DE3714612C2 - - Google Patents

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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen lumineszenten Mikroorganismus-Stamm und seine Verwendung bei analytischen Untersuchungen von Abwässern.
Bei den modernen Verfahren zur biologischen Behandlung, gegebenenfalls auch hochbelasteter, industrieller Abwasserströme, werden neben organischen Lösungsmitteln auch eine Vielzahl aromatischer, chlorierter und nitrierter Verbindungen mit bakterientoxischer Wirkung aus dem Abwasser eliminiert. Das ist möglich, weil aufgrund der hohen Stoffwechselleistung der zur Anwendung kommenden Bakterienpopulationen die Abbaugeschwindigkeit für diese Substanzen höher ist als die normalerweise eingeleitete Fracht. Das bedeutet, daß im Normalfall in den biologischen Reaktoren bakterientoxische Grenzkonzentrationen nicht erreicht werden, eine Schädigung der Biomasse somit nicht erfolgt. Schlagartig einsetzende Konzentrationsänderungen im Zulauf können jedoch in ungünstigen Situationen dazu führen, daß die Grenzkonzentrationen erreicht bzw. überschritten werden, so daß aufgrund von Vergiftungsreaktionen die Eliminationsleistung der Kläranlage zusammenbricht. Die Überwachung von Kläranlagenzuläufen auf außergewöhnliche bakterientoxische Effekte kann deshalb wesentlich zur Betriebssicherheit biologischer Kläranlagen beitragen. Voraussetzung für diese Anwendung sind allerdings möglichst schnell ansprechende, gegebenenfalls automatisierbare Testverfahren mit einer hohen Zuverlässigkeit. Nur durch solche Verfahren ist es möglich, anormale bakterientoxische Effekte rechtzeitig zu erkennen und geeignete Gegenmaßnahmen zu ergreifen, bevor das betreffende Abwasser in den biologischen Teil der Kläranlagen eingeleitet wird.
Neben den üblichen analytischen Methoden bieten sich auch Testverfahren an, bei welchen Mikroorganismen eingesetzt werden. Es ist bekannt, daß sogenannte "Leuchtbakterien" in der Lage sind, einen Teil der durch Stoffwechselvorgänge freigesetzten Energie in Form von Licht zu emittieren. Durch physiologisch ungünstige Außeneinflüsse, wie durch bakterientoxische Materialien, kann die Lichtemission gehemmt werden.
Das Ausmaß der Hemmung dieser Lichtemission kann zur analytischen Bestimmung solcher bakterientoxischen Materialien eingesetzt werden. Es hat sich jedoch erwiesen, daß bisher keine Leuchtbakterien verfügbar waren, die bei der Bestimmung von bakterientoxischen Materialien in Klärabwässern, insbesondere in industriellen Klärabwässern, vor allem auch der chemischen Industrie, zuverlässige Aussagen über einen evtl. schädigenden Einfluß auf die Eliminationsleistung von biologischen Klärsystemen, zulassen. Messungen unter der Verwendung der bekannten Leuchtbakterien führten zu Ergebnissen, die mit dem wirklich schädigenden Einfluß von bakterientoxischen Materialien auf die Mikroorganismen der Kläranlage nur unzureichend übereinstimmten. In Fresenius Zeitschrift für Analytische Chemie (1986) 325, S. 136-139, wurde über einen gentechnologisch modifizierten Mikroorganismus berichtet, welcher für die Analytik von Abwässern geeignet sein soll. Diese Veröffentlichung enthält jedoch keinerlei Angaben über die Art des in den beschriebenen Versuchen eingesetzten Mikroorganismus, so daß es dem Fachmann anhand des Offenbarungsgehaltes dieser Veröffentlichung nicht möglich ist, den dort verwendeten oder einen anderen entsprechenden Mikroorganismus-Stamm zu erzeugen und die beschriebenen Versuche nachzuvollziehen. Die Veröffentlichung enthält auch keinen Hinweis darauf, wie der Fachmann aus der Vielzahl der Mikroorganismen von Kläranlagen einen geeigneten Stamm auswählen und entwickeln könnte.
Es wurde nun der neue Klebsiella planticola-Stamm pDB 101 K 70 B gefunden, der in besonders günstiger Weise bei analytischen Untersuchungen, insbesondere von Abwässern, eingesetzt werden kann.
Dieser neue Stamm wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSB), Grisebachstraße 8, D-3400 Göttingen, Bundesrepublik Deutschland, in Übereinstimmung mit den Bestimmungen des Budapester Vertrages über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren am 6. April 1987 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer DSM 4081.
Der Stamm Klebsiella planticola pDB 101 K 70 B wurde durch die gentechnologische Modifizierung (Einbau des Leuchtsystems aus Vibrio fischeri) eines aus einer Kläranlage isolierten Klebsiella planticola Stammes erhalten.
Der neue Stamm weist beispielsweise die folgenden Eigenschaften auf:
Beweglichkeit:
nein
Gelatineverflüssigung: nein
H₂S-Entwicklung: nein
Indolbildung: nein
Wachstum bei 10°C: ja
Ureasebildung: ja
Voges-Proskauer-Reaktion: positiv
Reduktion von Nitrat @ zu Nitrit: ja
zu N₂: nein
Citratverwertung: ja
Methylrotprobe: positiv
Lumineszenz: ja
Der neue Mikroorganismus-Stamm kann z. B. in einer Schrägröhrchen-Kultur oder aber auch in gefriergetrockneter Form aufbewahrt werden. Es kann in allen Nährmedien, welche für Gram-negative Bakterien üblicherweise verwendet werden, vermehrt werden.
Es wurde gefunden, daß der neue lumineszente Klebsiella planticola Stamm pDB 101 K 70 B Eigenschaften aufweist, aufgrund derer er vorteilhaft bei analytischen Untersuchungen (im "Leuchtbakterien-Test") eingesetzt werden kann. Der neue Mikroorganismus-Stamm ist leicht handhabbar, kann nach den üblichen Methoden leicht aufbewahrt werden (z. B. nach Gefriertrocknung) und in üblichen Nährmedien verwendet werden. Der neue Stamm weist bei kurzer Ansprechzeit einen besonders günstigen Bereich auf, in dem eine Hemmung der Lichtemission durch die Einwirkung von (bakterientoxischen) Fremdsubstanzen erfolgt. Da bei dem neuen Stamm die Hemmung der Lichtemission durch (bakterientoxische) Fremdsubstanzen in hohem Maße mit der Einwirkung dieser Substanzen auf die Mikroorganismen von Kläranlagen, insbesondere von industriellen Abwässern und ganz besonders auch von gegebenenfalls auch hochbelasteten Abwässern der chemischen Industrie korreliert, kann der neue Mikroorganismus-Stamm Klebsiella planticola pDB 101 K 70 B in besonders günstiger Weise für die Untersuchung solcher Abwässer auf (bakterientoxische) Fremdsubstanzen, welche die Mikroorganismen der Kläranlage negativ beeinflussen könnten, verwendet werden. Durch den Leuchtbakterientest mit Hilfe des neuen Stammes können somit Substanzen, die einen schädigenden Einfluß auf die Mikroorganismen von Klärsystemen haben können frühzeitig erkannt werden, so daß gegebenenfalls erforderliche Gegenmaßnahmen getroffen werden können, bevor das jeweilige Abwasser in den biologischen Teil der Klärsysteme eingeleitet wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch die neue Verwendung des Klebsiella planticola Stammes pDB 101 K 70 B = DSM 4081 bei analytischen (qualitativen und quantitativen) Untersuchungen oder Überwachungen von Abwässern, vorzugsweise von industriellen Abwässern und ganz besonders bevorzugt von Abwässern der chemischen Industrie, wobei sich die analytischen Untersuchungen und Überwachungen auf Substanzen oder Substanzgemische beziehen, welche Mikroorganismen von Klärsystemen schädigen können.
Es war überraschend und aufgrund des Standes der Technik nicht vorhersehbar, daß der neue erfindungsgemäße Stamm in besonders günstiger Weise für die oben aufgeführten analytischen Zwecke verwendbar ist. Die bisher bekannten Leuchtbakterien ließen nur beschränkte Anwendungen zu. Insbesondere bei Abwässern, vor allem industriellen Abwässern der chemischen Industrie, korrelierten die Befunde nur unzureichend mit den wirklich vorliegenden Verhältnissen. Der neue Stamm Klebsiella planticola pDB 101 K 70 B stellt somit eine wertvolle Bereicherung der Technik dar.
Die Anwendung des neuen Mikroorganismus-Stammes erfolgt ebenso wie seine Handhabung (Aufbewahrung und Vermehrung), nach den allgemein üblichen Methoden der Analytik bzw. der Mikrobiologie.
Wie bereits erwähnt, beruht die Anwendung des neuen Stammes darauf, daß durch die Einwirkung von bakterientoxischen Stoffen die Intensität der normalen Lichtemission des lumineszenten Mikroorganismus vermindert wird und sich aus dieser Lichtemissions-Verringerung die Konzentration des bakterientoxischen Stoffes ermitteln läßt.
Zweckmäßigerweise erfolgt die Durchführung des Tests, indem eine standardisierte auf 0 bis 4°C abgekühlte Suspension des Stammes in einem Mischgefäß mit der zu untersuchenden Probe versetzt wird und anschließend auf 15 bis 20°C temperiert wird. Mit Hilfe eines geeigneten Lumineszenzphotometers wird die Zunahme der Lichtemission während des Testzeitraumes (5 bis 30 Min.) gemessen. Das kann geschehen, indem zu Beginn und am Ende des Tests jeweils eine Messung durchgeführt wird oder dadurch, daß die Lichtemission während des Tests kontinuierlich gemessen wird. Um festzustellen, ob eine Testprobe (z. B. Abwasserprobe) für die jeweiligen Kläranlagen-Mikroorganismen schädlichen Konzentrationen aufweist, kann es ausreichend sein, die für die Grenzkonzentration zugehörige Lumineszenz zu messen. Eine Unterschreitung der Grenzlumineszenz bedeutet dann eine zu hohe Schadstoffkonzentration und die Einleitung entsprechender Maßnahmen. Die Messungen können auch kontinuierlich oder semi-kontinuierlich durchgeführt werden.
Die Handhabung und Anwendung des neuen Mikroorganismus-Stammes soll anhand der folgenden Beispiele erläutert werden:
1. Medium für die Anzucht des Stammes
10 g Bacto-Trypton (Bacto ist ein Warenzeichen), 5 g Hefeextrakt und 20 g Natriumchlorid werden in 1000 ml Leitungswasser gelöst und auf pH 7 eingestellt (Natronlauge oder Leitungswasser). Jeweils 100 ml dieser Lösung werden in Erlenmeyerkolben abgefüllt und 20 Minuten bei 120°C im Autoklaven sterilisiert.
2. Anzucht des Stammes
Mit der Impföse beimpft man von einer Stammkultur die gemäß 1. erhaltene Nährlösung und inkubiert bei 25°C für 24 Stunden auf einer Schüttelmaschine.
3. Durchführung der analytischen Messung
Die gemäß 2. erhaltene Kultur wird durch Verdünnen mit der Nährlösung gemäß 1. auf eine (im Hinblick auf die Empfindlichkeit des eingesetzten Biolumineszenzphotometers festzulegende) Ausgangsleuchtintensität eingestellt.
Die Bakteriensuspension wird auf 0 bis 4°C abgekühlt.
  • a) Kontrollansatz:
    0,1 ml der Suspension werden in einer Küvette mit 0,1 ml Wasser gemischt und unmittelbar anschließend die Leuchtintensität (Wert: A) gemessen. Dann wird die Küvette mit Inhalt auf 20°C erwärmt und die Leuchtintensität (Wert: B) gemessen.
  • b) Testansatz:
    0,1 ml der Bakteriensuspension werden in einer Küvette mit 0,1 ml der Probelösung (z. B. Abwasser) gemischt und unmittelbar anschließend die Leuchtintensität (Wert: C) gemessen. Dann wird die Küvette mit Inhalt auf 20°C erwärmt und nach 15 Minuten die Leuchtintensität (Wert: D) bestimmt.
  • c) Berechnung der Hemmung:
    Die Hemmung der Lichtemission in % wird wie folgt berechnet:
Aus der gefundenen prozentualen Hemmung läßt sich in Abhängigkeit von den eingesetzten Testkonzentrationen in üblicher Weise über Regressionsrechnung auch der sogen. EC₅₀-Wert, d. h. die Konzentration (mg/l), bei der eine 50%ige Hemmung der Lichtemissionszunahme vorliegt, ermitteln.
Gegebenenfalls kann es wünschenswert sein, weitere Meßwerte bei verschiedenen Temperaturen zu ermitteln oder kontinuierlich während der Erwärmung der Küvette von 0 bis 4 auf 20°C zu messen.
Für die Messungen kommen alle üblichen Lumineszenzphotometer (z. B. Biolumineszenzmeßgerät Biocounter M 2010 oder Lumacounter M 2080) in Frage.
4. Messung der Giftwirkung von 3,5-Dichlorphenol auf Klebsiella planticola pDB 101 K 70 B
Durchführung gemäß 1. bis 3.
  • a) Kontrollansatz:
    Lichtemission Beginn (Wert: A): 16 947
    Lichtemission Ende (Wert: B): 118 757
  • b) Testansatz mit 25 mg/l 3,5-Dichlorphenol:
    Lichtemission Beginn (Wert: C): 10 296
    Lichtemission Ende (Wert: D): 70 822
  • c) Nach der obigen Formel errechnet sich eine Hemmung von 41%
    Aus Messungen mit verschiedenen Konzentrationen an 3,5-Dichlorphenol ergeben sich folgende Hemmungen:
    Testkonzentration 3,5-Dichlorphenol in mg/l
    Hemmung in %
    12,5
    11
    25 41
    35 55
    50 91
    Der hieraus berechnete EC₅₀-Wert beträgt: 27 mg/l
Nach der angegebenen Methode können praktisch alle für Kläranlagen-Mikroorganismen relevanten Stoffe, die bakterientoxisch sein können, erfaßt werden wie die gegebenenfalls halogenierten Phenole, z. B. die Kresole, 2-Chlorphenol, 4-Chlorphenol, 3,5-Dichlorphenol und Natrium-pentachlorphenolat. Für 3,5-Dichlorphenol wurde beispielsweise ein sehr gut reproduzierbarer EC₅₀ von 25 bis 30 mg/l ermittelt.

Claims (2)

1. Mikroorganismus-Stamm Klebsiella planticola pDB 101 K 70 B = DSM 4081.
2. Verwendung des Stammes nach Anspruch 1 bei analytischen Untersuchungen und Überwachungen von Abwässern, vorzugsweise industriellen Abwässern, insbesondere der chemischen Industrie, wobei sich die analytischen Untersuchungen und Überwachungen auf Substanzen oder Substanzgemische beziehen, welche Mikroorganismen von Klärsystemen schädigen können.
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