WO1998053090A1 - Microbiosensor para la monitorizacion en continuo de sustancias quimicas en fluidos - Google Patents

Microbiosensor para la monitorizacion en continuo de sustancias quimicas en fluidos Download PDF

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WO1998053090A1
WO1998053090A1 PCT/ES1998/000127 ES9800127W WO9853090A1 WO 1998053090 A1 WO1998053090 A1 WO 1998053090A1 ES 9800127 W ES9800127 W ES 9800127W WO 9853090 A1 WO9853090 A1 WO 9853090A1
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microbiosensor
fluids
chemical substances
continuous monitoring
microorganisms
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PCT/ES1998/000127
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English (en)
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Inventor
Teófilo DIEZ-CABALLERO ARNAU
Guillermo Rodriguez Albalat
Cristina Ferrer Ferrer
Enrique Espinas Marti
Sergio Montoro Rodriguez
Vladimir Erchov
Alejandro Mendoza Plaza
Teofilo Diego Diez-Caballero
Original Assignee
Biosensores, S.L.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

Definitions

  • biosensor technology resulting from multidisciplinary integration, basically in the areas of enzymology, immunology and microbiology with those of sensors and signal transducers. This has made it possible to obtain biosensors with specific applications (industrial, biomedical or environmental, among others), which begin to compete satisfactorily with already classic analytical technologies.
  • microbiosensors will find applications ranging from environmental monitoring to bioreactor control. More recently, advances in the field of genetic modification of microorganisms are making available to researchers the elements necessary to design and implement microbiosensors capable of not only detecting and quantifying specific compounds but even amplifying the signals generated in detection, taking advantage of the molecular biology of the modified microorganisms themselves
  • microbiosensors Among the most studied configurations to date for the design of microbiosensors, we must mention those of microbial membranes. In this technology, specific microorganisms or not, are retained within a membrane and in contact with the signal transducer of the microbiosensor. The presence of the substances capable of affecting the microbial metabolism produces a physical-chemical alteration in the internal face of the microbial membrane that is detected by the sensor and the properly treated signal allows to evaluate the substances of interest This technology has allowed to put on the market commercial equipment with new and interesting specifications, mainly in the environmental field (microbiosensors-BOD such as those of Doctor Lange, Medingen, or CKG, among others).
  • microbiosensors bases the functional design on the use of a microbial reactor maintained in the optimal conditions of microbial activity, in which the liquid sample that is desired to be directly monitored in the reactor is introduced, recording the signal produced by the transducer used .
  • the volume, dilution or injection rate of the sample is adjusted by automatic feedback systems of the generated signal so that it maintains a predetermined value.
  • Respiometers such as Rodtox (PA Vanrolleghem, et al.) An on-line Respirographic Biosensor for the Characterization of Load and Toxicity of Wastewaters ", J. Chem. Tech. Biotechnol. 1994, 59, 321-333) and Stip.
  • microbiosensors are currently being used with satisfactory results for specific applications (primarily BOD and toxicity), but their design inherently sets limitations functional for many applications of interest This is due to the modification of the set of parameters of the microbiological reactor (microbial concentration, functional alteration of the microorganisms, etc.) when introducing the sample itself to be analyzed in the reactor, it shows that sometimes it can have Sensitive concentrations of toxic chemicals or capable of altering the response of the whole of the sensing microorganisms for more or less long periods, consequently it is the difficulty of maintaining a stable baseline of response as well as the impossibility of analyzing samples of high toxicity or risk, if these are analyzed, to leave the microbes out of use ensor reversibly or irreversibly.
  • the invention described below provides innovations in the concept and design of microbiosensors, making it possible to greatly avoid the limitations set forth above.
  • innovations provided and their advantages over current microbial membrane technology are the following: a / Continuous availability of microorganisms when using a microbiological reactor with controlled growth parameters, which allows monitoring of high toxicity samples discard, after each determination, the microorganisms used in the mini-reactor or reaction unit, b /
  • the reaction unit or monitoring mini-reactor is a separate compartment to the mother reactor in which the continuous culture of microorganisms is maintained;
  • the samples to be analyzed are injected without interfering with the functioning of the continuous culture of microorganisms, c /
  • the physical separation membrane between the medium to be analyzed and the transducer is eliminated, allowing the range of linearity of the signal to be extended and dramatically reduce the time needed to reach a stable signal, d /
  • the introduction of standard samples, before and after injecting the test sample into the reaction unit makes possible the systematic
  • the invention described does not refer to or require a certain type of microorganism.
  • the technology described by the invention corresponds to a microbiosensor that integrates automated devices, reactors and mini-reactors, transducers, PLCs, Pe, thermostatting systems, etc. that make possible different applications using specific microorganisms in each case, and not only those currently available but others that may be obtained in the future.
  • the advantages described in the previous paragraph are obtained, in whole or in part, with respect to microbiosensors used today.
  • microbiosensor-BOD The technology and innovations derived from this patent can be applied to very varied types of microbiosensors, both for the cultures used, pure or mixed, as well as for the monitored analytes, specific molecules or nonspecific substrates, or for the generated physical-chemical signal and the transducer used for quantification.
  • a / pure microbial, natural or genetically modified strains which allow specific molecules to be monitored using, for example optoelectronic signal translators
  • b / mixed microbial cultures capable of metabolizing or being altered in its metabolism by a broad set of molecular species (analytes) present in the test sample (example: microbiosensor-BOD).
  • the genes that code for the metabolic pathway of interest are inserted.
  • the promoter of this gene sequence is activated and both the genes encoding the luciferase and those encoding the enzymes that catalyze the degradation of said metabolite are transcribed.
  • the analyte molecules can be organic compounds that are considered toxic in the environment, such as organochlorine compounds.
  • the most innovative bacterial strains incorporate a constitutive control consisting of the insertion into the bacterial chromosome of a gene that encodes the synthesis of a eukaryotic luciferase, the expression of which is constitutive.
  • light at 560 nm can be detected continuously as an indicator of the good metabolic state of biomass and also light at 490 nm when the specific toxic is present in the medium.
  • a microbiosensor system for the online monitoring of chemical substances in fluids is presented.
  • BOD Biochemical Oxygen Demand
  • the measurement of the Biochemical Oxygen Demand (BOD) is fundamental to control the operation of the Wastewater Treatment Plants (WWTP) and for the monitoring and surveillance of ecosystems. It is an analytical parameter that measures the oxygen used by microorganisms for the biochemical degradation of the organic matter contained in a sample during a specified incubation period at a given temperature. His knowledge allows adjusting the oxygen needs of the Biological Reactor or aeration tank, a key element in the operation of the Purifier.
  • the BOD microbiosensor equipment set forth as an example of the invention is based on advanced and original technologies, compared to other equipment with the same purpose today existing in the market, and makes it possible to obtain a BOD reading in liquid samples of very different composition in only 15 minutes This makes it possible: to obtain information in "real time" on the operation of a treatment plant or of the analyzed liquid mass, b / take corrective measures instantly if necessary, being able to assess in a short time the effect produced by the applied measures, c / save aeration energy, critical stage of WWTP consumption.
  • the microbiosensor-is constituted as an integrated system and includes: a - continuous microorganism growth units, b - microbiological reaction unit.
  • c- transducer component dissolved oxygen sensor in the case of BOD.
  • d.- hydraulic circuit for programmed liquid transfer e.- microprocessor for the control of the analytical process and signal acquisition, f- PC device for data processing and interface with the PLC.
  • the microbiosensor must have samples of filtered wastewater and in a position to be analyzed by the equipment.
  • This system is made up of liquid sample disposal pumps to be analyzed from the points specified in the treatment plant to the equipment and a tangential filter that eliminates suspension solids, which can interfere with the BOD measurement.
  • FIG. 1 shows the microbiosensor configuration.
  • the operating principles of the microbiosensor for continuous monitoring of chemical substances in fluids are detailed below:
  • the transducer component is located in the reaction unit, in this case a dissolved oxygen sensor of small dimensions with which the reduction of the dissolved oxygen due to the consumption of the organic matter contained in the sample.
  • the following substances are added in predetermined quantities: a.- The corresponding aliquot of the suspension of self-selected microorganisms that in a predetermined quantity is transferred in each measurement cycle to the minireactor (mR) from the mother reservoir ( RM).
  • b.- The reference substance or standard (P), whose value corresponding to the analytical variable that is measured is known and allows to verify the suitability of the measurement system.
  • a self-calibration of the microbiosensor takes place by means of the automated addition of the standard substance in predetermined quantity, before and after the addition of the samples to be analyzed.
  • the toxic effect that the analyzed sample can have on the microorganisms used in the measurement is determined in each cycle, by comparing the signals corresponding to the standards before and after the addition of the samples in the reaction cell.
  • the washing liquid consisting of a cleaning solution disposed in its corresponding reservoir within the microbiosensor equipment and which allows the washing of the mini-reactor and the active surfaces of the transducer components in each measurement cycle, once the determination is completed.
  • the washing phase begins with the emptying of the contents of the mini-reactor followed by the addition of the cleaning solution, and once filled it is kept inside the measuring cell for a programmed time in stirring by bubbling, subsequently emptying it.
  • the automated addition of the washing liquid takes place by means of a jet projected on the active surface of the transducer component, which allows prolonging the microbiosensor's autonomy time under equivalent conditions of response capacity and drastically reducing maintenance and handling needs with human intervention.
  • the oxygen required for the measured reaction is continuously supplied to the minireactor by means of a predetermined flow compressor and equipped with a filter that retains the solid particles present in the air (1).
  • a predetermined flow compressor equipped with a filter that retains the solid particles present in the air (1).
  • the microorganisms metabolize it, producing a concomitant consumption of dissolved oxygen.
  • the components of the microbiosensor equipment for the continuous monitoring of chemical substances in fluids are the following:
  • An internal fluidic system consisting of a system capable of boosting, regulating and channeling the different fluids to the measurement zone, all integrated into a flow system.
  • This system consists of the following parts: a drive system consisting of peristaltic pumps (3, 4, 5, 6, 7) so that each pump drives a different fluid, distribution tubes, which are flexible tubes through which they circulate the different fluids, three-way solenoid valve, which controls the passage of the sample to the measuring cell, and an aeration device comprising a set of compressors (1) provided with a filter and driving predetermined air flows through the corresponding distribution tubes for aeration of microorganisms in suspension.
  • An external fluidic system The recommended external hydraulic circuit for sample collection contains filtration devices (8) to eliminate suspended solids that do not provide any analytical value in the determination and could also damage the internal components of the microbiosensor, especially in The case of wastewater.
  • the device consists of an in-line tangential filter (8) so that the difference in pressure generated by the difference in elevation allows obtaining a free filtrate of suspended solids.
  • This filtered sample current is diverted to the solenoid valve which, according to the analysis program, allows the filtered sample, in an amount defined by the programmed time, to pass to the measuring cell (mR) once the renewal of the content transported by said conduit, to avoid contamination between samples of consecutive measurement cycles.
  • Thermostabilization A cascade thermostabilization system, which consists of a system that allows simultaneous maintenance of the appropriate temperature for the reaction being measured and the appropriate temperature for the preservation of the reactive media in a prolonged time.
  • the system consists of two devices.
  • a cold / heat thermostabilization device consisting of a thermostatted compartment in which the internal components and means of the equipment are housed microbiosensor The system keeps the compartment at refrigeration temperature for the maintenance of the stability of the reactive media in prolonged times.
  • a thermostabilization device of the reaction unit consisting of a thermally protected compartment and housed inside the previous device and containing the unit of reaction. It incorporates an adjustable thermostat All the elements are located in a bucket.
  • the microbiological system of the microbiosensor equipment consists of self-selected microorganisms, whose continuous controlled proliferation is carried out through the appropriate adjustment of their growth parameters (pH, r 3 , dilution, aeration and food). Starting from different initial stages of inoculum, the system is able to maintain the concentration and metabolic activity of the practically constant microorganisms, within the thermostatized reaction unit. Your metabolism is sensitive to variations in the chemical substances that are measured.
  • the reaction unit is contained in the corresponding thermostat device, and consists of the following components: A mother Reservoir (RM) consisting of a reservoir containing the microorganism or microorganisms in suspension and whose metabolic concentration and activity remain practically constant at through the control of: a / the systematic feedback with a means of predetermined composition, located in a reservoir equipped with an ultraviolet light lamp to prevent or control contaminating microbial growth, and b / the maintenance of microbial growth parameters (temperature, pH, dilution, aeration) preset.
  • RM Mother Reservoir
  • a Minireactor which is the physical device where the reactive components are added and mixed, said reaction takes place and is monitored by the corresponding transducer component.
  • the microorganisms interact with the components of the samples to be determined at the temperature and time determined by the specific analysis program and specified by the analytical process control system.
  • the transducer component in the case of BOD is a Clark-type dissolved oxygen electrode (2), capable of measuring the concentration of oxygen in the reaction mixture.
  • the working principle of the oxygen electrode is that it determines the partial pressure of oxygen in liquids according to the Clark principle.
  • the measurement procedure is characterized by the separation between the sample and the electrode by a permeable membrane.
  • the reduction of oxygen in the working electrode results from the application of a potential, by the following reaction:
  • the oxidation of the reference electrode is a result of the consumption of electrons.
  • the mounting of the sensor for commissioning contemplates the sequential realization of the following steps: fixing and tensioning of the membrane, adding electrolyte, assembly of the cap on the sensor, and commissioning of the mounted sensor.
  • the analytical process control system consists of a computer (PC) (12) that continuously monitors the operation of a programmable automaton (PLC) (11) that executes the instructions of the specific analysis program through the corresponding interfaces, controlling between other parameters: volumes and sequences of the process component shots, reaction time before reading results, acquisition of the reading signal generated by the transducer, system self-check, calculation and presentation of results.
  • PC computer
  • PLC programmable automaton
  • the computer implements a more complex processing of the transducer signals while allowing the control executed by the programmable controller to be modified according to the measurement needs or the operating conditions of the system.
  • the incorporation of modems (15) in the system The computer system enables microbiosensor equipment for a remote control by means of a point-to-point telephone connection (16), making it possible to centralize the operation of field equipment in the same physical space.
  • the device has a monitor (13) and printer (14), as peripherals for communication with the user.
  • control and data acquisition software of the microbiosensor object of the present invention for the particular case of BOD is described.
  • the BOD microbiosensor is controlled through specialized software.
  • the microbiosensor equipment includes a PC computer and a microprocessor (the PLC automaton).
  • Control programs implement the following functions:
  • the microbiosensor software includes two main programs and several additional programs (for remote access to the equipment, to build the graphics etc.).
  • the PLC PLC program allows you to control the operation of the device independently of the PC computer, while the PC program allows you to receive, store and analyze the measurement data.
  • the PC computer program receives the measurement data from the PLC controller every 30 seconds and stores it in a file on the hard disk. At the same time the program shows this data in a graph and analyzes the changes observed during the measurement cycle.
  • This graph of dissolved oxygen (fig. 2) is shown in a window where the operator can mark some points that interest him (establish the margins of integration of the signal) and calculate the areas under the peaks that correspond to the microbiosensor responses to the samples.
  • the PC program also has two more screens: one is called a time diagram and the other functional diagram of the measuring equipment.
  • the time diagram (fig. 3) allows to observe the operation of the measurement cycle through the activation and deactivation graphs of the fluidic circuit devices.
  • the diagram Functional (fig.4), it is a window that helps to better understand the microbiosensor operation and allows to control the electrical devices of the equipment (peristaltic pumps and solenoid valves).
  • the PLC PLC hardware is designed so that the exchange of messages between the PLC and the PC can be implemented without interrupting the PLC program.
  • the functional diagram represents the structure of the microbiosensor fluidic circuit. It includes the mini-reactor, the mother reactor, the peristaltic pumps, liquid circuits, solenoid valves, etc. This diagram allows you to control peristaltic pumps and solenoid valves from the PC computer screen. Any pump or solenoid valve is activated simply by pointing the cursor over its image and pressing the left mouse button. The image of the pump changes. When you type the image of the activated pump, it stops. In the same way the solenoid valve is activated and deactivated.
  • the dissolved oxygen diagram shows in real time the data obtained during the measurement cycle. These data represent the last 600 measures of dissolved oxygen (taken as often as desired).
  • this diagram shows the sample measurement peaks and the reference peaks (standards, Fig. 2).
  • the area of the peaks represents the biological oxygen demand (BOD).
  • BOD biological oxygen demand
  • this area is automatically calculated and the calculation result is displayed in the lower part of the main window in the information bar. It is also possible to calculate the area of any peak of the graph through the "Area" menu. Using the commands "Start Registration”, “Tin Registration” and “Baseline” (Fig. 5) mark the limits of integration of the graph (pointing the cursor to the points corresponding to the start and end of integration, and the bottom line of the which area is calculated: points ⁇ , b and c in Fig.
  • the time diagram shows in which The moment of the analytical cycle is the equipment
  • the state of the peristaltic pumps looks like the logical unit (the high signal) if the pump is activated, or as zero, if the The pump is also switched off
  • the equipment can also be controlled through the "Windows", “Commands", "User” menus With the "Windows” menu the operator chooses one of the three windows to control the equipment (Dissolved Oxygen, Diagram of Times or Block Diagram) By pressing a menu item "Windows” the corresponding window comes out in front of the others, and the operator can use it.
  • the "User” menu is used to change the level of access to the commands (for example, a supervisory user can change the properties of the measurement cycle, and another operator does not have access to this operation).
  • the "Commands” menu is used to activate mini-cycles of fluidic circuit operation.
  • the "Stop the Cycle” command is executed for a programmed time and includes activation of several pumps (those for washing and emptying).
  • the "Reload the Cycle” command is used to change the cycle's operating times.
  • the "Microorganisms” command activates the microorganism pump and then the feedback pump of the mother reactor.
  • the "Pattern" command activates the pattern pump for a predetermined time.
  • the "Input Sample” command implements a cycle of taking the input sample to a wastewater treatment plant.
  • the external pump of the input sample to the WWTP is activated and, after a sufficient time for the input sample to reach the equipment, the internal peristaltic pump is activated and the solenoid valve for the injection of the referred Sample input to the mini-reactor.
  • the "Output Sample” command implements the output sampling cycle of a treatment plant, which is equivalent to the input sampling cycle described in the previous point.
  • the "Wash" command activates the mini-reactor wash pump, and, after a predetermined time, the pump for emptying it is activated.
  • the "Emptying" command simply activates the emptying pump for the predetermined time
  • the measurement cycle times are defined within the PLC PLC program, and to change them you must change this program, or send the new time values from The PC computer.

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Abstract

En las dos últimas decadas se está asistiendo al desarrollo biosensores con aplicaciones concretas (industriales, biomédicas o medioambientales, entre otras), que comienzan a competir satisfactoriamente con tecnológias analíticas ya clásicas. Pero estos équipos, que principalmente se basan en la retención de los microorganismos en membranas, tienen limitaciones intrínsecas. Las innovaciones aportadas respecto de la actual tecnología son dos fundamentales: a) disponibilidad continua de microorganismos al utilizar un quimiostato, lo que permite monitorizar muestras de toxicidad elevada al desechar tras cada determinación los microorganismos utilizados, b) se elimina la membrana física de separación entre el medio a analizar y el transductor, permitiendo ampliar el rango de linealidad de la señal y reducir drásticamente el tiempo necesario para alcanzar una señal estable. Se presenta pués un sistema biosensor para monitorización en línea de sustancias quimicas en fluidos. Como ejemplo de aplicación se describirá la utilización del sistema en la determinación en linea de la Demanda Bioquimica de Oxigeno (DBO) en aguas.

Description

Titulo.
"Microbiosensor para la monitorización en continuo de sustancias químicas en fluidos".
Sector de la técnica
-Análisis químico y bioquímico. Análisis medioambiental -Sistema para análisis en FIA (Flow Injection Analysis),en Flujo Discontinuo. -Sistema para análisis automatizado con autocalibración.
-Aplicación en áreas diversas.Medio ambiente, reactores microbiológicos, fermentadores, biologia,agroalimentación e industrias relacionadas con dichas áreas.
Estado de la Técnica
Durante las dos últimas decadas se está asistiendo a un desarrollo creciente de la tecnología de biosensores fruto de la integración pluridisciplinar, básicamente de las áreas de enzimología , inmunología y microbiología con las de sensores y transductores de señal . Esto ha permitido obtener biosensores con aplicaciones concretas( industriales, biomédicas o medioambientales, entre otras), que comienzan a competir satisfactoriamente con tecnologías analíticas ya clásicas.
Si los biosensores enzimáticos encuentran aplicación especial en los casos de determinaciones repetitivas de una molécula-sustrato, para la que se puede obtener la correspondiente enzima, y los inmunobiosensores harán posible en un futuro próximo la determinación específica de prácticamente cualquier molécula simple o compleja obteniendo los respectivos anticuerpos, los microbiosensores encontrarán aplicaciones que van desde la monitorización medioambiental al control de bioreactores. Más recientemente, los avances en el campo de modificación genética de microorganismos están poniendo a disposición de los investigadores los elementos necesarios para diseñar e implementar microbiosensores capaces no sólo de detectar y cuantificar compuestos específicos sino incluso de amplificar las señales generadas en la detección, aprovechando la biología molecular de los propios microorganismos modificados
Entre las configuraciones más estudiadas hasta el presente para el diseño de microbiosensores hay que citar las de membranas microbianas. En esta tecnología, microorganismos específicos o no, están retenidos en el seno de una membrana y en contacto con el trasductor de señal del microbiosensor . La presencia de las sustancias capaces de afectar el metabolismo microbiano produce una alteración físico-química en la cara interna de la membrana microbiana que es detectada por el sensor y la señal convenientemente tratada permite valorar las sustancias de interés Esta tecnología ha permitido poner en el mercado equipos comerciales con nuevas e interesantes especificaciones , fundamentalmente en el campo medioambiental( microbiosensores- DBO como los de Doctor Lange , Medingen, o CKG, entre otros ). No obstante estos equipos que se basan en la retención de microorganismos en membranas tienen limitaciones intrínsecas originadas en su propio diseño y concepción. Por una parte los microorganismos fijados a la estructura de la membrana tienen limitada o nula capacidad de crecimiento y están expuestos a la presencia de ciertos tóxicos o factores esterilizantes , capaces de dejar fuera de uso a la membrana. Por otra las dimensiones y características físico. químicas de la propia membrana introducen limitaciones a la difusión de los analitos a su través y reducen el margen de concentraciones del analito para los que el equipo es capaz de generar respuestas lineales. (E. Praet, V. Reuter, T. Gaillard, J.-L Vasel."Bioreactors and biomembranes for biochemical oxigen demand estimation". Trends in Analitical Chemistry, vol. 14, n°. 7, 1995). Otra gran área de microbiosensores basa el diseño funcional en la utilización de un reactor microbiano mantenido en las condiciones óptimas de actividad microbiana, en el que se introduce la muestra líquida que se desea moiiitorizar directamente en el reactor, registrando la señal producida por el transductor utilizado. En algunas de las variantes de este tipo de microbiosensores se ajusta el volumen, dilución o caudal de inyección de la muestra mediante sistemas automáticos de retroalimentación de la señal generada a fin de que esta mantenga un valor predeterminado. En esta área de microbiosensores cabe citar respirometros como el Rodtox ( P.A. Vanrolleghem, et al. "An on-line Respirographic Biosensor for the Characterization of Load and Toxicity of Wastewaters", J. Chem. Tech. Biotechnol. 1994, 59, 321-333) y el Stip. Estos tipos de microbiosensores se están utilizando actualmente con resultados satisfactorios para aplicaciones concretas (fundamentalmente DBO y toxicidad), pero su diseño intrínsecamente establece limitaciones funcionales para muchas aplicaciones de interés. Esto es debido a la modificación del conjunto de parámetros del reactor microbiológico (concentración microbiana, alteración funcional de los microorganismos, etc.) al introducir la propia muestra a analizar en el reactor, muestra que en ocasiones puede tener concentraciones sensibles de productos químicos tóxicos o capaces de alterar durante períodos más o menos largos la respuesta del conjunto de los microorganismos sensores. Consecuencia de ello es la dificultad de mantener una línea base de respuesta estable así como la imposibilidad de analizar muestras de alta toxicidad o arriesgarse, si estas se analizan, a dejar fuera de uso el microbiosensor de forma reversible o irreversiblemente. La invención que a continuación se describe aporta innovaciones en el concepto y diseño de microbiosensores haciendo posible evitar en gran medida las limitaciones antes expuestas. Entre otras las innovaciones aportadas y sus ventajas respecto a la actual tecnología de membranas microbianas, de forma resumida, son las siguientes: a/ Disponibilidad continua de microorganismos al utilizar un reactor microbiológico con parámetros de crecimiento controlados, lo que permite monitorizar muestras de toxicidad elevadaal desechar, tras cada determinación los microorganismos utilizados en el minireactor o unidad de reacción, b/ La unidad de reacción o minireactor de monitorización es un compartimento independiente al reactor madre en el que se mantiene el cultivo continuo de microorganismos; en el minireactor se inyectan las muestras a analizar sin que estas interfieran en el funcionamiento del cultivo continuo de microorganismos, c/ Se elimina la membrana física de separación entre el medio a analizar y el transductor, permitiendo ampliar el rango de linealidad de la señal y reducir drásticamente el tiempo necesario para alcanzar una señal estable, d/ La introducción de muestras patrón, antes y después de inyectar la muestra problema en la unidad de reacción, hace posible el autocalibrado sistemático del equipo y la obtención de una línea base de referencia estable. e/Al desechar el contenido del minireactor de monitorización tras cada ciclo, es posible inyectar en este una proporción de volúmenes: (Volumen muestra problema) 1 (Volumen total) elevada, que permite detectar la presencia de ciertos compuestos químicos poco concentrados en la muestra problema o con poca capacidad de generación de señal en el transductor utilizado
Hay que resaltar que la invención que se describe no se refiere a ,ni requierte, un determinado tipo de microorganismo. La tecnología que describe la invención corresponde a un microbiosensor que integra dispositivos automatizados, reactores y minireactores, transductores, PLCs, Pe, sistemas de termostatizacion, etc. que hacen posible distintas aplicaciones utilizando para ello microorganismos específicos en cada caso, y no sólo los actualmente disponibles sino otros que en el futuro puedan obtenerse. En cualquiera de las posibles aplicaciones se obtienen en su totalidad o en parte, las ventajas que se describen en el párrafo anterior, respecto a equipos microbiosensores hoy en uso.
Descripción de la invención.
La tecnología e innovaciones derivadas de esta patente, pueden aplicarse a muy variados tipos de microbiosensores, tanto por los cultivos utilizados, puros o mixtos , como por los analitos monitorizados , moléculas específicas o sustratos inespecíficos, o por la señal físico-química generada y el transductor utilizado para su cuantificación. Como ejemplos aclaratorios de la amplia utilidad de la tecnología desarrollada se hará referencia a la utilización de: a/ cepas puras microbianas , naturales o genéticamente modificadas, que permiten monitorizar moléculas específicas utilizando, por ejemplo traductores optoelectrónicos de señal, y b/ cultivos microbianos mixtos capaces de metabolizar o ser alterados en su metabolismo por un conjunto amplio de especies moleculares (analitos) presentes en la muestra problema (ejemplo: microbiosensor- DBO). a/ Como referencia de esta aplicación se describe brevemente la utilización de microorganismos genéticamente modificados a los cuáles se les ha insertado una determinada secuencia génica mediante tecnología del DNA recombinante. Esta secuencia está constituida por los denominados genes LUX que codifican la síntesis de la enzima luciferasa, que cataliza una reacción de oxidación que lleva asociada la emisión de un fotón de luz de una longitud de onda de 490 nm. Esta enzima procede de un organismo procariótico. (Philip J. Hill, Stephen P. Denyer." Rapid Assays Based On In Vivo Bacterial Lumuniscence".Microbiology Europe, 16,May/June 1993),(Robert S. Burlage." Living Biosensors for the Management and Manipulation of Microbial Consortia"Annual Review Microbiol., 48. 81-104).
Asociados al mismo promotor(región del genoma dónde ocurre la transcripción de un gen), se insertan los genes que codifican para la ruta metabólica de interés. Cuando en el medio está presente el metabolito específico que se requiere (tóxico), se activa el promotor de esta secuencia génica y se transcriben tanto los genes que codifican para la luciferasa como los que codifican para las enzimas que catalizan la degradación de dicho metabolito. ( Jorma Lampinen, Marko Virta."Use of Controlled Luciferase Expression To Monitor Chemicals Affecting Protein Synthesis." Applied and Environmental Microbiology,Aug. 1995,p 2981-2989). Las moleculas-analito pueden ser compuestos orgánicos que se consideran tóxicos en el ambiente, tales como compuestos organoclorados. Las bacterias metabolizan estos tóxicos dando lugar a emisión de luz, la cual puede ser detectada y cuantificada, relacionándose con el tóxico presente en el medio. (S. Burlage,A. Palumbo." Biolumuniscent Repórter Bacteria Detect Contaminants in Soil Samples" Applied Biochemistry and Biotechnology,vol. 45/46). Las cepas bacterianas más innovadoras incorporan un control constitutivo que consiste en la inserción en el cromosoma bacteriano de un gen que codifica la síntesis de una luciferasa eucariótica, la expresión de la cual es constitutiva. Así se puede detectar luz a 560 nm de manera continuada como indicador del buen estado metabólico de la biomasa y además luz a 490 nm cuando está presente el tóxico específico en el medio. ( Ángel Cebolla , F. Ruiz- Berraquero." Stable Tagging oϊRhizobium meliloti with the Firefly Luciferase Gene for Environmental Monitoring" Applied and Environmental Microbiology,Aug. 1993,p.2511-2519)( Wood Kv. Gruber MG." Transduction in Microbial Biosensors Using Multiplexed Bioluminiscence."Biosensors and Bioelectronics 11(3):207- 214,1996) , (Gu MB. Dhurjati PS." A Miniature Bioreactor for Sensing Toxicity using recombinant bioluminiscent Escherichia coli Cells". Biotechnology Progress.12(3):393- 397,1996);b/para profundizar en el funcionamiento y aspectos tecnológicos de esta patente se expondrá con detalle un ejemplo de aplicación de la misma para la monitorización en línea de la Demanda Bioquímica de Oxígeno (DBO).
Ejemplo de realización de la invención para su aplicación en la monitorización en línea de la Demanda Bioquímica de Oxígeno (DBO).
Se presenta un sistema microbiosensor para la monitorización en línea de sustancias químicas en fluidos. Como caso particular y ejemplo de aplicación de la presente invención se describirá la utilización del sistema en la determinación de la Demanda Bioquímica de Oxígeno (DBO) en aguas. La medida de la Demanda Bioquímica de Oxígeno (DBO) es fundamental para controlar el funcionamiento de las Estaciones Depuradoras de Aguas Residuales (EDAR).y para la monitorización y vigilancia de ecosistemas. Es un parámetro analítico que mide el oxígeno utilizado por microorganismos para la degradación bioquímica de la materia orgánica contenida en una muestra durante un período de incubación especificado a una temperatura dada. Su conocimiento permite ajusfar las necesidades de oxígeno del Reactor Biológico o cuba de aireación, elemento clave en el funcionamiento de la Depuradora. Las determinaciones clásicas de la DBO requieren un tiempo de incubación de 5 días en el laboratorio, de forma que el resultado obtenido no refleja la contaminación del agua que debe ser tratada en ese momento por la Depuradora. Por consiguiente, estos sistemas analíticos son de escasa utilidad para procesos de control operativo que requieran cuantificar las muestras en tiempos menores. Se trata además de un análisis con un número considerable de fuentes de variabilidad en los resultados. El equipo microbiosensor DBO que se expone como ejemplo de la invención se basa en tecnologías avanzadas y originales, respecto a otros equipos con la misma finalidad hoy existentes en el mercado, y hace posible obtener una lectura del DBO en muestras liquidas de muy diversa composición en solo 15 minutos. Esto hace posible: a obtener información en "tiempo real" sobre el funcionamiento de una depuradora o de la masa liquida analizada, b/ tomar al instante medidas correctoras si es necesario, pudiendo valorar en corto tiempo el efecto producido por las medidas aplicadas, c/ ahorrar energía de aireación, etapa crítica de consumo de la EDAR. ál centralizar la monitorización de una o varias EDARs mediante captura remota de datos, e/ valorar la presencia de ciertos tóxicos en las muestras liquidas analizadas, ϋ determinar DBO incluso en muestras liquidas de elevada concentración de toxicos;g/ autocalibrar en cada ciclo de medida la respuesta analítica del equipo mediante patrones internos, h/ monitorizar el DBO en sistemas abiertos en un amplio margen de temperaturas ambientales. En los siguientes puntos se describe el funcionamiento y los componentes del equipo microbiosensor para la monitorización de sustancias químicas en fluidos, aplicado al caso particular de la determinación en línea de la D.B.O. en aguas. La configuración del microbiosensor para la monitorización en continuo de sustancias químicas en fluidos se describe a continuación. El microbiosensor-está constituido como un sistema integrado e incluye: a - unidades de crecimiento de microorganismos en continuo, b - unidad de reacción microbiológica. c- componente transductor (sensor de oxígeno disuelto en el caso de la DBO). d.- circuito hidráulico de transferencia programada de líquidos, e.- microprocesador para el control del proceso analitico y adquisición de la señal, f- dispositivo PC de tratamiento de los datos e interfase con el PLC. g - dispositivos de termoestabilización integrada.
Complementariamente el microbiosensor debe disponer de muestras de aguas residuales filtradas y en condiciones de ser analizadas por el equipo. Este sistema se compone de bombas de displasamiento de las muestras liquidas a analizar desde los puntos especificados en la planta de depuradora hasta el equipo y de un filtro tangencial que elimine los solidos de suspensión, que pueden interferir con la medida de DBO.
En la figura 1 se muestra la configuración del microbiosensor. Los principios de funcionamiento del microbiosensor para la monitorización en continuo de sustancias químicas en fluidos se detallan seguidamente: En la unidad de reacción se ubica el componente transductor, en este caso un sensor de oxígeno disuelto de pequeñas dimensiones con el que se mide la reducción del oxígeno disuelto debido al consumo de la materia orgánica contenida en la muestra. En cada ciclo de medida se adicionan, en cantidades predeterminadas, las siguientes sustancias: a.- La alícuota correspondiente de la suspensión de microorganismos autoseleccionados que en una cantidad predeterminada se trasvasa en cada ciclo de medida al minireactor (mR) desde el reservorio madre(RM). b.- La sustancia de referencia o patrón (P), cuyo valor correspondiente a la variable analítica que se mide es conocido y permite comprobar la idoneidad del sistema de medida. En cada ciclo de medida tiene lugar una autocalibración del microbiosensor mediante la adición automatizada de la sustancia patrón en cantidad predeterminada, antes y después de la adición de las muestras que se analizan. De este modo se determina en cada ciclo el efecto tóxico que la muestra analizada pueda tener sobre los microorganismos utilizados en la medida, mediante la comparación entre las señales correspondientes a los patrones antes y después de la adición de las muestras en la celda de reacción. c- Las muestras de agua a analizar, que previamente son impulsadas mediante bombeo (9 y 10) hasta el equipo microbiosensor durante un tiempo necesario para que se renueve el voumen muerto de los tubos de conducción, desde el punto de toma de muestra hasta el microbiosensor-DBO, de forma que esas muestras analizadas sean frescas. El líquido de lavado, que consta de una disolución de limpieza dispuesta en su correspondiente reservorio dentro del equipo microbiosensor y que permite en cada ciclo de medida el lavado del minireactor y de las superficies activas de los componentes transductores, una vez concluida la determinación. La fase de lavado se inicia con el vaciado del contenido del minireactor seguida de la adición de la disolución de limpieza, y una vez llenado se mantiene dentro de la celda de medida durante un tiempo programado en agitación por burbujeo, procediendo posteriormente a su vaciado. La adición automatizada del líquido de lavado tiene lugar por chorro proyectado sobre la superficie activa del componente transductor, lo que permite prolongar el tiempo de autonomía del microbiosensor en condiciones equivalentes de capacidad de respuesta y reducir drásticamente las necesidades de mantenimiento y manipulación con intervención humana.
El oxígeno necesario para la reacción que se mide se aporta continuamente al minireactor mediante un compresor de caudal predeterminado y dotado de un filtro que retiene las partículas sólidas presentes en el aire (1). Cuando la muestra que se inyecta en la unidad de reacción contiene materia orgánica, los microorganismos la metabolizan produciéndose un consumo concomitante de oxígeno disuelto. Los componentes del equipo microbiosensor para la monitorización en continuo de sustancias químicas en fluidos son los siguientes:
Los sistemas fluídicos. Un sistema fluídico interno, que consta de un sistema capaz de impulsar, regular y encauzar los diferentes fluidos hacia la zona de medida, todo ello integrado en un sistema en flujo. Este sistema consta de las siguientes partes: un sistema de impulsión que consta de bombas peristálticas (3, 4, 5, 6, 7) de forma que cada bomba impulsa un fluido diferente, tubos de distribución, que son tubos flexibles por los cuáles circulan los diferentes fluidos, electroválvula de tres vías, que controla el paso de la muestra a la celda de medida, y un dispositivo de aireación que comprende un conjunto de compresores (1) dotados de filtro y que impulsan caudales predeterminados de aire a través de los correspondientes tubos de distribución para la aireación de los microorganismos en suspensión. Un sistema fluídico externo: El circuito hidráulico exterior recomendado para la toma de la muestra contiene dispositivos de filtración (8) para eliminar los sólidos en suspensión que no aportan ningún valor analítico en la determinación y podrían además perjudicar los componentes internos del microbiosensor, especialmente en el caso de aguas residuales.
Estos dispositivos se ubican primero en el punto de recogida de la muestra y en el momento previo a la entrada de la muestra en el equipo microbiosensor. En este último caso, el dispositivo consta de un filtro tangencial (8) en línea de forma que la diferencia de presión generada por diferencia de cota permite obtener un filtrado libre de sólidos en suspensión. Esta corriente de muestra filtrada se deriva hacia la electroválvula que, de acuerdo con el programa de análisis permite el paso de la muestra filtrada, en una cantidad definida por el tiempo programado, hacia la celda de medida(mR)una vez asegurada la renovación del contenido transportado por dicha conducción, para evitar la contaminación entre muestras de ciclos de medida consecutivos.
Termoestabilización. Un sistema de termoestabilización en cascada, que consta de un sistema que permite el mantenimiento simultáneo de la temperatura adecuada para la reacción que se mide y la temperatura adecuada para la conservación de los medios reactivos en tiempo prolongado. El sistema está formado por dos dispositivos. Un dispositivo de termoestabilización frío/calor, que consta de un compartimento termostatizado en el que se alojan los componentes y medios internos del equipo microbiosensor. El sistema mantiene el compartimento a temperatura de refrigeración para el mantenimiento de la estabilidad de los medios reactivos en tiempos prolongados Un dispositivo de termoestabilización de la unidad de reacción, que consta de un compartimento térmicamente protegido y alojado dentro del dispositivo anterior y que contiene la unidad de reacción. Incorpora un termostato ajustable Todos los elementos se encuentran ubicados en una cubeta. Ambos sistemas incorporan sondas que permiten el control visual de la temperatura, dada la importancia de su conocimiento, puesto que la temperatura influye en la concentración de oxígeno disuelto y también en la permeabilidad frente al oxígeno de la membrana del electrodo con que se mide. El sistema microbiológico del equipo microbiosensor consta de microorganismos autoseleccionados, cuya proliferación controlada en continuo se realiza mediante el ajuste adecuado de sus parámetros de crecimiento (pH, r3, dilución, aireación y alimento). Partiendo de distintos estados iniciales de inoculo, el sistema es capaz de mantener la concentración y actividad metabólica de los microorganismos prácticamente constantes, dentro de la unidad de reacción termostatizada. Su metabolismo es sensible a las variaciones de las sustancias químicas que se miden. La unidad de reacción está contenida en el correspondiente dispositivo de termostatización, y consta de los siguientes componentes: Un Reservorio madre (RM) que consta de un depósito que contiene el microorganismo o microorganismos en suspensión y cuya concentración y actividad metabólicas se mantienen prácticamente constantes a través del control de: a/ la realimentación sistemática con un medio de composición predeterminada, ubicado en un reservorio equipado de una lámpara de luz ultravioleta para impedir o controlar el crecimiento microbiano contaminante, y b/ el mantenimiento de los parámetros de crecimiento microbiano (temperatura, pH, dilución, aireación) preestablecidos.
En el interior de reactor madre se introducen estructuras de densidad similar a la del líquido, bien huecas o con poros adecuados que permiten la colonización de las mismas por los microorganismos y sirven de inoculo concentrado para acelerar la recuperación funcional del cultivo continuo aún en ciertos casos de alteraciones del equipo o accidentes funcionales. Además estas estructuras favorecen la disolución del oxígeno en la suspensión de microorganismos porque aimentan el tiempo de contacto en la interfase aire/líquido. En cada ciclo de medida del microbiosensor se trasvasa una alícuota de microorganismos autoseleccionados a la celda de medida(mR).
Un Minireactor (mR), que es el dispositivo físico dónde se adicionan y mezclan los componentes reactivos, tiene lugar dicha reacción y se monitoriza mediante el correspondiente componente transductor. En el minireactor interaccionan los microorganismos con los componentes de las muestras que se quiere determinar a la temperatura y el tiempo determinados por el programa de análisis concreto y especificado por el sistema de control del proceso analítico.
El componente transductor para el caso de la DBO es un electrodo de oxígeno disuelto de tipo Clark (2), capaz de medir la concentración de oxígeno en la mezcla de reacción.
El principio de trabajo del electrodo de oxígeno es que determina la presión parcial de oxígeno en líquidos de acuerdo con el principio de Clark. El procedimiento de medida se caracteriza por la separación entre la muestra y el electrodo por una membrana permeable. La reducción del oxígeno en el electrodo de trabajo resulta de la aplicación de un potencial, mediante la siguiente reacción:
O2 + 2 H2O + 4 e" → 4 OH"
La oxidación del electrodo de referencia es resultado del consumo de electrones.
El montaje del sensor para su puesta en marcha contempla la realización secuencial délos siguientes pasos: fijación y tensionamiento de la membrana, adición de electrolito, ensamblaje de la caperuza sobre el sensor, y puesta en marcha del sensor montado.
El sistema de control del proceso analítico consta de un ordenador (PC)(12) que supervisa continuamente la operación de un autómata programable (PLC)(11) que a través de las interfases correspondientes ejecuta las instrucciones del programa de análisis específico, controlando entre otros parámetros: volúmenes y secuencias de las tomas de componentes del proceso, tiempo de reacción antes de la lectura de resultados, adquisición de la señal de lectura generada por el transductor, autochequeo del sistema, cálculo y presentación de resultados.
El ordenador (PC) implementa un procesado más complejo de las señales de los transductores al tiempo que permite modificar el control ejecutado por el autómata programable en función de las necesidades de medición o de las condiciones de funcionamiento del sistema. La incorporación de módems (15) en el sistema informático capacita el equipo microbiosensor para un control remoto mediante conexión telefónica punto a punto (16), haciendo posible centralizar en un mismo espacio físico la supervisión del funcionamiento de los equipos de campo. Además el equipo dispone de monitor (13) e impresora (14), como periféricos de comunicación con el usuario.
Como ejemplo se describe el software de control y de adquisición de datos del microbiosensor objeto de la presente invención para el caso particular de la DBO. El microbiosensor de DBO se controla a través del software especializado. El equipo del microbiosensor incluye un ordenador PC y un microprocesador (el autómata PLC). Los programas del control implementan las siguientes funciones:
- formación del diagrama de tiempos del ciclo de medida de DBO;
- control de funcionamiento de los dispositivos eléctricos del circuito fluídico;
- adquisición de las señales del sensor (sensores);
- demostración de los datos obtenidos en la pantalla del ordenador; - tratamiento preliminar de los datos;
- almacenamiento de los datos.
El software del microbiosensor incluye dos programas principales y varios programas adicionales (para acceso remoto al equipo, para construir los gráficos etc.). El programa del autómata PLC permite controlar el funcionamiento del equipo independientemente del ordenador PC, mientras que el programa del PC permite recibir, almacenar y analizar los datos de medidas.
El programa del ordenador PC recibe cada 30 segundos los datos de medida desde el autómata PLC y los almacena en un fichero en el disco duro. Al mismo tiempo el programa muestra estos datos en un gráfico y analiza los cambios que se observan durante el ciclo de medida. Este gráfico de oxigeno disuelto (fig. 2) se muestra en una ventana donde el operador puede marcar algunos puntos que le interesan (establecer los márgenes de integración de la señal) y calcular las áreas bajo de los picos que corresponden a las respuestas del microbiosensor a las muestras. El programa del PC dispone también de dos pantallas más: una se llama diagrama de tiempos y la otra diagrama funcional del equipo de medida. El diagrama de tiempos (fig.3) permite observar el funcionamiento del ciclo de medida a través de los gráficos de activación y desactivación de los dispositivos del circuito fluídico. El diagrama funcional (fig.4), es una ventana que ayuda a entender mejor funcionamiento del microbiosensor y permite controlar los dispositivos eléctricos del equipo (las bombas peristálticas y electroválvulas). El hardware del autómata PLC esta diseñado de forma que el intercambio de los mensajes entre el autómata y el ordenador PC puede implementarse sin interrumpir el programa del autómata.
El diagrama funcional (Fig.4) representa la estructura del circuito fluídico del microbiosensor. Incluye el minireactor, el reactor-madre, las bombas peristálticas, circuitos de líquidos, electroválvulas, etc. Este diagrama permite controlar las bombas peristálticas y electroválvulas desde la pantalla del ordenador PC. Cualquier bomba o electroválvula se activa simplemente apuntando el cursor sobre su imagen y pulsando la tecla izquierda del ratón. La imagen de la bomba cambia. Al teclear la imagen de la bomba activada se para. De la misma manera se activa y desactiva la electroválvula. El diagrama del oxígeno disuelto muestra en tiempo real los datos obtenidos durante el ciclo de medida. Estos dato representan las 600 últimas medidas del oxigeno disuelto (tomados con la frecuencia que se desee). Normalmente en este diagrama aparecen los picos de medidas de muestras y los picos de referencia (patrones, Fig.2). El área de los picos representa la demanda biológica de oxigeno (DBO). Cuando aparece un pico nuevo este área se calcula automáticamente y el resultado del cálculo se muestra en la parte inferior de la ventana principal en la barra de información. También es posible calcular el área de cualquier pico del gráfico a través del menú "Área". Usando los comandos "Inicio Registro", 'Tin Registro" y "Línea Base" (Fig.5) marcan los límites de integración del gráfico (apuntando el cursor a los puntos correspondientes al inicio y final de integración, y la línea bajo de la cual se calcula el área: puntos α, b y c en Fig.5). Después, usando el comando "Calcular" calcula el área marcada, y el resultado se muestra en la pantalla (Fig.6). El diagrama de tiempos muestra en qué instante del ciclo analítico se encuentra el equipo. El estado de las bombas peristálticas (Microorganismos, Realimentación, Patrón, Vaciado etc.) se ve como la unidad lógica (la señal alta) si la bomba esta activada, o como el cero, si la bomba esta apagada. El equipo también se puede controlar a través de los menús "Ventanas", "Comandos", "Usuario". Con el menú "Ventanas" el operador elige una las tres ventanas para controlar el equipo (Oxígeno Disuelto, Diagrama de Tiempos o Diagrama de Bloques). Apretando un ítem del menú "Ventanas" la ventana correspondiente sale delante de los otros, y el operador puede usarla. El menú "Usuario" sirve para cambiar el nivel de acceso a los comandos (por ejemplo, un usuario supervisor puede cambiar las propiedades del ciclo de medida, y otro operador no tiene acceso a esta operación). El menú "Comandos" sirve para activar mini-ciclos de funcionamiento del circuito fluídico.
- El comando "Parar el Ciclo" se ejecuta durante un tiempo programado y incluye activación de varias bombas (las de lavado y de vaciado).
- El comando "Recargar el Ciclo" sirve para cambiar los tiempos de funcionamiento del ciclo. - El comando "Microorganismos" activa la bomba de microorganismos y, después, la bomba de realimentación del reactor-madre.
- El comando "Patrón" activa la bomba del patrón durante un tiempo predeterminado.
- El comando "Muestra de Entrada" implementa un ciclo de toma de la muestra de entrada a una depuradora de agua residual. Al principio se activa la bomba externa de la muestra de entrada a la EDAR y, después de un tiempo suficiente para que la muestra de entrada llegue hasta el equipo, se activa la bomba peristáltica interna de entrada y la electroválvula para la inyección de la referida muestra de entrada al minireactor.
- El comando "Muestra de Salida" implementa el ciclo de toma de muestra de salida de una depuradora, que es equivalente al ciclo de toma de muestra de entrada descrito en el punto anterior.
- El comando "Lavado" activa la bomba de lavado del minireactor, y, después de un tiempo predeterminado, se activa la bomba para el vaciado del mismo.
- El comando "Vaciado" simplemente activa la bomba de vaciado durante el tiempo predeterminado Los tiempos del ciclo de medida están definidos dentro del programa del autómata PLC, y para cambiarlos hay que cambiar este programa, o bien enviar los nuevos valores de los tiempos desde el ordenador PC.
El sensor utilizado en este ejemplo, así como el software del protocolo analítico y el diagrama de bloques del microbiosensor, no suponen una limitación a la patente que se describe, existiendo otras combinaciones de sensores, microorganismos,medios de cultivo, parámetros funcionales y diagrama de bloques para distintas aplicaciones del objeto de esta patente.

Claims

REIVINDICACIONES.
Se reivindica como de nueva y propia invención la propiedad y explotación exclusiva de: 1/ "MICROBIOSENSOR PARA LA MONITORIZACIÓN EN CONTINUO DE SUSTANCIAS QUÍMICAS EN FLUIDOS", caracterizado porque los microorganismos utilizados se obtienen mediante crecimiento continuo en un quimiostato automatizado. 2/ " MICROBIOSENSOR PARA LA MONITORIZACIÓN EN CONTINUO DE SUSTANCIAS QUÍMICAS EN FLUIDOS", según reivindicación 1 caracterizado por disponer de un mini-reactor de constantes controladas al que se transfieren automáticamente siguiendo el protocolo analítico, alícuotas tanto de los microorganismos sensores obtenidos en el quimiostato como de patrones, muestras problemas a analizar y medios líquidos necesarios para optimizar el proceso analítico y cuyo contenido es deshechado en cada ciclo analítico. 3/ "MICROBIOSENSOR PARA LA MONITORIZACIÓN EN CONTÍNUO DE SUSTANCIAS QUÍMICAS EN FLUIDOS", según reivindicaciones 1 y 2, caracterizado por utilizar microorganismos cuyo metabolismo se modifica proporcionalmente a la concentración de sustancias químicas de interés presentes en la muestra líquida a analizar. 4/ "MICROBIOSENSOR PARA LA MONITORIZACIÓN EN CONTÍNUO DE SUSTANCIAS QUÍMICAS EN FLUIDOS",según reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por disponer en el mini-reactor de medida o en la conducción de líquidos posterior al mismo, de sensores específicos de la señal físico-química generada en el metabolismo microbiano por las sustancias químicas de interés presentes en la muestra. 5/ "MICROBIOSENSOR PARA LA MONITORIZACIÓN EN CONTÍNUO DE SUSTANCIAS QUÍMICAS EN FLUIDOS", según reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por permitir la determinación de la Demanda Bioquímica de Oxígeno (DBO), mediante un electrodo de oxígeno disuelto dispuesto en el mini-reactor . 6/ "MICROBIOSENSOR PARA LA MONITORIZACIÓN EN CONTÍNUO DE SUSTANCIAS QUÍMICAS EN FLUIDOS", según reivindiccaciones 1 a 5, caracterizado por disponer de un luminómetro para monitorizar la radiación electromagnética producida por la luciferasa del microorganismo utilizado, en respuesta a las sustancia química específica de interés presente en la muestra analizada . II "MICROBIOSENSOR PARA LA MONITORIZACIÓN EN CONTÍNUO DE SUSTANCIAS QUÍMICAS EN FLUIDOS", según reivindiccaciones 1 a 6 caracterizado por disponer de un sistema automatizado de limpieza entre ciclos analíticos sucesivos, mediante proyección de un chorro de líquido de lavado que permite mantener el sensor , la la celda de reacción, y los circuitos de líquidos en condiciones óptimas. 8/ "MICROBIOSENSOR PARA LA MONITORIZACIÓN EN CONTÍNUO DE SUSTANCIAS QUÍMICAS EN FLUIDOS", según reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por disponer en la celda de reacción sensores para la determinación de parámetros analíticos en cada determinación como pH y conductividad complementarios al sensor específico de la señal físico-química producida por la presencia de las sustancias químicas de interés. 9/ "MICROBIOSENSOR PARA LA MONITORIZACIÓN EN CONTÍNUO DE SUSTANCIAS QUÍMICAS EN FLUIDOS" según reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por disponer de un software de integración y tratamiento de las señales generadas por los distintos sensores del equipo que permite monitorizar en continuo los parámetros correspondientes. 10/ "MICROBIOSENSOR PARA LA MONITORIZACIÓN EN CONTÍNUO DE SUSTANCIAS QUÍMICAS EN FLUIDOS" según reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por disponer de un software y microprocesador para el control automatizado de los elementos que integran el equipo, que permite seleccionar los parámetros correspondientes a distintos protocolos analíticos a través de pantallas de diagrama de tiempos del proceso, diagrama de bloques del equipo y pantalla de registro gráfico de las señales registradas.
11/ "MICROBIOSENSOR PARA LA MONITORIZ ACIÓN EN CONTÍNUO DE SUSTANCIAS QUÍMICAS EN FLUIDOS" según reivindicaciones 1 a 10, caracterizado por disponer de un software y modem para la transmisión vía telefónica de los datos analíticos del equipo y para el control desde un ordenador remoto de los parámetros y protocolo analítico del equipo. 12/ "MICROBIOSENSOR PARA LA MONITORIZACIÓN EN CONTÍNUO DE SUSTANCIAS QUÍMICAS EN FLUIDOS" según reivindicaciones 1 a 11, caracterizado por disponer de un software ajustable a distintos protocolos analíticos que el usuario diseñe para aplicaciones específicas. 13/ "MICROBIOSENSOR PARA LA MONITORIZ ACIÓN EN CONTÍNUO DE SUSTANCIAS QUÍMICAS EN FLUIDOS" según reivindicaciones 1 a 12, caracterizado por disponer de dispositivos de termostatización independientes que permite el mantenimiento de temperaturas preestablecidas en los compartimentos del sistema que lo requieren, haciendo posible el funcionamiento del equipo aún en condiciones extremas de temperatura en el entorno del equipo.
14/ "MICROBIOSENSOR PARA LA MONITORIZ ACIÓN EN CONTÍNUO DE SUSTANCIAS QUÍMICAS EN FLUIDOS" según la reivindicaciones 1 a 13, caracterizado por disponer para la alimentación de los microorganismos de un medio liquido de cultivo específico para cada tipo de microorganismo usado y un sistema de dispensación de ese medio automatizado y programado que permite mantener el crecimiento continuo y actividad metabólica de los microorganismos utilizados. 15/ "MICROBIOSENSOR PARA LA MONITORIZACIÓN EN CONTÍNUO DE SUSTANCIAS QUÍMICAS EN FLUIDOS" según la reivindicaciones 1 a 14, caracterizado por disponer de un filtro tangencial en el circuito de toma de muestras problema, que permite tomar muestras filtradas eliminando los componentes sólidos en suspensión de tamaño superior al poro de la malla del filtro tangencial. 16/ "MICROBIOSENSOR PARA LA MONITORIZ ACIÓN EN CONTÍNUO DE SUSTANCIAS QUÍMICAS EN FLUIDOS" según la reivindicaciones 1 a 15, caracterizado por disponer de un sistema de esterilización mediante lámpara ultravioleta que impide el crecimiento microbiano en los medios de cultivo liquido de los microorganismos y en los líquidos de lavado.
17/ "MICROBIOSENSOR PARA LA MONITORIZACIÓN EN CONTÍNUO DE SUSTANCIAS QUÍMICAS EN FLUIDOS" según reivindicaciones 1 a 16, caracterizado por disponer del mecanismo automatizado para inyectar y analizar en cada ciclo volúmenes prestablecidos de muestras patrones, de composición específica ,que permiten el autocalibrado del sistema la detección de efectos tóxicos y el estudio detallado de las respuestas analíticas incluso mediante tratamiento por redes neuronales de la información obtenida
18/ "MICROBIOSENSOR PARA LA MONITORIZACIÓN EN CONTINUO DE SUSTANCIAS QUÍMICAS EN FLUIDOS" según reivindicación 1 a 17, caracterizado por disponer de un sistema automatizado para el crecimiento continuo del microorganismo o microorganismos a utilizar, dispuestos en sus correspondientes bioreactores que permite obtener, para utilizar en cada determinación , alícuotas independientes del microorganismo seleccionado a concentración y actividad metabólica prácticamente constantes.
19/ "MICROBIOSENSOR PARA LA MONITORIZ ACIÓN EN CONTÍNUO DE SUSTANCIAS QUÍMICAS EN FLUIDOS" según reivindicaciones 1 a 18, caracterizado por disponer de mecanismos automatizados que permiten la reactivación metabólica y la obtención de alícuotas de microorganismos seleccionados , con especificaciones predifinidas y reproducibles , partiendo de inoculos de microorganismos liofilizados o conservados a bajas temperaturas 20/ "MICROBIOSENSOR PARA LA MONITORIZACIÓN EN CONTÍNUO DE SUSTANCIAS QUÍMICAS EN FLUIDOS" según reivindicaciones 1 a 19, caracterizado por disponer en los reactores de crecimiento en continuo de microorganismos, de elementos solidos en suspensión cuyas estructuras huecas o porosas crean microentornos idóneos para la colonización de los microorganismos de trabajo.
21/ "MICROBIOSENSOR PARA LA MONITORIZ ACIÓN EN CONTÍNUO DE SUSTANCIAS QUÍMICAS EN FLUIDOS" según reivindicaciones 1 a 20, caracterizado por disponer de macro y minireactores microbiológicos cuyas superficies interiores se ajustan a la circulación de líquido interior, creada por la aireación o por el flujo forzado de forma que se eliminen las zonas en las que el líquido pudiera retenerse o circular a velocidad reducida.
PCT/ES1998/000127 1997-05-19 1998-05-07 Microbiosensor para la monitorizacion en continuo de sustancias quimicas en fluidos WO1998053090A1 (es)

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DE69838673T DE69838673T2 (de) 1997-05-19 1998-05-07 Mikrobiosensor zum kontinuierlichen nachweis von chemischen substanzen in flüssigkeiten
EP98917133A EP0989188B1 (en) 1997-05-19 1998-05-07 Microbiosensor for the continuous monitoring of chemical substances in fluids
AU70445/98A AU7044598A (en) 1997-05-19 1998-05-07 Microbiosensor for the continuous monitoring of chemical substances in fluid
DK98917133T DK0989188T3 (da) 1997-05-19 1998-05-07 Microbiosensor til vedvarende overvågning af tilstedeværelse af kemiske materialer i væsker
US09/449,852 US20020137093A1 (en) 1997-05-19 1999-11-26 Method for continuous monitoring of chemical substances in fluids

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PT (1) PT989188E (es)
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101087858B1 (ko) 2009-05-11 2011-11-30 주식회사 엔바이져코리아 발광 미생물을 이용한 수계 독성 자동 원격 모니터링 방법 및 장치

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060019331A1 (en) * 2004-07-20 2006-01-26 Gideon Eden Method and system for generating a telephone alert indicating the presence of an analyte
ES2281285B1 (es) * 2006-02-23 2008-08-16 Fusinco, S.L. Sistema analizador automatico, en tiempo real, de la concentracion de microorganismos vivos en liquidos.
ES2315122B1 (es) * 2006-09-16 2009-12-30 Universitat Autonoma De Barcelona Sensor perfeccionado para la medida de la toxicidad del agua.
DE102007016629A1 (de) * 2007-04-05 2008-10-09 Micronas Gmbh Sensor zur Erfassung eines toxischen oder gefährlichen Gasgemisches und Betriebsverfahren
US20100138066A1 (en) * 2008-11-14 2010-06-03 Thinkeco Power Inc. System and method of democratizing power to create a meta-exchange
CN102109512A (zh) * 2011-01-29 2011-06-29 佛山分析仪有限公司 一种检测水质毒性的装置及方法
CN104820082A (zh) * 2015-05-21 2015-08-05 中国神华能源股份有限公司 废水毒性检测系统及废水毒性检测方法
CN111896699A (zh) * 2020-07-01 2020-11-06 武汉新烽光电股份有限公司 一种基于复合菌种投放的bod在线监测装置及方法
CN111899818A (zh) * 2020-07-28 2020-11-06 王艳捷 一种智慧型污水生物处理活性污泥监测技术及方法
WO2022076500A1 (en) 2020-10-08 2022-04-14 Ecolab Usa Inc. System and technique for detecting cleaning chemical usage to control cleaning efficacy

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2163612A1 (de) * 1971-12-21 1973-06-28 Passavant Werke Verfahren und vorrichtung zum messen und/oder ueberwachen des gehaltes an biologisch abbaubarer organischer materie in einer probenfluessigkeit
DE3714612A1 (de) * 1987-04-16 1988-10-27 Bayer Ag Mikroorganismus-stamm und seine verwendung
DE3818906A1 (de) * 1988-06-03 1989-12-14 Siepmann Friedrich W Verfahren und vorrichtung zur toxizitaetsmessung von waessrigen loesungen, insbesondere abwasser
EP0531955A2 (de) * 1991-09-13 1993-03-17 Forschungszentrum Jülich Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung der Nitrifikationsaktivität in einem Abwasserstrom oder -becken und deren Anwendung
DE4332163A1 (de) * 1993-09-22 1995-03-23 Kolibri Umweltanalytik Und On Verfahren und Gerät zur Schadstoffanalyse von Gewässerproben
DE4332165A1 (de) * 1993-09-22 1995-03-23 Kolibri Umweltanalytik Und On Verfahren und Gerät zur Schadstoffanalyse von Gewässerproben
DE29513115U1 (de) * 1995-08-16 1996-04-18 Transferzentrum Mikroelektronik E.V., 99099 Erfurt Online Biosensor
DE29607093U1 (de) * 1996-04-19 1996-07-18 Ingenieurgemeinschaft agwa GmbH, 30161 Hannover Adaptiv, wassergüteabhängig gesteuertes Abwasserbauwerk
DE19547655A1 (de) * 1995-12-20 1997-06-26 Abb Research Ltd Vorrichtung und Verfahren zur Überprüfung von Flüssigkeiten

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2163612A1 (de) * 1971-12-21 1973-06-28 Passavant Werke Verfahren und vorrichtung zum messen und/oder ueberwachen des gehaltes an biologisch abbaubarer organischer materie in einer probenfluessigkeit
DE3714612A1 (de) * 1987-04-16 1988-10-27 Bayer Ag Mikroorganismus-stamm und seine verwendung
DE3818906A1 (de) * 1988-06-03 1989-12-14 Siepmann Friedrich W Verfahren und vorrichtung zur toxizitaetsmessung von waessrigen loesungen, insbesondere abwasser
EP0531955A2 (de) * 1991-09-13 1993-03-17 Forschungszentrum Jülich Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung der Nitrifikationsaktivität in einem Abwasserstrom oder -becken und deren Anwendung
DE4332163A1 (de) * 1993-09-22 1995-03-23 Kolibri Umweltanalytik Und On Verfahren und Gerät zur Schadstoffanalyse von Gewässerproben
DE4332165A1 (de) * 1993-09-22 1995-03-23 Kolibri Umweltanalytik Und On Verfahren und Gerät zur Schadstoffanalyse von Gewässerproben
DE29513115U1 (de) * 1995-08-16 1996-04-18 Transferzentrum Mikroelektronik E.V., 99099 Erfurt Online Biosensor
DE19547655A1 (de) * 1995-12-20 1997-06-26 Abb Research Ltd Vorrichtung und Verfahren zur Überprüfung von Flüssigkeiten
DE29607093U1 (de) * 1996-04-19 1996-07-18 Ingenieurgemeinschaft agwa GmbH, 30161 Hannover Adaptiv, wassergüteabhängig gesteuertes Abwasserbauwerk

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101087858B1 (ko) 2009-05-11 2011-11-30 주식회사 엔바이져코리아 발광 미생물을 이용한 수계 독성 자동 원격 모니터링 방법 및 장치

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