungstemperaturen der reaktivierten Bakterien waren in den hier dargestellten Versuchen ca. 6°C. Auffallend war der Unterschied zwischen flüssiggetrockneten und gefriergetrockneten Leuchtbakterien. Während bei gefriergetrockneten Leuchtbakterien die Leuchtleistung über die Zeit langsam abnahm, stieg die Leuchtleistung bei den flüssiggetrockneten Leuchtbakterien über die Zeit bis auf das Doppelte an. Dieser Effekt kann durch die unterschiedlichen Inhaltsstoffe der Leuchtbakterienkonserven erklärt werden.

Tabelle 1

Empfindlichkeit von flüssiggetrockneten und gefriergetrockneten Leuchtbakterien nach Reaktivierung gegen 3,5-Dichlorphenol (5 mg/l im Testansatz).

Tabelle 2

Leuchtleistung unterschiedlich reaktivierter und konservierter Leuchtbakterien über die Zeit.

Diese Ergebnisse werden durch folgende Abbildung verdeutlicht, in der die Leuchtleistungen gefriergetrockneter Bakterien nach deren Reaktivierung gemäß dem herkömmlichen und dem erfindungsgemäßen Verfahren gegenübergestellt sind.

Claims

1. Medium zur Reaktivierung konservierter lumineszierender Mikroorganismen, erhältlich durch die Zucht der Mikroorganismen auf einem geeigneten Nährmedium bis zur Entfaltung der Lumineszenz-Emission und anschließende Abtrennung des umgesetzten, das Reaktivierungsmedium bildenden Nährmediums.

2. Medium nach Anspruch 1, erhältlich durch Konservierung des umgesetzten Nährmediums im Anschluß an die Abtrennung von den Mikroorganismen.

3. Medium nach Anspruch 2, erhältlich durch Einfrieren des umgesetzten Nährmediums im Anschluß an die Abtrennung der Mikroorganismen.

4. Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 3, erhältlich durch die Zucht der lumineszierenden Mikroorganismen auf künstlichem Seewassermedium.

5. Medium nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das künstliche Seewasser aus in destilliertem Wasser gelöstem NaCl, KCl, MgSO₄·7 H₂O, CaCl₂·2 H₂O, NaH₂PO₄, (NH₄) HPO₄, MgSO₄, CaCO₃, Tris-Puffer, FeSO₄·7 H₂O, K₂HPO₄·3 H₂O, NH₄Cl, Glycerin, Pepton und/oder Hefeextrakt besteht.

6. Verfahren zur Herstellung eines Mediums gemäß den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismen bis zur Entfaltung der Lumineszenz- Emission auf einem geeigneten Nährmedium angezüchtet und anschließend durch Abtrennen des umgesetzten Nährmediums das Reaktivierungsmedium erhalten wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das umgesetzte Nährmedium nach der Abtrennung der Mikroorganismen konserviert wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das umgesetzte Nährmedium durch Einfrieren konserviert wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die lumineszierenden Mikroorganismen in künstlichem Seewasser gezüchtet werden.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismen auf einem aus NaCl, KCl, MgSO₄·7 H₂O, CaCl₂·2 H₂O, NaH₂PO₄, (NH₄) HPO₄, MgSO₄, CaCO₃, Tris-Puffer, FeSO₄·7 H₂O, K₂HPO₄·3 H₂O, NH₄Cl, Glycerin, Pepton und/oder Hefeextrakt bestehenden Nährmedium gezüchtet werden.

11. Verwendung des Mediums gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Überwachung der Toxizität von wäßrigen Proben.