DE102020118433B3

DE102020118433B3 - Verfahren zum Identifizieren von Enterokokken in Meerwasser und marinen Sedimenten

Info

Publication number: DE102020118433B3
Application number: DE102020118433.6A
Authority: DE
Inventors: Hongxia Ming; Jingfeng Fan; Dongwei Li; Jie Su; Yantao WANG; Tingting Shi; Yuan Jin; Jixue Song; Huiling Huang
Original assignee: National Marine Environmental Monitoring Center
Current assignee: National Marine Environmental Monitoring Center
Priority date: 2020-03-13
Filing date: 2020-07-13
Publication date: 2021-09-16
Anticipated expiration: 2040-07-14
Also published as: CN111349682A

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Überwachung der Meeresumgebung, insbesondere ein Verfahren zum Identifizieren von Enterokokken in Meerwasser und Sedimenten. Ein Verfahren zum Identifizieren von Enterokokken in Meerwasser und Sedimenten, umfassend die folgenden Schritte:(1) jeweiliges Nehmen von flüssigen Meerwasserproben und festen marinen Sedimentproben in der Meeresumgebung;(2) Mischen der festen marinen Sedimentproben mit der physiologischen Kochsalzlösung gemäß einem bestimmten Verhältnis, Durchlassen der Mischung durch die Filtermembran; (3) eine die Bakterien auffangenden Seite der Filtermembran wird nach oben gerichtet, und die andere Seite wird auf das Slanetz&Bartley Kultursubstrat zur Kultivierung gelegt;(4) Übertragen der Filtermembran mittels einer Pinzette auf eine Platte mit vorgewärmtem Enterokokken-Agarkultursubstrat, und für die Platte wird eine Farbentwicklung durchgeführt; (5) Auswählen von Farbkolonien und Verwenden einer Wasserstoffperoxidlösung für ein Katalaseexperiment, und die Kolonien mit negativem Katalaseexperiment sind die Enterokokken. Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung hat eine gute Genauigkeit und niedrige Kosten für das Screening der Enterokokken und kann sich zu verschiedenen Sorten von Umgebungsproben von Meerwasser und marinen Sedimenten eignen.

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Umgebungsüberwachung des Seebades, insbesondere ein Verfahren zum Identifizieren von Enterokokken in Meerwasser und marinen Sedimenten.
STAND DER TECHNIK
Gegenwärtig bestehen hauptsächlich die folgenden internationalen Standardverfahren zum Identifizieren von Enterokokken in der Wasserumgebung:

(1) ISO 7899-1: 1998 Wasserqualität - Detektion und Zählung von Darmenterokokken in Oberflächen- und Abwasser - Teil 1: Miniaturisierte Methode (wahrscheinlichste Anzahl) durch Inokulation in flüssigem Medium
(2) ISO 7899-2: 2000 Wasserqualität - Detektion und Zählung von Darmenterokokken - Teil 2: Membranfiltrationsmethode
(3) EPA 821-R-02-021: 2002 Methode 1106.1: Enterokokken in Wasser durch Membranfiltration unter Verwendung von Membran-Enterococcus-Esculin-Eisenagar (mE-EIA).

Darüber hinaus wurden in China auch einschlägige Industriestandards erlassen: HY/T 127-2010 Richtlinien für die Bewertung sicherer Küstenerholungswasserumgebungen (Guidelines for safe coastal recreational water environments assessment), die ebenfalls zwei ISO-Verfahren betreffen, eines ist das wahrscheinlichste Zählverfahren und das andere ist das Filtrationsmembranverfahren.
Die obigen Verfahren verfügen über die folgenden Probleme:

1. Es gibt keine Verfahren zum Identifizieren von Enterokokken in marinen Sedimenten.
2. Das in ISO (7899-1:1998) und den chinesischen Richtlinien für die Bewertung sicherer Küstenerholungswasserumgebungen (HY/T 127-2010) betroffene wahrscheinlichste Zählverfahren hat einen folgenden Mangel: das Thalliumacetat wird im MUD/SF-Kultursubstrat verwendet, das ist ein hochgiftiges Medikament, wodurch die persönliche Sicherheit des Laborpersonals nicht garantiert werden kann.
3. Das in ISO (7899-2:2000) und den chinesischen Richtlinien für die Bewertung sicherer Küstenerholungswasserumgebungen (HYT 127-2010) betroffene Filtrationsmembranverfahren hat einen folgenden Mangel: bestimmte Arten von Streptokokken können detektiert werden.
4. Das EPA(821-R-02-021:2002)-Filtrationsmembranverfahren hat einen folgenden Mangel: die Arzneimittel sind teuer und können nur importiert werden, darüber hinaus wird in dem Kultursubstrat ein hochtoxisches Arzneimittel - Natriumazid - verwendet, wodurch die persönliche Sicherheit des Laborpersonals nicht garantiert werden kann.

INHALT DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
Hinsichtlich der oben geschilderten Probleme zielt die vorliegende Erfindung darauf ab, ein Verfahren zum Identifizieren von Enterokokken in Meerwasser und Sedimenten eines Seebades zur Verfügung.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Identifizieren von Enterokokken in Meerwasser und marinen Sedimenten zur Verfügung, umfassend die folgenden Schritte:

(1) Jeweiliges Nehmen einer Meerwasserprobe und einer marinen Sedimentprobe von dem Seebad;
(2) die Filtermembran a lässt die Meerwasserprobe durch; die Filtermembran b lässt eine Mischung von der marinen Sedimentprobe und der physiologischen Kochsalzlösung durch;
(3) die Filtermembran a und die Filtermembran b werden jeweils mit einer nach oben gerichteten die Bakterien auffangenden Seite auf das Slanetz&Bartley Kultursubstrat zur Kultivierung gelegt;
(4) Übertragen der Filtermembran a und der Filtermembran b mittels einer Pinzetteauf eine Platte mit vorgewärmtem Enterokokken-Agarkultursubstrat, um eine Kultivierung durchzuführen, bis schwarze oder braune Kolonien auf der Filtermembran vorhanden sind;
(5) Auswählen von schwarzen oder braunen Kolonien und Verwenden einer Wasserstoffperoxidlösung für ein Katalaseexperiment, und die Kolonien ohne gaserzeugende Reaktion im Katalaseexperiment sind die Enterokokken.

Bevorzugt ist in der obigen technischen Lösung das Verfahren zum Mischen der marinen Sedimentprobe und der physiologischen Kochsalzlösung im Schritt (2) wie folgt: Mischen der marinen Sedimentprobe und der physiologischen Kochsalzlösung in einer sterilen Umgebung mit einem Verhältnis von 1:2-1:9 (m/V) und Verdünnen der Mischung mit physiologischer Kochsalzlösung nacheinander mit einem 10-mal-Gradienten. Der Verdünnungsgrad hängt vom Bakteriengehalt der Probe ab, wobei die Anzahl der Kolonien pro Platte bevorzugt zwischen 1 und 30 liegt, und wobei jeder Verdünnungsgrad 3 parallele Proben erfordert. Bevorzugt werden die marine Sedimentprobe und die physiologische Kochsalzlösung in einer sterilen Umgebung mit einem Verhältnis von 1: 9 (m/V) gleichmäßig gemischt.
Bevorzugt handelt es sich bei der im Schritt (2) verwendeten Filtermembran a und Filtermembran b in der obigen technischen Lösung jeweils um eine Nitrocellulosefiltermembran mit einer Porengröße von 0,45 µm.
Bevorzugt handelt es sich bei der Formel von Slanetz&Bartley-Kultursubstrat im Schritt (3) in der obigen technischen Lösung darum, dass es die folgenden Bestandteile pro Liter enthält: Trypton 20,0 g, Hefeextraktpulver 5,0 g, Glucose 2,0 g, Natriumazid 0,4 g, Dikaliumhydrogenphosphat 4,0 g, TTC-Triphenyltetrazoliumchlorid 0,1 g, Agar 8 g-18 g, pH 7,2±0,1, 25°C.
Bevorzugt enthalten die Kultivierungsbedingungen im Schritt (3) in der obigen technischen Lösung eine Temperatur von 36°C±2°C und eine Kultivierungszeit von 44±4 h.
Bevorzugt beträgt die Vorwärmungstemperatur im Schritt (4) in der obigen technischen Lösung 44°C±0,5°C; wobei die Kultivierungstemperatur 44°C±0,5°C und die Zeit 2 h beträgt.
Bevorzugt handelt es sich bei der Formel von Enterokokken-Agarkultursubstrat im Schritt (4) in der obigen technischen Lösung darum, dass es die folgenden Bestandteile pro Liter enthält: Trypton 17,0 g, Rindfleischextraktpulver 3,0 g, Hefeextraktpulver 5,0 g, Kuhgallenpulver 10,0 g, Natriumchlorid 5,0 g, Aescin 1,0 g, Ammoniumeisencitrat 0,5 g, Natriumazid 0,15 g, Agar 8 g-18 g, pH 7,2±0,1, 25°C.
Bevorzugt beträgt die Konzentration der Wasserstoffperoxidlösung im Schritt (5) in der obigen technischen Lösung 1,5 Gew.-% bis 15 Gew.-%. Bevorzugt beträgt die Konzentration der Wasserstoffperoxidlösung 3 Gew.-%.
Vorteile der vorliegenden Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Identifizieren von Enterokokken in Meerwasser und Sedimenten von dem Seebad zur Verfügung. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung weist eine hohe Genauigkeit beim Filtern der Enterokokken (im Vergleich zum Stand der Technik wird die Genauigkeitsrate der Identifizierung der Enterokokken bei der vorliegenden Erfindung um 39% erhöht), niedrige Kosten (im Vergleich zur Technologie im EPA-Standard werden die Kosten um das Zehnfache reduziert) und eine gute Sicherheit auf, und das Verfahren kann auf verschiedene Arten von Meerwasser- und Sedimentumgebungsproben von dem Seebad angewendet werden.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Mit den folgenden nicht beschränkenden Ausführungsbeispielen kann der Durchschnittsfachmann auf diesem Gebiet die vorliegende Erfindung umfassender verstehen, allerdings wird die vorliegende Erfindung auf keine Weise beschränkt.
Ausführungsbeispiel 1
Ein Verfahren zum Identifizieren von Enterokokken in Meerwasser und marinen Sedimenten, umfassend die folgenden Schritte: die in der Meeresumgebung genommenen Proben werden in flüssige Meerwasserproben und feste marine Sedimentproben unterteilt.
Für die flüssigen Meerwasserproben werden direkt 100 ml flüssige Meerwasserproben gemessen und mit einer Nitrocellulosefiltermembran mit einer Porengröße von 0,45 µm gefiltert, wobei eine die Bakterien auffangende Seite der Filtermembran (nämlich eine beim Filtern mit den Probe versetzte Seite) nach oben gerichtet ist und eng an dem Slanetz&Bartley-Kultursubstrat anliegt, (die Formel von Slanetz&Bartley-Kultursubstrat g/L lautet: Trypton 20,0 g, Hefeextraktpulver 5,0 g, Glucose 2,0 g, Natriumazid 0,4 g, Dikaliumhydrogenphosphat 4,0 g, TTC-Triphenyltetrazoliumchlorid 0,1 g, Agar 8 g-18 g, pH 7,2±0,1 (25°C)), nach dem Kultivieren bei 36°C±2°C für 44±4 h werden die Filtermembranen mittels einer sterilisierten Pinzette auf eine Platte des vorerwärmten Enterokokken-Agarkultursubtrats bei 44°C±0,5°C übertragen, (die Formel von Enterokokken-Agarkultursubstrat g/L lautet: Trypton 17,0 g, Rindfleischextraktpulver 3,0 g, Hefeextraktpulver 5,0 g, Kuhgallenpulver 10,0 g, Natriumchlorid 5,0 g, Aescin 1,0 g, Ammoniumeisencitrat 0,5 g, Natriumazid 0,15 g, Agar 8 g-18 g, pH 7,2±0,1, (25°C)), die Platte wird für 2 h bei 44°C±0,5°C kultiviert, und schwarze oder braune typische Kolonien erscheinen auf den Filtermembranen, dabei ist die typische Kolonieform kreisförmig und weist eine konvexe und glänzende Oberfläche, bündige Kanten und einen Durchmesser in einem Bereich von 0,5-1 mm auf. Auswählen von schwarzen oder braunen Kolonien, Verwenden einer Wasserstoffperoxidlösung von 3 Gew.-% für ein Katalaseexperiment, d.h. Auswählen und Tropfen der Kolonien auf einen sterilisierten Objektträger unter Verwendung eines sterilen Inokulationsrings, Zugeben 20 µl Wasserstoffperoxidlösung von 3 Gew.-% zu der Kolonienprobe, Beobachten der gaserzeugenden Reaktion der Probe und Aufzeichnen die Kolonien, die in dem Katalaseexperiment negativ sind (keine Blasenbildung), und diese sind die Enterokokken.
Bei festen marinen Sedimentproben werden mit einem sterilen Betriebsverfahren 5 g feste marine Sedimentproben gewogen und dann mit 45mL physiologischer Kochsalzlösung versetzt, danach erfolgen eine gleichmäßige Mischung und eine Verdünnung mit physiologischer Kochsalzlösung nacheinander mit einem 10-mal-Gradienten, (der Verdünnungsgrad hängt vom Bakteriengehalt der Probe ab, wobei die Anzahl der Kolonien pro Platte bevorzugt zwischen 1-30 liegt, und wobei für jeden Verdünnungsgrad 3 parallele Proben angeordnet sein sollen), 10 mL verdünnte Proben werden genommen und durch die Nitrocellulosefiltermembran mit einer Porengröße von 0,45 µm gefiltert, dabei ist eine die Bakterien auffangende Seite der Filtermembran (nämlich eine beim Filtern mit den Probe versetzte Seite) nach oben gerichtet und liegt eng an dem Slanetz&Bartley-Kultursubstrat an, nach dem Kultivieren bei 36°C±2°C für 44±4 h werden die Filtermembranen mittels einer sterilisierten Pinzette auf eine Platte des vorerwärmten Enterokokken-Agarkultursubtrats bei 44°C±0,5°C übertragen, die Platte wird bei 44°C±0,5°C für 2h kultiviert, dabei erscheinen schwarze oder braune Kolonien auf der Filtermembran. Auswählen von schwarzen oder braunen Kolonien, Verwenden einer Wasserstoffperoxidlösung von 3 Gew.-% für ein Katalaseexperiment, d.h. Auswählen und Tropfen der Kolonien auf einen sterilisierten Objektträger unter Verwendung eines sterilen Inokulationsrings, Zugeben 20 µl Wasserstoffperoxidlösung von 3 Gew.-% zu der Kolonienprobe, Beobachten der gaserzeugenden Reaktion der Probe und Aufzeichnen die Kolonien, die in dem Katalaseexperiment negativ sind (keine Blasenbildung), und diese sind die Enterokokken.
Ausführungsbeispiel 2

18 schwarze oder braune Kolonien im Ausführungsbeispiel 1 werden zufällig für ein Katalaseexperiment ausgewählt. Für die PCR-Produkte oder Bakterienflüssigkeiten der Kolonien wird weiterhin eine Sequenzierung erster Generation durchgeführt (Shanghai Sangon wird mit den Sequenzierungsarbeiten beauftragt), dabei sind die Ergebnisse wie in Figur 1 dargestellt. Von den 18 Kolonien sind 11 Stämme negativ bei den Ergebnissen im Katalaseexperiment, diese werden durch die Sequenzierung als Enterokokken identifiziert; und 7 Kolonien sind positiv bei den Ergebnissen im Katalaseexperiment, diese werden durch die Sequenzierung als Staphylococcus aureus identifiziert; dabei beträgt die Genauigkeit 100%. Im Vergleich zum Stand der Technik ist die Genauigkeit um 39% verbessert. Tabelle 1

Probe	Katalaseexperiment (positiv+/negativ-)	Sequenzierungsergebnis
1	-	Enterokokken
2	-	Enterokokken
3	-	Enterokokken
4	-	Enterokokken
5	-	Enterokokken
6	-	Enterokokken
7	-	Enterokokken
8	-	Enterokokken
9	-	Enterokokken
10	-	Enterokokken
11	-	Enterokokken
12	+	Staphylococcus aureus
13	+	Staphylococcus aureus
14	+	Staphylococcus aureus
15	+	Staphylococcus aureus
16	+	Staphylococcus aureus
17	+	Staphylococcus aureus
18	+	Staphylococcus aureus

Claims

Verfahren zum Identifizieren von Enterokokken in Meerwasser und marinen Sedimenten, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst: (1) Jeweiliges Nehmen einer Meerwasserprobe und einer marinen Sedimentprobe von dem Seebad; (2) die Filtermembran a lässt die Meerwasserprobe durch; die Filtermembran b lässt eine Mischung von der marinen Sedimentprobe und der physiologischen Kochsalzlösung durch; (3) die Filtermembran a und die Filtermembran b werden jeweils mit einer nach oben gerichteten die Bakterien auffangenden Seite auf das Slanetz&Bartley Kultursubstrat zur Kultivierung gelegt; (4) Übertragen der Filtermembran a und der Filtermembran b auf eine Platte mit vorgewärmtem Enterokokken-Agarkultursubstrat, um eine Kultivierung durchzuführen, bis schwarze oder braune Kolonien auf der Filtermembran vorhanden sind; (5) Auswählen von schwarzen oder braunen Kolonien und Verwenden einer Wasserstoffperoxidlösung für ein Katalaseexperiment, und die Kolonien ohne gaserzeugende Reaktion im Katalaseexperiment sind die Enterokokken.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren zum Mischen der marinen Sedimentprobe und der physiologischen Kochsalzlösung im Schritt (2) wie folgt ist: Mischen der marinen Sedimentprobe und der physiologischen Kochsalzlösung in einer sterilen Umgebung mit einem Verhältnis von 1:2-1:9 (m/V) und Verdünnen der Mischung mit physiologischer Kochsalzlösung nacheinander mit einem 10-mal-Gradienten.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der im Schritt (2) verwendeten Filtermembran a und Filtermembran b jeweils um eine Nitrocellulosefiltermembran mit einer Porengröße von 0,45 µm handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierungsbedingungen im Schritt (3) eine Temperatur von 36°C±2°C und eine Kultivierungszeit von 44±4 h enthalten.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorwärmungstemperatur im Schritt (4) 44°C±0,5°C beträgt; wobei die Kultivierungstemperatur 44°C±0,5°C und die Zeit 2h beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der Wasserstoffperoxidlösung im Schritt (5) 1,5 Gew.-% bis 15wt Gew.-% beträgt.