PT989188E - Micro biosensor para a monitorização contínua de substâncias químicas em fluídos - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

MICRO BIOSENSOR PARA A MONITORIZAÇÃO CONTÍNUA DE SUBSTÂNCIAS QUÍMICAS EM FLUÍDOS Área Tecnológica desta patente.

Análises químicas e bioquímicas. Análise do meio ambiente.

Sistema para FIA (analise de injecção corrente) com corrente não contínua.

Sistema para análise automática com auto-calibração. Aplicação em muitas áreas; meio ambiente, reactores microbiológicos, fermentos, biologia, alimentação agrícola e industrias relacionadas com estas áreas mencionadas.

Estado da arte

Durante as ultimas duas décadas houve um crescente desenvolvimento no que respeita à tecnologia de bio- sensores como um resultado da integração multidisciplinar entre as áreas de enzimologia, imunologia e microbiologia e as de sensores e transdutores de sinal. Isto permitiu o desenvolvimento do biosensor com aplicações especificas (industrial, bio-medicinal ou ambiental, por mencionar algumas) que podem, agora, completar com as clássicas tecnologias analíticas. Se os bio-sensores enzimáticos tivessem uma aplicação especial nos casos de identificação repetitiva de uma molécula/substrato, para a qual a correspondente enzima se possa encontrar, e se o uso de bio-sensores imunes permitisse, num futuro próximo, a identificação especifica de qualquer molécula simples ou composta obtendo os seus respectivos anticorpos, então os 1 micro bio-sensores poderiam ter muitas aplicações variando desde a monitorização ambiental ao controlo dos bio-reactores.

Mais recentemente, os avanços no campo da modificação genética de microrganismos estão agora a dar aos pesquisadores os elementos necessários para desenhar micro bio-sensores capazes de, não só, detectar e quantificar componentes específicos, mas também de amplificar os sinais gerados na detecção, fazendo uso da biologia molecular dos microrganismos modificados.

Entre essas configurações mais estudadas até a data para o desenho de micro bio-sensores temos que ver os que têm membranas micróbias nestes microrganismos tecnológicos, especificamente ou não, estão no interior de uma membrana e estão em contacto com os transdutores de sinal do micro biosensor. A presença de substâncias que podiam afectar o metabolismo do micróbio, produz uma alteração físico-química na membrana contendo os micróbios que é detectado pelo censor e que, se o sinal é manejado adequadamente, então as substâncias de interesse podem ser medidas. Esta tecnologia permitiu o aparecimento, no mercado de equipamentos comerciais com especificações novas e interessantes sobretudo no que respeita à área ambiental (micro bio-sensores - BOD como os do Doutor Lange, Medingen ou LKG entre outros). No entanto estes aparelhos que estão baseados na retenção de microrganismos nas membranas possuem limitações intrínsecas provenientes da ideia e do desenho.

Para começar, os microrganismos que estão fixos à estrutura da membrana têm pouca ou quase nenhuma capacidade para crescer e correm perigo na presença de certas toxinas ou 2 factores de esterilização que podem fazer a membrana inutilizável. Também o tamanho e as características físico-químicas da membrana podem limitar a difusão de analíticos através dela e podem reduzir a margem de concentração dos analíticos pelos quais o aparelho é capaz de gerar respostas lineares (E. Praet, v. Reuter, T. Gaillard, J.-L Vasel. "Bio-reactores e bio-membranas para o oxigénio bioquímico pedem estimativa" Tendências na Química analítica, vol. 14, n07, 1995).

Outra grande área de micro bio-sensores baseia o desenho funcional na utilização de um reactor microbial mantido em óptimas condições para a actividade microbial, dentro da qual é acrescentada a amostra liquida, para ser monitorizada, directamente dentro do reactor, registando o sinal produzido pelo transdutor. Em algumas das variantes deste tipo de micro biosensor pode-se ajustar o volume, diluição ou a corrente de injecção da amostra através de sistemas automáticos de feedback do sinal geradas de forma a que um valor predeterminado é mantido. Bons exemplos destes micro bio-sensores são os respirómetros como Rodtox (P.A. Vanrolleghem, et al. "Um Biosensor Respirográfico em directo para a Caracterização de Carga e Toxicidade de Águas de esgoto", J. Chem. Tech. Biotecnol. 1994, 59,321-333) e Estipulado. Estes tipos de micro bio-sensores estão a ser usados neste momento com aplicações especificas (sobretudo BOD e toxicidade) com resultados satisfatórios mas o seu desenho tem limitações funcionais em muitas aplicações de interesse, isto é devido à alteração geral nos parâmetros do reactor microbiológico (concentração de micróbios, alteração funcional nos microrganismos, etc.) ao introduzir a amostra a ser analisada dentro do reactor, mostrando que em ocasioes podem existir concentrações consideráveis de produtos químicos tóxicos capazes de 3 alterar, por longos períodos de tempo, a resposta geral dos sensores do microorganismo. Consequentemente é difícil manter uma linha base de respostas fixas fazendo com que seja impossível analisar amostras de grande toxicidade ou, se se arrisca a analisar estas amostras, reversivelmente ou irreversivelmente se pode danificar o micro biosensor.

[0007] A invenção que vamos descrever agora alterou o conceito e o desenho dos micro bio-sensores fazendo com que seja possível superar um grande número de limitações que tinham antes. Entre as inovações que tem e as vantagens que possui sobre a tecnologia actual de membranas microbiais, resumindo, são as seguintes: a) disponibilidade continua de microrganismos durante a utilização de um reactor micro biológico com parâmetros de crescimento controlado o que permite a monitorização de amostras de grande toxicidade descartando os microrganismos usados no mini reactor ou unidade de reacção depois de cada medição. b) a unidade de reacção ou mini reactor para a análise é um compartimento independente do reactor mãe no qual existe o cultivo continuo de microrganismos, no mini reactor as amostras para análise são injectadas sem interferir com a acção de cultivo contínuo de células. c) elimina a membrana que separa fisicamente o meio a ser analisado e o transdutor, embora permitindo a amplificação do raio do sinal e reduzindo drasticamente o tempo necessário para alcançar um sinal fixo. d) A introdução da amostra de referencia antes e depois da injecção da amostra-problema dentro da unidade de reacção faz com que seja possível auto-calibrar sistematicamente o aparelho e obter uma linha base de referencia estável. 4 e) Descartando os conteúdos do mini reactor que monitoriza a amostra depois de cada ciclo faz com que seja possivel injectar dentro dele um valor alto de: (volume de amostra-problema) 1 (volume total) que permite a detecção de determinados componentes químicos em pequenas concentrações na amostra-problema ou com pouca capacidade para gerar um sinal no transdutor. Há que salientar que a invenção descrito não se refere a requerer um certo tipo de microorganismo. A tecnologia do invenção corresponde a um micro biosensor está feito de mecanismos automáticos, reactores, e transdutores de mini reactores, PLC's, PC, sistemas de termostato etc. o que faz com que seja possivel o seu uso em diversas aplicações, usando microrganismos específicos em cada caso, e não só os que estão disponíveis no momento mas também os que se podiam obter no futuro. Em qualquer das possíveis aplicações desta patente, as vantagens descritas no parágrafo anterior vão ser obtidas total ou parcialmente em comparação com a tecnologia usada hoje.

Descrição da invenção A tecnologia e as inovações que surgem desta patente, podem ser aplicadas a diversos tipos de micro bio-sensores, como nas culturas usadas, puras ou misturadas, ou como monitorizarão os analistas, em moléculas específicas ou em substratos específicos, ou por o sinal físico-químico gerado e o transdutor usado para quantificar. Como exemplos para explicar o vasto uso das referencias da tecnologia desenvolvida será feito a todas as tensões microbiais puras, natural ou geneticamente modificadas, que permitam a monitorização de moléculas específicas usando, por exemplo transdutores de sinal optoelectronico e b 1 culturas 5 microbiais mistas capazes de metabolizar ou alterar o seu metabolismo quando expostas a uma grande variedade de espécies moleculares (analitos) presentes na amostra-problema (exemplo - BOD). a/ Como referencia a esta aplicação está uma curta descrição do uso de microrganismos geneticamente modificados dentro dos quais inserimos uma determinada sequência genética através da tecnologia recombinante de DNA. Esta sequência está feita dos genes chamados LUX que codificam a síntese da enzima luciferase, que catalisa a reacção de oxidação associada com a emissão de um fóton de luz com o comprimento de onda de 490 nm. Esta enzima vem de um organismo procariotico (Philip j. Hill, Stephen P. Denyer." Testes Rápidos baseados em luminescência ao vivo" Microbiologia Europa, 16, May/June 1993), (Robert S. Burlage." Bio-sensores Vivos para a Gestão e Manipulação de Consórcios Microbiais" Revisão Anual Microbiol., 48. 81 -1 04).

Associado ao mesmo promotor (região do genoma onde ocorre a transcrição de um gene) estão inseridos os genes que codificam para a rota metabólica de interesse. Quando o metabolito especifico a ser medido (tóxico) está presente no meio, o promotor desta sequência genética é activado e transcreve ambos os genes que codificam para luciferase e os que codificam para as enzimas que catalisam a degradação do dito metabolito (Jorma Lampinen, Marko Virta. "Uso da Expressão Controlada Luciferase Para Monitorizar Químicos que Afectam a Síntese de Proteínas." Micro-biologia Aplicada e Ambiental, Ago. 1995, p. 2981 -2989).

[0011] As moléculas-analitos podem ser componentes orgânicos que são considerados tóxicos para o ambiente, como componentes de organocloro. A bactéria metaboliza 6 estas toxinas, emitindo luz durante o processo, que pode ser detectada e quantificada, relativamente à toxina presente no meio (S. Burlage, A. Palumbo." Relatório da Bactéria Bio-luminescente Detecta Contaminantes nas Amostras do Solo" Bioquímica Aplicada e Biotecnologia, vol.45/46). As mais inováveis tensões bacterianas incorporam um controlo constitutivo que consiste na inserção de um gene codificando para a síntese de uma luciferase eucariótica dentro do cromossoma bacterial, a expressão pela qual é constitutivo. E é possível detectar a continua emissão de luz a 560 nm como um indicador do bom estado metabólico da bio-massa e adicionalmente uma luz a 490 nm quando uma toxina específica está presente no meio ( Angel Cebolla, F. Ruiz-Berraquero." Marcação Estável de Rhizabium meliloti com o Gene Pirilampo Luciferase para Monitorização Ambiental" Micro-biologia Aplicada e Ambiental, Ago. 1993,p.2511-2519) (Wood Kv. Gruber MG." Transdutor em Bio-sensores Microbiais Usando a Bio-luminescencia Multiplexada. "Bio-sensores e Bio-electrónicas 11(3):207- 214,1996), (Gu MB. Dhurjati PS." Um Bio-reactor em Miniatura para Sentir Toxicidade usando Células Escherichia coli recombinantes e Bio-luminescentes". Progresso Bio-tecnológico. 12(3):393-397,1996); b 1 Aprofundando na função e o aspecto tecnológico de esta patente um exemplo detalhado da aplicação desta patente para monitorizar on-line a Demanda do Oxigénio Bioquímico (BOD).

Um exemplo prático da aplicação do invenção na monitorização on-line da Demanda do Oxigénio Bioquímico (BOD)

Um sistema de micro biosensor é apresentado para a monitorização on-line de substâncias químicas em fluidos. O 7 uso do sistema na determinação da Demanda do Oxigénio Bioquímico será descrito como um caso particular e o exemplo de uma aplicação da invenção apresentado. A medida da Demanda do Oxigénio Bioquímico (BOD) é fundamental no controlo da função do WWTP (Planta de Tratamento de Águas Residuais) e para a monitorização e observação de ecossistemas. É um parâmetro analítico que mede o oxigénio usado pelos microrganismos para a degradação bioquímica de material orgânico contido numa amostra durante um período de incubação específico a determinada temperatura. Esta informação permite o ajuste das necessidades do oxigénio do reactor biológico o que é vital para a função do WWTP.

Os meios tradicionais de medição do BOD requerem um tempo de incubação de 5 dias no laboratório, o que quer dizer que o resultado obtido não reflectiu a poluição da água que precisava de ser tratada nesse momento no WWTP.

Como uma consequência estes sistemas analíticos não têm demasiada utilidade nestes processos de controlo operativo que requerem quantificação de amostras em períodos de tempo mais curtos. É também uma análise com um numero considerável de fontes de variação nos resultados. 0 equipamento do micro biosensor BOD, como um exemplo da aplicação do invenção, está baseado em tecnologias originais e avançadas comparadas com outros aparelhos com o mesmo propósito que estão agora no mercado, e faz com que seja possível obter uma leitura do BOD em amostras liquidas de composição diversa em apenas 15 minutos. É então possível: a/ obter informação actualizada sobre a actuação de um WWTP ou do volume liquido analisado. 8 b/ se necessário medir instantânea e correctamente, sendo possível aceder num curto período de tempo ao efeito produzido pelas medições aplicadas.

c/ poupar a energia usada para a aeração, um dos processos custosos do WWTP d/ centrar a monitorização de um ou vários WWTP por meio da captura remota de dados. e/ identificar e analisar a presença de determinadas toxinas nas amostras líquidas analisadas, f/ determinar o BOD incluso nas amostras liquidas com níveis elevados de toxinas. g/ auto-calibrar cada ciclo, medindo a resposta analítica do aparelho usando como referencia amostras internas, h/ monitorizar o BOD de sistemas abertos numa grande variedade de temperaturas ambientais.

Nas seguintes notas a função e os componentes do aparelho de micro biosensor para a monitorização de substâncias químicas em fluidos será examinado, no caso específico da determinação on-line do BOD na água. A configuração do micro biosensor para a monitorização contínua de substâncias químicas em fluidos será agora descrita. 0 micro biosensor está feito de um sistema integrado e inclui a/ unidades para o crescimento contínuo de microrganismos. b/ unidades de reacção microbiológica. c/ componente de transdutor (sensor de oxigénio dissolvido no caso do BOD) 9 d/ um circuito hidráulico programado para o tratamento de líquidos. e/ micro processador para o controlo do processo analítico e a aquisição do sinal. f/ dispositivos de PC para o tratamento de dados e comunicação com PLC (micro processador) . g/ dispositivos de termo-estabilização integrada. 0 micro biosensor deveria ser capaz de usar o aparelho. Este sistema está composto de bombas peristálticas para manejar as amostras a ser analisadas, dos pontos específicos no WWTP até dentro do aparelho e um filtro tangencial que elimina as suspensões sólidas que podiam interferir com a medição do BOD. A figura 1 mostra a apresentação do micro biosensor. As primeiras fases do funcionamento do micro biosensor para a monitorização contínua de substâncias químicas em fluidos estão dispostas da seguinte maneira:

Na unidade de reacção está situado o componente transdutor. Neste caso um pequeno e dissolvido sensor de oxigénio que mede a redução do oxigénio dissolvido devido à metabolização de material orgânico na amostra.

Em cada ciclo quantidades predeterminadas das seguintes substancias são acrescentadas: a/ a correspondente parte alíquota da suspensão de micro organismos de quantidade predeterminada é transferida em cada ciclo para dentro do mini reactor desde o reservatório principal (RH). b/ a substancia da amostra de referencia, cujo valor correspondente da variável analítica é medido o que 10 permite o teste do sistema de medição. Em cada ciclo tem lugar uma auto calibração do micro biosensor através de uma adição automática duma quantidade predeterminada da amostra der referência (P) antes e depois da adição das amostras a ser analisadas. De esta forma em cada ciclo o efeito tóxico que a amostra analisada poderia ter nos microrganismos usados na medição podem ser determinados através da comparação entre os sinais correspondentes das amostras de referencia antes e depois da adição das amostras-problema dentro da célula de reacção. c/ As amostras de água a ser analisadas que são previamente dirigidas por bombas peristálticas até o equipamento micro biosensor dentro de um tempo determinado que permite que o volume-morto nos tubos de condução sejam referidos, desde o lugar da toma da amostra até o do micro biosensor BOD, assegurando que as amostras a ser analisadas são frescas. 0 liquido para a lavagem consiste numa solução de limpeza no reservatório correspondente dentro do aparelho micro biosensor e acalma a lavagem do mini reactor e as superfícies activas dos transdutores depois de cada ciclo uma vez que o ciclo tenha terminado. 0 passo de lavagem começa com o esvaziar dos conteúdos do mini reactor seguido da adição da solução de limpeza, e uma vez cheio a solução é mantida na célula e regada fazendo bolhas por um tempo determinado, isto é finalmente seguido por o esvaziar da célula. A adição automática do liquido de limpeza ocorre por meio de um jacto de liquido sobre as superfícies activas do componente transdutor, o que aumenta o período de tempo que o micro biosensor, ainda com a mesma capacidade de resposta nas mesmas condições, pode permanecer autónomo e de essa maneira reduz drasticamente 11 as necessidades de manutenção e manipulação através da intervenção humana. 0 oxigénio necessário para a reacção é fornecido continuamente ao mini reactor através de um revestimento de ar pré-ajustado e ajustado com um montador que captura as partículas sólidas presentes no ar (1) . Quando a amostra que é injectada dentro da unidade de reacção contém material orgânico, os microrganismos o metabolizam, produzindo um consumo anexado de oxigénio dissolvido.

Os componentes do aparelho micro biosensor para a contínua monitorização de substâncias químicas em fluidos são as seguintes: os sistemas de fluido: Um sistema interno de fluido, que consiste num sistema capaz de conduzir, regular e canalizar os diferentes fluidos até o micro reactor, que all se integram num sistema de corrente. Este sistema consiste nas seguintes partes: um sistema condutor de conservação está feito de bombas peristálticas (3,4,5,6,7) com cada bomba dirigindo um fluido diferente, os tubos de distribuição são flexíveis; através dos quais circulam os diferentes fluidos, uma válvula eléctrica de 3 caminhos que controla a passagem da amostra dentro da célula e uma dence de aeração feita de compressores e facilitando os tubos de distribuição correspondentes de forma a arejar os microrganismos em suspensão: Um sistema externo de fluidos: Um circuito hidráulico externo usado para a toma da amostra possui dence (8) de filtração para a eliminação de sólidos em suspensão que não têm valor analítico ou que também poderiam danificar os componentes internos dos micro bio-sensores, especialmente no caso de descargas.

Estes dences estão situados primeiramente no ponto de colecção da amostra e até determinado ponto, justo antes da 12 entrada da amostra dentro do aparelho micro biosensor. Neste ultimo caso, o dispositivo está feito de um filtro tangencial on line (8) de forma a que as diferenças em pressão geradas ao longo do filtro permitem a produção de um filtro livre de sólidos em suspensão. Esta corrente de amostras filtradas é dirigida à válvula eléctrica, a qual em acordo com o protocolo analítico permite a entrada da amostra filtrada, numa quantidade definida pelo protocolo, dentro do mini reactor tendo já assegurado a remoção do volume-morto das amostras prévias de maneira a evitar a contaminação entre amostras de ciclos consecutivos.

Termo-estabilidade. Os sistemas de termo estabilidade que permitem a manutenção simultânea de uma temperatura adequada para o crescimento microbial (fixada entre 25 e 50°C) e uma temperatura adequada (2- 8°C) para a conservação da média de reacção durante um longo período de tempo. 0 sistema está feito de dois dences.

Uma termo-estabilização quente/fria do dence, que consiste de um compartimento com um termostato o qual contém os componentes e o meio liquido do equipamento do micro biosensor. 0 sistema mantém o compartimento a uma temperatura refrigerada para a manutenção de um meio reactivo estável durante longos períodos de tempo.

Uma termo-estabilização do dence, da unidade de reacção, consistindo em um compartimento termicamente protegido situado com o dispositivo ajustável de termo-estabilização quente/frio um termostato é incorporado. Ambos sistemas têm sensores que permitem o controlo visual da temperatura, dada a sua importância, uma vez que a temperatura influencia a concentração de oxigénio dissolvido e também a 13 permeabilidade do oxigénio da membrana do eléctrodo com a qual a quantidade de oxigénio é medida. 0 sistema micro-biológico do aparelho micro biosensor consiste está a ser continuamente controlado através do ajustamento dos seus parâmetros de crescimento (PH, temperatura, diluição, aeração e alimentação) . Independentemente do sistema de começo inócuo é capaz de manter a concentração e actividade metabólica dos microrganismos praticamente constante dentro da reacção de unidade controlada por termostato. 0 seu metabolismo é sensível às mudanças em substâncias químicas. A unidade de reacção está contida dentro correspondente dispositivo controlado termostaticamente e está constituída pelos seguintes componentes:

Um reservatório principal (RH) está constituído de um tanque que contém os microrganismos em suspensão e cuja concentração e actividades metabólicas são mantidas praticamente constantes através do controlo de: a/ a re-alimentação sistemática com um meio de alimentação predeterminado, situada num reservatório equipado com uma lâmpada ultravioleta a qual pára ou controla o crescimento de contaminantes microbiais 1B11111111|||É manutenção dos parâmetros preestabelecidos do crescimento microbial (temperatura, PH, diluição, aeração)

Estruturas de densidade semelhante à do meio líquido, vazias ou com poros suficientemente grandes que permitam a sua colonização pelos microrganismos são introduzidas no interior reactor principal e servem como um concentrado inócuo para acelerar a recuperação funcional das culturas continuadas. Nos casos de alterações dos aparelhos ou 14 acidentes no funcionamento para além disso estas estruturas favorecem a dissolução do oxigénio na suspensão de microrganismos porque aumentam o tempo de contacto entre ar/liquido. Em cada ciclo do micro biosensor uma parte aliquota de microrganismos é passada para dentro da célula de reacção (MR). 0 mini reactor (MR) é o dence onde os componentes da reacção são adicionados e misturados, onde ocorre a reacção e onde é monitorizada utilizando o correspondente componente do transdutor. No mini reactor interagem os microrganismos com os componentes da amostra que vão ser analisados, o tempo e a temperatura são determinados pelas análises protocolares especificas e estão especificados pelo sistema de controlo do processo analítico. 0 componente transdutor no caso do BOD é do tipo Clark (2) eléctrodo de oxigénio dissolvido, capaz de medir a concentração de oxigénio na mistura reactiva. 0 principal trabalho do eléctrodo de oxigénio é determinar a pressão parcial de oxigénio em líquidos de acordo com os princípios de Clark. 0 processo de medição está baseado na separação da amostra e o eléctrodo por uma membrana permeável. A redução de oxigénio no eléctrodo que está a ser trabalhado é produzida através da seguinte reacção 02 + 2 H20 + 4e -»40H' A oxidação do eléctrodo de referência resulta do consumo de electrões.

Os passos a dar entre o ajustar do sensor e o pô-lo a funcionar são mostrados aqui: a fixação local e o 15 estiramento da membrana, a adição de electrólito, posta da cobertura sobre o sensor e o ligar do sensor fixo. 0 sistema de controlo do processo analítico consiste num computador (PC) (12) que supervisiona continuamente a operação de um micro processador programado (PLC) (11), que leva a cabo as instruções do protocolo de análises especificas controlando, entre outros parâmetros, os seguintes: volumes e sequências da toma de componentes do processo, tempos de reacção antes da leitura de resultados, obtendo o sinal gerado pelo transdutor, um auto exame do sistema e finalmente o cálculo e a apresentação de resultados. 0 computador (PC) leva a cabo o complexo processo dos sinais desde os transdutores e permite a modificação dos controlos levada a cabo pelo micro processador programável dependendo das necessidades de medição ou das condições de funcionalidade do sistema. A incorporação de modems dentro do sistema do computador permite ao equipamento de micro biosensor ser controlado remotamente através de uma conexão telefónica (16), fazendo possivel a centralização do controlo de vários micro bio-sensores situados em diferentes WWTP. Ademais, o aparelho tem um monitor (13) e uma impressora (14).

Como um exemplo, o software de controlo e aquisição de dados do micro biosensor do presente invenção, no caso particular do bod, será descrita. 0 micro biosensor BOD está controlado por um software especializado. 0 aparelho do micro biosensor inclui um computador PC e um micro processador (o PLC). Os programas de controlo implementam as seguintes funções: 16 - o desenho gráfico de um diagrama mostrando a função dos dispositivos no que respeita ao tempo para um protocolo especifico. controlo da função dos dispositivos eléctricos do circuito fluido. - aquisição dos sinais desde o(s) sensor(es). - mostra dos dados obtido no ecrã do computador. - tratamento preliminar de dados. - armazenamento de dados. 0 software do micro biosensor inclui dois programas principais e vários programas adicionais (para o controlo remoto do aparelho, para construir gráficos, e outras coisas mais). 0 programa do micro processador PLC permite o controlo do funcionamento do aparelho independentemente do computador PC, enquanto que o programa do PC permite a recepção, o armazenamento e a análise de dados. 0 programa do computador PC recebe a cada 30 segundos os dados do micro processador PLC e armazena-os num ficheiro de um disco duro. Ao mesmo tempo, o programa mostra estes dados numa forma gráfica e analisa as alterações observadas durante o ciclo. Este gráfico de oxigénio dissolvido (fig.2) é mostrado numa janela onde o operador pode anotar qualquer ponto de interesse e calcular as áreas abaixo do pico que correspondem às respostas do respirograma do micro biosensor à amostra.

O programa do PC prepara dois ecrãs mais: um chamado diagrama de tempo e o outro diagrama da função do aparelho. O diagrama de tempo (fig.3) permite observar o funcionamento do ciclo usando os gráficos de activação e desactivação dos dispositivos no circuito de fluido. O 17 diagrama de função (fig.4) é uma janela que ajuda à melhor compreensão do funcionamento do micro biosensor e permite o controlo dos dispositivos eléctricos do aparelho (a bomba peristáltica e as válvulas eléctricas). 0 hardware do micro processador PLC está desenhado de forma a que a troca de mensagens entre o micro processador e o computador PC possa ocorrer sem interromper o programa do micro processador. 0 diagrama de função (fig.4) representa a estrutura do circuito de fluido do micro biosensor. Inclui o mini reactor, o reactor principal, as bombas peristálticas, circuitos líquidos, válvulas eléctricas, etc. Estes diagrama permite o controlo das bombas peristálticas e das válvulas eléctricas desde o ecrã do computador PC. Qualquer bomba ou válvula eléctrica pode ser activada com simplesmente mover o cursor na sua imagem e clicando no botão esquerdo do rato. A imagem da bomba se altera. Clicando outra vez na imagem da bomba activada, esta pára. Da mesma forma a válvula eléctrica pode ser activada / desactivada. 0 diagrama do oxigénio dissolvido mostra os dados actuais obtidos durante o ciclo. Os dados representam as 600 ultimas medições do oxigénio dissolvido (feitas tantas vezes quantas necessárias). Normalmente os picos das medições da amostra e os picos da amostra de referencia aparecem no diagrama (referencias, fig.2). A área dos picos representa a demanda de oxigénio bioquímico (BOD). Quando um novo pico aparece, a nova área é calculada automaticamente e o resultado do cálculo é mostrado na parte de baixo da janela na barra de informação. Também é possível calcular a área de qualquer pico no gráfico utilizando o comando "Área" do menu. Ao utilizar os comandos "Começar a Gravar", "Terminar Gravar" e "Linha 18 base" (fig.5) é possível marcar os limites para a integração do gráfico respirométrico (movendo o cursor para os correspondentes pontos de começar e acabar a integração e a linha base desde a qual a área pode ser calculada; pontos a, b e c na fig.5). Ao usar o comando "Calcular" a área marcada será calculada e o resultado mostrado no ecrã (fig.6). 0 diagrama de tempo mostra onde se encontra o aparelho no ciclo analítico. 0 estado das bombas peristálticas (Microrganismos, re-alimentação, Referencia, Vazio, etc.) é visto como uma unidade activada (o sinal superior) se a bomba está activada, ou a zero se a bomba está desligada. O aparelho também pode ser controlado utilizando os menus "Windows", "Comandos", "Utilizador". Com o menu "Windows" o operador elege uma das três janelas para controlar o aparelho (Oxigénio Dissolvido, Diagrama de Tempo ou Diagrama de Caixas). Ao pressionar um dos itens no menu "Windows", a janela correspondente será mostrada em cima das outras e o operador poderá, então, usar o diagrama. 0 menu "Utilizador" serve para regular o nível de acesso aos comandos (por exemplo, um supervisor pode alterar as propriedades do ciclo mas outro operador não terá acesso a este comando). 0 menu "Comando" serve para activar mini ciclos no circuito de fluido. - 0 comando "Parar o Ciclo" é levado a cabo num tempo programado e inclui a activação de várias bombas (as de lavagem e de esvaziar). - 0 comando "Alterar Parâmetros do Ciclo " serve para mudar os tempos de funcionamento do ciclo. - 0 comando "Micro organismos" activa a bomba de micro organismo e, depois, a bomba para a re-alimentação do reactor principal. 19 - 0 comando "Amostra de Referencia" activa a bomba da amostra de referencia depois de um tempo predeterminado. - 0 comando " Entrada de Amostra" Começa a parte do ciclo envolvida na toma de uma amostra desde a entrada até ao WWTP. No inicio, a bomba externa para a amostra é activada ao entrar no wwtp permitindo à amostra alcançar o aparelho. Depois de algum tempo, tanto a bomba peristáltica interna como a válvula eléctrica para a injecção da amostra dentro do mini reactor são activadas. - 0 comando "Passagem da Amostra" inicia a parte do ciclo envolvida na toma de uma amostra desde a passagem do WWTP a qual segue o mesmo padrão que o do comando acima descrito, para a toma de uma amostra desde a entrada do WWTP. 20

Claims (10)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um método para a contínua monitorização da presença de substâncias químicas em fluidos, disse monitorização contínua sendo levada a cabo em ciclos consecutivos utilizando um micro biosensor caracterizado de maneira a que compreende os passos de: a/ a cultura num chemostat posto dentro de um compartimento termostático de uma suspensão de microrganismos cujo metabolismo é modificado proporcionalmente a concentração de substâncias químicas de interesse presentes na amostra liquida a ser analisada; b/ a extracção de uma parte alíquota dos microrganismos cultivados desde o chemostat para cada um dos ciclos analíticos dentro de um compartimento separado; c/ a actividade metabólica e a concentração dos microrganismos cultivados no chemostat são mantidas praticamente constantes através da injecção de um nutriente liquido (meio de alimentação) para a re-alimentação sistemática da suspensão microbial dentro do chemostat; d/ o crescimento dos microrganismos cultivados em suspenso e também dentro da cavidade ou estruturas porosas livres, colocado dentro do chemostat para criar um ambiente micro adequado para a colonização dos microrganismos. e/ a injecção de um fluxo de ar forçado dentro da suspensão microbial; 1 A medição, é levada a cabo por: g/ injectando um extracto de uma parte alíquota microbial do chemostat dentro de um compartimento à parte chamado célula de reacção, em cada ciclo analítico; h/ injectando uma amostra de referência com uma composição específica dentro da célula de reacção, para a auto calibração do sistema em cada ciclo analítico; i/ obtendo um sinal físico-químico gerado no metabolismo microbial através das substâncias químicas presentes na amostra de referência; j/ pré tratando a amostra a ser analisada através da filtração tangencial para remover sólidos suspendidos; k/ injectando a amostra a ser analisada dentro da célula de reacção; 1/ obtendo um sinal físico-químico gerado no metabolismo microbial através de substâncias químicas presentes na amostra filtrada; m/ traduzindo os sinais físico-químicos gerados pela presença de substâncias químicas de interesse dentro de parâmetros analíticos através da utilização de um sensor; n/ comparando entre sinais gerados através da amostra e os sinais gerados através da amostra de referencia, obtidos na célula de reacção através da utilização de um sensor; o/ Descartando os conteúdos da célula de reacção, após cada ciclo analítico. Um método para a contínua monitorização da presença de substâncias químicas em fluidos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado de maneira a que 0 2 nutriente liquido usado no passo (d) é pré tratado através da esterilização utilizando um sistema baseado em lâmpadas ultravioletas.
2. 3. Um método para a monitorização continua da presença de substâncias químicas em fluidos, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado de maneira a que é usado um sistema para limpar a célula de reacção, os sensores, e os circuitos líquidos entre ciclos analíticos sucessivos.
3. 4. Um método para a monitorização contínua da presença de substâncias químicas em fluidos, de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado de maneira a que a Demanda de Oxigénio Bioquímico (BOD) pode ser determinada na célula de reacção usando a parte alíquota do microbial extraído do chemostat e um eléctrodo de oxigénio dissolvido colocado na célula de reacção.
4. 5. Um aparelho (Figura 1) monitorização contínua da presença de substâncias químicas em fluidos para levar a cabo o método da reivindicação 1, o qual compreende: a/ um sistema para o cultivo contínuo dos microrganismos usados, compreendendo: • um chemostat colocado dentro de um compartimento com termostato • um reservatório de nutriente liquido esterilizado dentro de um compartimento com termostato 3 • um dispositivo para o fluxo de ar forçado dentro do chemostat • um dispositivo para a termostática independente do chemostat • um dispositivo para a termostática independente do nutriente liquido • dispositivos para a injecção do nutriente liquido e para a extracção da parte aliquota microbial. b/ um sistema para as medições analíticas baseado nos microrganismos cultivados, compreendendo: • um reservatório de uma amostra de referencia (calibração de substrato) posto dentro de um compartimento com termostato • uma célula de reacção posta num compartimento com termostato • um dispositivo para a termostática independente da célula de reacção • um dispositivo para o fluxo de ar forçado da célula de reacção • um dispositivo para a termostática independente do reservatório da amostra de referência • um circuito de uma toma de amostra com um filtro tangencial • dispositivos para a injecção dos microrganismos cultivados, amostra de referencia, e amostra filtrada. c/ um sistema para limpar o circuito liquido. 4
5. 6. Um aparelho para a continua monitorização da presença de substâncias químicas em fluidos, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado de maneira a que a célula de reacção inclui sensores específicos para a detecção de sinais físico-químicos, gerados no metabolismo microbial, através de substâncias químicas de interesse presente na amostra.
6. 7. Um aparelho para a continua monitorização da presença de substâncias químicas em fluidos, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado de maneira a que é usado um sistema para limpar a célula de reacção, os sensores, e o circuito liquido, a qual compreende um reservatório do liquido de lavagem, colocado num compartimento com termostato.
7. 8. Um aparelho para a continua monitorização da presença de substâncias químicas em fluidos, de acordo com a reivindicação 5, o qual compreende um software para a integração e tratamento dos sinais eléctricos gerados pelos sensores.
8. 9. Um aparelho para a continua monitorização da presença de substâncias químicas em fluidos, de acordo com a reivindicação 5, o qual compreende um micro processador e o seu software para o controlo automático do aparelho, permitindo a selecção de parâmetros correspondentes ao protocolo analítico do utilizador para aplicações específicas.
9. 10. Um aparelho para a continua monitorização da presença de substâncias químicas em fluidos, de acordo com a 5 reivindicação 5, o qual compreende um software e um modem para a transmissão de dados através da linha telefónica e para o controlo dos parâmetros do protocolo analítico desde um computador remoto. 6

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10. 13. Monitor Reservatório Principal 14. Impressora 15. Modem 16. Telecontrolo

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