DE3714612A1 - Mikroorganismus-stamm und seine verwendung - Google Patents

Mikroorganismus-stamm und seine verwendung

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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen lumines­ zenten Mikroorganismus-Stamm und seine Verwendung bei analytischen Untersuchungen, insbesondere von Abwäs­ sern.
Bei den modernen Verfahren zur biologischen Behandlung, gegebenenfalls auch hochbelasteter, industrieller Ab­ wasserströme, werden neben organischen Lösungsmitteln auch eine Vielzahl aromatischer, chlorierter und nitrierter Verbindungen mit bakterientoxischer Wirkung aus dem Abwasser aliminiert. Das ist möglich, weil auf­ grund der hohen Stoffwechselleistung der zur Anwendung kommenden Bakterienpopulation die Abbaugeschwindigkeit für diese Substanzen höher ist als die normalerweise eingeleitete Fracht. Das bedeutet, daß im Normalfall in den biologischen Reaktoren bakterintoxische Grenzkon­ zentrationen nicht erreicht werden, eine Schädigung der Biomasse somit nicht erfolgt. Schlagartig einsetzende Konzentrationsänderungen im Zulauf können jedoch in ungünstigen Situationen dazu führen, daß die Grenzkon­ zentrationen erreicht bzw. überschritten werden, so daß aufgrund von Vergiftungsreaktionen die Eliminations­ leistung der Kläranlage zusammenbricht. Die Überwachung von Kläranlagenzuläufern auf außergewöhnliche bakterien­ toxische Effekte kann deshalb wesentlich zur Betriebs­ sicherheit biologischer Kläranlagen beitragen. Voraus­ setzung für diese Anwendung sind allerdings möglichst schnell ansprechende, gegebenenfalls automatisierbare Testverfahren mit einer hohen Zuverlässigkeit. Nur durch solche Verfahren ist es möglich, anormale bakterien­ toxische Effekte rechtzeitig zu erkennen und geeignete Gegenmaßnahmen zu ergreifen, bevor das betreffende Abwasser in den biologischen Teil der Kläranlagen ein­ geleitet wird.
Neben den üblichen analytischen Methoden bieten sich auch Testverfahren an, bei welchen Mikroorganismen ein­ gesetzt werden. Es ist bekannt, daß sogenannte "Leucht­ bakterien" in der Lage sind, einen Teil der durch Stoffwechselvorgänge freigesetzten Energie in Form von Licht zu emittieren. Durch physiologisch ungüngstige Außeneinflüsse, wie durch bakterientoxische Materialien, kann die Lichtemission gehemmt werden.
Das Ausmaß der Hemmung dieser Lichtemission kann zur analytischen Bestimmung solcher bakterientoxischen Materialien eingesetzt werden. Es hat sich jedoch erwiesen, daß bisher keine Leuchtbakterien verfügbar waren, die bei der Bestimmung von bakterientoxischen Materialien in Klärabwässern, insbesondere in indu­ striellen Klärabwässern, vor allem auch der chemischen Industrie, zuverlässige Aussagen über einen evtl. schädigenden Einfluß auf die Eliminationsleistung von biologischen Klärsystemen, zulassen. Messungen unter der Verwendung der bekannten Leuchtbakterien führten zu Ergebnissen, die mit dem wirklich schädigenden Einfluß von bakterientoxischen Materialien auf die Mikroorganis­ men der Kläranlage nur unzureichend übereinstimmten. In Fresenius Zeitschrift für Analytische Chemie (1986) 325. S. 136-139, wurde über einen gentechnologisch modifi­ zierten Mikroorganismus berichtet, welcher für die Analytik von Abwässern geeignet sein soll. Diese Veröf­ fentlichung enthält jedoch keinerlei Angaben über die Art des in den beschriebenen Versuchen eingesetzten Mikroorganismus, so daß es dem Fachmann anhand des Offenbarungsgehaltes dieser Veröffentlichung nicht möglich ist, den dort verwendeten oder einen anderen entsprechenden Mikroorganismus-Stamm zu erzeugen und die beschriebenen Versuche nachzuvollziehen. Die Veröffent­ lichung enthält auch keinen Hinweis darauf, wie der Fachmann aus der Vielzahl der Mikroorganismen von Klär­ anlagen einen geeigneten Stamm auswählen und entwickeln könnte.
Es wurde nun der neue Klebsiella planticola-Stamm pDB 101 K 70 B gefunden, der in besonders günstiger Weise bei analytischen Untersuchungen, insbesondere von Abwässern, eingesetzt werden kann.
Dieser neue Stamm wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Grisebachstraße 8, D-3400 Göttingen, Bundesrepublik Deutschland, in Übereinstimmung mit den Bestimmungen des Budapester Ver­ trages über die internationale Anerkennung der Hinter­ legung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentver­ fahren am 6. April 1987 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer DSM 4081.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auch auf die Mutanten und Varianten dieses Stammes, welche die für die Ausführung der Erfindung wesentlichen Merkmale und Eigenschaften aufweisen.
Der Stamm Klebsiella planticola pDB 101 K 70 B wurde durch die gentechnologische Modifizierung (Einbau des Leuchtsystems aus Vibrion fischeri) eines aus einer Kläranalge isolierten Klebsiella planticola Stammes erhalten.
Der neue Stamm weist beispielsweise die folgenden Eigen­ schaften auf:
Beweglichkeit:nein Gelatineverflüssigung:nein H₂S-Entwicklung:nein Indolbindung:nein Wachstum bei 10°C:ja Ureasebildung:ja Voges-Proskauer-Reaktion:positiv Reduktion von Nitrat
  zu Nitrit:ja   zu N₂:nein Citratverwertung:ja Methylrotprobe:positiv Lumineszenz:ja
Der neue Mikroorganismus-Stamm kann z. B.: in einer Schrägröhrchen-Kultur oder aber auch in gerfriergetrock­ neter Form aufbewahrt werden. Er kann in allen Nähr­ medien, welche für Gram-negative Bakterien üblicherweise verwendet werden, vermehrt werden.
Es wurde gefunden, daß der neue lumineszente Klebsiella planticola Stamm pDB 101 K 70 B Eigenschaften aufweist, aufgrund derer er vorteilhaft bei analytischen Unter­ suchungen (im "Leuchtbakterien-Test")eingesetzt werden kann. Der neue Mikroorganismus-Stamm ist leicht hand­ habbar, kann nach den üblichen Methoden leicht auf­ bewahrt werden (z. B. nach Gefriertrockung) und in üblichen Nährmedien verwendet werden. Der neue Stamm weist bei kurzer Ansprechzeit einen besonders günstigen Bereich auf, in dem eine Hemmung der Lichtemission durch die Einwirkung von (bakterientoxischen) Fremdsubstanzen erfolgt. Da bei dem neuen Stamm die Hemmung der Licht­ emission durch (bakterientoxische) Fremdsubstanzen in hohem Maße mit der Einwirkung dieser Substanzen auf die Mikroorganismen von Kläranlagen, insbesondere von industriellen Abwässern und ganz besonders auch von gegebenenfalls auch hochbelasteten Abwässern der chemi­ schen Industrie korreliert, kann der neue Mikroorganis­ mus-Stamm Klebsiella planticola pDB 101 K 70 B in besonders günstiger Weise für die Untersuchung solcher Abwässer auf (bakterientoxische) Fremdsubstanzen, welche die Mikroorganismen der Kläranlage negativ beeinflussen könnten, verwendet werden. Durch den Leuchtbakterientest mit Hilfe des neuen Stammes können somit Substanzen, die einen schädigenden Einfluß auf die Mikroorganismen von Klärsystemen haben können frühzeitig erkannt werden, so daß gegebenenfalls erforderliche Gegenmaßnahmen getrof­ fen werden können, bevor das jeweilige Abwasser in den biologischen Teil der Klärsysteme eingeleitet wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch die neue Verwendung des Klebsiella planticola Stammes pDB 101 K 70 B und seiner Mutanten und Varianten zur Verwendung bei analytischen (qualitativen und quantitativen) Untersuchungen oder Überwachungen.
Bevorzugt sind hierbei analytische Untersuchungen oder Überwachungen von Abwässern, vorzugsweise von industri­ ellen Abwässern und ganz besonders bevorzugt von Abwäs­ sern der chemischen Industrie, welche gegebenenfalls auch stark belastet sein können. Vorzugsweise dienen die analytischen Untersuchungen oder Überwachungen zum Auf­ finden und gegebenenfalls auch Bestimmen von Stoffen bzw. Stoffgemischen in Abwässern (insbesondere Kläranla­ genzuläufen), welche die Mikroorganismen in Klärsystemen schädigen oder deren Abbauleistung vermindern könnten.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch für den Anwender vorbereitete Testsysteme ("Kits"), welche den neuen Stamm oder seine Mutanten und Varianten (gegebenenfalls in lyophilisierter Form) neben anderen Hilfsmitteln (z. B. Gefäßen wie Küvetten, Pipetten, Meßgefäße) oder Nähr- und Verdünnungsmitteln und/oder Anwendungsanleitungen) enthalten, sowie die Verwendung dieser Testsysteme zu analytischen Untersuchungen oder Überwachungen.
Es war überraschend und aufgrund des Standes der Technik nicht vorhersehbar, daß der neue erfindungsgemäße Stamm in besonders günstiger Weise für die oben aufgeführten analytischen Zwecke verwendbar ist. Die bisher bekannten Leuchtbakterien ließen nur beschränkte Anwendungen zu. Insbesondere bei Abwässern, vor allem industriellen Ab­ wässern der chemischen Industrie, korrelierten die Be­ funde nur unzureichend mit den wirklich vorliegenden Verhältnissen. Der neue Stamm Klebsiella planticola pDB 101 K 70 B stellt somit eine wertvolle Bereicherung der Technik dar.
Die Anwendung des neuen Mikroorganismus-Stammes erfolgt ebenso wie seine Handhabung (Aufbewahrung und Vermeh­ rung), nach den allgemein üblichen Methoden der Analytik bzw. der Mikrobiologie.
Wie bereits erwähnt, beruht die Anwendung des neuen Stammes darauf, daß durch die Einwirkung von bakterien­ toxischen Stoffen die Intensität der normalen Lichtemis­ sion des lumineszenten Mikroorganismus vermindert wird und sich aus dieser Lichtemissions-Verringerung die Konzentration des bakterientoxischen Stoffes ermitteln läßt.
Zweckmäßigerweise erfolgt die Durchführung des Tests, indem eine standardisierte auf 0 bis 4°C abgekühlte Suspension des Stammes in einem Mischgefäß mit der zu untersuchenden Probe versetzt wird und anschließend auf 15 bis 20°C temperiert wird. Mit Hilfe eines geeigneten Lumineszensphotometers wird die Zunahme der Lichtemis­ sion während des Testzeitraumes (5 bis 30 Min) gemessen. Das kann geschehen, indem zu Beginn und am Ende des Tests jeweils eine Messung durchgeführt wird oder da­ durch, daß die Lichtemission während des Tests kontinu­ ierlich gemessen wird. Um festzustellen, ob eine Test­ probe (z. B. Abwasserprobe) für die jeweiligen Kläranla­ gen-Mikroorganismen schädliche Konzentrationen aufweist, kann es ausreichend sein, die für die Grenzkonzentration zugehörige Lumineszenz zu messen. Eine Unterschreitung der Grenzlumineszenz bedeutet dann eine zu hohe Schad­ stoffkonzentration und die Einleitung entsprechender Maßnahmen. Die Messungen können auch kontinuierlich oder semi-kontinuierlich durchgeführt werden.
Die Handhabung und Anwendung des neuen Mikroorganismus- Stammes soll anhand der folgenden Beispiele erläutert werden:
1. Medium für die Anzucht des Stammes
10 g Bacto-Trypton (Bacton ist ein Warenzeichen der Fa. DIFCO Lab., Detroit, USA), 5 g Hefeextrakt und 20 g Natrium­ chlorid werden in 1,000 ml Leitungswasser gelöst und auf pH 7 eingestellt (Natronlauge oder Leitungswasser). Jeweils 100 ml dieser Lösung werden in Erlenmeyerkolben abgefüllt und 20 Minuten bei 120°C im Autoklaven steri­ lisiert.
2. Anzucht des Stammes
Mit der Impföse beimpft man von einer Stammkultur die gemäß 1. erhaltene Nährlösung und inkubiert bei 25°C für 24 Stunden auf einer Schüttelmaschine.
3. Durchführung der analytischen Messung
Die gemäß 2. erhaltene Kultur wird durch Verdünnung mit der Nährlösung gemäß 1. auf eine (im Hinblick auf die Empfindlichkeit des eingesetzten Biolumineszenzphoto­ meters festzulegende) Ausgangsleuchtintensität eingestellt.
Die Bakteriensuspension wird auf 0 bis 4°C abgekühlt.
  • a) Kontrollansatz
    0,1 ml der Suspension werden in einer Küvette mit 0,1 ml Wasser gemischt und unmittelbar anschließend die Leuchtintensität (Wert: A) gemessen. Dann wird die Küvette mit Inhalt auf 20°C erwärmt und die Leuchtintensität (Wert: B) gemessen.
  • b) Testansatz
    0,1 ml der Baktereinsuspension werden in einer Küvette mit 0,1 ml der Probelösung (z. B. Abwasser) gemischt und unmittelbar anschließend die Leucht­ intensität (Wert: C) gemessen. Dann wird die Küvette mit Inhalt auf 20°C erwärmt und nach 15 Minuten die Leuchtintensität (Wert: D) bestimmt.
  • c) Berechnung der Hemmung
    Die Hemmung der Lichtemission in % wird wie folgt berechnet:
Aus der gefundenen prozentualen Hemmung läßt sich in Abhängigkeit von den eingesetzten Testkonzentrationen in üblicher Weise über Regressionsrechnung auch der sogen. EC₅₀-Wert, d. h. die Konzentration (mg/l), bei der eine 50%ige Hemmung der Lichtemissionszunahme vorliegt, ermitteln.
Gegebenenfalls kann es wünschenswert sein, weitere Meß­ werte bei verschiedenen Temperaturen zu ermitteln oder kontinuierlich während der Erwärmung der Küvetten von 0 bis 4 auf 20°C zu messen.
Für die Messung kommen alle üblichen Lumineszenz­ photometer (z. B. Biolumineszenzmeßgerät Biocounter M 2010 oder Lumacounter M 2080 der Firma Lumac) in Frage.
4. Messung der Giftwirkung von 3,5-Dichlorphenol auf Klebsielle planticola pDB 101 K 70 B Durchführung gemäß 1. und 3.
  • a) Kontrollansatz:
    Lichtemission Beginn (Wert: A): 16947
    Lichtemission Ende (Wert: B): 118757
  • b) Testansatz mit 25 mg/l 3,5-Dichlorphenol:
    Lichtemission Beginn (Wert: C) 10296
    Lichtemission Ende (Wert: D): 70822
  • c) Nach der obigen Formel errechnet sich eine Hemmung von 41%
  • Aus Messungen mit verschiedenen Konzentrationen an 3,5-Dichlorphenol ergeben sich folgende Hemmungen:
  • Der hieraus berechnete EC₅₀-Wert beträgt: 27 mg/l
Nach der angegebenen Methode können praktisch alle für Kläranlagen-Mikroorganismen relevanten Stoffe, die bakterientoxisch sein können, erfaßt werden wie die gegebenenfalls halogenierten Phenole, z. B. die Kresole, 2-Chlorphenol, 4-Chlorphenol, 3,5-Dichlorphenol und Natrium-pentachlorphenolat. Für 3,5-Dichlorphenol wurde beispielsweise ein sehr gut reproduzierbarer EC₅₀ von 25 bis 30 mg/l ermittelt.

Claims (8)

1. Mikroorganismus-Stamm Klebsiella planticola pDB 101 K 70 B und seine Mutanten und Varianten.
2. Verwendung des Klebsiella planticola Stammes pDB 101 K 70 B und seiner Mutanten und Varianten bei analytischen Untersuchungen oder Über­ wachungen.
3. Verwendung gemäß Anspruch 2 bei analytischen Untersuchungen und Überwachungen von Abwäsern.
4. Verwendung gemäß den Ansprüchen 2 und 3, wobei die Abwässer industrielle Abwässer, vorzugsweise der chemischen Industrie, sind.
5. Verwendung gemäß den Ansprüchen 2 bis 4, wobei sich die analytischen Untersuchungen und Überwachungen auf Substanzen oder Substanzgemische beziehen, welche Mikroorganismen von Klärsystemen schädigen können.
6. Für den Anwender vorbereitete Testsysteme ("Kits") welche den Mikroorganismus-Stamm gemäß Anspruch 1 neben anderen Hilfsmitteln enthalten.
7. Verwendung der Testsysteme gemäß Anspruch 6 bei analytischen Untersuchungen oder Überwachungen, vorzugsweise von Abwässern, insbesonere von indu­ striellen Abwässern.
8. Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei sich die analy­ tischen Untersuchungen und Überwachungen auf Sub­ stanzen oder Substanzgemische beziehen, welche Mikroorganismen von Klärsystemen schädigen können.
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